CN107868778A - 一种富硒酵母的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵工业技术领域，具体涉及一种富硒酵母的制备方法。本发明选用广西巴马县土壤样品，巴马土壤、谷物中的硒含量高于全国平均水平10倍以上，通过对土壤样品中酵母菌种筛选和育种，培养得到富硒的酵母菌菌种，对硒离子浓度、培养条件进行优化，提高了酵母菌硒含量的提高；本发明通过对富硒土壤中分离筛选得到的富硒酵母菌，通过用梯度浓度的***钠的驯化，筛选抗硒能力高的酵母菌落，再进行紫外诱变，增强其富硒能力，得到获得生物量高、富硒能力强的酵母。

Description

一种富硒酵母的制备方法
技术领域
本发明涉及发酵工业技术领域，具体涉及一种富硒酵母的制备方法。
背景技术
众所周知，硒是人和动物体内的一种必需微量元素，是生物体内谷胱甘肽过氧化合物的重要成分，有着多方面的生物学功能，其中最主要的生物学功能是清除生物体内产生的过多活性氧自由基，因而具有提高生物体免疫力、抗衰老、抗癌的作用。此外，环境砷中毒是一个世界性问题，其危害不仅表现为近期砷对人和动物的健康有害，更为严重的是引起人体远期恶性化改变—癌变、突变及畸变。依据砷—硒可以互为解毒剂的医学原理，加之硒具有抑制和抗癌变、抗突变及抗畸变的生物学功能，富含硒的酵母在预防和治疗地方性中毒方面将发挥显著的作用。此外，酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的14种微量元素，对机体的健康有益。
硒是人体必需的微量元素。硒的营养主要是通过蛋白质特别是与酶蛋白结合发挥抗氧化作用。富硒酵母是指在培养酵母的过程中加入硒元素，酵母生长时吸收利用了硒，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，从而消除了化学硒（如***钠）对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。富硒酵母被人体吸收后，通过与其他酶蛋白及维生素的协同作用能有效清除人体细胞内自由基及过氧化物，从而延缓细胞的衰老，预防和抑制肿瘤、抗衰老、维系心血管***正常的结构与功能，预防动脉和硬化和冠心病的出现。酵母具有高度的富硒能力，能将无机硒转化为有机硒，因此富硒酵母广泛用于食品、保健品和饲料行业中作为补充微量元素硒的来源。
当前，市面上已经有很多品种的富硒酵母，其生产工艺各不相同，现有技术中的富硒酵母主要以糖蜜为原料进行扩大培养，但是以糖蜜为原料其污染比较严重，使得环保费用高，并且得到的富硒酵母中的硒含量只有1000～2000ppm，硒的含量均偏低，不足以满足人类的需求，并无法发挥其最大的经济效益。
总结来说，富硒酵母的硒含量较低主要有以下两点原因：其一是没有对酵母菌种进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，由于不同酵母菌种对硒的抗性有较大差异，从而对硒离子的吸收转化能力差异也很大。其二是没有对生产发酵培养富硒酵母的培养基的硒离子浓度、培养条件进行优化，因此培养的酵母虽然称做“富硒酵母”，但是这种称做“富硒酵母” 细胞的硒含量较低，酵母细胞的生物量也较低。
现有技术中生产称做“富硒酵母”细胞地方法大体有三种，第一种是采用混合处理方法，将一定量的硒酸盐或***盐与酵母细胞混合而成。其主要缺陷在于：其未将无机硒转化成为有机硒，这种硒酸盐或***盐与酵母细胞混合在一起的所谓“富硒酵母”能使人和动物对其的吸收率很低，产生的生物学作用较差，不是真正的富硒酵母。
第二种是采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞悬浮于含有硒酸盐或***盐的水溶液中处理一定时间，使硒离子吸附于酵母细胞表面，其主要缺陷在于：这种处理仍然不能将无机硒转化成为有机硒，这种吸附硒酸盐或***盐的酵母细胞与上述第一种方法没有本质的区别，能使人或动物对其的吸收率很低，产生的生物学作用较差，同样不是真正的富硒酵母。
第三种是在含有硒离子的培养基中培养酵母细胞，但是对酵母菌种没有进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，其主要缺陷在于：由于不同酵母菌种对硒的抗性有较大差异，从而对硒离子的吸收转化能力差异很大。此外，这种技术对培养基的硒离子浓度、培养条件未进行优化，因此采用这种技术培养的酵母中，有机硒含量较低，每克干酵母细胞含有机硒500微克以下、细胞生物量也低、从而经济效益也很低。
因此，提供一种高效且简便的富硒酵母的制备方法，以此来适应于社会的需求，是一件十分有必要的事情。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前没有对酵母菌种进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，没有对生产发酵培养的富硒酵母的富硒能力进行优化的问题，提供了一种富硒酵母的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种富硒酵母的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将土样加入酵母菌液体培养基中，培养，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，培养，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线2~3次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落接种至酵母菌液体培养基，活化培养，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，培养，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，培养，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级驯化后酵母菌菌落，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，活化培养，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡，并于摇床上震荡，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，紫外灯照射，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1mL涂布于酵母菌平板培养基，培养，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，培养，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，驯化诱变后酵母菌菌株接种至富硒发酵培养基，培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母干燥，冷却，得富硒酵母粉。
所述步骤（1）中土壤样品为广西巴马县土壤样品，土样与酵母菌液体培养基的质量比为4:9，培养条件为30~35℃200r/min摇床培养18~24h。
所述步骤（1）中酵母菌平板培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖12~15份，酵母膏8~10份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，pH值自然，121℃灭菌20min；酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基的配方中的琼脂，其他组分不变。
所述步骤（2）中纯化后酵母菌单菌落与酵母菌液体培养基的质量比为1:9，一级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:1000，酵母菌活化培养物与一级驯化和筛选培养基的质量比为1:8，二级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:500，三级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:300；驯化和筛选培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖8~10份，酵母膏15~18份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，***钠10~12份，pH值自然，121℃灭菌20min。
所述步骤（3）中紫外诱变的条件为15W紫外灯25cm距离处照射180s。
所述步骤（4）中发酵培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖10~12份，酵母膏18~20份，磷酸氢二钾1~2份，牛肉膏10~15份，蛋白胨8~10份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
所述步骤（4）中酵母菌菌株与富硒发酵培养基的质量比为1:9，沉淀与蒸馏水的质量比为1:50。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明选用广西巴马县土壤样品，巴马土壤、谷物中的硒含量高于全国平均水平10倍以上，通过对土壤样品中酵母菌种筛选和育种，培养得到富硒的酵母菌菌种，对硒离子浓度、培养条件进行优化，提高了酵母菌硒含量的提高；
（2）本发明通过对富硒土壤中分离筛选得到的富硒酵母菌，通过用梯度浓度的
***钠的驯化，筛选抗硒能力高的酵母菌落，再进行紫外诱变，增强其富硒能力，得到获得生物量高、富硒能力强的酵母。
具体实施方式
原料：广西巴马县土壤。
酵母菌平板培养基：按质量份数计，取葡萄糖12~15份，酵母膏8~10份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，pH值自然，121℃灭菌20min。
酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基中的琼脂，其他组分不变。
驯化和筛选培养基：按质量分数计，取葡萄糖8~10份，酵母膏15~18份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，***钠10~12份，pH值自然，121℃灭菌20min。
发酵培养基：按质量份数计，取葡萄糖10~12份，酵母膏18~20份，磷酸氢二钾1~2份，牛肉膏10~15份，蛋白胨8~10份，***钠10~12份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
一种富硒酵母的制备方法，包括如下步骤：
（1）将广西巴马县土壤样品按质量比4:9加入酵母菌液体培养基中，30~35℃下200r/min摇床培养18~24h，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，在30~35℃恒温培养箱中培养36~48h，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线2~3次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落按质量比1:9接种至酵母菌液体培养基，25~30℃活化培养18~24 h，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物按质量比1:8接种至一级的驯化和筛选培养基，25~33 ℃培养36~48h，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，25~30℃摇床培养36~48h，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级酵母菌培养物，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，25~30℃恒温活化培养12~18h，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡30min，并于摇床上震荡60~70min，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热30min，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，15W紫外灯25cm距离处照射180s，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1ml涂布于酵母菌平板培养基，25~30℃培养72h后，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，25~30℃、200r/min振荡培养48h，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，将驯化诱变后酵母菌菌株按质量比1:9接种至富硒发酵培养基，振荡培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再按质量比1:50加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母置于100℃ 的烘箱内干燥6h，冷却至室温，得富硒酵母粉。
实例1
酵母菌平板培养基：按质量份数计，取葡萄糖12份，酵母膏8份，蛋白胨5份，硫酸镁0.02份，琼脂15份，pH值自然，121℃灭菌20min。
酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基中的琼脂，其他组分不变。
驯化和筛选培养基：按质量分数计，取葡萄糖8份，酵母膏15份，蛋白胨5份，硫酸镁0.02份，琼脂15份，***钠10份，pH值自然，121℃灭菌20min。
发酵培养基：按质量份数计，取葡萄糖10份，酵母膏18份，磷酸氢二钾1份，牛肉膏10份，蛋白胨8份，***钠10份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
原料：广西巴马县土壤。
一种富硒酵母的制备方法，包括如下步骤：
（1）将广西巴马县土壤样品按质量比4:9加入酵母菌液体培养基中，30℃下200r/min摇床培养18h，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，在30℃恒温培养箱中培养36h，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线2次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落按质量比1:9接种至酵母菌液体培养基，25~30℃活化培养18~24 h，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物按质量比1:8接种至一级的驯化和筛选培养基，25~33 ℃培养36~48h，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，25~30℃摇床培养36~48h，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级酵母菌培养物，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，25℃恒温活化培养12h，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡30min，并于摇床上震荡60min，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热30min，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，15W紫外灯25cm距离处照射180s，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1ml涂布于酵母菌平板培养基，25℃培养72h后，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，25℃、200r/min振荡培养48h，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，将驯化诱变后酵母菌菌株按质量比1:9接种至富硒发酵培养基，振荡培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再按质量比1:50加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母置于100℃ 的烘箱内干燥6h，冷却至室温，得富硒酵母粉。
实施例2
酵母菌平板培养基：按质量份数计，取葡萄糖13份，酵母膏9份，蛋白胨6份，硫酸镁0.03份，琼脂17份，pH值自然，121℃灭菌20min。
酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基中的琼脂，其他组分不变。
驯化和筛选培养基：按质量分数计，取葡萄糖9份，酵母膏16份，蛋白胨6份，硫酸镁0.03份，琼脂17份，***钠11份，pH值自然，121℃灭菌20min。
发酵培养基：按质量份数计，取葡萄糖11份，酵母膏19份，磷酸氢二钾1份，牛肉膏13份，蛋白胨9份，***钠11份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
原料：广西巴马县土壤。
一种富硒酵母的制备方法，包括如下步骤：
（1）将广西巴马县土壤样品按质量比4:9加入酵母菌液体培养基中，33℃下200r/min摇床培养22h，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，在32℃恒温培养箱中培养42h，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线2次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落按质量比1:9接种至酵母菌液体培养基，25~30℃活化培养18~24 h，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物按质量比1:8接种至一级的驯化和筛选培养基，25~33 ℃培养36~48h，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，25~30℃摇床培养36~48h，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级酵母菌培养物，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，27℃恒温活化培养15h，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡30min，并于摇床上震荡65min，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热30min，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，15W紫外灯25cm距离处照射180s，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1ml涂布于酵母菌平板培养基，27℃培养72h后，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，27℃、200r/min振荡培养48h，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，将驯化诱变后酵母菌菌株按质量比1:9接种至富硒发酵培养基，振荡培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再按质量比1:50加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母置于100℃ 的烘箱内干燥6h，冷却至室温，得富硒酵母粉。
实施例3
酵母菌平板培养基：按质量份数计，取葡萄糖15份，酵母膏10份，蛋白胨7份，硫酸镁0.05份，琼脂20份，pH值自然，121℃灭菌20min。
酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基中的琼脂，其他组分不变。
驯化和筛选培养基：按质量分数计，取葡萄糖10份，酵母膏18份，蛋白胨7份，硫酸镁0.05份，琼脂20份，***钠12份，pH值自然，121℃灭菌20min。
发酵培养基：按质量份数计，取葡萄糖12份，酵母膏20份，磷酸氢二钾2份，牛肉膏15份，蛋白胨10份，***钠12份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
原料：广西巴马县土壤。
一种富硒酵母的制备方法，包括如下步骤：
（1）将广西巴马县土壤样品按质量比4:9加入酵母菌液体培养基中，35℃下200r/min摇床培养24h，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，在35℃恒温培养箱中培养48h，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线3次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落按质量比1:9接种至酵母菌液体培养基，25~30℃活化培养18~24 h，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物按质量比1:8接种至一级的驯化和筛选培养基，25~33 ℃培养36~48h，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，25~30℃摇床培养36~48h，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级酵母菌培养物，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，30℃恒温活化培养18h，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡30min，并于摇床上震荡70min，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热30min，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，15W紫外灯25cm距离处照射180s，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1ml涂布于酵母菌平板培养基，30℃培养72h后，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，30℃、200r/min振荡培养48h，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，将驯化诱变后酵母菌菌株按质量比1:9接种至富硒发酵培养基，振荡培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再按质量比1:50加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母置于100℃ 的烘箱内干燥6h，冷却至室温，得富硒酵母粉。
对比例：郑州某食品科技有限公司生产的富硒酵母
方法：取等量的由实施例与对比例所制备的富硒酵母，检测其中硒含量。
富硒酵母具体检测情况如表1：
表1
检测项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
硒含量（mg/kg） 113.5 127.6 143.8 58.5
由上可知，本发明所制备的富硒酵母硒含量高，是一种安全高效的富硒酵母的制备方法，值得推广和使用。

Claims (7)

1.一种富硒酵母的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
（1）将土样加入酵母菌液体培养基中，培养，得酵母培养液，取酵母培养液用质量分数为0.9%的生理盐水进行梯度稀释至10-6稀释级，得稀释后酵母菌培养液，将酵母菌培养液涂布于酵母菌平板培养基上，培养，挑取菌径最大的酵母菌单菌落平板划线2~3次，得纯化后酵母菌单菌落；
（2）挑取上述纯化后酵母菌单菌落接种至酵母菌液体培养基，活化培养，得酵母菌活化培养物，将***钠按质量比1:1000加入驯化和筛选培养基混合，得一级驯化和筛选培养基，将酵母菌活化培养物接种至一级驯化和筛选培养基，培养，得一级驯化后酵母菌菌落，将***钠按质量比1:500加入驯化和筛选培养基混合，得二级驯化和筛选培养基，挑取驯化酵母菌菌落接种至二级驯化和筛选培养基，培养，得二级酵母菌发酵液，将二级酵母菌发酵液用无菌水将其稀释至10-3的稀释级，将***钠按质量比1:300加入驯化和筛选培养基混合，得三级驯化和筛选培养基，将稀释后发酵液涂布于三级驯化和筛选培养基培养，得三级驯化后酵母菌菌落，将三级酵母菌培养物重复涂布培养3~4次，得硒抗性驯化后酵母菌菌落；
（3）挑取硒抗性驯化后酵母菌菌落接种至酵母菌平板培养基中，活化培养，得活化酵母菌落，取无菌水洗涤活化酵母菌落，倒入盛有玻璃珠的容器中，振荡，并于摇床上震荡，得到单细胞菌悬液，用血球计数板计数，用无菌水将单细胞菌悬液调整至细胞浓度为10-6~10-7个/mL，紫外灯预热，取制备好的单细胞菌悬液置于无菌平皿内，置磁力搅拌器上搅拌，紫外灯照射，得处理的菌悬液，取处理的菌悬液0.1mL涂布于酵母菌平板培养基，培养，挑选出菌径最大的单菌落接种至种于发酵培养基中，培养，得紫外诱变后酵母菌培养液，干燥，得紫外诱变后酵母菌菌株；
（4）将***钠按质量比1:250加入发酵培养基混合，得富硒发酵培养基，驯化诱变后酵母菌菌株接种至富硒发酵培养基，培养，得驯化诱变酵母菌培养物，离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，再加入蒸馏水，离心，除上清液，此步骤反复2~3次，得到去培养液湿酵母，将湿酵母干燥，冷却，得富硒酵母粉。
2.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中土壤样品为广西巴马县土壤样品，土样与酵母菌液体培养基的质量比为4:9，培养条件为30~35℃200r/min摇床培养18~24h。
3.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中酵母菌平板培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖12~15份，酵母膏8~10份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，pH值自然，121℃灭菌20min；酵母菌液体培养基：去掉酵母菌平板培养基的配方中的琼脂，其他组分不变。
4.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中纯化后酵母菌单菌落与酵母菌液体培养基的质量比为1:9，一级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:1000，酵母菌活化培养物与一级驯化和筛选培养基的质量比为1:8，二级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:500，三级驯化和筛选培养基中***钠与驯化和筛选培养基的质量比为1:300；驯化和筛选培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖8~10份，酵母膏15~18份，蛋白胨5~7份，硫酸镁0.02~0.05份，琼脂15~20份，***钠10~12份，pH值自然，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中紫外诱变的条件为15W紫外灯25cm距离处照射180s。
6.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵培养基的配方为按质量份数计，取葡萄糖10~12份，酵母膏18~20份，磷酸氢二钾1~2份，牛肉膏10~15份，蛋白胨8~10份，pH4.8±0.2，121℃灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的果富硒酵母的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中酵母菌菌株与富硒发酵培养基的质量比为1:9，沉淀与蒸馏水的质量比为1:50。
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