CN105586392B - 评估胎儿样本中母体细胞污染程度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测胎儿核酸样本中是否含有母体核酸的方法，包括：获得胎儿核酸样本和母体的核酸样本，所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本各自包含DNA片段；分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与以下21个参考SNP中的至少5个对应的位点的碱基类型：rs1057079、rs3890011、rs13007735、rs10172036、rs2516835、rs1656922、rs2686817、rs11167136、rs70156、rs2275111、rs2293277、rs2292681、rs3742302、rs4981088、rs11737、rs7169981、rs3115438、rs2302836、rs1455556、rs2235862和rs2296241；基于比较所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的对应于相同所述参考SNP的位点的碱基类型的差异，判断所述胎儿核酸样本中是否含有所述母体核酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物样品检测领域，具体地，本发明涉及评估胎儿样本中母体细胞污染程度的方法，更具体地，本发明涉及一种检测胎儿核酸样本中是否含有母体核酸的方法和一种试剂盒。
背景技术
目前产前诊断中，胎儿样本的获取方式主要是羊膜腔穿刺术和绒毛穿刺取样术，而由于母体细胞或者蜕膜的污染，这些有创取样方法可能会导致胎儿样本中存在母体细胞污染(maternal cell contamination,MCC)的可能性，是影响产前诊断结果准确性的主要因素之一。1983年，Benn and Hsu对美国全国范围内的羊水标本中母体细胞污染情况进行调查，发现0.3％的羊水标本存在母体细胞污染的情况[Benn PA,Hsu LY.1983.Maternalcell contamination of amnioticfluid cell cultures:results of a U.S.nationwidesurvey.Am J Med Genet 15(2):297–305.]。一个欧洲合作研究中心调研发现，0.34％经过培养的羊水样本存在母体细胞污染的情况[Bui TH,Iselius L,LindstenJ.1984.European collaborative study on prenatal diagnosis:mosaicism,pseudomosaicism and single abnormal cells in amniotic fluid cellcultures.Prenat Diagn 4Spec No:145–162.]。2005年，Stojilkovic-Mikic等利用定量荧光PCR(QF-PCR)技术对307例产前诊断样本(254例羊水样本)中母体细胞污染情况进行研究，在未经培养的羊水样本中，母体细胞污染发生率高达9.1％，经过培养的羊水样本中，母体细胞污染发生率高达2.8％[Stojilkovic-Mikic T,Mann K,Docherty Z.2005.Maternalcell contamination of prenatal samples assessed by QF-PCR genotyping.PrenatDiagn 2005；25:79–83.]。
产前诊断样品中母体细胞污染程度的评估对产前样本的诊断结果以及孕妇妊娠干预至关重要。目前，评估产前诊断样品中母体细胞污染程度的方法主要有PCR扩增技术、荧光定量PCR技术(Quantitative fluorescence–polymerase chain reaction，QF-PCR)、短串联重复序列(STR)分型技术、高效变性液相色谱技术、基因芯片分析技术等。PCR扩增技术是一种常见的、用于检测产前诊断样本中母体细胞污染的方法，Antoniadi等用PCR扩增技术对胎儿和母体样本DNA进行扩增检测，在135例胎儿样本中发现4例样本存在母体细胞污染的情况[Antoniadi T,Yapijakis C,Kamino petros P,Makatsoris C,VelissariouV,Vassilopoulos D,Petersen MB.2002.Prenat Diagn 2002；22:425–429.]。
人类基因组DNA单核苷酸多态性(SNP)分型技术是检测人类基因组DNA单核苷酸多态性位点处碱基类型的技术，主要方法有时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)技术、荧光定量PCR技术、基因芯片技术、变形高效液相色谱等。
发明内容
依据本发明的一方面，提供一种检测胎儿核酸样本中是否含有母体核酸的方法，所述母体核酸来自怀有所述胎儿的母亲，所述方法包括以下步骤：(a)获得所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本，所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本各自包含DNA片段，以及任选的获得父本核酸样本，所述父本核酸样本来自所述胎儿的父亲，所述父本核酸样本包含DNA片段；(b)分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与以下21个参考SNP中的至少5个对应的位点的碱基类型：rs1057079、rs3890011、rs13007735、rs10172036、rs2516835、rs1656922、rs2686817、rs11167136、rs70156、rs2275111、rs2293277、rs2292681、rs3742302、rs4981088、rs11737、rs7169981、rs3115438、rs2302836、rs1455556、rs2235862和rs2296241，任选的检测所述父本核酸样本中的DNA片段中的与所述胎儿核酸样本和/或所述母体的核酸样本中的所述位点对应的位点的碱基类型；(c)基于比较(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及任选的所述父本核酸样本中的DNA片段中的对应于所述参考SNP的位点的碱基类型的差异，判断所述胎儿核酸样本中是否含有所述母体核酸。任选地，(b)步骤也可以是，分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与所述21个参考SNP中的至少10个对应的位点的碱基类型；任选地，(b)步骤也可以是，分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与所述21个参考SNP中的至少15个对应的位点的碱基类型；任选地，(b)步骤还可以是，分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与所述21个所述参考SNP中的至少20个对应的位点的碱基类型；任选地，(b)步骤还可以是，分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与所述21个参考SNP对应的位点的碱基类型。前述的以“rs”编号来指代SNP是依据NCBI数据库，NCBI对所有提交的snp进行分类考证之后，都会给出一个rs号，并给出该SNP的具体信息，包括前后序列、位置信息、分布频率等。本发明中利用NCBI对SNP的编号来指示所选择组合的SNP位点，是利用SNP的一种命名或表示方式指示某个(些)人的特定SNP，是为方便表达指代，一个SNP位点还可以有其它表示方式，本领域普通技术人员知道，采用其它命名方式比如以该SNP在cDNA上的位置来命名指代与本发明一样的参考SNP或SNP组合也属于本发明范围。一个SNP基于其rs号，能确定该SNP的前后序列，依据其前后序列设计引物，扩增待测样本，能够将待测样本中的包含与那参考SNP对应的位点的核酸片段扩增出来，接着基于扩增出来的包含上述位点的核酸片段，检测所述位点的碱基类型，获得位点的碱基类型。
本发明的这一方面的方法，所选择组合的21个SNP位点或者其部分是基于HapMap数据库样本基因型、在满足最大程度区分样本、组合位点少的基础上进行优化选取，具有保守度低、变异频率高的特性。通过检测人类基因组的这21个SNP位点处或者其部分的碱基类型，即通过检测胎儿核酸样本、母体核酸样本以及任选的父体DNA样本的与这21个SNP位点或其部分对应的位点的碱基类型，比较分析母体核酸样本、任选的父体核酸样本与胎儿样本DNA的上述位点处的碱基差异，可以对约95％的产前诊断样本中母体细胞污染程度进行评估，能够快速评估胎儿核酸样本是否受到母体细胞污染以及受到母体细胞污染的程度。
在本发明的一个实施例中，(b)步骤中的位点的碱基类型的检测包括：利用单核苷酸引物延伸法获得包含所述位点的延伸产物，以及，检测所述延伸产物，获得所述位点的碱基类型。单核苷酸引物延伸法也称为微测序，利用该法对SNP进行分型，可以先扩增含有SNP的DNA片段作为模板，再在所述SNP的上游或下游设计引物，在反应体系中加入底物ddNTP，利用SNP与ddNTP互补配对，在引物的3’端掺入一个碱基，产生等位基因特异性引物延伸产物，该产物的一个末端即为该SNP位点，检测该位点或者基于延伸前后的序列的差异，确定该位点的碱基类型，在本发明的一个实施例中，利用质谱检测延伸前后的序列的分子量差异，确定所掺入的一个碱基的类型。更具体的，检测位点的碱基类型是利用飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)，利用MALDI-TOF MS方法检测SNP位点处碱基类型是通过检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定SNP位点处碱基类型，具有自动化、快速、灵敏、成本低、谱图简单直观等特点，是一种检测SNP的理想方法。
在本发明的一个实施例中，(b)步骤中的位点的碱基类型的检测包括，利用第一引物，分别扩增所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及任选的所述父本核酸样本中的含有与所述参考SNP对应的位点的DNA片段，获得胎儿扩增产物和母体扩增产物和任选的父本扩增产物；利用第二引物分别结合所述胎儿扩增产物和所述母体扩增产物和任选的所述父本扩增产物，各自延伸一个碱基，对应获得胎儿延伸产物和母体延伸产物和任选的父本延伸产物；基于所述胎儿延伸产物和所述母体延伸产物各自与所述第二引物的分子量差异，任选的基于所述父本延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述胎儿核酸样本、所述母体的核酸样本和任选的所述父本核酸样本中的所述位点的碱基类型。所述胎儿延伸产物和所述母体延伸产物和任选的所述父本延伸产物的3’端都为所述位点，这是通过利用扩增产物模板设计第二引物，使在延伸反应时，第二引物能够结合到模板上的紧挨所述位点的位置，使所延伸的一个碱基为目标位点，而且基于底物是ddNTP，不能再继续延伸，获得单碱基延伸产物。
在本发明的一个实施例中，当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1057079时，所述第一引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述第二引物为SEQ ID NO:3；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3890011时，所述第一引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，所述第二引物为SEQ ID NO:6；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs13007735时，所述第一引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，所述第二引物为SEQ ID NO:9；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs10172036时，所述第一引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，所述第二引物为SEQ ID NO:12；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2516835时，所述第一引物为SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14，所述第二引物为SEQ ID NO:15；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1656922时，所述第一引物为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述第二引物为SEQ IDNO:18；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2686817时，所述第一引物为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，所述第二引物为SEQ ID NO:21；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11167136时，所述第一引物为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，所述第二引物为SEQ IDNO:24；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs70156时，所述第一引物为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，所述第二引物为SEQ ID NO:27；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2275111时，所述第一引物为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，所述第二引物为SEQ ID NO:30；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2293277时，所述第一引物为SEQ ID NO:31和SEQID NO:32，所述第二引物为SEQ ID NO:33；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2292681时，所述第一引物为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，所述第二引物为SEQ ID NO:36；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3742302时，所述第一引物为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，所述第二引物为SEQ ID NO:39；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs4981088时，所述第一引物为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，所述第二引物为SEQ ID NO:42；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11737时，所述第一引物为SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，所述第二引物为SEQ ID NO:45；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs7169981时，所述第一引物为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，所述第二引物为SEQ ID NO:48；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3115438时，所述第一引物为SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，所述第二引物为SEQ ID NO:51；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2302836时，所述第一引物为SEQID NO:52和SEQ ID NO:53，所述第二引物为SEQ ID NO:54；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1455556时，所述第一引物为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，所述第二引物为SEQ IDNO:57；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2235862时，所述第一引物为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59，所述第二引物为SEQ ID NO:60；当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2296241时，所述第一引物为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，所述第二引物为SEQ ID NO:63。上述具体引物序列是发明人经过多次设计试验获得的，能够用于多重PCR反应体系中，在本发明的一个实施例中，利用多组第一引物进行多重扩增，能够在一个PCR反应体系中同时获得多个包含不同目标位点的扩增产物，以所述扩增产物作为模板，在同一个延伸反应体系中加入多组第二引物，多组第二引物能够互不干扰的各自结合到目标位置进行单碱基延伸，获得延伸产物。
在本发明的一个实施例中，(c)步骤包括：基于比较(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的对应于相同所述参考SNP的位点的碱基类型的差异，当任一所述位点在所述胎儿核酸样本和在所述母体的核酸样本中的碱基类型符合以下(i)-(iii)至少之一，则判定所述胎儿核酸样本含有所述母体核酸，(i)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也为所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，(ii)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中为所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基，(iii)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中为所述两种类型碱基之一以及另一种与其不等量的碱基。这边所说的“量”可以是实际的包含所述位点碱基的延伸产物的数量、浓度或比例，也可以是反应在位点分型图或位点检测图上的碱基的质谱峰的大小或者质谱峰的面积的大小。
在本发明的一个实施例中，(c)步骤包括：基于(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及所述父本核酸样本中的DNA片段中的对应于相同所述参考SNP的位点的碱基类型，先判断所述胎儿核酸样本的所述位点的碱基类型是否符合孟德尔遗传规律，(1)当任一所述位点的碱基类型符合孟德尔遗传规律且该位点符合(i)、(ii)和(ii)至少之一，和/或，(2)当任一所述位点的碱基类型不符合孟德尔遗传规律且该位点符合(iv)和(v)至少之一，则判定所述胎儿核酸样本含有所述母体核酸，(i)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也为所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，(ii)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中为所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基，(iii)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中为所述两种类型碱基之一以及另一种与其不等量的碱基，(iv)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也包含所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，(v)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中包含所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基。
依据本发明的另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括引物对，每对所述引物对包含第一引物和第二引物，所述引物对能够用以检测与以下21个参考SNP中的至少5个对应的位点的碱基类型：rs1057079、rs3890011、rs13007735、rs10172036、rs2516835、rs1656922、rs2686817、rs11167136、rs70156、rs2275111、rs2293277、rs2292681、rs3742302、rs4981088、rs11737、rs7169981、rs3115438、rs2302836、rs1455556、rs2235862和rs2296241。任选地，所述引物对能够用以检测与所述21个参考SNP中的至少10个对应的位点的碱基类型。任选地，所述引物对能够用以检测与所述21个参考SNP中的至少15个对应的位点的碱基类型。任选地，所述引物对能够用以检测与所述21个参考SNP中的至少20个对应的位点的碱基类型。任选地，所述引物对能够用以检测与所述21个参考SNP对应的位点的碱基类型。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒包含的引物对为，当所要检测的位点包含对应所述参考SNP中的rs1057079的位点时，为能检测该位点所述第一引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述第二引物为SEQ ID NO:3；当为检测对应所述参考SNP中的rs3890011的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，所述第二引物为SEQ ID NO:6；当为检测对应所述参考SNP中的rs13007735的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8，所述第二引物为SEQ ID NO:9；当为检测对应所述参考SNP中的rs10172036的位点为时，所述第一引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，所述第二引物为SEQ ID NO:12；当为检测对应所述参考SNP中的rs2516835的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述第二引物为SEQ ID NO:15；当为检测对应所述参考SNP中的rs1656922的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述第二引物为SEQ ID NO:18；当为检测对应所述参考SNP中的rs2686817的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，所述第二引物为SEQ ID NO:21；当为检测对应所述参考SNP中的rs11167136的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，所述第二引物为SEQ ID NO:24；当为检测对应所述参考SNP中的rs70156的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，所述第二引物为SEQ ID NO:27；当为检测对应于所述参考SNP中的rs2275111的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，所述第二引物为SEQ ID NO:30；当为检测对应所述参考SNP中的rs2293277的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，所述第二引物为SEQ ID NO:33；当为检测对应所述参考SNP中的rs2292681的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，所述第二引物为SEQ ID NO:36；当为检测对应所述参考SNP中的rs3742302的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，所述第二引物为SEQ ID NO:39；当为检测对应所述参考SNP中的rs4981088的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，所述第二引物为SEQ ID NO:42；当为检测对应所述参考SNP中的rs11737的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，所述第二引物为SEQ ID NO:45；当为检测对应所述参考SNP中的rs7169981的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，所述第二引物为SEQ ID NO:48；当为检测对应所述参考SNP中的rs3115438的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，所述第二引物为SEQ ID NO:51；当为检测对应所述参考SNP中的rs2302836的位点时，所述第一引物为SEQID NO:52和SEQ ID NO:53，所述第二引物为SEQ ID NO:54；当为检测对应所述参考SNP中的rs1455556的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，所述第二引物为SEQID NO:57；当为检测对应所述参考SNP中的rs2235862的位点时，所述第一引物为SEQ IDNO:58和SEQ ID NO:59，所述第二引物为SEQ ID NO:60；当为检测对应所述参考SNP中的rs2296241的位点时，所述第一引物为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，所述第二引物为SEQID NO:63。前述本发明一方面或者各个具体实施方式中的方法中的涉及位点选择组合以及引物的技术特征和优点的描述，也同样适用于本发明这一方面的试剂盒，在此不再赘述。
利用本发明的方法和/或试剂盒，评估胎儿核酸样本中母体细胞污染的方法，利用MALDI-TOF MS方法，通过对人类基因组中SNP位点碱基类型进行检测，评估产前诊断样本中母体细胞污染程度，其具有的优势主要有：1)自动化、检测周期短——能够实现短时间内对多个样本进行检测，2天内即可获得检测结果，能够及时对产前诊断样本中是否存在母体细胞污染做出判断，辅助产前诊断；2)成本低、谱图简单直观——利用MALDI-TOF MS方法能够实现对多个样本的检测，降低检测成本，并且检测质谱峰图简单直观，通过比较胎儿样本峰图与亲本样本质谱峰图差异，能够迅速的对胎儿样本中是否存在母体细胞污染做出判断。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点，结合下面附图对实施方式的描述将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例中的胎儿核酸样本中的母体细胞污染的评估方法的流程图；
图2是本发明的一个实施例中的存在母体细胞污染的胎儿及亲本核酸样本的21个SNP位点质谱峰图。
具体实施方式
图1是采用本发明方法的一个实施例的流程，一般流程包括：SNP位点的选取与优化、胎儿和母体DNA样本以及任选的父体DNA样本的SNP位点碱基类型检测、样本质谱图分析等。
1、人类基因组的21个SNP位点
21个SNP位点是基于HapMap数据库样本基因型、在满足最大程度区分样本、组合位点少的基础上进行优化选取，具有保守度低、变异频率高的特性。通过检测产前诊断DNA样本、母体DNA样本及父体DNA样本的这21个SNP位点碱基类型，比较质谱峰图差异，可以对约95％的产前诊断样本中母体细胞污染程度进行评估。21个SNP位点信息详见表1。
表1
| No. | 染色体 | 位置(Position) | rs编号(rs No) | 等位基因(Alleles) | 频率(Frequencies) |
| 1 | chr1 | 11205058 | rs1057079 | A/G | 0.563/0.437 |
| 2 | chr1 | 47398743 | rs3890011 | C/G | 0.408/0.592 |
| 3 | chr2 | 141751592 | rs13007735 | A/G | 0.442/0.558 |
| 4 | chr2 | 204824283 | rs10172036 | G/T | 0.547/0.453 |
| 5 | chr2 | 99779131 | rs2516835 | C/T | 0.5/0.5 |
| 6 | chr3 | 186443018 | rs1656922 | C/T | 0.527/0.473 |
| 7 | chr7 | 47968927 | rs2686817 | A/C | 0.487/0.513 |
| 8 | chr8 | 143310815 | rs11167136 | A/G | 0.496/0.504 |
| 9 | chr9 | 125424507 | rs70156 | A/C | 0.606/0.394 |
| 10 | chr10 | 120917445 | rs2275111 | A/G | 0.516/0.483 |
| 11 | chr10 | 95279506 | rs2293277 | A/T | 0.421/0.579 |
| 12 | chr12 | 120995332 | rs2292681 | C/T | 0.433/0.557 |
| 13 | chr13 | 31233063 | rs3742302 | C/T | 0.506/0.494 |
| 14 | chr14 | 20665840 | rs4981088 | A/G | 0.472/0.528 |
| 15 | chr15 | 77344793 | rs11737 | A/T | 0.433/0.567 |
| 16 | chr15 | 90226947 | rs7169981 | A/C | 0.602/0.398 |
| 17 | chr16 | 20986506 | rs3115438 | C/T | 0.507/0.493 |
| 18 | chr17 | 5991344 | rs2302836 | A/G | 0.471/0.529 |
| 19 | chr18 | 61170721 | rs1455556 | A/G | 0.435/0.565 |
| 20 | chr20 | 50238545 | rs2235862 | C/T | 0.474/0.526 |
| 21 | chr20 | 52786219 | rs2296241 | A/G | 0.5/0.5 |
2、产前诊断样本中SNP位点碱基类型检测
产前诊断样本SNP位点碱基类型检测是基于MALDI-TOF MS技术，利用单核苷酸引物延伸法对SNP进行分型，即先扩增含有SNP的DNA片段作为模板，利用SAP酶(虾碱性磷酸酶)将ddNTP清除。再在SNP的上游或下游设计引物，在反应体系中加入相应的ddNTP，由于SNP与ddNTP互补配对，引物3’端掺入一个或两个碱基，产生等位基因特异性引物延伸产物。延伸产物经纯化后，用于MALDI-TOF MS检测。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同的峰而检测SNP类型。由于延伸反应是以包含预定位点的扩增产物为模板，并且进行延伸反应的延伸引物的3’端紧邻所述预定位点，并且在延伸反应时使用ddNTP作为原料，因而可以保证延伸反应仅延伸一个碱基，即对应预定的位点，基于各个不同碱基的分子量存在较为显著的差别，因而，通过对延伸产物的分子量进行检测，可以通过所获得的延伸产物的分子量来确定预定位点的碱基类型。
3、DNA SNP质谱峰图分析
利用MALDI-TOF MS技术对产前诊断样本、母体样本、父体样本DNA的21个SNP位点碱基类型进行检测，检测结果分为4种情况：
(a)最适用于母体细胞污染判断的SNP点。母亲样本DNA SNP位点碱基为杂合型，胎儿DNA SNP位点碱基为纯合型，例如母体DNA SNP位点碱基为AT、胎儿DNA SNP位点碱基为AA，如果存在母体细胞污染，胎儿样本DNA质谱图中会有“T”碱基峰的干扰。
(b)亚适用于母体细胞污染判断的SNP点。母亲样本DNA SNP位点碱基为纯合型，胎儿DNA SNP位点碱基为杂合型，例如母DNA SNP位点碱基为AA、胎儿DNA SNP位点碱基为AT，通过比对母亲与胎儿样本DNA SNP位点质谱峰面积来判定，如果存在母体细胞污染，胎儿质谱图中"A"的峰面积将高于“T”峰面积。较佳地，在实际应用中该类SNP位点作为辅助判断，进一步查找(a)类位点或者查找多个该类位点以进一步确认判断结果。
(c)无法进行判断的点。胎儿和母亲DNA SNP位点碱基类型完全相同，例如：母DNASNP位点碱基为AA、胎儿DNA SNP位点碱基为AA，或者母DNA SNP位点碱基为AC、胎儿DNA SNP位点碱基为AC，这样的点不能用于判断胎儿样本中是否存在母体细胞污染。
(d)胎儿样本DNA SNP位点发生新发突变。根据父亲本、母本及胎儿DNA SNP碱基类型分析，胎儿DNA SNP碱基类型不符合孟德尔遗传规律，胎儿样本DNA发生新发突变。如果胎儿DNA发生新发突变的等位基因遗传于母亲，例如父DNA SNP位点碱基为AT、母DNA SNP位点碱基为T、胎儿DNA SNP位点碱基为A，这种情况表明胎儿DNA SNP发生新发突变，根据胎儿新发突变的SNP位点碱基类型、母DNA SNP位点碱基类型、以及上述a和/或b中所述SNP位点判断胎儿样本是否存在母体细胞污染情况。如果胎儿DNA发生新发突变的等位基因遗传于父亲，例如父DNA SNP位点碱基为T、母DNA SNP位点碱基为AT、胎儿DNA SNP位点碱基为A，这种情况表明胎儿DNA SNP发生新发突变，这种情况下根据a和/或b中所述SNP位点判断胎儿样本是否存在母体细胞污染情况。
在(d)情况时用到父亲碱基类型，即需要检测父本核酸的对应位点的碱基类型，一是用以辅助判断胎儿碱基类型，验证质谱结果的准确性、以及排除其他样本污染的可能性；二是根据父母基因型判断胎儿相应位点是否符合孟德尔遗传规律是否发生新发突变。
通过比较分析胎儿样本、母体样本以及父体样本DNA SNP质谱峰图，根据胎儿样本与母体样本的检测峰图差异判断胎儿样本中是否存在母体细胞污染。
以下总体描述具体的实施操作步骤。
从母体、父体外周血样本以及胎儿样本(羊水或者绒毛等)中提取1ug左右的DNA。对样本DNA的目标SNPs位点进行PCR扩增，PCR产物用碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase(SAP))处理。对SAP处理后的PCR产物进行延伸反应，延伸反应产物用树脂纯化，纯化后的产物转移至Spectro CHIP芯片，用Mass ARRAY分析仪进行质朴检测，结果用Mass ARRAY TYP-ER软件进行分析。
对父体、母体与胎儿样本DNA SNP分型及质谱图进行分析，胎儿质谱峰图结果与SNP分型结果完成一致，则表明胎儿样本中存在母体细胞污染的可能性较低；如果胎儿质谱峰图结果与SNP分型结果不一致，如母亲样本DNA SNP位点碱基为杂合型，胎儿DNA SNP位点碱基为纯合型，例如母体DNA SNP位点碱基为AT、胎儿DNA SNP位点碱基为AA，而胎儿质谱峰图中对应的SNP位点处存在“T”碱基峰的干扰，则表明胎儿样本中存在母体细胞污染的可能性。
以下结合具体个体样本对依据本发明的具体检测方法的运行结果进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如购自Sequenom公司的飞行时间质谱试剂盒来进行质谱检测等。
实施例
利用MALDI-TOF MS方法对30例胎儿核酸样本(羊水样本)中是否存在母体细胞污染进行检测，发现1例产前诊断样本中存在母体细胞污染，样本来自天津妇幼保健院。
1)引物设计
对人类基因的21个SNP位点的PCR引物和延伸引物进行设计，引物序列如表2所示。
表2
2)样本DNA提取对30例羊水样本、母体外周血以及父体外周血，利用qiagen试剂盒(Hilden,Germany)进行样本DNA提取，提取量约为1ug左右。
3)PCR扩增通过PCR扩增，获得目标SNP位点序列的扩增产物。PCR扩反应体系如表3所示。所有试剂均购买于美国Sequenom公司，PCR仪为GeneAmp PCR System 9700Dual384-Well Sample Block Module。PCR反应条件如表4所示。
表3
| 试剂 | 浓度 | 反应体积(ul) |
| 水 | — | 1.8 |
| 10x PCR缓冲液 | 0.2x/ul | 0.5 |
| MgCl2 | 0.4x/ul | 0.4 |
| dNTP混合物 | 100uM/ul | 0.1 |
| 扩增引物混合物 | 20nM/ul | 1.0 |
| Tap酶 | 0.1U/ul | 0.2 |
| 模板DNA | — | 1.0 |
| 体积 | — | 5.0 |
表4
利用SAP酶对上述PCR扩增产物进行处理，其反应体系为，5.0ul扩增产物用0.16ulSAP酶缓冲液和0.3ulSAP酶以及1.54ul的水(HPLE级)，总反应体积为7.0ul。SAP酶反应条件为37℃温育40min，85℃温育5min。
4)延伸反应PCR扩增产物经SAP酶处理后，进行单碱基的延伸反应，反应体系为：0.655ul水、0.2ul 10xiPLEX缓冲液、0.2ul终止混合物、0.041ul iPLEX酶(Sequenom)、0.904ul 10uM延伸引物。延伸反应条件为：94℃、30s，94℃、5s，52℃、5s，80℃、5s 5个循环，共40个循环；最后72℃、3min。在终止反应中加6mg阳离子交换树脂(Sequenom)、20ul水进行脱盐。
5)质谱检测通过点样仪(MassARRAY Nanodispenser RS1000,Sequenom)把经过纯化后的延伸产物转移至384孔Spectro CHIP芯片上，利用Sequenom MALDI-TOF质谱仪进行检测，获得母体、父体以及胎儿样本DNA SNP位点的碱基质谱峰图。
6)检测结果分析通过比对家系样本父体、母体和胎儿样本DNA的21个SNP质谱图，发现30个家系样本(母体、父体以和胎儿样本)中，检出1例胎儿样本中存在母体细胞污染。该例存在母体细胞污染的胎儿及亲本样本DNA的21个SNP位点质谱检测结果如表5所示，质谱峰图如图2所示。质谱峰图结果表明，胎儿样本质谱结果中，SNP位点rs3890011、rs2275111和rs7169981存在来源母体细胞的DNA碱基杂峰的干扰，表明该家系的胎儿样本中存在母体细胞污染，对应表5中的斜体显示行。
表5
| Position | rs No | 父体 | 母体 | 胎儿 |
| chr1：11205058 | rs1057079 | T | T | T |
| chr1：47398743 | rs3890011 | GC | GC | CG |
| Chr2：141751592 | rs13007735 | AG | G | G |
| Chr2：204824283 | rs10172036 | G | GT | GT |
| Chr2：99779131 | rs2516835 | C | C | C |
| Chr3：186443018 | rs1656922 | CT | C | CT |
| Chr7：47968927 | rs2686817 | CA | CA | CA |
| Chr8：143310815 | rs11167136 | A | A | A |
| Chr9：125424507 | rs70156 | CA | C | CA |
| chr10：120917445 | rs2275111 | A | GA | AG |
| chr10：95279506 | rs2293277 | T | T | T |
| chr12：120995332 | rs2292681 | A | GA | GA |
| chr13：31233063 | rs3742302 | G | G | G |
| chr14：20665840 | rs4981088 | G | A | AG |
| chr15：77344793 | rs11737 | AT | T | AT |
| chr15：90226947 | rs7169981 | CA | CA | CA |
| chr16：20986506 | rs3115438 | CT | C | CT |
| chr17：5991344 | rs2302836 | T | TC | TC |
| chr18：61170721 | rs1455556 | C | TC | TC |
| Chr20：50238545 | rs2235862 | A | A | A |
| Chr20：52786219 | rs2296241 | G | G | G |
Claims (10)
1.一种检测胎儿核酸样本中是否含有母体核酸的方法，所述母体核酸来自怀有所述胎儿的母亲，所述方法包括以下步骤，
(a)获得所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本，所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本各自包含DNA片段，以及任选的获得父本核酸样本，所述父本核酸样本来自所述胎儿的父亲，所述父本核酸样本包含DNA片段；
(b)分别检测所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的与以下21个参考SNP中的至少21个对应的位点的碱基类型：rs1057079、rs3890011、rs13007735、rs10172036、rs2516835、rs1656922、rs2686817、rs11167136、rs70156、rs2275111、rs2293277、rs2292681、rs3742302、rs4981088、rs11737、rs7169981、rs3115438、rs2302836、rs1455556、rs2235862和rs2296241，任选的，检测所述父本核酸样本中的DNA片段中的与所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的所述位点对应的位点的碱基类型；
(c)基于比较(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及任选的所述父本核酸样本中的DNA片段中的对应于所述参考SNP的位点的碱基类型的差异，判断所述胎儿核酸样本中是否含有所述母体核酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于，(b)步骤中的位点的碱基类型的检测包括，
利用单核苷酸引物延伸法获得包含所述位点的延伸产物，以及，
检测所述延伸产物，获得所述位点的碱基类型。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，(b)步骤中的位点的碱基类型的检测包括，
利用第一引物，分别扩增所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及任选的所述父本核酸样本中的含有与所述参考SNP对应的位点的DNA片段，获得胎儿扩增产物和母体扩增产物和任选的父本扩增产物；
利用第二引物分别结合所述胎儿扩增产物和所述母体扩增产物和任选的所述父本扩增产物，各自延伸一个碱基，对应获得胎儿延伸产物和母体延伸产物和任选的父本延伸产物；
基于所述胎儿延伸产物和所述母体延伸产物各自与所述第二引物的分子量差异，任选的基于所述父本延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述胎儿核酸样本、所述母体的核酸样本和任选的所述父本核酸样本中的所述位点的碱基类型。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述胎儿延伸产物和所述母体延伸产物和任选的所述父本延伸产物的3’端都为所述位点。
5.权利要求4的方法，其特征在于，当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1057079时，所述第一引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述第二引物为SEQ ID NO:3；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3890011时，所述第一引物为SEQ ID NO:4和SEQID NO:5，所述第二引物为SEQ ID NO:6；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs13007735时，所述第一引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，所述第二引物为SEQ ID NO:9；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs10172036时，所述第一引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，所述第二引物为SEQ ID NO:12；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2516835时，所述第一引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述第二引物为SEQ ID NO:15；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1656922时，所述第一引物为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述第二引物为SEQ ID NO:18；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2686817时，所述第一引物为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，所述第二引物为SEQ ID NO:21；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11167136时，所述第一引物为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，所述第二引物为SEQ ID NO:24；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs70156时，所述第一引物为SEQ ID NO:25和SEQID NO:26，所述第二引物为SEQ ID NO:27；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2275111时，所述第一引物为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，所述第二引物为SEQ ID NO:30；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2293277时，所述第一引物为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，所述第二引物为SEQ ID NO:33；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2292681时，所述第一引物为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，所述第二引物为SEQ ID NO:36；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3742302时，所述第一引物为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，所述第二引物为SEQ ID NO:39；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs4981088时，所述第一引物为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，所述第二引物为SEQ ID NO:42；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11737时，所述第一引物为SEQ ID NO:43和SEQID NO:44，所述第二引物为SEQ ID NO:45；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs7169981时，所述第一引物为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，所述第二引物为SEQ ID NO:48；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3115438时，所述第一引物为SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，所述第二引物为SEQ ID NO:51；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2302836时，所述第一引物为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53，所述第二引物为SEQ ID NO:54；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1455556时，所述第一引物为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，所述第二引物为SEQ ID NO:57；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2235862时，所述第一引物为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59，所述第二引物为SEQ ID NO:60；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2296241时，所述第一引物为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，所述第二引物为SEQ ID NO:63。
6.权利要求1-5任一方法，其特征在于，(b)步骤中的位点的碱基类型的检测利用质谱进行。
7.权利要求6所述方法，其特征在于，(c)步骤包括，
基于比较(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本中的DNA片段中的对应于相同所述参考SNP的位点的碱基类型的差异，当任一所述位点在所述胎儿核酸样本和在所述母体的核酸样本中的碱基类型符合以下至少之一，则判定所述胎儿核酸样本含有所述母体核酸，
(i)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也为所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，
(ii)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中为所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基，
(iii)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中为所述两种类型碱基之一以及另一种与其不等量的碱基。
8.权利要求6所述方法，其特征在于，(c)步骤包括，
基于(b)步骤中检测的所述胎儿核酸样本和所述母体的核酸样本以及所述父本核酸样本中的DNA片段中的对应于相同所述参考SNP的位点的碱基类型，判断所述胎儿核酸样本的所述位点的碱基类型是否符合孟德尔遗传规律，
(1)当任一所述位点的碱基类型符合孟德尔遗传规律且该位点符合(i)、(ii)和(ii)至少之一，和/或，
(2)当任一所述位点的碱基类型不符合孟德尔遗传规律且该位点符合(iv)和(v)至少之一，
则判定所述胎儿核酸样本含有所述母体核酸，
(i)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也为所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，
(ii)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中为所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基，
(iii)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中为所述两种类型碱基之一以及另一种与其不等量的碱基，
(iv)在所述母体的核酸样本中为两种类型碱基且所述两种类型碱基等量，在所述胎儿核酸样本中也包含所述两种类型碱基且所述两种类型碱基不等量，
(v)在所述母体的核酸样本中为一种类型碱基，在所述胎儿核酸样本中包含所述一种类型碱基以及另一种与其不等量的碱基。
9.一种试剂盒，其包括引物对，每对所述引物对包含第一引物和第二引物，所述引物对能够用以检测与以下21个参考SNP中的至少21个对应的位点的碱基类型：rs1057079、rs3890011、rs13007735、rs10172036、rs2516835、rs1656922、rs2686817、rs11167136、rs70156、rs2275111、rs2293277、rs2292681、rs3742302、rs4981088、rs11737、rs7169981、rs3115438、rs2302836、rs1455556、rs2235862和rs2296241。
10.权利要求9的试剂盒，其特征在于，当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1057079时，所述第一引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述第二引物为SEQ ID NO:3；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3890011时，所述第一引物为SEQ ID NO:4和SEQID NO:5，所述第二引物为SEQ ID NO:6；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs13007735时，所述第一引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，所述第二引物为SEQ ID NO:9；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs10172036时，所述第一引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，所述第二引物为SEQ ID NO:12；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2516835时，所述第一引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述第二引物为SEQ ID NO:15；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1656922时，所述第一引物为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述第二引物为SEQ ID NO:18；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2686817时，所述第一引物为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，所述第二引物为SEQ ID NO:21；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11167136时，所述第一引物为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，所述第二引物为SEQ ID NO:24；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs70156时，所述第一引物为SEQ ID NO:25和SEQID NO:26，所述第二引物为SEQ ID NO:27；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2275111时，所述第一引物为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，所述第二引物为SEQ ID NO:30；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2293277时，所述第一引物为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，所述第二引物为SEQ ID NO:33；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2292681时，所述第一引物为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，所述第二引物为SEQ ID NO:36；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3742302时，所述第一引物为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，所述第二引物为SEQ ID NO:39；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs4981088时，所述第一引物为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，所述第二引物为SEQ ID NO:42；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs11737时，所述第一引物为SEQ ID NO:43和SEQID NO:44，所述第二引物为SEQ ID NO:45；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs7169981时，所述第一引物为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，所述第二引物为SEQ ID NO:48；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs3115438时，所述第一引物为SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，所述第二引物为SEQ ID NO:51；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2302836时，所述第一引物为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53，所述第二引物为SEQ ID NO:54；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs1455556时，所述第一引物为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，所述第二引物为SEQ ID NO:57；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2235862时，所述第一引物为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59，所述第二引物为SEQ ID NO:60；
当所述位点为对应所述参考SNP中的rs2296241时，所述第一引物为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，所述第二引物为SEQ ID NO:63。
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