CN110452969B - 一种基于kasp的大鼠遗传质量监控snp标记分型方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒，所能够检测的SNP位点包括48个：覆盖了大鼠20条常染色体和X性染色体，每条染色体上至少选择2个SNP位点，近交大鼠品系两两之间至少有5个SNP位点用于区分，该方法还包括针对大鼠SNP标记设计的KASP引物组和KASP预混液。根据本发明所述方法可以有效快速区分常见近交系大鼠品系，并可对近交系大鼠的遗传纯合度或遗传污染进行有效检测，对封闭群大鼠的遗传多样性进行快速检测以及对未知来源的大鼠进行溯源，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒。
背景技术
在生物医学研究中，实验动物的遗传质量是衡量其品质好坏的重要因素，利用遗传特性稳定的实验动物才能保证实验结果具有参考价值和可比性。《常用品系大鼠的基因组及SNP遗传标记分析》（华南理工大学，工程硕士论文，2018年4月）中提到对其进行定期的遗传检测是必不可少的：近交系动物同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善的特点，检测近交系动物的纯合度和遗传污染情况，为保证科学研究实验结果的可靠、稳定及完整提供了依据；封闭系动物个体具有遗传杂合性，个体间具有遗传多样性和差异性，从而类似人类群体遗传异质性遗传组成，在人类遗传研究，药物筛选、毒理实验、生物制品和化学制品的鉴定等方面起着不可替代的作用；目前封闭群动物普遍缺乏遗传检测方法和标准，我国封闭群大鼠的遗传质量主要是在繁育环节进行控制，然而生产管理与繁育方式的实际效果如何却无法进行评估，因此，需要定期的遗传检测对其生产管理及繁育方式等作出反馈及调整是必需的。
生化标记基因检测、免疫标记基因检测以及毛色基因检测等传统的遗传质量检测方法存在着精确度不高以及检测标记少等局限性，这些检测方法已不再满足科学发展的需要。随着基因组学研究的不断进步，SNP标记开始逐渐被应用于各种实验动物的鉴定及遗传检测中，相比于传统的遗传质量检测方法，利用SNP标记具有操作简单快速、能鉴别出同源品系以及能进行大规模高通量检测的显著优点。
传统的SNP检测方法如DNA测序、RFLP、SSCP、ASO等操作复杂，易出错；Taqman方法、质谱分析、DNA芯片、SNaPshot法等有着高效快速的优点，但需要投入昂贵设备或者高成本的试剂，也难以普及应用。
KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于高通量SNP分型，尤其在样本量大，SNP标记少时，KASP的应用特点最为显著。KASP在小到中等数量的标记应用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性。但KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA变异、多态性等因素，标记开发的成功率较低。
CN109022592 A公布了一种针对4种大鼠常用品系Wistar、GK、BN、SD的13个SNP标记，选择的SNP标记采用高通量测序及生物信息分析等技术开发的能用于快速鉴定四种常用品系 ( Wistar、GK、BN、SD )大鼠的SNP标记，所用的SNP检测技术为一代测序，方法繁琐，价格昂贵，不易于自动化应用。
国内外对大鼠SNP遗传分析尚处于研究阶段，检测方法主要有二代测序、普通PCR结合Sanger测序、PCR-LDR等。因此，提供一种基于KASP的SNP分子标记分型技术，可以在快速鉴别大鼠遗传质量。
本发明建立的大鼠基因型鉴别技术可以快速准确区分常见近交系大鼠品系，并可对近交系大鼠的遗传纯合度或遗传污染进行有效检测，对封闭群大鼠的遗传多样性进行快速检测以及对未知来源的大鼠进行溯源，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
发明内容
为解决现有技术的上述问题，本发明筛选了用于大鼠遗传质量监控的SNP标记，并基于SNP标记设计了KASP引物组及KASP反应体系和条件，并将所述引物组应用于在大鼠遗传质量监控中。
本发明的目的在于提供一种用于区分大鼠近交系的SNP标记分型方法，能够有效快速区分常见近交系大鼠品系，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
本发明另一目的在于提供一种检测大鼠近交系遗传纯合度的SNP标记分型方法，用于排除繁殖过程中的遗传污染以及检测大鼠近交系的遗传纯合度，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
本发明的另一目的在于提供一种未知近交系大鼠溯源的SNP标记分型方法，能够根据SNP标记分型对其来源进行鉴定，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
本发明的另一目的在于提供一种封闭系大鼠遗传多样性检测的SNP标记分型方法，能够对封闭群动物的遗传质量进行有效的控制，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
本发明的另一目的在于提供一种用于大鼠遗传质量监控的SNP标记分型试剂盒，可鉴别48个SNP位点的任何一个或多个，包括KASP引物组以及优化的KASP反应体系，其设计巧妙，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于大鼠遗传质量监控SNP标记，相关信息如表1所示：
表1 大鼠48个SNP标记相关信息
表1中的SNP位置是基于NCBI Genome Data Viewer选取的。
优选的，SNP标记的开发方法如下：常用近交系大鼠品系两两之间至少有5个SNP标记可以用来检测；覆盖所有的20条常染色体和X染色体，每条染色体上至少选取2个SNP标记，染色体较长的适当增加SNP标记数量，使各标记可以相互验证，减少抽样误差。
优选的，可根据实验需要对所需检测的SNP标记数进行调整、自由组合。
进一步的，根据所述SNP标记的侧翼序列设计KASP引物组，引物组为两条等位基因特异性正向引物和一条通用反向引物。其中，KASP引物组是基于Rattus norvegicus RGSC6.0/rn6 genome序列设计的；上游引物1中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT序列为FAM荧光基团；下游引物2中的GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列为HEX荧光基团，引物组具体信息如表2所示：
表2 针对SNP标记的KASP引物组序列表
本发明提供的基于KASP的SNP标记分型方法操作简单，将所述的KASP引物组和KASP Master Mix加入到含有DNA样本的PCR反应板中，进行PCR扩增，最终结果使用荧光检测仪进行分型即可。
本发明还提供所述基于KASP的SNP标记分型的具体方法，可鉴别48个SNP位点的任何一个或多个，包括以下步骤：
1. 样本收集：无菌采集鼠尾1-2 cm或大鼠安乐死后，无菌采集肾脏、肝脏、肺脏等组织；优选的，-20℃冻存备用；
2. DNA提取：每个动物取30 mg组织样本，提取DNA；优选的，使用组织基因组DNA提取试剂盒进行提取；优选的，-20℃冻存备用；
3. KASP反应体系：2×KASP预混液、KASP引物组混合液和步骤2所述DNA，优选的，2×KASP预混液为KASP Master Mix，优选的，DNA浓度为10ng/µL;
4. KASP反应条件：94℃预变性15 min；94℃ 20 s，退火温度61℃，每个循环降0.6℃，1 min，循环10次；94℃ 20 s，退火温度55℃ 1 min，循环26次；94℃ 20 s，退火温度57℃ 1 min，循环12次； 30℃ 30 s，PCR仪读取FAM和HEX荧光信号，分析结果。
进一步的，可对常用大鼠近交品系进行分型，使用本发明所述的方法进行检测，根据不同SNP标记的分型，判断近交系大鼠的品系。
优选的，可对以下12种近交系大鼠进行分型，所述近交系大鼠为ACI、BUF、LEC、SHR、BB、Dahl、Lewis、WF、BN、F344、RCS和WKY。
进一步的，可对常用大鼠近交品系进行遗传纯合度检测以及遗传污染检测，使用本发明所述的方法进行检测，根据不同SNP标记的分型，判断近交系大鼠的纯合度或遗传污染情况。
优选的，可对以下12种近交系大鼠进行遗传纯合度检测以及遗传污染检测，所述近交系大鼠为ACI、BUF、LEC、SHR、BB、Dahl、Lewis、WF、BN、F344、RCS和WKY。
进一步的，可对常用大鼠封闭群遗传多样性监测，具体步骤为：取一定数量的封闭群大鼠根据本发明所述方法进行检测，可以根据实验需要去除一些SNP标记，实验结果为某些SNP标记会表现为一种纯合型；而某些SNP标记表现出多态性，表现为杂合型和一种纯合型；某些SNP标记表现为杂合型和两种纯合型，通过对这些数据的分析，计算Shannon指数（I）和Nei基因多样性指数，检测封闭群的质量。
优选的，可对以下2种封闭群，SD和Wistar，进行遗传多样性检测。
进一步的，可对未知来源的近交系大鼠进行溯源，使用本发明所述的检测方法进行检测，根据不同SNP标记的分型，判断近交系大鼠的亲本来源。
本发明的方法具有直观性，自动和批量化，结论准确，时间和经济成本低，还具有一定的灵活性，可实现对大鼠遗传质量的高通量检测。
附图说明
图1为4个近交系大鼠在rs8161747位点的KASP检测分型图，正方形聚集点为FAM荧光信号，识别的是rs8161747 位点的T碱基；圆形聚集点为HEX荧光信号，识别的是rs8161747 位点的C碱基；菱形点是空白对照，无荧光信号未识别到T或C碱基，根据表2中信息判断，圆形聚集点的样品为BN大鼠。
图2为4个近交系大鼠在18个SNP标记的KASP检测分型图，正方形聚集点为FAM荧光信号，识别的是本发明所述上游引物1所示碱基类型；圆形聚集点为HEX荧光信号，识别的是本发明所述上游引物2所示碱基类型；菱形点是空白对照，未识别到荧光信号，可以得知，4个近交系大鼠在所示的18个SNP标记都为纯合子，可以判定所检测的近交系大鼠纯合度高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在对封闭系大鼠SNP标记研究时，通常利用POPEGEN version 1.32遗传分析软件对表现为群体多态性的几个SNP标记进行数据分析，对群体的Hardy-Weinberg检验中，对某些SNP标记上X2值，自由度（df）和且P>0.05时的临界值计算，判定各个标记的调查结果其观察值与期望值之间是否符合Hardy-Weinberg平衡，进而反应该封闭系大鼠的质量；此外，还可以通过Nei基因多样性指数和Shannon 指数（I）用来评价封闭群内的遗传多样性；其中Shannon’s信息指数（SI）描述种群中个体的紊乱和不确定性，不确定性较高，多样性也就较高，Nei基因多样性指数反映种群的基因多样性程度。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得；若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议条件。
实施例1
本发明提供了一种大鼠遗传质量监控的SNP标记，基于NCBI SNP数据库进行筛选和定位，并开发相应的KASP引物组。
本发明中SNP标记的筛选确定，根据以下特征进行：常用近交系大鼠品系两两之间至少有5个SNP标记可以进行区分；覆盖所有的20条常染色体和X染色体，每条染色体上至少选取2个SNP标记，染色体较长的适当增加SNP标记数量，使各标记可以相互验证，减少抽样误差；标记越多检测到突变或者遗传漂移的几率越大。因此，从符合要求的容易区分各种品系的大鼠SNP标记中进行了优化组合得到本发明所述的48个SNP标记，具体信息见表1。
实施例2
根据实施例1所述48个SNP标记，针对每个标记用Primer 3在线引物设计软件设计相应的KASP引物组，引物组为两条等位基因特异性正向引物和一条通用反向引物，具体序列信息见表2，其中，KASP引物组是基于Rattus norvegicus RGSC 6.0/rn6 genome序列设计的；上游引物1中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT序列为FAM荧光基团；下游引物2中的GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列为HEX荧光基团。
实施例3
根据本发明所述方法对4种常见近交系大鼠分型，4种常见近交系大鼠在48个SNP标记碱基信息具体见表3：
表3 四种常见近交系大鼠48个SNP标记碱基信息
具体检测步骤如下：
1. 样本收集: 样本为4个近交大鼠品系，F344，LEWIS, BN, Wistar，每个品系各2只。将大鼠安乐死后，无菌采集鼠尾1-2 cm、肾脏、肝脏、肺脏等组织，-20℃冻存备用；
2. 基因组DNA提取：每个动物取30 mg左右组织样本，参照组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP304）说明书提取基因组DNA，-20℃冻存备用；
3. 配制10µLKASP反应体系：2×KASP Master Mix5 µL（KBS-1016-001）；0.14 µLKASP引物组混合液，其中，上游引物1浓度为12 µM，上游引物2浓度为12 µM，下游引物浓度为15 µM；将步骤2中提取得到的基因组DNA稀释至10 ng/µL，补足余量；
4. 进行KASP反应：94℃预变性15 min；94℃ 20 s，61℃1 min，退火温度每个循环降0.6℃，10个循环；94℃ 20 s，55℃ 1 min，26个循环；94℃ 20 s，57℃ 1 min，12个循环；30℃ 30 s，在QPCR仪上读取FAM和HEX荧光信号；
5. 结果分析：将得到的FAM和HEX信号与表2和表3所示信息进行比对，可以得知所检测样品的品系。如图1所示rs8161747位点的分型情况，正方形聚集点为FAM荧光信号，识别的是T碱基，圆形聚集点为HEX荧光信号，识别的是C碱基；根据表1可知，在rs8161747位点为C碱基的是BN大鼠。
实施例4
本发明提供了一种4种常见大鼠近交系遗传纯合度的检测方法，4种常见近交系大鼠中48个SNP标记碱基信息具体见表3。
包括以下步骤：
1. 样本收集: 样本为4种常见近交大鼠品系，F344，LEWIS, BN, Wistar，每个品系各2只。将大鼠安乐死后，无菌采集鼠尾1-2 cm、肾脏、肝脏、肺脏等组织，-20℃冻存备用；
2. 基因组DNA提取：每个动物取30 mg左右组织样本，参照组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP304）说明书提取核酸，-20℃冻存备用；
3. 配制10µLKASP反应体系：2×KASP Master Mix5 µL（KBS-1016-001）；0.14 µL各KASP引物组混合液，其中，上游引物1浓度为12 µM，上游引物2浓度为12 µM，下游引物浓度为15 µM；10 ng/µL的DNA补足余量；
4. 进行KASP反应：94℃预变性15 min；94℃ 20 s，61℃1 min，退火温度每个循环降0.6℃，10个循环；94℃ 20 s，55℃ 1 min，26个循环；94℃ 20 s，57℃ 1 min，12个循环；30℃ 30 s，在QPCR仪上读取FAM和HEX荧光信号；
结果分析：我们对48个SNP标记都进行了实验，结果发现本申请选用的4中大鼠近交系的48个SNP标记均为纯合子，说明选用的4种大鼠近交系纯合度高。因在一个常规PCR反应板仅有96个孔，4个样品的48个位点至少需要分3次实验进行，48个位点的分型图无法体现在同一个图片上，因此，我们只展示了其中18个位点的分型图，具体使用的引物序列信息如表4所示：
表4 所展示的18个SNP标记及相关引物信息
本发明选取的48个SNP标记，常用近交系大鼠两两品系之间至少有5个SNP标记可以进行区分，覆盖所有的20条常染色体和X染色体，每条染色体上至少选取2个SNP标记，染色体较长的适当增加SNP标记数量，可根据不同的实验需求，调整所使用的SNP标记数量。根据本发明所述方法可以有效快速区分常见近交系大鼠品系，并可对近交系大鼠的遗传纯合度或遗传污染进行有效检测，对封闭群大鼠的遗传多样性进行快速检测以及对未知来源的大鼠进行溯源。
另外需要说明的是，本发明上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，可以应用于不同的大鼠遗传质量监控实验中，根据选择样本和实验目的不同，达到不同的效果，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州西山生物技术有限公司
<120> 一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒
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gaaggtgacc aagttcatgc tcagtcaaat tagtttctct tct 43
<210> 29
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaaggtcgga gtcaacggat tcagtcaaat tagtttctct tcg 43
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagctggttt ccttgttttg 20
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaaggtgacc aagttcatgc tcacacgtga ctccaagaaa 40
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaggtcgga gtcaacggat tcacacgtga ctccaagaat 40
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agctcaagtt ctaagctgac 20
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaggtgacc aagttcatgc tgttattagt ttcacatttc tta 43
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat tgttattagt ttcacatttc ttg 43
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agcacaatac atcattacaa 20
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaaggtcgga gtcaacggat taatgacttt aatatcttac gtcagctaga t 51
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
taacagaatg tacagaacca ttacggctt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaaggtcgga gtcaacggat tgcgaattaa ggtctgagaa cc 42
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggcattcaga gggtcat 17
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaaggtcgga gtcaacggat taggcaccgg cttaaattct tactag 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aaagggcata tctgaaaact gccatcta 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gaaggtgacc aagttcatgc tagttggctt ctttgaat 38
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gaaggtcgga gtcaacggat tagttggctt ctttgaac 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gcattatgtg attgcttctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaaggtcgga gtcaacggat tgttttccaa tgcgactggg aca 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agtctcatgc cctgtgtaga cacta 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gaaggtgacc aagttcatgc tcgcattttc ttctctgtct 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcttgtccc ctccctgact ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaaggtgacc aagttcatgc tgggattgat tggcatagac ca 42
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gaaggtcgga gtcaacggat tggattgatt ggcatagacc g 41
<210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttgtggtca ggcagca 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gaaggtcgga gtcaacggat taacaagccg ctggtttatg tctac 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcagacagc aagttggggg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
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<210> 65
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gaaggtcgga gtcaacggat tcacccaccc gtaattcc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgtttctg ctttgct 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gaaggtcgga gtcaacggat tatctttaca aaaccagata gattcaactg t 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
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<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gaaggtcgga gtcaacggat tcaggcgttc agtggaccac 40
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atttcaggaa gtggggag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gaaggtcgga gtcaacggat tggataagta cgctgcctgc c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gttcagcctc tagcacctcc tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gaaggtgacc aagttcatgc ttgtagcgag cacactcctt 40
<210> 77
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gaaggtcgga gtcaacggat ttgtagcgag cacactcctc 40
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ttaacaagtg cgctgacc 18
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gaaggtgacc aagttcatgc tgcccacaca cattttggca gac 43
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gaaggtcgga gtcaacggat tggcccacac acattttggc agat 44
<210> 81
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gtctatataa tgtgtggggc tcattgaa 28
<210> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gaaggtgacc aagttcatgc ttctttgtgg tgatgca 37
<210> 83
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
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<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
taacggcgtc agaacca 17
<210> 85
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
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<210> 86
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gaaggtcgga gtcaacggat tgaatccaga tgacctcaga cag 43
<210> 87
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gcccacattt cagtccagct ttcat 25
<210> 88
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gaaggtgacc aagttcatgc taaccatctg ctgtacccca 40
<210> 89
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gaaggtcgga gtcaacggat tccatctgct gtaccccg 38
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cagaactacc tcccttta 18
<210> 91
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gaaggtgacc aagttcatgc tgttcagtct tactaaaagg atcgtcttt 49
<210> 92
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gaaggtcgga gtcaacggat tcagtcttac taaaaggatc gtcttc 46
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gatggctccg tccagctctc at 22
<210> 94
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gaaggtgacc aagttcatgc tcgcagagaa atgtgtccaa t 41
<210> 95
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gaaggtcgga gtcaacggat tcgcagagaa atgtgtccaa c 41
<210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gcagtcaccc acccttt 17
<210> 97
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
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<210> 98
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gaaggtcgga gtcaacggat tgagatcaca aatggctatc tgatgc 46
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
cctgcttctg ccaaaactgc atacaa 26
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gaaggtgacc aagttcatgc tggcgtatgg ctgtatgtt 39
<210> 101
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gaaggtcgga gtcaacggat tggcgtatgg ctgtatgtg 39
<210> 102
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tgatggcctg aggtgtt 17
<210> 103
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gaaggtgacc aagttcatgc tacgaggaca aattaaacaa gaggact 47
<210> 104
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gaaggtcgga gtcaacggat tcgaggacaa attaaacaag aggacc 46
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ctgtctcctc agccaatcag atgtt 25
<210> 106
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gaaggtgacc aagttcatgc tgcagacttc tctctttggt t 41
<210> 107
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
gaaggtcgga gtcaacggat tgcagacttc tctctttggt g 41
<210> 108
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
acctctactc tgtggga 17
<210> 109
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
gaaggtgacc aagttcatgc tcccaccaga gactgttccc att 43
<210> 110
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gaaggtcgga gtcaacggat tccaccagag actgttccca tg 42
<210> 111
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
acagcccttg ctggtggctg at 22
<210> 112
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gaaggtgacc aagttcatgc ttccccagtc caccccagt 39
<210> 113
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gaaggtcgga gtcaacggat ttccccagtc caccccagc 39
<210> 114
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cacgagtgtc ccaccttcc 19
<210> 115
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gaaggtgacc aagttcatgc tgggacttaa ggtggcagag tg 42
<210> 116
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gaaggtcgga gtcaacggat tggggactta aggtggcaga gta 43
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ggctccatta tataatttaa actgatccaa 30
<210> 118
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gaaggtgacc aagttcatgc tgcaactcca gtccctcaca 40
<210> 119
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gaaggtcgga gtcaacggat tgcaactcca gtccctcacg 40
<210> 120
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tagggtgggc agcagag 17
<210> 121
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gaaggtgacc aagttcatgc tcataagaca acacacaaac aa 42
<210> 122
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gaaggtcgga gtcaacggat tcataagaca acacacaaac ag 42
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gagaaaccta agaccctcac 20
<210> 124
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gaaggtgacc aagttcatgc tgggatacag ggttgaccat 40
<210> 125
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gaaggtcgga gtcaacggat tgggatacag ggttgaccac 40
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ctctgtcctc caggttgctg 20
<210> 127
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gaaggtgacc aagttcatgc tgaataaagc caagtgcat 39
<210> 128
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
gaaggtcgga gtcaacggat tgaataaagc caagtgcac 39
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
tccccacaag actcactttt 20
<210> 130
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
gaaggtgacc aagttcatgc tggcagcaac cagatagata 40
<210> 131
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gaaggtcgga gtcaacggat tggcagcaac cagatagatg 40
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
agggacagtg gtggcaatta 20
<210> 133
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gaaggtgacc aagttcatgc tcagccataa acctagattc at 42
<210> 134
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
gaaggtcgga gtcaacggat tcagccataa acctagattc ac 42
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
ttcttggtag cacatcag 18
<210> 136
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gaaggtgacc aagttcatgc tctgagtgtt cttgctccca 40
<210> 137
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gaaggtcgga gtcaacggat tctgagtgtt cttgctcccg 40
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
ctagcttttg tctctgcgtt 20
<210> 139
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gaaggtgacc aagttcatgc tgcagtaaat cccagaccat 40
<210> 140
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
gaaggtcgga gtcaacggat tgcagtaaat cccagaccac 40
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
caccccatcc aaggtacaga 20
<210> 142
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
gaaggtgacc aagttcatgc ttcatgcttc aagatatccc t 41
<210> 143
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
gaaggtcgga gtcaacggat ttcatgcttc aagatatccc c 41
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tgcaagtttg gtgatccgt 19
Claims (1)
1.用于扩增rs8161747位点的引物在F344、LEWIS、BN、Wistar四种大鼠SNP标记分型上的应用，其特征在于：所述的rs8161747位点标记信息为：位于1号染色体上RGSC6.0/rn6 第59715538bp；等位基因为C/T；
用于扩增rs8161747位点的引物包括两条等位基因特异性上游引物，分别为上游引物1和上游引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，还包括一条通用下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
上游引物1和上游引物2分别有FAM和HEX荧光信号识别区；
应用方法包括以下步骤：
（1）.样本收集：样本为4个近交大鼠品系：F344、LEWIS、BN、Wistar，每个品系各2只，将大鼠安乐死后，无菌采集鼠尾1-2cm、肾脏、肝脏、肺脏等组织，-20℃冻存备用；
（2）.基因组DNA提取：每个动物取30mg左右组织样本，参照组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，-20℃冻存备用；
（3）.配制10μL KASP反应体系：2×KASP Master Mix 5μL；0.14μL KASP引物组混合液，其中，上游引物1浓度为12μM，上游引物2浓度为12μM，下游引物浓度为15μM；将步骤（2）中提取得到的基因组DNA稀释至10ng/μL，补足余量；
（4）.进行KASP反应：94℃预变性15min；94℃20s，61℃1min，退火温度每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s，55℃1min，26个循环；94℃20s，57℃1min，12个循环；30℃30s，在QPCR仪上读取FAM和HEX荧光信号；
（5）.将得到的FAM和HEX信号与F344、LEWIS、BN、Wistar品系大鼠位于1号染色体上的rs8161747位点对应的碱基T、T、C、T进行比对，在rs8161747位点为C碱基的是BN大鼠。
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