CN110622920A

CN110622920A - 一种纯黑毛色猪种的选育方法

Info

Publication number: CN110622920A
Application number: CN201911066191.0A
Authority: CN
Inventors: 顾以韧; 杨跃奎; 梁艳; 杨雪梅; 陶璇; 钟志君; 王言; 雷云峰; 张金灵; 吕学斌; 何志平; 曾凯; 陈晓晖; 龚建军; 应三成
Original assignee: Sichuan Animal Science Academy
Current assignee: Sichuan Animal Science Academy
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2019-12-31
Also published as: CN112813177A

Abstract

本发明提供了一种纯黑毛色猪种的选育方法，主要是对父本和/或母本猪种的特定位点进行检测（MC1R*31基因的708bp位点、730bp位点、788bp位点），通过判断基因型，从而判准确预测后代猪毛色，得到纯黑毛色后代。

Description

一种纯黑毛色猪种的选育方法

技术领域

本发明涉及猪遗传育种领域，特别是涉及一种生产黑色后代种猪或商品猪快速分子选育方法。

背景技术

过去几十年对猪的遗传改良主要集中在提高生长速度和增加瘦肉率等胴体性能，忽略了对猪肉质品质的改良，从而导致了在猪胴体性能大幅度提高的同时，肉质急剧下降，口感变差。随着社会经济的发展，人民生活水平的提高和消费观念的转变，猪肉的消费群体和市场结构也发生了明显变化，对肉质好、风味佳的优质猪肉产品需求量与日俱增。

我国地方猪种具有肉质好、风味佳、抗逆性强等优点，是打造优质精品猪肉的良好素材，更是开发极品猪肉的优势资源。此外，我国绝大多数地方猪种皮毛均为黑色，而我国消费者对黑猪肉具有一种与生俱来的青睐感，因为目前市场上的优质黑猪往往多是含有我国地方猪种血源的杂交猪，相比引进的外种猪具有更好的肉质和口感，售价也比外种猪肉更高，即使在国际市场上，日本和中国台湾黑猪肉价格也明显高于洋三元。市场需求决定育种目标，因此，利用国内外两类基因资源，培育优质高效、适应不同市场需求的专门化品系并配套生产黑色优质风味猪成为猪育种领域的主攻目标。

然而，很多黑色的专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中后代会出现明显毛色分离，如川藏黑猪配套系商品猪就会出现一定比例的黑黄毛色分离，而消费者第一印象是感官，毛色分离会使消费者产生心理排斥，从而影响产品经济价值。后代种猪或商品猪毛色分离已成为黑色的专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中一个“卡脖子”关键技术问题。

常规育种对猪毛色的选育是横交固定后通过持续的世代选育逐渐剔除后代中毛色出现分离的个体，从而使黑色逐渐固定。但这种传统的育种技术周期长，通常需6~8个世代甚至更长时间才能固定育种材料后代的预期毛色，且预见性差，只能在后代出生后才能根据毛色表型进行选择，不能对后代毛色分离情况进行准确预测，效率低，成本高，这就严重影响和制约了专门化品系选育和新品种（配套系）育种进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯黑毛色猪种的选育方法，以一种效率高，成本低，耗时短的方法准确预测后代猪毛色，得到纯黑毛色后代。

针对专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中广泛用于父本的杜洛克和巴克夏外种猪在与我国地方猪（黑色）或含有地方猪血源的黑色母本新品种/品系进行杂交育种时后代会发生明显的毛色分离现象，本发明通过鉴定和筛选得到与种猪或商品猪毛色有因果关系的基因型，可应用于猪专门化品系选育和新品种（配套系）后代毛色的早期精确预测和选择，实现猪育种或商品猪生产过程中后代毛色的快速、定向、高效预测和选择。

具体第，本发明提供了一种纯黑毛色猪种的选育方法，该方法包括：

对父本和/或母本猪种的单倍型MC1R*31基因的708bp位点、730bp位点、788bp位点中的至少一个进行检测，判断是否符合以下情况的至少一种： 708bp位点为AA基因型，730bp位点为GG基因型，788bp位点为CC基因型；若符合，则选择作为父本和/或母本猪进行繁育。

其中，采用Snapshot技术进行位点检测。

所述单倍型MC1R*31的SNP的708bp位点等位基因A决定猪黑毛色，A对G呈显性。

所述单倍型MC1R*31的SNP的730bp位点等位基因G决定猪黑毛色，G对A呈显性。

所述单倍型MC1R*31的SNP的788bp位点等位基因C决定猪黑毛色，C对T呈显性。

检测方法中，引物如下：

外侧引物及有效序列至少包括如下之一：

；

内侧引物及有效序列至少包括如下之一：

本发明的有益效果是：本发明方法可精确预测专门化品系和新品种（配套系）后代毛色，与传统育种技术相比，可迅速缩短育种周期，降低种猪选育成本，提高后代种猪或商品猪毛色的一致性和经济价值。本发明填补我国猪品种背景快速、定向、通量筛选后代毛色方面的业界空白，推进优质风味黑猪种业自主创新，实现我省猪毛色育种从“传统育种”到定向、高效“精确育种”的跃升。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。以下所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

5个品种157个猪耳组织样本，并对不同组合的后代根据毛色表型抽样检测基因型，每种配套组合或毛色分离表型抽取10头，共100个样本，对耳组织样本提取DNA用于后续的Snapshot突变位点检测和分型。

实验

1、 DNA 标本***扩增

1.1 引物序列

引物名称引物序列长度

1.2 主要仪器

2720 thermal cycler（Applied Biosystems），板式离心机（5810R Eppendorf）

1.3 主要试剂

金牌绿酶 Mix （北京擎科新业生物技术有限公司）

1.4 实验步骤

PCR 反应：使用擎科金牌绿酶进行扩增：

金牌绿酶 Mix 45 µl

F Primer（10P） 2 µl

R Primer（10P） 2 µl

gDNA 1 µl

反应条件为：

98℃ 2min

98℃ 10s

60℃ 20s 35cycs

72℃ 10s

72℃ 1min

4℃ hold

2、模板 DNA 制备和引物设计

2.1 SNaPshot PCR 引物设计

上表引物中的有效序列如下：

2.2 主要仪器

2.3 主要试剂

SAP （New England Biolabs）， Exo I （New England Biolabs）

2.4 实验步骤

在 15 µL PCR 产物中加入 5 U SAP 和 2 U Exo I，震荡混匀， 37 °C 保

3、 SNaPshot PCR 制备和纯化

3.1 主要仪器

3.2 主要试剂

SNaPshot Multiplex Kit（Applied Biosystems）

3.3 实验步骤

（1）混合模板：如果以 PCR 产物作为 SNaPshot PCR 的模板，在纯化好

后，每种各取 3µL，混合。

（2） SNaPshot PCR：

PCR 循环条件为：

96℃ 10s

50℃ 5s 25cycs

60℃ 30s

4℃ hold

4、电泳样品制备

4.1 主要仪器

4.2 主要试剂

Hi-Di （Applied Biosystems），GeneScan-120 LIZ （Applied Biosystems）

4.3 实验步骤

首先将 SNaPshot 产物稀释 20 倍：

95 ℃变性 5 min →迅速冰冷 4 min。

、光谱校正

5.1 主要仪器

2720 thermal cycler（Applied Biosystems），偏振塞曼原子吸收光谱仪

ZA3700（日立）

5.2 主要试剂

Hi-Di （Applied Biosystems）

5.3 实验步骤

光谱校正(Spectral Calibration)

（1）DS-02（ E5）： dR110， dR6G， dTAMRA， dROX， LIZ。

（2）3700 光谱校正

6、毛细管电泳检测及数据分析

6.1 主要仪器及软件

3730xL DNA Analyzer （Applied Biosystems），GeneMapper v4.0（Applied

Biosystems）；

6.2 实验步骤

（1）使用 3730XL DNA Analyzer 对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。

检测环境条件：

实验室温度：18-25 ℃

毛细管长度：50 cm

加热炉温度：60 ℃

运行电压：15 KV

（2）使用 GeneMapper V4.0 对实验结果进行分析，结果使用 Sanger 测序

进行校正。

基因及检测位点如下：

Sus scrofa haplotype MC1R*31 melanocortin receptor 1 gene（GenBank:GQ900673.1）

421 ggacgatgcc tgtgcttggc ccggagagga ggctgctggc ttccctcagc tccgcA/G（位点1）cccc

481 cagccgcccc ccgcctcggg ctggccgcca accagaccaa ccagacgggc ccccagtgcc

541 tggaggtgtc cattcccgac gggctcttcc tcagcctggg gctggtgagc ctcgtggaga

601 acgtgctggt ggtggccgcc atcgccaaga accgcaacct gcactcgccc atgtactact

661 tcgtctgctg cctggccgtg tcggacctgc tggtgagcgt gagcaacA/G（位点2）tgctggagacgg

721 ccgtgctgcC/T（位点3）gctgctggag gcgggcgccc tggccgccca ggccgccgtggtgcagcagc

781 tggacaaC/T（位点4）gt catggacgtg ctcatctgcg gctccatggt gtccagcctctgcttcctgg

841 gcgccatcgc cgtggaccgc tacgtgtcca tcttctacgc gctgcgctac

注：上述基因中，“A/G”表示该位点的碱基可以是A或G中的一种。“C/T”同上。

在检测的4个位点中，位点1不符合毛色表型分离规律，位点2、位点3和位点4表现出了与毛色表型存在因果关系，具体结果如下。

（一） MC1R基因位点2（A/G）的检测

表1 5个品种位点2毛色检测结果

对于位点2，外种猪杜洛克猪和巴克夏猪均为GG基因型，地方猪种太湖猪和藏猪均为AA基因型，而利用外种猪和地方猪种资源经横交固定和持续世代选育培育而成的黑色父本新品种S06基因型为AA和AG。位点2的SNP突变与毛色存在因果关系，其中等位基因A决定黑毛色，A对G呈显性。

表2 不同品种杂交后代位点2毛色检测结果

对不同品种杂交后代毛色表型观察和位点2基因型检测结果表明：

（1）外种猪与地方猪种杂交（杜洛克X太湖猪，杜洛克X藏猪）后代均表现为黑色，基因型均为杂合型AG，表明黑色对杜洛克的黄色和巴克夏的六点白呈显性；

（2）地方猪种藏猪X太湖猪杂交后代毛色均为黑色，基因型均为纯合的AA；

（3）以地方猪的杂交后代（藏猪X太湖猪）为母本，与作为父本的外种猪杜洛克猪和巴克夏猪杂交，其后代毛色均为黑色，基因型均为杂合型的AG；

（4）黑色父本新品种S06目前正在进行毛色固定选育，其与藏猪×太湖猪种母猪杂交时毛色均为黑色，其中基因型为AA的个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型均为AA，而基因型为AG的个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型为AA和AG；

（5）基因型为AA的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色均为黑色，基因型分别为AA和AG，基因型为AG的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色出现明显分离，出现毛色分离的个体基因型均为GG；S06个体与巴克夏×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交后代毛色分离规律与其和杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交的毛色分离相同。

由此可知，对于位点2，在所有检测的品种和个体毛色分离表型上符合基因分离规律，选择黑色纯合基因型AA个体可在专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中快速固定后代毛色，或选择亲本一方是纯合型黑色种猪个体进行杂交生产黑色后代商品猪而不发生毛色分离。

（二）MC1R基因位点3（A/G）的检测

表3 5个品种/品系位点3毛色检测结果

对于位点3，实际检测到的并非序列中的C/T突变，而是A/G突变。该位点（A/G突变）作为影响后代毛色的SNP位点，可能是该群体长期世代选育过程中向后代毛色的偏好性定向选择的结果，而NCBI库中的序列突变的获得样本个体一般不会存在此现象。外种猪杜洛克猪和巴克夏猪均为AA基因型，地方猪种太湖猪和藏猪均为GG基因型，而黑色父本新品种S06基因型为GG和GA。位点3的SNP突变与毛色存在因果关系，其中等位基因G决定黑毛色，G对A呈显性。

表4 不同品种杂交后代位点3毛色检测结果

对不同品种杂交后代毛色表型观察和位点3基因型检测结果表明：

（1）外种猪与地方猪种杂交（杜洛克X太湖猪，杜洛克X藏猪）后代均表现为黑色，基因型均为杂合型GA；

（2）地方猪种藏猪X太湖猪杂交后代毛色均为黑色，基因型均为纯合的GG；

（3）以地方猪的杂交后代（藏猪X太湖猪）为母本，与作为父本的外种猪杜洛克猪和巴克夏猪杂交，其后代毛色均为黑色，基因型均为杂合型的GA；

（4）黑色父本新品种S06与藏猪×太湖猪种母猪杂交时毛色均为黑色，其中基因型为GG的S06个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型均为GG，而基因型为GA的个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型为GG和GA；

（5）基因型为GG的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色均为黑色，基因型分别为GG和GA，基因型为GA的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色出现明显分离，出现毛色分离的个体基因型均为AA；S06个体与巴克夏×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交后代毛色分离规律与其和杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交的毛色分离相同。

由此可知，对于位点3，在所有检测的品种和个体毛色分离表型上符合基因分离规律，选择黑色纯合基因型AA个体可在专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中快速固定后代毛色，或选择亲本一方是纯合型黑色种猪个体进行杂交生产黑色后代商品猪而不发生毛色分离。

（三）MC1R基因位点4（C/T）的检测

表5 5个品种/品系位点4毛色检测结果

对于位点4，外种猪杜洛克猪和巴克夏猪均为TT基因型，地方猪种太湖猪和藏猪均为CC基因型，而黑色父本新品种S06基因型为CC和CT。位点4的SNP突变与猪毛色存在因果关系，其中等位基因C决定黑毛色，C对T呈显性。

表6 不同品种杂交后代位点4毛色检测结果

对不同品种杂交后代毛色表型观察和位点4基因型检测结果表明：

（1）外种猪与地方猪种杂交（杜洛克X太湖猪，杜洛克X藏猪）后代均表现为黑色，基因型均为杂合型CT；

（2）地方猪种藏猪X太湖猪杂交后代毛色均为黑色，基因型均为纯合的CC；

（3）以地方猪的杂交后代（藏猪X太湖猪）为母本，与作为父本的外种猪杜洛克猪和巴克夏猪杂交，其后代毛色均为黑色，基因型均为杂合型的CT；

（4）黑色父本新品种S06与藏猪×太湖猪种母猪杂交时毛色均为黑色，其中基因型为CC的S06个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型均为CC，而基因型为CT的个体与藏猪×太湖猪种母猪杂交时后代基因型为CC和CT；

（5）基因型为CC的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色均为黑色，基因型分别为CC和CT，基因型为CT的S06个体与杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交时后代毛色出现明显分离，出现毛色分离的个体基因型均为TT；

（6）S06个体与巴克夏×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交后代毛色分离规律与其和杜洛克×（藏猪×太湖猪）种母猪杂交的毛色分离相同。

由此可知，对于位点4，在所有检测的品种和个体毛色分离表型上符合基因分离规律，选择黑色纯合基因型CC个体可在专门化品系选育和新品种（配套系）培育过程中快速固定后代毛色，或选择亲本一方是纯合型黑色种猪个体进行杂交生产黑色后代商品猪而不发生毛色分离。

综上所述，在专门化品系选育和新品种（配套系）培育的过程中位点2选择AA，位点3选择GG，位点4选择CC基因型均有利于快速固定后代毛色的目的；在黑色商品猪生产的过程中，父本和母本一方是黑色的纯合基因型即可确保后代商品猪毛色全部为黑色，不发生毛色分离。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省畜牧科学研究院

<120> 一种纯黑色猪种的选育方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 外侧引物MC1R-F

<400> 1

agggaagacttggtggggag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 外侧引物MC1R-R

<400> 2

ccgtgtggtggtagtaggcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-3-P

<400> 3

ttgcgcccgcctccagcagc 20

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-1-P

<400> 4

tttttttttt tttttttttt ttttctggct tccctcagct ccgc 44

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-2-P

<400> 5

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tgctggtgag cgtgagcaac 50

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-4P

<400> 6

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttgtgg tgcagcagct ggacaa 56

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-3P有效序列

<400> 7

gcgcccgcctccagcagc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-1-P有效序列

<400> 8

ctggcttccctcagctccgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-2P有效序列

<400> 9

tgctggtgagcgtgagcaac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 内侧引物MC1R-4-P有效序列

<400> 10

gtggtgcagcagctggacaa 20

Claims

1.一种纯黑毛色猪种的选育方法，其特征在于，对父本和/或母本猪种的单倍型MC1R*31基因的708bp位点、730bp位点、788bp位点中的至少一个进行检测，判断是否符合以下情况的至少一种： 708bp位点为AA基因型，730bp位点为GG基因型，788bp位点为CC基因型；若符合，则选择作为父本和/或母本猪进行繁育。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，采用Snapshot技术进行位点检测。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，单倍型MC1R*31的SNP的708bp位点等位基因A决定猪黑毛色，A对G呈显性。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，单倍型MC1R*31的SNP的730bp位点等位基因G决定猪黑毛色，G对A呈显性。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，单倍型MC1R*31的SNP的788bp位点等位基因C决定猪黑毛色，C对T呈显性。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，检测中，外侧引物及有效序列至少包括如下之一：

AGGGAAGACTTGGTGGGGAG F CCGTGTGGTGGTAGTAGGCG R

。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，检测中，还包括内侧引物，其有效序列至少包括如下之一：

GCGCCCGCCTCCAGCAGC R CTGGCTTCCCTCAGCTCCGC F TGCTGGTGAGCGTGAGCAAC F GTGGTGCAGCAGCTGGACAA F

。