CN104938787B - 一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂及制备和应用 - Google Patents
一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂及制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂及制备和应用。棉粕复合组剂中棉粕60%‑70%，葵花籽粕8%‑10%，菜粕15%‑13%，红花籽粕5%‑12%和葡萄籽粕2%‑5%和添加1.5%的复合菌剂，通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按3:5:2的比例混合制备获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按1:1组成；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合制备棉粕复合微生态制剂。制备的棉粕复合微生态制剂适用鱼类等水产养殖，鱼体的消化率高、水中稳定性好、对水体污染小、促进鱼体生长等方面获得显著的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于现代饲料工业的技术领域。具体的说，本发明涉及一种适用于水产养殖的棉粕复合微生态制剂制备及应用的技术领域。
背景技术
中国饲料行业发展快速，对于饲料产业的核心技术饲料添加剂也随着生物技术的发展而开发出越来越多的生物科技产品。微生态饲料添加剂应运而生，微生态制剂的应用研究克服了长期使用抗生素给养殖业造成的种种弊端，对发展绿色饲料添加剂具有广阔的应用前景，己被农业部列为二十一世纪重点推广技术项目。这意味着对微生态制剂的研究、推广，符合我国可持续发展的总体要求。目前很多制药企业都加入了微生态制剂的研发和生产行列，行业标准逐渐规范。科研到生产到行销的产业链逐渐完整。
美国从70年代开始使用饲用微生态制剂，日本、西欧一些发达国家相继开发研制新型的抗生素替代品，使微生态制剂得到了迅速普及。随着科学技术的不断发展，饲用微生态制剂在菌种、生产工艺、剂型上大有改进，产品的稳定性、耐加工性也大大提高。
我国饲用微生态制剂的研究始于80年代，90年代相继有产品出现，2010年已登记有饲用微生态制剂数百种。目前我国市场上供应饲用微生态制剂品种繁多，包括单一菌剂，更多的是复合菌剂，已登记的国外进口产品有十几种，并不断有新的产品进入。据了解，国内微生物饲料添加剂产业目前处于起步阶段，微生态制剂市场空间极大，产业发展前景十分广阔。
我国是一个蛋白资源稀缺的国家。2011年中国对进口大豆的依赖度已经超过80％；20世纪末期，我国每年大约进口70万吨鱼粉，约80％来自秘鲁，从智利进口量不足10％，此外从美国、日本、东南亚国家也有少量进口；国内饲料行业对质优价廉蛋白原料的需求日益迫切。根据国家饲料办公室的估算，按照我国人民膳食结构与养殖业的发展规划要求，到2020年所需的蛋白饲料会有更大的缺口。为了解决目前常规蛋白质饲料价格高且资源不足的问题，人们开始开发和利用棉粕、葵花粕等杂粕饲料。虽然这些蛋白质饲料中的氨基酸消化率低，限制性氨基酸含量低，氨基酸间对的均衡性差，以及含有一定的抗营养物质，但如果经过适当的加工处理以及合理利用，仍可以部分甚至全部替代常规蛋白质饲料，提高经济效益。
棉籽是和大豆、菜粕同样重要的食用油脂资源，是一种开发利用完全的蛋白质资源。新疆是全国最大的棉花与油葵种植区，拥有优质、丰富的油料与蛋白原料资源，长期以来新疆油脂加工业只注重食用油的品质，忽略了粕类产品的开发，榨油后的低蛋白粕类只能作为低端原料在饲料中低比列使用。
微生态制剂的开发和广泛应用，对促进我国水产养殖的发展发挥了积极的作用，且潜力很大。目前，继光合细菌在水产中广泛应用后，许多的微生态制剂逐步渗透到水产业中来，并发挥其显著的优势，随着“白色农业”的发展，微生态制剂必将在水产养殖中起着重要的作用。目前，关于微生态制剂在水产养殖中的应用，国内外学者进行了一些尝试，并取得较为理想的效果，但较之在医学和畜牧方面的研究和应用，尚有较大差距，仍处在较低水平。鉴于水产养殖的特殊环境，以及随着生物科学的纵深发展，在光辉的抗生素时代之后，必将是一个新的微生态制剂时代，其在水产养殖上的应用必将有着更为广泛的前景。绿色饲料添加剂的开发已是大势所趋，值得指出的是,在研究益生菌的同时,必须下大力研究动物肠道菌菌群自身的特点及寄主和环境之间的关系，才能设计出高效新一代的微生态制剂。
目前微生态制剂在运输、使用和保存过程中易失活，从而降低其生物活性作用；有些菌株进入消化道后，不能有效抵抗盐酸、胆汁酸等的作用，从而无法长时间定植肠道发挥功能；微生态制剂预防效果好于治疗效果，但作用慢，需长时间连续使用，费用相应增加等不利因素和技术制约。以上问题还有待于进一步深入研究开发应用。
发明内容
针对现有技术未见采用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕混合物为发酵底物，利用微生物发酵与直投式微生态制剂相结合制备新型适用于水产养殖的棉粕复合微生态制剂的技术现状，本发明旨在于提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂及制备和应用，通过微生物发酵分解改善棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕的品质，并制备棉粕复合组剂，利用微生态制剂的制备技术制备与之适用配合的直投式微生物冻干制剂，通过将发酵制备的棉粕复合组剂与直投式微生物冻干制剂复合配合适用鱼类等水产养殖，确保鱼体的消化率高、浪费少、水中稳定性好、对水体污染小、气味酸甜芳香、适口性好且能增进鱼类的食欲、促进鱼体生长。
本发明提供的技术方案：
本发明的棉粕复合微生态制剂由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕，通过固体发酵制备而成；其中主要原料选择棉粕60％-70％，葵花籽粕8％-10％，菜粕15％-13％，红花籽粕5％-12％和葡萄籽粕2％-5％，混合菌剂由凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉菌剂组成，通过固态发酵制备棉粕复合组剂。采用常见制备方法结合冻干技术制备分别获得蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂组成直投混合菌种粉剂。通过棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂混合组成棉粕复合微生态制剂，应用于鱼类等水产养殖，对于有效利用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕资源，充分满足鱼类等水产养殖的需求，对于确保鱼体的消化率高、浪费少、水中稳定性好、对水体污染小、气味酸甜芳香、适口性好且能增进鱼类的食欲、促进鱼体生长等方面获得显著突出的技术效果。
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕60％-70％，葵花籽粕8％-10％，菜粕15％-13％，红花籽粕5％-12％和葡萄籽粕2％-5％和1.5％的复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按重量比3:5:2比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合制备获得棉粕复合微生态制剂。
同时，本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备方法，具体通过如下工艺制备获得，％按照重量百分比计，具体制备方法步骤如下：
(1)原料的预处理：将原料棉粕60％-70％，葵花籽粕8％-10％，菜粕15％-13％，红花籽粕5％-12％和葡萄籽粕2％-5％，按比例混合并粉碎，过40目筛；按照重量比1:0.8的料液比加水，搅拌混合均匀获得原料。
(2)菌种的活化、培养和菌剂的获得：分别将选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉进行试管斜面活化培养，并将经试管斜面活化的菌种转入到摇瓶中进行培养，分别获得凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌菌剂。
(3)复合菌剂的制备：将凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合，即制备获得复合菌剂。
(4)接菌：以1.5％的接种比例将步骤(3)所制备的复合菌剂接入到步骤(1)制备的原料中。
(5)固体发酵：采用常见的发酵设备，搅拌步骤(1)制备的原料和步骤(3)添加的复合菌剂，使之混合均匀，经过控制发酵温度为30℃-35℃，pH自然，连续固态发酵48h-60h。
(6)烘干、制粒：将上述步骤(5)发酵制备好的原料经造粒、烘干至水分含量为12％获得棉粕复合组剂。
(7)菌种粉剂的制备：分别选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌经过菌种的活化、菌体的收集、菌泥的冷冻干燥获得粉剂：
菌种的活化：将选用的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌分别用100ml灭菌的改良MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后再将上述100ml菌液全部转入至400ml灭菌改良MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至发酵罐中进行扩大培养48h。
菌体收集：利用超速离心机对发酵后的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的菌液分别进行离心，在转速为4000-6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物。
菌泥冷冻干燥：将分别收集到的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液；再将其盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min，然后置-80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，分别制备获得蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂。根据实验设计，真空冷冻干燥条件设置冻干仪腔体温度为-60℃-70℃，压力为0.006Pa，时间为14h；复配保护剂采用脱脂奶粉7.06％、麦芽糖6.46％和谷氨酸钠6.7％。
(8)调配：将上述步骤分别获得的蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成获得直投混合菌种粉剂。
(9)成品：选用上述步骤(6)制备的棉粕复合组剂和步骤(8)制备获得直投混合菌种粉剂，按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
本发明中，所选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌都为常见的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道获得。
本发明所选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌尽管都为常见的菌种，但是，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑复合菌种的安全性，特别是应用鱼类等水产养殖中，都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得，对于直投混合菌种的选择，要充分考虑菌种的属性以及直投混合菌种对于采用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕复合通过固态发酵后带给水产养殖应用的适用性进行综合考量，基于大量科学实验，确定选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌采用分别制备冻干粉剂，与通过固态发酵制备复合菌剂复配的相融性，从而整体制备获得具有适用鱼类水产养殖的棉粕复合组剂，可见，要通过菌种的复配和实用性，本发明提供的棉粕复合组剂组分设定和组分的确定都经过大量科学实验获得，并通过应用证明对于如何综合利用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕，分解其中比如棉酚等有毒有害物质，对于应用鱼类等水产养殖，确保鱼体的消化率高、浪费少、水中稳定性好、对水体污染小、气味酸甜芳香、适口性好且能增进鱼类的食欲、促进鱼体生长等方面获得显著的技术效果。
直投式发酵剂是一种不需活化和扩增便能直接应用于生产的新型发酵剂，具有活菌含量高、菌种保质期长等优点，也防止了菌种退化和污染，提高了发酵制品工业的劳动生产率和产品质量。由于菌种对热刺激的敏感性，直投式发酵剂工艺上多采用真空冷冻干燥法，冷冻和干燥过程中会使部分细胞损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化。为了提高菌种冻干后的存活率，冻干前加入保护剂减少冻干损伤是必要的，使其最大限度发挥保护功能，提高发酵菌剂的存活率。不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂往往不能满足菌体抵抗外界恶劣环境的条件，而复配保护剂中各保护剂在冷冻干燥中则发挥各自的特性并能起到增效作用，本发明通过试验验证获得蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌保护剂的最佳配方为脱脂奶粉7.06％、麦芽糖6.46％和谷氨酸钠6.7％，植物乳杆菌冷冻干燥存活率达到92.95％，蜡样芽孢杆菌的冷冻干燥存活率达到94.1％。
本领域蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌常见的筛选MRS培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g、吐温801ml、PH值6.2-6.4、用蒸馏水定容至1000ml，115-120℃灭菌30min。
本领域蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌分离培养基选用常见的分离MRS培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸二氢钾2g、吐温801.0ml、碳酸钙20g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、水1000ml,调pH值6.2-6.5,115℃灭菌20min。
本发明蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌发酵培养采用的改良MRS培养基:在MRS培养基基础上添加α-甲基葡萄糖苷10g、山梨酸钾1g,调pH值6.2-6.5,115℃灭菌20min；化后的培养基配方为，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏2g/L，MnSO40.005g/L，NaCl 2g/L，K2HPO43g/L，MgSO40.02g/L，在此培养基基础上进行发酵条件的优化，得出优化后的培养条件为：温度40℃，初始pH值为7.0，转速210r/min，装液量为30mL(250mL的三角瓶)，接种量为6％(v/v)，发酵时间48h。
本发明技术制备的棉粕复合微生态制剂适口性好，能够增进鱼类的食欲；具有较好的成形性和耐水性，保证了棉粕复合微生态制剂在水中的稳定性，减少水体的污染；同时，在鱼体中的消化率高，促进鱼体的生长，具有广泛的应用价值。
本发明采用的棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕的粉碎、加水、混合等预处理、菌种的活化、发酵、菌种的冷冻干燥等技术手段尽管离不开现有技术的支持和启发，但是发酵工艺中棉粕复合微生态制剂的物料比、料液比、发酵菌种的选择以及直投混合菌种的选择、制备，对于决定棉粕复合微生态制剂的品质都具有重要的作用，也是决定性因素，不能说采用的技术手段和工具是现有技术，进而否定本发明提供的整体制备棉粕复合微生态制剂的创新性，现有所有技术发明和创新都离不开现有技术的支撑和基础。可见，本发明提供的棉粕复合微生态制剂制备工艺中的各技术因素和技术参数都经过综合考量和设计，本发明提供的棉粕复合微生态制剂的制备方法中各技术环节具有上下一体，任何技术步骤不可或缺，紧密不可分割的特点，不能任意取舍肢解其中的技术步骤。
进一步，本发明提供利用上述制备获得的棉粕复合微生态制剂在水产养殖中的应用。适口性好，能增进鱼类的食欲；具有较好的成形性和耐水性，保证了棉粕复合饲料在水中的稳定性，减少水体的污染；同时，在鱼体中的消化率高，具有广泛的应用价值。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
(1)本发明通过利用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕混合物为原料，利用微生物发酵技术制备棉粕复合组剂，通过冻干技术制备直投式微生态制剂，通过利用棉粕复合组剂和直投式微生态制剂相配合制备新型的适用于水产养殖的棉粕复合微生态制剂。本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷、充分利用棉粕、葵花籽粕等蛋白原料，制备的棉粕复合微生态制剂气味酸甜芳香，适口性好，能增进鱼类的食欲；具有较好的成形性和耐水性，保证了棉粕复合饲料在水中的稳定性，减少水体的污染；同时，在鱼体中的消化率高，具有广泛的应用价值。
(2)本发明提供的适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，通过充分考虑棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕的营养特点，经过固体发酵技术制备获得棉粕复合饲料，经过冻干技术制备直投式微生态制剂，通过利用棉粕复合组剂和直投式微生态制剂相配合制备新型的适用于水产养殖的棉粕复合微生态制剂。制备的棉粕复合微生态制剂含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养物质，营养价值高，能够促进鱼体的生长。
(3)采用本发明提供的适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂成本低，棉粕、葵花籽粕等棉粕复合微生态制剂原料的产量大，回收成本低，且在制备棉粕复合微生态制剂的过程中设备简单，工艺简单，制备的成本低。
(4)采用本发明提供的适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂在水中稳定性好：棉粕复合微生态制剂静置于水体中，全部漂浮于水体表面，浸泡15min后饲料颗粒开始下沉，最终近一半饲料处于水体上层，说明棉粕复合微生态制剂具有较好的水中稳定性，对水体污染小。
(5)采用本发明提供的适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂能够促进鱼体生长：棉粕复合微生态制剂在鲤鱼生长方面显示出较好的效果，其中鲤鱼单位长度鱼体的质量大，鱼体肥满，鱼体胴体比例大，可食部分多，促进鱼体的生长。
附图说明
图1显示为棉粕复合微生态制剂的工艺流程简图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的主要原料：棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕原料都为本领域熟知选用的；所选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌都为常见的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道获得。
选用的主要设备：粉碎机、搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、无菌操作台、控温摇床、高速离心机、发酵罐、真空冷冻离心机、菌液瓶等设备都为本领域熟知选用的。
本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
但不限制本发明的实施，另外，在下述的说明中，如无特别说明，涉及的所有％皆指m/m质量百分比或重量份比计。
实施例一：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕60％-70％，葵花籽粕8％-10％，菜粕15％-13％，红花籽粕5％-12％和葡萄籽粕2％-5％和1.5％的复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
本发明中，所选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌都为常见的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道获得，同时，本发明采用的上述菌种发酵液的制备方法及其在制备过程中选用的培养基及培养条件都为本领域常见和熟知。
本发明所选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母、黑曲霉、蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌尽管都为常见的菌种，但是，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑到复合菌种的安全性，特别是应用鱼类等水产养殖中都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得，对于直投混合菌种的选择，要充分考虑菌种的属性以及直投混合菌种对于采用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕复合通过固态发酵后带给水产养殖的应用的适用性的综合考量，基于大量科学实验，确定选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌采用分别制备冻干粉剂，通过固态发酵制备复合菌剂复配的相融性，从而整体制备获得具有对于适用鱼类水产养殖的棉粕复合组剂，可见，要通过菌种的复配和实用性，本发明提供的棉粕复合组剂组分设定和组分的确定都经过大量科学实验获得，并通过应用证明对于如何综合利用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕，分解其中比如棉酚等有毒有害物质，对于应用鱼类等水产养殖，确保鱼体的消化率高、浪费少、水中稳定性好、对水体污染小、气味酸甜芳香、适口性好且能增进鱼类的食欲、促进鱼体生长等方面获得显著的技术效果。
直投式发酵剂是一种不需活化和扩增便能直接应用于生产的新型发酵剂，具有活菌含量高、菌种保质期长等优点，也防止了菌种退化和污染，提高了发酵制品工业的劳动生产率和产品质量。由于菌种对热刺激的敏感性，直投式发酵剂工艺上多采用真空冷冻干燥法，冷冻和干燥过程中会使部分细胞损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化。为了提高菌种冻干后的存活率，冻干前加入保护剂减少冻干损伤是必要的，使其最大限度发挥保护功能，提高发酵菌剂的存活率。不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂往往不能满足菌体抵抗外界恶劣环境的条件，而复配保护剂中各保护剂在冷冻干燥中则发挥各自的特性并能起到增效作用，本发明通过试验验证获得蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌保护剂的最佳配方为脱脂奶粉7.06％、麦芽糖6.46％和谷氨酸钠6.70％，植物乳杆菌冷冻干燥存活率达到92.95％，蜡样芽孢杆菌的冷冻干燥存活率达到94.1％。
本领域蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌常见的MRS培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g、吐温801ml、PH值6.2-6.4、用蒸馏水定容至1000ml，115-120℃灭菌30min。
本领域蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌分离培养基选用常见的MRS培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、酵母粉5g、葡萄糖5g、磷酸二氢钾2g、吐温801.0ml、碳酸钙20g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、水1000ml,调pH值6.2-6.5,115℃灭菌20min。
本发明蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌采用的改良MRS培养基:在MRS培养基基础上添加α-甲基葡萄糖苷10g、山梨酸钾1g,调pH值6.2-6.5,115℃灭菌20min；化后的培养基配方为，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏2g/L，MnSO40.005g/L，NaCl 2g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO40.02g/L，在此培养基基础上进行发酵条件的优化，得出优化后的培养条件为：温度40℃，初始pH值为7.0，转速210r/min，装液量为30mL(250mL的三角瓶)，接种量为6％(v/v)，发酵时间48h。
实施例二：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕60％，葵花籽粕10％，菜粕13％，红花籽粕12％和葡萄籽粕5％和1.5％的复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
实施例三：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕70％，葵花籽粕8％，菜粕15％，红花籽粕5％和葡萄籽粕2％和1.5％的复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
实施例四：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕65％，葵花籽粕9％，菜粕14％，红花籽粕8.5％和葡萄籽粕3.5％和1.5％的复合菌剂通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的棉粕复合组剂与500公斤的直投混合菌种粉剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
实施例五：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备
本发明具体提供一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备方法，具体通过如下工艺制备获得，％按照重量百分比计，具体制备方法步骤如下：
(1)原料的预处理：将原料棉粕60％-70％，葵花籽粕8％-10％，菜粕15％-13％，红花籽粕5％-12％和葡萄籽粕2％-5％，按比例混合并粉碎，过40目筛；按照重量比1:0.8的料液比加水，搅拌混合均匀获得原料。
(2)菌种的活化、培养和菌剂的获得：分别将选用的凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉分别进行试管斜面活化培养，并将经试管斜面活化的菌种转入到摇瓶中进行培养，分别获得三种凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉菌菌剂。
(3)复合菌种的制备：将凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合，即为制备的复合菌剂。
(4)接菌：以1.5％的接种比例将步骤(3)所制备的复合菌剂接入到步骤(1)制备的原料中。
(5)固体发酵：采用常见的发酵设备，搅拌步骤(1)制备的原料和步骤(3)添加的复合菌剂，使之混合均匀，经过控制发酵温度为30℃-35℃，pH自然，连续固态发酵48h。
(6)烘干、制粒：将上述步骤(5)发酵制备好的原料经造粒、烘干至水分含量为12％获得棉粕复合组剂。
(7)分别选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌经过菌种的活化、菌体的收集、菌泥的冷冻干燥获得粉剂：
菌种的活化：将选用的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌分别用100ml灭菌的改良MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后再将上述100ml菌液全部转入至400ml灭菌改良MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至发酵罐中进行扩大培养48h。
菌体收集：利用超速离心机对发酵后的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的菌液分别进行离心，在转速为4000-6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物。
菌泥冷冻干燥：将分别收集到的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液；再将其盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min，然后置-80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，分别制备获得蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂。根据实验设计，真空冷冻干燥条件设置冻干仪腔体温度为-60℃-70℃，压力为0.006Pa，时间为14h；复配保护剂采用脱脂奶粉7.06％、麦芽糖6.46％和谷氨酸钠6.70％。
(8)调配：将上述步骤分别获得的蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成直投混合菌种粉剂。
(9)成品：选用上述步骤(6)制备的棉粕复合组剂和步骤(8)制备获得直投混合菌种粉剂，按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
通过上述工艺制备的棉粕复合微生态制剂适口性好，能够增进鱼类的食欲；具有较好的成形性和耐水性，保证了棉粕复合微生态制剂在水中的稳定性，减少水体的污染；同时，在鱼体中的消化率高，促进鱼体的生长，具有广泛的应用价值。
本发明采用的棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕的粉碎、加水、混合等预处理、菌种的活化、发酵、菌种的冷冻干燥等技术手段尽管离不开现有技术的支持和启发，但是发酵工艺中棉粕复合微生态制剂的物料比、料液比、，发酵菌种的选择以及直投混合菌种的选择、制备，对于决定棉粕复合微生态制剂的品质都具有重要的作用，也是决定性因素，不能说采用的技术手段和工具是现有技术，进而否定本发明提供的整体制备棉粕复合微生态制剂的创新性，现有所有技术发明和创新都离不开现有技术的支撑和基础。可见，本发明提供的棉粕复合微生态制剂制备工艺中的各技术因素和技术参数都经过综合考量和设计，本发明提供的棉粕复合微生态制剂的制备方法中各技术环节具有上下一体，任何技术步骤不可或缺，紧密不可分割的特点，不能任意取舍肢解其中的技术步骤。
实施例六：适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备
将原料棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕，按比例混合并粉碎，过40目筛；按照重量比1:0.8的料液比加水，搅拌混合均匀获得原料；分别将凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉菌种进行活化培养并获得相应的三种菌剂，并按照重量比3:5:2的比例混合获得复合菌剂，以1.5％的接种比例复合菌剂接入到制备的原料中；采用固态发酵工艺，发酵温度为30℃-35℃，pH自然，连续固态发酵48h-60h，并经过烘干、制粒，获得水分含量为12％的棉粕复合组剂；分别选用蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌经过冷冻干燥获得相应的两种粉剂，按照重量比1:1组成获得直投混合菌种粉剂；将按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合制备获得棉粕复合微生态制剂。
饲料蛋白质被鱼体摄食后，必须在鱼的消化道中在各种消化酶的作用下，分解成氨基酸后才能被鱼体吸收利用。饲料中蛋白质的含量以及有效能值对鱼类的生长发育起着至关重要的作用。同时，维生素是鱼体内物质代谢中必不可少的特殊营养物质。棉粕蛋白质含量较高，但是组成不太理想，精氨酸含量高达3.6％-3.8％，而赖氨酸含量仅有1.3％-l.5％，为大豆粕的一半，蛋氨酸也不足，约0.4％，赖氨酸的利用率较差，矿物质中含磷多，但多属植酸磷，利用率低，因此需要添加菜粕、葡萄籽粕等原料；葵花籽粕的蛋白含量根据脱壳程度差异很大，在24％-38％左右，葵花籽粕的氨基酸组成特点是赖氨酸含量不足，在1.1％-1.2％左右，低于棉粕，蛋氨酸含量较高，约0.6％-0.7％左右，高于豆粕、棉粕和花生粕，葵花籽粕的B族维生素含量丰富，烟酸含量达200mg/kg，是豆粕的5倍，但缺乏胡萝卜素，矿物质中钙、磷、铁、锌、铜含量也较高，因此，需要添加棉粕、菜粕等原料；菜粕中含有丰富的赖氨酸，常量和微量元素，其中钙、硒、铁、镁、锰、锌的含量比豆粕高，磷含量是豆粕的2倍，同时它还含有丰富的含硫氨基酸，这正是豆粕所缺少的，所以它和豆粕合用时可以起平衡和互补作用；红花籽粕中蛋白质含量为20％-60％，其精氨酸含量高达1.2％-3.7％，含有丰富的维生素和矿物质，钙多磷少，并含有多种抗氧化物质；葡萄籽粕富含大量的多酚类物质、亚油酸、氨基酸、多种维生素、粗脂肪、微量元素，其中，多酚类物质中原花青素为主要物质，具有超强抗氧化能力，是维生素E的50倍，是维生素C的20倍，它能清除体内过多的自由基，其抗氧化能力已得到国际公认，目前，葡萄籽粕已被广泛应用于饲料中，不仅节约了大量的粮食，而且显著提高了经济效益，因此，葡萄籽粕的添加对于鱼体的生长有重要的作用。本发明通过充分分析棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕这五种粕类物质的营养特性，并根据鱼体的生长需要，通过微生物发酵作用制备获得棉粕复合组剂。同时，根据鱼体的消化等因素制备直投混合菌种粉剂，其由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成。将棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂混合制备棉粕复合微生态制剂。
实施例七：棉粕复合微生态制剂水中稳定性的测定
(1)实验过程
随机选取20粒试验饲料轻轻置于水面，使其自由沉降，并按下秒表，记录其自由沉降的时间t，用尺子测量液面与底部的高度h。
沉降速率v＝h/t
式中，h为液面高度(cm)；t为降沉时间(s)
(2)实验结果
将棉粕复合微生态制剂静置于水体中，其全部漂浮于水体表面，浸泡15min后饲料颗粒开始下沉，最终近一半饲料处于水体上层。因棉粕复合微生态制剂的密度小于水体密度，可漂浮于水体表面，随着饲料吸水量增多，逐渐出现下沉现象，与饲料吸水特性变化相似。浸泡15min左右，吸水量趋于饱和，饲料颗粒下沉数量增多。计算沉降速度为1cm/s。饲料颗粒在水体中悬浮或上下起伏，表明因吸水过程，饲料正处于趋于平衡的状态。仍有近一半颗粒处于水体上层，说明饲料颗粒在静水中保持平衡状态，棉粕复合微生态制剂在水中稳定性强。
实施例八：棉粕复合微生态制剂的鱼类应用试验
1、试验对象
选择池塘培育当年鲤鱼成鱼。成鱼购回后，置于水泥池中，按照常规饲喂和管理方法，用鲤鱼成鱼饲料饲喂7d。空腹24h后，将其称重，选择体重、体型一致的鲤鱼置于试验网箱中，平均体重710g左右。设置试验组和对照组两组，试验组选用上述实施例提供的棉粕复合微生态制剂，对照组选用市场常见的鱼类适用饲料制剂，每组3个平行，共6组，每组随机分配试验用鱼30尾，共计180尾。
2、饲喂方法
养殖试验从10月初开始，到11月底结束，为期8周，共计56d。试验开始前，试验鲤鱼用3％的食盐水浸泡10-15min，进行常规消毒，饲喂鲤鱼成鱼饲料驯化1周，以适应环境。饥饿24h，对每个试验池内的鱼称重。试验鱼分别在每天的10时、14时、18时进行投喂，日投饵率2-3％，以刚好饱食为宜，或0.5h食完。每隔2周对各试验组鱼进行抽样称重，调整日投喂量，并根据水温和生长情况及时调整投喂量。
养殖期间每天上午和下午各测量水温一次，观察鱼体游动判断水体溶氧，每天用pH试纸测定pH值一次，每天吸污一次，及时捞出死亡鱼种，进行称量、记录，同时对死亡鱼体的外观和脏器进行描述。
3、鱼体的测定指标
(1)鱼体生长指标
鱼体的生长速度根据特定生长率、增重率指标表示。停食24h后对试验鱼体称重，每个养殖网箱的试验鱼进行总体的称重，各项指标根据以下公式。
特定生长率(SGR，％/d)＝[ln(W1)-ln(W0)]/t×l00
增重率(％)＝(W1-W0)/W0×l00
其中Wl、W0分别为鱼体饲养末重和初重，t为试验天数。
(2)鱼体形态指标
试验结束时，从每个养殖网箱内随机抽取5尾鱼进行体重、体长的测量，然后解剖取内脏称重。计算肥满度和内脏指数指标。
肥满度(％)＝体重(g)/体长(cm)
内脏指数(％)＝内脏重(g)/全鱼重(g)x100
(3)鱼体肌肉的主要成分测定
鱼体肌肉为冷冻样品，从每个养殖网箱内分别取5尾鱼，在冰柜中冷冻1周后，取背部白肌，进行测定，测定指标为水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分的含量。
(4)健康指标
试验结束时，对每个养殖网箱中已解剖的5尾鱼的内脏器官进行进一步分离，分别取肾脏、肝胰腺、脾脏进行称重，计算相关指标。包括肝胰腺指数、脾脏指数和头肾指数。
4、试验结果
(1)生长速度
表1 各组鱼体的均重、增重率和特定生长率
| 初均重/g | 末均重/g | 增重率/％ | 特定生长率/％ | |
| A1 | 716.7 | 924.1 | 28.94 | 0.45 |
| A2 | 714.0 | 926.8 | 29.80 | 0.46 |
| A3 | 710.6 | 927.2 | 30.48 | 0.48 |
| B1 | 712.3 | 798.4 | 12.08 | 0.20 |
| B2 | 716.4 | 818.9 | 14.31 | 0.24 |
| B3 | 710.4 | 792.5 | 11.55 | 0.20 |
试验鱼8周的特定生长率和增重率如表1所示。试验组A的特定生长率与增重率显著高于对照组B，分别达到0.46％和29.74％，比对照组提高了0.25％和17.09％。上述分析表明实验组本发明提供的棉粕复合微生态制剂饲料对鲤鱼显示出较好的生长效果，且优于相对应的对照组饲料。
(2)鱼体形态指标：试验组A的肥满度与高于对照组B，达到30.72g/cm，比对照组高3.61g/cm。而试验组A的内脏指数显著低于对照组B，分别达到14.49％与16.14％。试验组肥满度高、内脏指数低说明试验组A与对照组相比，单位长度鱼体的质量大，鱼体肥满，并且鱼体胴体比例大，可食部分多。
(3)肌肉基本成分分析：由表2可知，与对照组相比，试验组水分降低，但差异不显著(P＞0.05)，试验组脂肪含量均低于对照组，差异不显著(P＞0.05)。试验组和对照组鱼体肌肉中灰分含量相近，并无显著差异。试验组采用本发明提供的棉粕复合微生态制剂的粗蛋白含量显著高于试验组鱼体粗蛋白含量(P＜0.05)。
表2 各组鱼体肌肉基本成分
| 水分/％ | 粗脂肪/％ | 粗蛋白/％ | 灰分/％ | |
| A1 | 77.54±0.12 | 2.05±0.53 | 20.01±0.08 | 1.19±0.21 |
| A2 | 77.04±0.42 | 3.42±0.28 | 20.30±0.34 | 1.20±0.22 |
| A3 | 77.24±0.26 | 3.77±0.20 | 20.14±0.23 | 1.08±0.18 |
| B1 | 78.71±0.18 | 3.83±0.87 | 19.37±0.20 | 1.05±0.08 |
| B2 | 76.63±0.66 | 3.91±0.45 | 19.59±0.07 | 1.35±0.14 |
| B3 | 78.75±0.03 | 3.95±0.57 | 19.20±0.01 | 1.15±0.20 |
(4)健康指标
表3 各组鱼体肝胰腺、肾脏、脾脏指数
| 肝胰腺指数 | 肾脏指数 | 脾脏指数 | |
| A1 | 2.20±0.39 | 0.68±0.02 | 0.26±0.02 |
| A2 | 2.27±0.17 | 0.60±0.01 | 0.26±0.05 |
| A3 | 2.29±0.04 | 0.53±0.06 | 0.30±0.01 |
| B1 | 2.26±0.02 | 0.60±0.04 | 0.33±0.03 |
| B2 | 1.77±0.03 | 0.61±0.01 | 0.28±0.02 |
| B3 | 1.61±0.26 | 0.55±0.03 | 0.33±0.01 |
肝胰脏是水产动物重要的代谢器官，具有排毒解毒的功能，肝胰脏指数可反映肝肿大、脂肪肝等鱼体生理问题。试验组与对照组相比，试验组A2、A3肝胰腺指数均高于对照组，试验组与对照组间差异不显著(P＞0.05)。试验期间，没有发现采用本发明上述提供的棉粕复合微生态制剂对试验鲤鱼肝胰脏造成不利影响。试验结束后，鱼体解剖的肝胰脏颜色为正常的深红色，肝胰腺指数表明各试验组鱼体的肝胰脏没有受到影响。试验组与对照组肾脏指数相近，稍高于对照组，差异不显著(P＞0.05)。初步确定棉粕复合微生态制剂没有对机体免疫细胞造成影响。脾脏是机体重要的造血器官，滤过血液并参与机体免疫反应。试验组脾脏指数为0.27略低于对照组脾脏指数0.31，差异不显著。试验饲料与商品饲料对脾脏影响相近，采用本发明提供的棉粕复合微生态制剂没有对脾脏造成影响。
结论：采用本发明提供的棉粕复合微生态制剂在鲤鱼生长方面显示出较好的效果，以棉粕复合微生态制剂饲养的鲤鱼单位长度鱼体的质量大，鱼体肥满，并且鱼体胴体比例大，可食部分多，优于相对应的商品饲料。鱼肉品质与商业饲料喂养的鱼肉品质相近，甚至优于商品饲料。采用本发明提供的棉粕复合微生态制剂未对鱼体健康造成影响，达到商品饲料水平，没有对鱼体的生理健康造成不良影响。总之，采用本发明提供的棉粕复合微生态制剂在鲤鱼饲养方面与商品饲料的效果相近，在一些方面甚至优于商品饲料。
通过上述各实施例提供的一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂及制备和应用，利用棉粕、葵花籽粕、菜粕、红花籽粕和葡萄籽粕混合物为原料，利用微生物发酵技术制备棉粕复合组剂，通过冻干技术制备直投式微生态制剂，通过利用棉粕复合组剂和直投式微生态制剂相配合制备新型的适用于水产养殖的棉粕复合微生态制剂。解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷、充分利用棉粕、葵花籽粕等蛋白原料，制备的棉粕复合微生态制剂气味酸甜芳香，适口性好，能增进鱼类的食欲；具有较好的成形性和耐水性，保证了棉粕复合饲料在水中的稳定性，减少水体的污染；同时，在鱼体中的消化率高，具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，其特征在于，%按重量百分比计，棉粕复合微生态制剂配比由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕60%-70%，葵花籽粕8%-10%，菜粕15%-13%，红花籽粕5%-12%和葡萄籽粕2%-5%和添加1.5%的复合菌剂，通过固态发酵制备获得棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
2.如权利要求1所述的一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，其特征在于，按重量百分比计，棉粕复合微生态制剂配比由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕60%，葵花籽粕10%，菜粕13%，红花籽粕12%和葡萄籽粕5%和添加1.5%的复合菌剂，通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
3.如权利要求1所述的一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂，其特征在于，按重量百分比计，棉粕复合微生态制剂配比由棉粕复合组剂和直投混合菌种粉剂组成，棉粕复合组剂含有棉粕70%，葵花籽粕8%，菜粕15%，红花籽粕5%和葡萄籽粕2%和添加1.5%的复合菌剂，通过固态发酵制备棉粕复合组剂，复合菌剂由凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合获得；直投混合菌种粉剂由蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成混合；按照每500g的直投混合菌种粉剂与500公斤的棉粕复合组剂混合组成棉粕复合微生态制剂。
4.一种如权利要求1至3任意一项所述的一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，%按照重量百分比计，棉粕复合微生态制剂的具体制备步骤如下：
（1）原料的预处理：将原料棉粕60%-70%，葵花籽粕8%-10%，菜粕15%-13%，红花籽粕5%-12%和葡萄籽粕2%-5%，按比例混合并粉碎，过40目筛；按照重量比1:0.8的料液比加水，搅拌混合均匀获得原料；
（2）菌种的活化、培养和菌剂的获得：分别将凝结芽孢杆菌、产朊假丝酵母和黑曲霉菌种进行试管斜面活化培养，并将经试管斜面活化的菌种转入到摇瓶中进行培养，分别获得凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂；
（3）复合菌剂的制备：将凝结芽孢杆菌菌剂、产朊假丝酵母菌剂和黑曲霉菌剂按照重量比3:5:2的比例混合，即为制备获得复合菌剂；
（4）接菌：以1.5%的接种比例将步骤（3）所制备的复合菌剂接入到步骤（1）制备的原料中；
（5）固体发酵：采用常见的发酵设备，搅拌步骤（1）制备的原料和步骤（3）添加的复合菌剂，使之混合均匀，经过控制发酵温度为30℃-35℃，pH自然，连续固态发酵48h-60h；
（6）烘干、制粒：将上述步骤（5）发酵制备好的原料经造粒、烘干至水分含量为12%获得棉粕复合组剂；
（7）菌种粉剂的制备：分别选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌经过菌种的活化、菌体的收集、菌泥的冷冻干燥获得粉剂；
（8）调配：将上述步骤分别获得的蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂按照重量比1:1组成直投混合菌种粉剂；
（9）成品：选用上述步骤（6）制备的棉粕复合组剂和步骤（8）制备获得直投混合菌种粉剂混合制备获得棉粕复合微生态制剂。
5.如权利要求4所述的一种适用水产养殖的棉粕复合微生态制剂的制备方法，所述的菌种粉剂的制备，分别选用蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌经过菌种的活化、菌体的收集、菌泥的冷冻干燥获得粉剂，其特征在于，菌种粉剂的制备具体步骤如下：
（1）菌种的活化：将选用的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌分别用100ml灭菌的改良MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后再将上述100ml菌液全部转入至400ml灭菌改良MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至发酵罐中进行扩大培养48h；
（2）菌体收集：利用超速离心机对发酵后的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的菌液分别进行离心，在转速为4000-6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；
（3）菌泥冷冻干燥：将分别收集到的蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液；再将其盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min，然后置-80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，分别制备获得蜡样芽孢杆菌粉剂与植物乳杆菌粉剂；根据实验设计，真空冷冻干燥条件设置冻干仪腔体温度为-60℃-70℃，压力为0.006Pa，时间为14h；复配保护剂采用脱脂奶粉7.06%、麦芽糖 6.46%和谷氨酸钠 6.7%。
6.如权利要求1、2和3任意一项权利要求所述的棉粕复合微生态制剂在水产养殖中的应用。
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