FR2859104A1

FR2859104A1 - Molecules a activite anti-adipogenique sur cellules adipocytaires humaines

Info

Publication number: FR2859104A1
Application number: FR0310324A
Authority: FR
Inventors: Anne Marie Rodriguez; Christian Dani; Gerard Ailhaud; Joelle Guesnet; Anne Guezennec
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Yves Saint Laurent Parfums SA; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Yves Saint Laurent Parfums SA; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2005-03-04
Also published as: WO2005023234A1

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition cosmétique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains ou comme principe actif dans une composition dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme.

Description

Molécules à activité anti-adipogénique sur cellules adipocytaires humaines.

La présente invention concerne l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (le NDGA ) ou d'un dérivé de celui-ci, comme agent anti-adipogénique dans des préparations cosmétiques, dermo-pharmaceutiques, pharmaceutiques et alimentaires. L'invention concerne également des compositions cosmétiques, dermo-pharmaceutiques, pharmaceutiques et alimentaires contenant le NDGA en quantité suffisante pour inhiber la formation d'adipocytes humains.

L'invention englobe aussi des méthodes pour la prévention ou le traitement de surcharges pondérales ou de tout autre condition impliquant une différenciation adipocytaire aberrante ou indésirable, chez l'homme, en utilisant des compositions à base de NDGA ou de ses dérivés.

L'adipocyte est la principale cellule du tissu adipeux, et comporte non seulement l'équipement nécessaire à la régulation de la balance énergétique (sous contrôle hormonal), mais joue également un rôle complexe et dynamique interférant sur les réponses immunologiques, les maladies vasculaires et la régulation de l'appétit, grâce à ses capacités de cellule endocrine, autocrine et paracrine. Les adipocytes, cellules hautement spécialisées, stockent l'énergie sous forme de triglycérides et la libèrent sous forme d'acides gras. Le développement pondéral du tissu adipeux est le reflet direct de l'état des réserves d'énergie lipidique. Les cellules précurseurs des adipocytes (les préadipocytes), peuvent se différencier en adipocyte tout au long de la vie. Cette différenciation est stimulée par des hormones ou par des nutriments comme les acides gras. Le développement excessif du tissu adipeux conduisant à l'obésité fait intervenir d'une part, une hypertrophie adipocytaire (augmentation de la taille cellulaire) et d'autre part, une hyperplasie cellulaire, c'est à dire une augmentation du nombre des cellules adipeuses.

L'adipocyte mature, qui est une cellule différenciée, a perdu toute capacité de division. Par conséquent, l'augmentation du nombre des adipocytes, observée au cours du développement du tissu adipeux, résulte en fait de la sur-prolifération et de la différenciation de précurseurs cellulaires en adipocytes, les précurseurs étant présents dans la fraction vasculaire du stroma de ce tissu.

Dans la mesure où le développement du tissu adipeux résulte en partie de la différenciation de précurseurs cellulaires, il est intéressant, dans la recherche de molécules susceptibles d'être efficaces dans la lutte contre la surcharge pondérale, d'identifier des composés capables d'inhiber la différenciation adipocytaire.

A ce jour, un certain nombre d'inhibiteurs de différenciation adipocytaire sur cellules 3T3-L1 notamment ou d'autres lignées cellullaires ont été publiés, par exemple, la [1,25]-dihydroxyvitamine D3 (Kelly, K.A. et al.,Réf 1) ou 'acide rétinoïque à forte concentration (Hilda et al., Réf. 2) alors que ce dernier est décrit comme activateur de la différenciation adipocytaire à faible concentration (Safanova et al.,Réf. 3 et 4), l'octoanoate (Han et al., Réf. 5) et la vitamine K2 (Palacios et al., Réf. 6). Ceci étant, ces molécules sont peu ou pas adaptées, voire interdites, pour une utilisation en cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.

Il existe donc aujourd'hui un besoin d'identifier des molécules ayant un effet inhibiteur sur la formation d'adipocytes humains, et qui soient adaptées à une utilisation cosmétique, thérapeutique ou alimentaire.

Les présents inventeurs ont criblé un nombre important de molécules à la recherche d'agents anti-adipogéniques. Ils ont découvert, de manière surprenante, que l'acide nordihydroguaiarétique (le NDGA ) est capable d'inhiber de façon significative, la différenciation adipocytaire humaine, et ce à un stade très précoce du processus de différenciation.

L'activité anti-adipogènique du NDGA sur des cellules humaines est inattendue pour plusieurs raisons. Bien que Thuillier P et al., (Référence 7) aient récemment montré que certains inhibiteurs de lipoxygénase (LOX), dont le NDGA, la quercétine et la morine, inhibent la différenciation de kératinocytes murins, probablement via une action inhibitrice sur les récepteurs PPARa et PPARy ( Peroxisome Proliferator-Activated Receptors a et y" ), les présents inventeurs ont constaté que ces résultats ne pouvaient être extrapolés à la différenciation adipocytaire humaine. En effet des essais menés par les inventeurs dans le cadre de la présente invention démontrent que la quercétine et la morine n'ont aucun effet antiadipogènique sur des cellules humaines.

En outre, des travaux effectués par Ye et Serrero (Référence 8), sur une lignée cellulaire adipogénique murine (lignée 1246) ont montré que le NDGA n'a aucun effet sur l'expression de l'ADRP ( adipose differentiation related protein ) qui est un marqueur précoce de la différenciation adipocytaire (Jang & Serrero, Référence 9).

Il ressort de ces différents travaux que les effets du NDGA sur la différenciation adipocytaire humaine ne pouvaient être prévus sur la base de ses effets sur des cellules de rongeurs.

Le NDGA a déjà été utilisé dans des préparations cosmétiques et thérapeutiques, notamment pour ses effets anti-repousse poil (WO 00/28959), ses effets anti-acnéiques (FR 2830195), ses

effets anti-oxydants (Réf. 12), ses effets anti-inflammatoires (US 4,530,844 et US 4,568,696), et ses effets anti-tumoraux (EP 297733). Ceci étant, ce composé n'a pas à ce jour été utilisé en tant qu'inhibiteur de différenciation adipocytaire.

La présente invention concerne donc l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou de ses dérivés, comme principe actif dans une composition cosmétique, dermopharmaceutique, pharmaceutique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains.

L'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4) présente la formule chimique suivante :

Le NDGA est également connu sous les noms de :

- 'y-diméthyl-a-â-bis (3,4-dihydroxyphenyl) butane 1,2-benzenediol,4,4'-(2,3-diméthyl-1,4-butane)
1,4-Bis(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutane 4,4'-(2,3-dimethyl-1,4-butanediyl)bis(pyrocatechol)
Butane,1,4-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethyl-
Dihydronorguaiaretic acid Dans le contexte de l'invention le NDGA peut être une molécule naturelle, obtenue par extraction végétale, par exemple de la plante Larrea divaricata ou Larrea tridentata. Le NDGA peut être purifié à partir de l'extrait végétal, ou l'extrait brut peut être utilisé. Le NDGA peut également être produit par synthèse chimique.

Dans le contexte de l'invention, un dérivé du NDGA signifie toute molécule étant structurellement apparentée au NDGA, et ayant une activité anti-adipogènique telle que définie ci-dessous. De préférence les dérivés ont la formule I :

FORMULE # dans laquelle R1, R2 sont indépendamment soit (-H), soit un radical méthyl (-CH3) soit un radical éthyl (-C2H5), soit un radical méthoxy (-COCH3) ou éthoxy (-COCzHs),
R3 à à R6 et R10 à R13 sont indépendamment (-H), ou un radical méthyl (-CH3) où un radical éthyl (-CzHs),
R7, R8 et R9 sont indépendamment (-H), soit (-OH), soit un radical méthyl (-CH3) soit un radical éthyl (-CzHs), soit un radical méthoxy (-COCH3) ou éthoxy (-COC2H5).

De préférence, dans la formule I, R1 et R2représentent (-H), R7et R8 représentent (-OH), R9 représente (H), et R3 à R6et R10 à R13 représentent indépendamment (-H), ou un radical méthyl (-CH3).

Selon l'invention, le NDGA et ses dérivés exercent un effet inhibiteur sur la formation d'adipocytes humains. Cet effet, également désigné comme un effet anti-adipogénique , signifie une inhibition de la différenciation de cellules souches humaines ou de cellules précurseurs préadipocytaires humaines, en adipocytes. La différenciation adipocytaire se caractérise principalement par une modification morphologique des cellules précurseurs (passage de la forme fibroblastique à une forme ronde avec accumulation de gouttelettes de triglycérides), un changement phénotypique, et l'apparition des marqueurs spécifiques de l'adipocyte, par exemple le hPPARy2 (récepteur y2 humain activé par les proliférateurs de péroxisome ("human peroxisome proliferator activated receptor y"), et la haP2 (protéine humaine de liaison des acides gras ("human adipocyte fatty acid binding protein"). Une induction de l'expression de certains enzymes, par exemple la glycérophosphate déshydrogénase (GPDH), est également constatée au cours de la différenciation adipocytaire.

Selon l'invention, l'inhibition par le NDGA de la formation d'adipocytes a lieu à un stade précoce de la différenciation, notamment avant l'apparition de marqueurs spécifiques d'adipocytes, tels

que le hPPARy2 ou la haP2, avant l'expression d'activité enzymatique spécifique, telle que l'activité GPDH, et avant la formation d'adipocytes chargés de triglycérides.

L'effet anti-adipogénique du NDGA et de ses dérivés peut être mis en évidence in vitro en mesurant soit le niveau d'expression de marqueurs adipocytaires, soit le niveau d'activité enzymatique spécifique, présentés par des cellules humaines multipotentes en présence du NDGA ou de ses dérivés, après plusieurs jours de culture dans un milieu de différenciation adipocytaire. Ces niveaux sont comparés avec ceux présentés par les mêmes cellules en l'absence du NDGA ou de ses dérivés. Les cellules ayant été exposées au milieu contenant du NDGA présentent un niveau d'expression des marqueurs adipocytaires, ou un niveau d'activité enzymatique, largement inférieur aux niveaux constatés en l'absence du NDGA ou de ses dérivés. Pour effectuer les mesures de niveau d'expression, le hPPARy2 ou la haP2 conviennent comme marqueurs spécifiques adipocytaires. Leurs niveaux d'expression peuvent être déterminés par dosage d'ARNm ou de protéines. Pour effectuer les mesures de niveaux d'activité enzymatique, l'activité GPDH peut être utilisée.

De préférence, l'effet anti-adipogénique du NDGA et de ses dérivés est mis en évidence en mesurant l'activité glycérophosphate déshydrogénase (GPDH), par exemple en mettant en oeuvre les essais décrits dans les protocoles expérimentaux ci-dessous.

Le principe du dosage GPDH est résumé sur ce schéma:
GPDH Dihydroxyacétone phosphate + NADH# Glycérophosphate + NAD La vitesse initiale de disparition du NADH est déterminée à 340nm (en présence de NADH, DHAP et du lysat cellulaire), permettant ainsi de calculer la quantité de substrat dégradé, et par conséquent, l'activité enzymatique spécifique (après dosage des protéines).

Dans le contexte de l'invention, une inhibition significative de la différenciation adipocytaire signifie une diminution significative du point de vue statistique de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport aux cellules différenciées en adipocytes en l'absence de traitement. Cette inhibition significative se traduit par exemple par une diminution d'au moins 10%, ou d'au moins 15% ou 30 % de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport aux cellules différenciées en adipocytes en l'absence de traitement, de préférence d'au moins 50 %, plus particulièrement d'au moins 60 %, et préférentiellement d'au moins 80% de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport au contrôle.

Le procédé de mise en évidence de l'effet anti-adipogènique comporte de préférence les étapes suivantes (voir Figure 1) : - Multiplication des cellules souches ou précurseurs jusqu'à confluence ;
Initiation de la différenciation (Jour 0) par mise en culture des cellules dans un milieu de différenciation adipocytaire, en absence de sérum de veau foetal, et en présence du
NDGA ou de l'un de ses dérivés, à la concentration désirée, pendant 12 jours ;
Maintien de la présence du NDGA ou de ses dérivés jusqu'à la détermination de l'activité
GPDH, cette étape de détermination pouvant intervenir à tout moment entre le Jour 0 et le Jour 12. Une réduction significative de l'activité spécifique de la GPDH par rapport au niveau d'activité en l'absence de traitement peut être constatée à partir de Jour 1, et atteint généralement une réduction d'au moins 50% à partir de Jour 3. De préférence la détermination de l'activité GPDH est donc effectuée entre le Jour 3 et le Jour 12;
Le milieu de culture est changé tous les deux jours jusqu'à Jour 12.

Les effets anti-adipogéniques du NDGA, et de ses dérivés, se manifestent sur des cellules souches adultes humaines, ainsi que sur des préadipocytes humains. Dans le contexte de l'invention, le terme cellule souche désigne une cellule multipotente ayant une capacité d'autorenouvellement élevée, une activité télomérase significative, et une capacité à rentrer en quiescence. Ces cellules multipotentes sont capables de se différencier en au moins deux types cellulaires, et de préférence en au moins trois ou quatre types cellulaires différents. Le terme préadipocyte désigne toute cellule précurseur de l'adipocyte déjà engagée dans une voie de différenciation adipocytaire. Les préadipocytes sont également désignés cellules précurseurs des adipocytes . Comme exemple de préadipocytes humains susceptibles d'être utilisés pour la mise en évidence in vitro de l'effet antiadipogénique du NDGA ou de ses dérivés, l'on peut citer la lignée cellulaire de préadipocytes bruns humains PAZ-6 (Réf. 10, et demande de brevet internationale WO 9634100). Cette lignée a été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisms (CNCM) de l'Institut Pasteur, sous le numéro 1-1531. L'on peut également citer les cellules dénommées SGBS Adipocytes (Réf. 11).

Les effets anti-adipogéniques du NDGA et ses dérivés se manifestent de façon particulièrement évidente sur des cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux humain. Comme exemple de ces cellules souches préférées, l'on peut citer des cellules multipotentes décrites dans la demande de brevet internationale n PCT/FR 03/02439. Plus précisément, ces cellules multipotentes, après avoir atteint la quiescence, présentent de façon stable le phénotype suivant in vitro :
HLA classe # négative,
HLA classe Il négative,

CD3 négative,
CD13 positive,
Oct-4 positive,
Rex-1 positive,
ABCG2 positive.

Ces caractéristiques phénotypiques s'associent à un caryotype normal, et à une activité télomérase significative. De préférence les cellules sont également LIF-R négatives. Ce phénotype est conservé in vitro de façon stable, c'est-à-dire en l'absence ou en présence de FGF-2, et à des concentrations de sérum de veau foetal qui peuvent dépasser 10%. Le phénotype est également conservé à des densités d'ensemencement élevées, et au-delà de 140 doublements de populations.

Ces cellules souches humaines multipotentes peuvent être obtenues en mettant en oeuvre un procédé comprenant les étapes suivantes : a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux provenant d'un enfant âgé de moins de dix ans, par exemple âgé de moins de cinq ans ; b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), à l'exception des adipocytes, c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), d) sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population CA et population CS , la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population CS présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures, e) enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence, f) éventuellement, induction d'une prolifération accrue des cellules souches de la population CA , par exemple par addition d'un facteur de croissance.

Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que le NDGA inhibe, de façon importante, la différenciation de cellules souches multipotentes en adipocytes, et cela à un stade précoce de la différenciation, c'est-à-dire avant l'apparition des marqueurs cellulaires ou enzymatiques, spécifiques des adipocytes. De ce fait, le NDGA, ou un dérivé de celui-ci, se prête à une utilisation comme principe actif dans une composition cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains.

Lorsque les compositions anti-adipogéniques de l'invention sont utilisées dans un contexte cosmétique, elles sont destinées à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales non-pathologiques, à la prévention ou au traitement de la cellulite, à la prévention ou au traitement de capitons, ou au raffermissement cutané.

Les compositions à base de NDGA, ou de ses dérivés, peuvent également être utilisées dans des applications dermo-pharmaceutiques, auquel cas, elles sont destinées à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales pathologiques impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme, tels que le surpoids et l'obésité.

Les concentrations de NDGA ou de ses dérivés utilisées dans les compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques de l'invention sont de l'ordre de 0.0001 % à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition, par exemple à une concentration comprise entre 0.001% et 5% en poids, de préférence entre 0.001% et 1 % en poids.

Les compositions anti-adipogèniques cosmétiques et dermo-pharmaceutiques de l'invention sont généralement formulées pour une administration par voie cutanée, percutanée ou transcutanée. L'administration par voie cutanée consiste en une administration sur la peau, sans effraction de la peau, en vue d'une action locale (effet topique) ou non (effet systémique).

L'administration par voie percutanée, ou transcutanée conduit à une diffusion à travers les structures cutanées et sous-cutanées, et éventuellement à un effet systémique, après résorption sanguine. Lorsque les compositions anti-adipogéniques de l'invention sont destinées à une utilisation pharmaceutique autre que dermo-pharmaceutique, elles sont formulées pour une administration par voie intradermique, sous-cutanée ou orale.

Selon les aspects cosmétique et dermo-pharmaceutique de l'invention, la composition à base du NDGA, ou de ses dérivés, est appliquée directement sur la peau des parties du corps à traiter, par exemple sur les hanches, les cuisses, le bas-ventre, le ventre, les bras, la poitrine.

Alternativement, la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique peut être incorporée ou adsorbée dans des textiles susceptibles d'être mis directement au contact de la peau afin de permettre une délivrance topique continue.

Les compositions de l'invention sont présentées sous forme d'émulsion, de lait, de lotion, de gel, de pommade, d'huile corporelle, de savon, de spray, de stick, de gélules, de comprimés, de patch, de sirop, de solutés, ou de solutions. Le ou les principes actifs est (ou sont) incorporé(s) tel(s) quel(s) dans la composition sous forme de liposomes, macro-, micro-, nanoparticules, ou sont absorbé (s) surun support organique ou minéral.

Hormis le NDGA, ou ses dérivés, les compositions de l'invention contiennent généralement d'autres ingrédients, par exemple un excipient acceptable du point de vue cosmétique ou physiologique.

Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuvent contenir tout ingrédient habituellement utilisé en cosmétique, tels que polymères gélifiants, agents tensioactifs, agents émulsifiants, extraits de plantes, extraits marins, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits biotechnologiques, filtres solaires, et huiles essentielles.

En outre, les compositions cosmétiques et dermo-pharmaceutiques de l'invention peuvent contenir un deuxième principe actif. Dans le cas d'une composition cosmétique, le. deuxième principe actif peut être tout agent actif utilisé de façon courante en cosmétique. Il est de préférence choisi parmi les principes actifs suivants : un actif amincissant, un actif drainant, un activateur de la microcirculation, un protecteur des capillaires sanguins, ou encore un mélange d'au moins deux de ces principes actifs.

Lorsque les compositions à base de NDGA, ou de ses dérivés, contiennent, comme principe actif additionnel, un actif amincissant, celui-ci est de préférence un activateur de lipolyse, tel que la caféine, ou un dérivé de celle-ci comme le siloxanetriol alginate de caféine, ou une base xanthique favorisant la lipolyse. L'actif amincissant peut également être un inhibiteur de la lipoprotéine lipase.

Comme exemple de deuxième principe actif stimulant la microcirculation cutanée, l'on peut citer des extraits d'origine végétale, contenant par exemple des flavonoïdes, des ruscogénines et dérivés, et de l'aescine contenus dans les extraits de Ruscus aculeatus.

Selon une autre variante de l'invention, l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou un dérivé de celui-ci, est utilisé comme principe actif dans une composition alimentaire amincissante. Selon cet aspect de l'invention, la composition à base de NDGA, ou de ses dérivés, est formulée pour une ingestion orale, par exemple sous forme de comprimés, granules, biscottes, capsules, boissons, gâteaux etc. La teneur en NDGA, ou ses dérivés, est de préférence de l'ordre de 0.0001% à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition, par exemple à une concentration comprise entre 0.001% et 5% en poids, de préférence entre 0.001% et 1 % en poids. Dans le contexte de l'invention, le terme composition alimentaire inclut les compléments alimentaires à usage nutritionnel ou physiologique.

Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures : Figure 1 : schématique de l'essais d'activité GPDH à 340 nm (mesure du NAD consommé en présence de dihydroxyacétone phosphate). Abbréviations : J = jour; GPDH = Glycérophosphate déshydrogénase.

Figure 2 : représentation schématique de la réaction enzymatique utilisée dans les essais d'activité GPDH. Abbréviations: DHAP = dihydroxyacétone phosphate.

Figure 3 : Courbe étalon : NDGA et Morine.

Figure 4 : Courbe étalon : Quercétine.

Figure 5 : Activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 M NDGA et 10 M NDGA.

Figure 6 : spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 M Morine et 10 M Morine.

Figure 7 : Activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 M Quercétine et 10 M Quercétine Figure 8 : dose-réponse NDGA, illustrant l'activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de différentes concentrations de NDGA (0 à 10 M NDGA). L'inhibition de l'activité GPDH par le NDGA est concentration-dépendent.

EXEMPLES A MATERIEL ET METHODES A. 1 CULTURE DE CELLULES MULTIPOTENTES HUMAINES : Des cellules souches multipotentes (appelées cellules Primo 2CA ), sont obtenues à partir de tissu adipeux humain, par la mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet internationale PCT/FR 03/02439.

Plus particulièrement, les cellules souches sont obtenues par le procédé suivant : a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux provenant d'un enfant sain, âgé de moins de dix ans, par exemple d'un nouveau-né ou d'un enfant âgé de 2 ou 3 mois à 8 ans. Il peut s'agir d'enfants de sexe masculin ou féminin ; b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), (par exemple préadipocytes, cellules souches, cellules endothéliales, péricytes, mastocytes...) à l'exception des adipocytes. Les adipocytes peuvent être éliminés, par exemple, par centrifugation ; c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), et de préférence pendant 12 à 80 heures, par exemple 12 à 72 heures.

L'ensemencement des cellules est de préférence effectué à une densité comprise entre
1000 et 5000 cellules /cm2, par exemple 1000 à 3500 cellules /cm2. Le milieu de culture utilisé pour cette étape du procédé est normalement un milieu de culture type DMEM, additionné de sérum foetal sans ajout d'autres facteurs de croissance. Par exemple, un milieu particulièrement approprié est le suivant : DMEM+ 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g / ml de streptomycine).; d) sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population CA et population CS , la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population CS présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures (par exemple de 48 à 72h). La population CS se trouve après 12 heures de culture, en suspension dans le milieu de culture, alors que la population CA adhère aux boîtes. Les cellules souches se retrouvent uniquement dans la sous-population CA ; e) enrichissement de la population CA jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence. Cette enrichissement est obtenue par mise en culture de la population CA , dans un milieu sans facteurs de croissance rajouté, par exemple le milieu de culture DMEM+ 10% de sérum de veau foetal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine). Un transfert cellulaire est effectué lorsque les cellules arrivent à 80% de confluence et

l'ensemencement est effectué à haute densité, c'est-à-dire à une densité comprise entre
1000 à 5000 cellules / cm2, de préférence entre 2000 et 2500 cellules / cm2. A chaque transfert cellulaire, les cellules sont diluées par 2 ou par 3 au maximum, pendant environ
50-80 doublements de population (stade auquel la population CA est fortement enrichie en cellules souches. ) La population CA peut être considérée comme ayant atteint la quiescence lorsqu'il y a arrêt spontané de la prolifération à 70% de confluence environ ; f) induction d'une prolifération accrue des cellules souches de la population CA , par exemple par addition d'un facteur de croissance, tel que le FGF-2 humain. Après avoir atteint la quiescence, la prolifération des cellules de la population CA est induite par trypsinisation et dilution des cellules dans de nouvelles boîtes.

Les cellules multipotentes ( souches ) sont toujours maintenues à 37 C dans un incubateur assurant une atmosphère humide (95% air ; 5% CO2).

Milieu de culture pour les cellules souches en prolifération: Les cellules multipotentes sont cultivées en milieu DMEM enrichi par 10% de sérum de veau foetal (FCS) décomplémenté (chauffage 20 minutes à 56 C), supplémenté en antibiotiques (62 g/ml de pénicilline et 50 g/ml de streptomycine) et en FGF-2 humain à une concentration finale entre 2,5 ng/ml et 10ng/ml (Sigma F0291).

Entretien: Les cultures d'entretien sont ensemencées dans des boîtes de 100 mm de diamètre à raison de 2,5.105 cellules par boîte. Le milieu est changé tous les deux jours. Les cellules sont trypsinées (Gibco Trypsine-EDTA 1X Invitrogen Corporation) lorsqu'elles arrivent environ à 70% de confluence. Elles conservent ainsi leur plasticité cellulaire.

Protocole de différenciation adipocytaire: Lorsque les cellules atteignent la confluence, celles-ci sont maintenues 24h à 48h supplémentaires dans le milieu de culture en l'absence de FGF-2. A ce stade, la différenciation adipocytaire peut alors être induite.

A JO (début de la différenciation), le milieu de culture est changé et les cellules sont désormais cultivées en milieu DMEM/F12 (1:1), en absence de sérum de veau foetal (FCS) mais alors supplémenté en antibiotiques (62 g/ml de pénicilline et 50 /ml de streptomycine) et en différents produits détaillés dans le tableau suivant :

@

<tb>
<tb> Finale <SEP> initiale <SEP> pour <SEP> Conservation <SEP> après
<tb> Finale <SEP> initiale <SEP> pour <SEP> 10 <SEP> ml <SEP> décongélation
<tb>

Insuline Sigma 1-9278 0.86 PM 10 mg/ml 5 ul 4 C

<tb>
<tb> Transferrine <SEP> Sigma <SEP> T-2252 <SEP> 10 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> mg/ml <SEP> 100 <SEP> l <SEP> 4 C
<tb> T3 <SEP> Sigma <SEP> T-6397 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> nM <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 1 <SEP> l <SEP> -20 C
<tb> Ciglitazone <SEP> Biomol <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 2 <SEP> l <SEP> -20 C
<tb>

!BMX*S/gma/-708 100 uM 100 mM 10 ul Jetée après usage

<tb>
<tb> Dexaméthasone* <SEP> Sigma <SEP> D-4902 <SEP> 1 <SEP> M <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 10 <SEP> l <SEP> -20 C
<tb>
* uniquement les 72 premières heures de différenciation (JO à J3).

Le milieu est ensuite changé tous les deux jours jusqu'au 12ème jour.

A. 2 Screening des produits - test de cytotoxicite au MTT Préparation des solutions mères des produits testés :

<tb>
<tb> Stockage <SEP> P.M <SEP> en <SEP> Solutions <SEP> mères <SEP> à <SEP> préparer <SEP> Solution
<tb> g/mole <SEP> en <SEP> mM <SEP> pour <SEP> la
<tb> dilution
<tb> Acide <SEP> nor- <SEP> RT <SEP> 302,4 <SEP> 10 <SEP> ; <SEP> 5 <SEP> ; <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 0,5 <SEP> ; <SEP> 0,1 <SEP> DMSO
<tb> dihydroguaiarétique
<tb> Quercétine <SEP> RT <SEP> 338,3 <SEP> 10 <SEP> ; <SEP> 5 <SEP> ; <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 0,5 <SEP> ; <SEP> 0,1 <SEP> DMSO
<tb> Morine <SEP> RT <SEP> 302 <SEP> 10 <SEP> ; <SEP> 5 <SEP> ; <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 0,5 <SEP> ; <SEP> 0,1 <SEP> DMSO
<tb>
Les cellules préadipocytaires (appelées cellules souches Primo 2CA ) sont ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 5.103 cellules par puits dans le milieu de prolifération (DMEM +10% FCS) en l'absence de FGF-2 humain. 24 heures après, la différenciation est induite selon le protocole de différenciation décrit plus haut en ajoutant ou pas les produits à tester dans le milieu de culture.

Le test au MTT ((3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) permet d'éliminer tous les produits qui s'avèrent toxiques pour les cellules. Le MTT est un colorant soluble jaune qui est dit supravital avec une étape de métabolisation, c'est à dire qu'il est absorbé par les cellules

vivantes puis métabolisé par les enzymes mitochondriales (succinate déshydrogénase) en un composé bleu foncé : le formazan, qui se présente sous forme de cristaux violets insolubles en milieu aqueux. La formation de formazan dépend directement de l'activité de la succinate déshydrogénase et donc du nombre de cellules viables.

Afin d'obtenir des concentrations finales de l'ordre du M, 1 l des solutions mères préparées auparavant est pris dans 1 ml de milieu de différenciation adipocytaire. 100 l de ces dilutions sont ensuite déposés par puits en duplicat.

Pour les contrôles positifs, le milieu est dépourvu de produit mais contient du DMSO.

Les puits situés au pourtour de la plaque de 96 puits ne sont pas ensemencés. Ils. pourraient sinon générer des erreurs lors de la lecture au spectrophotomètre. Les puits représentant le blanc restent vides. Ils mesurent le bruit de fond. Les puits représentant les contrôles positifs (mortalité de base prise comme 0 % de mortalité). ne reçoivent aucun produit. Les puits recevant les produits à tester (1/1000 des solutions mères préparées) sont ensemencés à 5.103 cellules par puits.

Le milieu de différenciation avec ou sans les drogues à tester est changé tous les deux jours jusqu'au 12èmejour.

A J12, on ajoute 10 l de MTT par puits (ROCHE Cell Prolifération kit # MTT). Les plaques sont mises dans un incubateur assurant une atmosphère humide (95% air ; 5% CO2) pendant 4 heures. On y ajoute ensuite 100 l par puits de la solution de solubilisation (ROCHE Cell Prolifération kit # MTT). Elles sont ensuite placées dans l'incubateur pendant la nuit.

La lecture est faite le lendemain matin au spectrophotomètre à 550 nm.

Les DO sont alors comparées à la DO du témoin prise comme 0% de mortalité.

% mortalité = [(D.O (0 % mortalité)) - (D.O (produit)) * 100] / (D.O (0 % mortalité) A. 3 CRIBLAGE PAR ESSAI DE L'ACTIVITE GLYCEROPHOSPHATE DESHYDROGENASE (GPDH) Une fois le test de cytotoxicité au MTT terminé, certains produits ont été sélectionnés pour leur absence de cytotoxicité. Afin de suivre l'effet éventuel de ces produits sur la différenciation adipocytaire, ils sont alors criblés par des essais d'activité GPDH à 340 nm (mesure du NAD réduit consommé en présence de dihydroxyacétone phosphate). (Voir Figure 1)

Principe et protocole de dosage de la Glycérophosphate déshydrogénase GPDH : Une différenciation adipocytaire est réalisée sur des plaques 24 puits. L'ensemencement de départ est de 105 cellules par puits, 24 heures avant le début de la différenciation.

A J12, les plaques sont mises sur de la glace. Le milieu de culture est aspiré. Les puits sont délicatement rincés avec du PBS (Gibco BRL, Life Technologies) afin de ne pas décoller le tapis cellulaire. 200 l de tampon d'homogénéisation froid (Tris 242g (20 mM) ; 37,2 mg (1mM) ; (3-mercaptoéthanol 7 l (1mM) ; H2O 100 mi qsp ; ajuster à un pH de 7,3) sont ajoutés par puits. Les cellules sont ensuite récupérées avec un Policeman ou une pointe de pipette puis déposées dans des tubes de 1,5 ml. L'homogénat obtenu est soumis à un traitement sonique entre 20 et 30 Hz pendant 10 à 15 secondes tout en gardant les tubes dans la glace.

On détermine la vitesse initiale de disparition du NADH à 340 nm ce qui permet de calculer la quantité de substrat consommé par puits, puis l'activité enzymatique spécifique après dosage des protéines (Voir Figure 2).

Le dosage : Dans une cuve de spectrophotomètre sont ajoutés : 830 l d'eau, 100 l de tampon de dosage (Triéthanolamine 14,9g (1 M) ; ss-mercaptoéthanol 7 l (1mM) ; EDTA 930 mg (25mM) ; H20 100 ml qsp ; ajuster le pH à 7,7) à température ambiante, 10 l de NADH à 12,5 mM en concentration initiale (Roche).

On vérifie que la D.O de base se trouve autour de 0,6 à 0,8. Puis on ajoute 50 l d'homogénat et 10 l de DHAP à 20 mM initial (Roche).

On lit ensuite la variation de D.O à 340 nm.

Les calculs : Le coefficient d'extinction du NADH à 340 nm est de 6220 (la D.O à 340 nm d'une solution de NADH 1 M = 6220). D'où pour une solution à 1 nmole/ml # 0,00622
D.O /mn (vitesse d'oxydation du NADH) * Volume du tampon d'homogénéisation (200 NI)
0,00622 * Volume d'homogénat dosé (en général 50 NI) exprimé en nmoie/min/puits

Exemple de calcul : Activité = 12 nmoles/min pour 50 l d'homogénat Au total pour 200 l d'homogénat : (12 * 200) / 50 = 48 nmoleslminlpuits Dosage des protéines : pour 5 l d'homogénat on obtient une D.O = 0.1 Donc pour 200 [il d'homogénat (1 puits) = (200 * 0.1) /5 = 4 Courbe étalon BSA : 1 g de protéine = 0,05 D.O Donc pour 1 puits: (4 * 1) / 0.05 = 80 pg de protéines AS = (48 * 1000) / 80 = 600 nmoleslminlmg de protéines A. 5 COURBE DOSE-REPONSE Les cellules sont ensemencées dans une plaque 24 puits à raison de 105 cellules par puits dans du milieu de culture classique utilisé pour l'entretien mais sans FGF-2 humain. 24 heures après, les cellules sont mises dans du milieu de différenciation contenant ou pas, le produit retenu (NDGA) à des concentrations croissantes allant de 2 à 10 uM.

Le milieu de différenciation, contenant ou pas le NDGA, est changé tous les deux jours. La différenciation est arrêtée au 12ème jour et des dosages d'activité de la glycérophosphatase déshydrogénase sont effectués.

B. RESULTATS B. TEST DE CYTOTOXICITE AU MTT Tous les composés sont testés en duplicat à différentes concentrations finales (10 ; 5 ; 1 ; 0,5 ; 0,1 M).

Les résultats obtenus au test de cytotoxicité au MTT sont rapportés dans le tableau 1.

On constate que les trois composés testés (la quercétine, l'acide nor-dihydroguaiarétique, la morine), ne présentent aucune toxicité pour les cellules.

Tous les composés sont donc testés en fin de différenciation adipocytaire pour leur effet antiadipogénique par essais d'activité GPDH

B.2 CRIBLAGE PAR DES ESSAIS D'ACTIVITE DE LA GLYCEROPHOSPHATE DESHYDROGENASE (GPDH) Les composés sélectionnés sont testés en triple à deux concentrations différentes :

<tb>
<tb> Produits <SEP> Concentrations <SEP> finales <SEP> pour <SEP> le <SEP> criblage
<tb> Quercétine <SEP> 10 <SEP> et <SEP> 2,5 <SEP> pM <SEP>
<tb> Acide <SEP> nor-dihydroguaiarétique <SEP> 10 <SEP> et <SEP> 2,5 <SEP> M
<tb> Morine <SEP> 10 <SEP> et <SEP> 2,5 <SEP> M
<tb>
Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 2 et 3 et dans les figures 3 et 4. Les figures 5,6 et 7 présentent les histogrammes révélant l'activité spécifique en nmojes/min/mg de protéines de tous les composés non cytotoxiques testés.

Le NDGA se révèle être non cytotoxique et anti-adipogénique (tableau 4) aux concentrations testées.

B.4 COURBE DOSE-REPONSE La courbe dose-réponse nous renseigne sur l'activité spécifique (en nmoles/min/mg de protéine) en fonction des différentes concentrations de NDGA (0 ; 2 ; 6 ; et 10 uM). Les résultats sont rapportés dans le tableau 4 et la Figure 8. L'IC50 (concentration requise pour une inhibition de 50 %) est à 4,5 uM.

En conclusion, l'acide nor-dihydroguaiarétique se révèle être non toxique et possède un effet anti-adipogénique sur les cellules humaines au cours de leur différenciation en adipocytes. Il est donc adapté à une utilisation en thérapie et en cosmétique, en pharmaceutique (ou en thérapeutique) et en alimentaire.

C FORMULATIONS COSMETIQUES Les compositions à base de NDGA peuvent être incluses dans des formulations cosmétiques des types suivants :

CREME AMINCISSANTE
Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 GLYCERINE 5.00 CARBOPOL 0.20 SEL SODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0. 10 HUILE DE FEUILLE (LEAF OIL) de CAMELLIA SINENSIS 2. 00 POLYISOBUTENE HYDROGENE 8.00 STEARATE DE GLYCERYLE SE 2.00 DIMETHICONE 1. 00 STEARATE DE GLYCERYLE ET PEG-100 STEARATE 1.50 TRIETHYLHEXANOINE 5. 00 ACIDE STEARIQUE 2. 00 ALCOOL CETYLIQUE 1. 00 SILICE 1. 00 MALEATE DE DICAPRYLE 6. 00 STEARATE DE GLYCERYLE 1.00 DIMETHICONE 3. 50 EAU (WATER) 2.30 TRIETHANOLAMINE 0. 50 PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.70 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE FRAGRANCE 0.30 ACETATE DE TOCOPHEROL 0.50 CAFEINE 2. 00 HYALURONATE DE SODIUM 0. 04 EXTRAIT DE CENTELLA ASIATICA 1.00 EXTRAIT DE RUSCUS ACULEATUS 1.00 NDGA ou dérivés 0. 001 à 10

GEL AMINCISSANT
Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 SEL SODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0. 20 CARBOPOL 0.50 GLYCERINE 3.00 POLYGLYCERYLMETHACRYLATE ET PROPYLENEGLYCOL 5. 00 DIPROPYLENEGLYCOL 3. 00 BUTYLENEGLYCOL 5. 00 PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.65 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE TRIETHANOLAMINE 0. 50 CAFEINE 2. 00 EXTRAIT DE RUSCUS ACULEATUS 1.00 NDGA ou dérivés 0. 001 à 10 SERUM AMINCISSANT
Nom INCI Quantité EAU(WATER) QSP 100 SEL TRISODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0. 10 HYDROXYETHYLCELLULOSE 0.10 GOMME DE XANTHANE 0.30 PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.65 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE BUTYLENEGLYCOL 5. 00 MONOSTEARATE POLYOXYETHYLENIQUE (20) DE SORBITANNE 1.00 FRAGRANCE 0.05 ACETATE DE TOCOPHEROL 0.10 CITRATE DE SODIUM 0.65 CAFEINE 2. 00 NDGA ou dérivés 0. 001 à 10

CREME TEINTEE AMINCISSANTE Nom INCI Quantité
EAU (WATER) QSP 100
SILICATE DOUBLE D'ALUMINIUM ET DE MAGNESIUM 0. 50
GOMME DE CELLULOSE 0.35
GLYCERINE 3. 00
POLYVINYLPYRROLIDONE (PVP) 5.00 DI PROPYLENEGLYCOL 0. 05
PROPYLENEGLYCOL 2. 00
PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 1.00 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE
GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0.20
TRIETHANOLAMINE 0. 70
PALMITATE D'ISOPROPYLE 4. 00
HUILE MINERALE (MINERAL OIL) 2. 00
HEXYLDECANOL 3.00
STEARATE DE GLYCERYLE 2. 00
ACIDE STEARIQUE (STEARIC ACID) 2. 40
ACIDE OLEIQUE (OLEIC ACID) 0. 50
MONOSTEARATE POLYOXYETHYLENIQUE (60) DE SORBITANNE 0. 70
TOCOPHEROL 0.50
DIOXYDE DE TITANE (TITANIUM DIOXIDE) 7. 00
OXYDE DE FER (IRON OXIDE) 4. 00
NYLON-2 6.00
HYALURONATE DE SODIUM 0. 01
FRAGRANCE 0.50
PROPYLENEGLYCOL DICAPRYLATE / DICAPRATE 7. 20
NDGA ou dérivés 0. 001 à 10

<tb> Tableau <SEP> 1
<tb> %D.O <SEP> par <SEP> rapport <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 0.0 <SEP> par <SEP> rapport <SEP> %D.O <SEP> par <SEP> rapport
<tb>

PRODUIS 10 au M contrôle 1) en duplicat 2) Moycnne % Mortalité 5/11\1 au contrôle 1) en duplicat ! 2) Moyenne ^/, Mortalité 1 pM au contrôle I) en duplicaf ' 2) Moyenne % Mortalité 1) Acide nor-dihydroguaiarétiquc 2.8 ,7S 197 ############TTr*###5###############)"2###0### 2)Quercétinc 147 ? 193 170 0 .23 i 141 ,33 0 97 H 452 0 Quercétine 147 193 170 123! 142 133 118 108 3) Morine 128! 227 178 0 ,,5 204 160 0 107 184 146 % 0.0 par rapport '% D.O par rapport ############################## aueontr6)eendup)icat ~~~~~~~~~~~~~ au contrôle en duplicat ~~~~~~~~~~~~~~~~~ 0.5/11\1 contrôle duplicat I ! | 2) Moyennc %, Mortalité 0,1 yM jj en duplicat 2) Moyenne % Mortalité

Tableau 2

<tb> Activité <SEP> D.O <SEP> protéines <SEP> Quantité <SEP> en <SEP> g <SEP> de <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> en <SEP> Moyenne <SEP> des
<tb> Unités <SEP> D.O/min <SEP> nmoles/min/puits <SEP> pour <SEP> 10 <SEP> fil <SEP> protéines <SEP> (pour <SEP> 200 <SEP> l <SEP> nmoles/mn/mg <SEP> de <SEP> triplicats
<tb> nmo <SEP> pUits <SEP> d'homogénat <SEP> d'homogénat) <SEP> protéines <SEP> trip@cats
<tb> Acide <SEP> Contrôle <SEP> 0,11 <SEP> 70,7 <SEP> 0,164 <SEP> 54,67 <SEP> 1294,0 <SEP> 1294
<tb> Nor-dihydroguaiaretique <SEP> 10 <SEP> M <SEP> 0,001 <SEP> 0,6 <SEP> 0,02 <SEP> 6,67 <SEP> 96,5
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0,04 <SEP> 13,33 <SEP> 0,0 <SEP> 51
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,003 <SEP> 1,9 <SEP> 0,103 <SEP> 34,33 <SEP> 56,2
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,061 <SEP> 39,2 <SEP> 0,107 <SEP> 35,67 <SEP> 1099,9
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,073 <SEP> 46,9 <SEP> 0,118 <SEP> 39,33 <SEP> 1193,5 <SEP> 1070
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,068 <SEP> 43,7 <SEP> 0,143 <SEP> 47,67 <SEP> 917,4
<tb> Morine <SEP> Contrôle <SEP> 0,095 <SEP> 61,1 <SEP> 0,163 <SEP> 54,33 <SEP> 1124,4 <SEP> 1124
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,117 <SEP> 75,2 <SEP> 0,139 <SEP> 46,33 <SEP> 1623,9
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,117 <SEP> 75,2 <SEP> 0,153 <SEP> 51,00 <SEP> 1475,3 <SEP> 1484
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,115 <SEP> 74,0 <SEP> 0,164 <SEP> 54,67 <SEP> 1352,8
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,126 <SEP> 81,0 <SEP> 0,12 <SEP> 40,00 <SEP> 2025,7
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,11 <SEP> 70,7 <SEP> 0,164 <SEP> 54,67 <SEP> 1294,0 <SEP> 1514
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,116 <SEP> 74,6 <SEP> 0,183 <SEP> 61,00 <SEP> 1222,9
<tb>

Tableau 3

<tb> Unités <SEP> Activité <SEP> en <SEP> D.O <SEP> protéines <SEP> Quantité <SEP> en <SEP> g <SEP> de <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> en <SEP> Moyenne <SEP> des
<tb>

Unités D.0/min 1 / . /. pour 10 Il protéines (pour 200 lll nmoles/mn/mg de . 1. nmo es mm pUitS, énat d'homo énat "tnp Icats d'homogénat d'homogénat) protéines imputais

<tb> Quercetine <SEP> Contrôle <SEP> 0,034 <SEP> 21,9 <SEP> 0,082 <SEP> 27,33 <SEP> 799,9 <SEP> 800
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,051 <SEP> 32,8 <SEP> 0,084 <SEP> 28,00 <SEP> 1171,3
<tb> 10 <SEP> M <SEP> 0,038 <SEP> 24,4 <SEP> 0,078 <SEP> 26,00 <SEP> 939,9 <SEP> 1056
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,082 <SEP> 52,7 <SEP> 0,112 <SEP> 37,33 <SEP> 1412,5
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,083 <SEP> 53,4 <SEP> 0,096 <SEP> 32,00 <SEP> 1668,0 <SEP> 1558
<tb> 2,5 <SEP> M <SEP> 0,081 <SEP> 52,1 <SEP> 0,098 <SEP> 32,67 <SEP> 1594,6
<tb>

Tableau 4

<tb> Concentration <SEP> finale <SEP> D.O/min <SEP> Activité <SEP> D.O <SEP> protéines <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> protéines <SEP> en <SEP> g <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> Moyenne
<tb>

du NDGA en NIVi en nmoles/min/puits (pour 10 fil d'homogénat) (pour 200 III d'homogénat) en nmoles/min/mg de protéines des AS

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Harry's Cosmeticology, J. B. Wilkinson and R. J. Moore (Eds), 7th Edition 1982, Chemical 12 Publishing, New York, pp. 718, 722-724.

Claims

REVENDICATIONS Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition cosmétique, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains ou comme principe actif dans une composition dermo-pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme.

Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est une molécule naturelle, obtenue par extraction végétale.

Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le principe actif est contenu dans un extrait végétal.

Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est une molécule de synthèse.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la composition cosmétique est destinée à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales non-pathologiques, à la prévention ou au traitement de la cellulite, à la prévention ou au traitement de capitons, ou au raffermissement cutané.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition dermo-pharmaceutique est destinée à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales pathologiques, tels que le surpoids et l'obésité.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition cosmétique, ou dermo-pharmaceutique contient l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou le dérivé de celui-ci, à une concentration comprise entre 0.0001% et 10% en poids, de préférence entre 0.001% et 5% en poids, et plus préférentiellement entre 0.001% et 1.0% en poids, par rapport au poids total de la composition Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique est appliquée par voie cutanée, percutanée ou transcutanée.

<Desc/Clms Page number 27>

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique se présente sous forme d'émulsion, de lait, de lotion, de gel, de pommade, de huile corporelle, de savon, de spray, de stick, de gélules, de comprimés, de patch, de sirop, de solutés, de solutions.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le ou les principes actifs sont incorporé(s) dans la composition sous forme de liposomes, macro-, micro-, nanoparticules, ou sont absorbé (s) sur un support organique ou minéral.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition cosmétique contient en outre un excipient cosmétiquement acceptable, et éventuellement tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique, tels que polymères gélifiants, agents tensioactifs, agents émulsifiants, extraits de plantes, extraits marins, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits biotechnologiques, filtres solaires, huiles essentielles.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la composition dermo-pharmaceutique contient en outre un excipient acceptable du point de vue physiologique.

Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique contient un deuxième principe actif.

Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le deuxième principe actif est choisi parmi les principes actifs suivants : un actif amincissant, un actif drainant, un activateur de la microcirculation, un protecteur des capillaires sanguins.

Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'actif amincissant est un activateur de lipolyse, tel que la caféine, ou un inhibiteur de la Lipoprotéine Lipase.

Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique est incorporée ou liée ou adsorbée dans les textiles susceptibles d'être mis directement au contact de la peau afin de permettre une délivrance topique continue.

Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou un dérivé de celui-ci , en association avec un agent lipolytique tel que la caféine

<Desc/Clms Page number 28>

ou un dérivé de celle-ci comme le siloxanetriol alginate de caféine, ou une base xanthique favorisant la lipolyse.

Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou un dérivé de celui-ci, en association avec un inhibiteur de Lipoprotéine Lipase.

Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou un dérivé de celui-ci, en association avec un extrait végétal stimulant la microcirculation cutanée comme les flavonoïdes, les ruscogénines et dérivés, l'aescine contenus dans les extraits de Ruscus aculeatus.

Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition alimentaire amincissante.

Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme, ledit médicament étant formulé pour administration par voie intradermique, sous-cutanée ou orale.