CN101380382A - 一种具有抗氧化活性的中药提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗氧化活性的中药提取物，该提取物是强肌健力方中药的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色谱具有以下图谱特征：在保留时间依次为5.30±0.05min、5.80±0.10min和6.55±0.35min处有吸收峰，吸收峰的相对峰面积依次为4.43～10.48％、32.9～56.03％和1.75～2.02％；其中，所述的高效液相色谱条件为：色谱柱：DikmaDiamonsil C18 5um 250×4.6mm；样品：1mg/mL的所述提取物的无水乙醇溶液；进样量：20μL；流动相：体积比为25∶70∶3∶2的水、甲醇、乙腈和THF混合物；流速：0.500ml/min；检测波长：225nm。本发明所述提取具有较强的抗氧化活性，对骨髓间充质干细胞具有保护作用，可用于制备保护骨髓间充质细胞的药物。

Description

一种具有抗氧化活性的中药提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种医药配制品，具体涉及一种中药材的提取物。

背景技术

强肌健力方，是我国著名老中医邓铁涛教授经验方，源于金元四大家之一李东垣补中益气汤。但又有异于原方，不同者有三：一是东垣之补中益气汤用药分量颇轻；二是东垣立此方，是治疗“脾胃之气下流，使谷气不得升浮”所致的“气高而喘，身热而烦，其脉洪大而头痛，或渴不止，其皮肤不任风寒而生寒热”之证；三是东垣所立之法“甘温除大热”之法。“强肌健力饮”与“补中益气汤”药味虽同，但分量各异，以致所主治之病证，所针对之病机以及立法组方之旨亦不相同。后人又总结历代运用补中益气汤的经验，改变了配伍分量成为“补中益气丸”(炙黄芪200g、党参60g、炙甘草100g、白术60g、当归60g、升麻60g、柴胡60g和陈皮60g载《中国药典》2000年版第一部480页)。药典“补中益气丸”，黄芪与甘草分量最多，且均炙用，党参、白术、当归、升麻、柴胡、陈皮分量相等。邓铁涛教授根据张锡纯治大气下陷宜重用生箭黄芪之经验，黄芪重用，生用而不用炙，甘草轻用亦不用炙，取其不致甘守太过之意；陈皮轻用以作反佐，取其行气而无损气之弊。

邓铁涛教授治疗重症肌无力重用黄芪，受清代名医王清任《医林改错》补阳还五汤之启发，该方取“治痿独取阳明”之意，重用生黄芪四两(120克)为主药，在于救脾胃，主肌肉，充肺气，主升陷，营卫充和，气血流畅，达到强肌健力之目的，以之为君；党参、白术健脾，当归质润辛温入血以配参芪，使气血相生，阴阳相济，肌肉得以濡养，以上3药任臣药之职；柴胡、升麻升发脾阳，共为佐药。陈皮一味以反佐，达理气行滞、舒畅气机之目的；甘草和中，调和诸药，作使药之用。

强肌健力方(也称为强肌健力系列)包括强肌健力饮、强肌健力胶囊和强肌健力口服液三种剂型。

第一种剂型，强肌健力饮，为中药饮片，需要煎煮，上世纪50年代开始使用，其配方为：黄芪20∶党参6∶白术5∶当归4∶升麻3∶柴胡∶陈皮1∶甘草1。

第二种剂型，强肌健力胶囊，1988年开始在广州中医药大学第一附属医院使用至今，其配方为：黄芪84.0Kg，柴胡12.6Kg，白术21.0Kg，甘草4.2Kg，陈皮4.2Kg，当归16.8Kg，党参25.2Kg，升麻12.6Kg和五爪龙21.0Kg(邓铁涛教授强肌健力系列治疗重症肌无力简介，载于《理论探讨临床应用实验研究邓铁涛基金资助课题论文汇编》广州：广州中医药大学邓铁涛研究所，2006：90)。

第三种剂型，强肌健力口服液。配方为：黄芪560克，党参168克，白术140克，当归113克，升麻87克，柴胡80克，陈皮28克，甘草28克，山梨酸钾2克，果葡糖浆50ml，共制成1000ml。该制剂由广州中医学院花都制药厂和广州中医学院中药与保健开发研究所共同研制所得，载于“强肌健力饮申报资料”(1994年)项目4“制备工艺及其研究资料”第2页，2003年获国家药监局临床研究批文，批文号为2003L00874。

现代中医学研究表明，强肌健力方入脾经，益气补脾之力强。在治疗与骨髓间充质干细胞含量水平有关的疾病中常用强肌健力方与其它药物进行配伍，但普遍存在治疗周期长，效果不明显的缺陷。随着科学技术的发展，中医药领域引入了现代提取方法提取中药有效成分，以提高药效和降低副作用。目前，中药的提取方法主要有氯仿-甲醇超声提取，乙醇提取和水提取。由于氯仿和甲醇都是有毒性溶剂，因此氯仿-甲醇超声提取物主要进行脂溶性化学成分分析。乙醇提取物和水提取物为最常用中药的提取方法，但是本发明人发现强肌健力乙醇提取和水提取物的抗氧化活性较低，对骨髓间充质干细胞无保护作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗氧化活性的中药提取物。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种具有抗氧化活性的中药提取物，该提取物是强肌健力方中药的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色谱具有以下图谱特征：在保留时间依次为5.30±0.05min、5.80±0.10min和6.55±0.35min处有吸收峰，所述吸收峰的相对峰面积依次为4.43～10.48％、32.9～56.03％和1.75～2.02％；其中，

所述的高效液相色谱条件为：

色谱柱：Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm；

样品：1mg/mL的所述提取物的无水乙醇溶液；

进样量：20μL；

流动相：体积比为25∶70∶3∶2的水、甲醇、乙腈和THF混合物；

流速：0.500ml/min；

检测波长：225nm；

所述强肌健力方中药来源于强肌健力口服液，由以下重量份的药材组成：黄芪560，党参168，白术140，当归113，升麻87，柴胡80，陈皮28和甘草28。

本发明所述的提取物在常温(25℃)下为深咖啡色膏体，略有芳香气味；难溶解于水，易溶于有机溶剂，在乙醇中溶解量为20mg/ml，氯仿溶解量为50mg/ml，二甲亚砜中溶解量为30mg/ml。

本发明提取物是用乙酸乙酯提取强肌健力方中药得到的，具体是：将强肌健力方中各种药材粉碎成10～40目的细粉，加入6～12倍的乙酸乙酯在80～90℃下回流提取8～12小时，减压并加热浓缩去除乙酸乙酯。为了得到效果更好的提取物，在乙酸乙酯提取前或提取后还可以用碱液皂化法、酶解法或有机溶剂浸提法脱脂；为了尽量保护强肌健力方中药材有效成分不受破坏，我们推荐用有机溶剂法脱脂，具体方法是：用强肌健力方药粉质量6～12倍的有机溶剂在80～90℃下回流提取8～12小时，除去有机溶剂提取物，所述的有机溶剂可以是石油醚、***或异丙醇等弱极性溶剂。

上述方法中，用乙酸乙酯提取的温度优选87℃，时间优选12小时。

上述方法所得的提取物还可以用硅胶柱层析纯化，具体方法为：将本发明提取物上硅胶层析柱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱2次，取洗脱液蒸发浓缩成无色蜡状固体即可；所述的梯度洗脱的程序为：石油醚的用量从100％按1％递减至0，乙酸乙酯的用量相应递增。

本发明提取物制备方法中所述的固体与液体之间的比例为重量/体积比(本领域的习惯做法)，即固体为重量单位，液体为体积单位。

本发明所述的提取物的鉴定方法为：将所得提取物用无水乙醇(分析纯)溶解，配成1mg/mL浓度，并用滤膜(0.45μm)过滤后，在以水、甲醇、乙腈和THF(体积比为25：70：3：2)为流动相，波长为225nm，色谱柱为Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，进样量为20uL，流速为0.500ml/min的条件下进行高效液相HPLC检测。

本发明提取物对ABTS自由基和过氧自由基具有很好的清除作用，还可抑制脂质过氧化，具有较强的抗氧化活性。已有不少研究指出骨髓间充质干细胞损伤可能是由氧化损伤造成，本发明提取物的药理实验也证明本发明提取物对骨髓间充质干细胞具有保护作用，因此，本发明提取物可用于制备保护骨髓间充质干细胞的药物。

本发明提取物可加入药学上可接受的辅料制备成各种常规剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液等，其中以胶囊剂为佳。经硅胶柱层析纯化后还可以制备成注射剂。

以下通过药理试验及其结果来说明本发明具有的技术效果。

一、不同溶剂的强肌健力方中药提取物的比较

1、各种提取物的制备

本发明提取物(即乙酸乙酯提取物)：按实施例2方法制备。

石油醚提取物：用强肌健力方药粉质量6-12倍的石油醚在85℃下回流提取12小时后除去石油醚。

无水乙醇提物：用强肌健力方药粉质量6-12倍的无水乙醇在92℃下回流提取12小时后除去无水乙醇，即得。

95％乙醇提取物：用强肌健力方药粉质量6-12倍的95乙醇在95℃下回流提取12小时后除去95乙醇。

水提物：用强肌健力方药粉质量6-12倍的蒸馏水在100℃下回流提取12小时后除去水份。

2、各种提取物中总酚含量的测定

测量方法参照2005年《药典》(《中华人民共和国药典》2005版，第一部，附录XB)：将上述五种提取物用相应的溶剂溶解配成1mg/mL溶液。各取样品液200μL，补加200μL95乙醇。置于试管内，加入500μL0.25mol/L的Folin-Ciocalteu试剂，充分混合，静置3min。再加1mL 15％Na₂CO₃溶液，充分混合，静置30min。混合液用0.45μM的微孔滤膜过滤，在760nm处测A值，以15％Na₂CO₃溶液为空白。以连苯三酚为对照品绘制标准工作曲线，如图1所示。

3、结果

表1 强肌健力各提取物的总酚含量(％，以连苯三酚计，n＝3，Mean±SD)

结果如表1所示，强肌健力饮原药材用六种不同的溶剂提取，以乙酸乙酯提取物中的总酚含量最高。

以下药效实验中所用的石油醚提取物、乙醇提取物、水提物和本发明提取物均按上述实验一(即不同溶剂的强肌健力方中药提取物的比较)中方法制备。

二、抗氧化活性研究

1 对DPPH自由基的清除能力

DPPH实际上是以自由基DPPH·的形式存在的，所以，有个单电子，在519nm有强吸收，其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色，加入受试物后，在519nm处可以监测DPPH·被清除的效果，这种效果通常用对DPPH的抑制率来表示。显然，抑制率越大，DPPH自由基清除越彻底，受试物的抗氧化性越强。(Blois M.，1958.Antioxidant determinations by the use of astable free radical.Nature 181，Letter，1199-1200.)

本文依据Brand-Williams法进行检测(Brand-Williams，W.，Cuvelier，M.E.& Berset C.，1995.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity.Lebensmittel-Wissenschaft undTechnologies 28，25-30.)：将实验一中各提取物配成浓度为5mg/mL的样品液，除水提物外用水做溶剂外，其余均用DMSO作溶剂。取样品液4，10，20，30，40，50μL，加入到1.0mLDPPH测试液(0.1mmol/L)中，补加95％乙醇，使总反应体积为1.5mL。充分振摇，静置30分钟，测各反应液的A值(519nm)，以95乙醇为空白。依据下式计算抑制率：抑制率＝[1-(A-A样)/A0]×100％。其中：A0-未加样的DPPH溶液的吸光度；A-加样后DPPH溶液的吸光度；A样-样品液自身的吸光度。公式中引入A样是为了消除样品液本身颜色对实验结果的影响。结果如下(表2)

表2 强肌健力饮各提取物对DPPH的抑制率(％，n＝3，Mean±SD，GSH为阳性对照组)

 

终浓度μg/mL	阳性对照组GSH	石油醚提取物	乙酸乙酯提取物	无水乙醇提取物	95％乙醇提取物	水提取物
							13.33	42.74±0.99	35.86±1.79	43.33±1.49	33.23±0.76	33.99±3.36	31.03±0.368
33.33	49.43±0.25	40.88±1.05	58.19±1.15	38.28±0.98	35.64±0.22	33.33±0.57
							66.67	58.65±2.64	44.87±0.13	72.58±2.38	42.88±0.19	41.08±0.52	38.04±0.099
100	64.39±1.08	49.95±1.19	86.78±9.41	46.29±0.58	44.74±3.31	41.47±0.30
							133.33	69.53±0.51	58.06±4.27	87.098±2.05	47.10±0.91	47.92±1.14	44.80±0.82
166.67	72.93±1.59	56.86±0.61	90.158±1.98	54.01±0.69	50.89±1.57	47.75±0.63

从结果可以看出：强肌健力饮的各提取物中，以本发明提取物清除DPPH自由基能力最强。

2 对ABTS自由基的清除能力

ABTS·+自由基是由ABTS[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfpnic acid)]即[2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]，经活性氧氧化后生成的稳定的蓝绿色阳离子自由基，向其中加入被测物质，如果该物质存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色。根据褪色程度来判断该物质对ABTS·+的清除能力[5]。(Re R.，Pellegrini N.，Proteggente A.，Pannala A.，et al，1999.Antioxidant activity applying an improved ABTS radicalcation decolorization assay.Free Radical Biology & Medicine 26，1231-1237.)，从清除体外自由基的角度反映样品的抗氧化能力。

7.4mmol/LABTS储备液和2.6mmol/L K2S2O8储备液各取0.55mL等体积混合，在室温，避光条件下放置12小时，形成ABTS·+自由基储备液。使用前加入无水乙醇约43mL稀释成ABTS·+工作液，要求在30℃，734nm波长下的吸光度为1.10±0.02。将已经配制好的各提取物母液用无水乙醇(水提物用蒸馏水)稀释成不同浓度的测试液0.3mL，然后在相应试管中分别加入1.2mL的ABTS·⁺工作液，充分混合后，避光，室温下放置2小时。以无水乙醇为空白，在734nm波长下测定吸光度。以标准品为阳性对照。最后结果取3组平行实验的平均值。抑制率的计算公式：抑制率＝(A₀-A)/A₀*100％，其中A₀为未加样品的ABTS·+溶液的吸光度；A为样品与ABTS·+反应后的吸光度。结果如表3所示。

表3 强肌健力饮各提取物对ABTS^·+的抑制率(％，n＝3，Mean±SD，Trolox为阳性对照组)

 

浓度μg/mL	阳性对照组Trolox	石油醚提取物	乙酸乙酯提取物	无水乙醇提取物	95％乙醇提取物	水提物
							0.4152	4.24±4.59	6.12±0.86	5.13±2.32	3.51±1.60	1.46±0.84	3.36±0.14
2.076	31.52±0.81	8.66±0.085	8.15±1.79	5.85±0.46	4.95±2.17	6.97±1.09
							4.152	69.77±0.11	9.45±0.499	15.39±0.77	9.66±2.22	9.31±0.82	10.61±1.72
6.228	100.67±0.15	13.03±0.52	23.38±0.55	12.68±3.44	10.49±1.01	15.55±3.02
							8.304	100.04±0.20	15.12±0.45	30.5±0.92	14.72±1.20	12.48±1.41	19.48±3.07
10.38	100.08±0.056	18.21±0.57	39.72±2.37	20.04±2.88	18.58±0.36	22.16±2.29
							12.456	100.08±0.056	20.23±0.085	44.58±1.60	23.93±3.00	20.82±0.37	24.42±0.96
14.532	100.35±0.00	21.17±0.17	48.91±0.25	29.07±2.21	25.17±0.26	28.79±0.72
							16.608	100.12±0.096	26.28±0.085	55.79±2.71	30.80±1.45	30.37±2.83	32.36±3.24
18.684	100.08±0.056	26.90±0.59	63.84±0.25	36.09±0.96	34.80±0.49	37.10±4.31

从表3可以看出，本发明提取物对ABTS·+有很好的清除作用。

3 总还原能力

总还原能力常用于反映样品的抗氧化活性强弱，该法依据Oyaizu法^[3](Oyaizu，M.，1986.Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine.Jpn.J.Nutr.44，307-315.).强肌健力饮各提取物，除水液外，其余均用DMSO作溶剂，浓度为10mg/mL。各提取物依次取0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0mL，加入到磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)中，并使总体积为3.5mL，再加入2.5mLK₃Fe(CN)₆溶液(1g/100mL)，充分混合后，于50℃水浴20min，充分反应。然后，加入2.5mL三氯乙酸溶液(10g/100mL)终止反应。以2500g/min离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水、2.5mLFeCl₃溶液(0.1g/100mL)，充分混合，并开始计时，在90s时，于700nm处测A值。A值越大，提示相对总还原能力越强。结果如表4所示。

表4 强肌健力饮各提取物总还原能力(A_700nm，n＝3，mean±SD，GSH为阳性对照组)

从以上结果可以看出，强肌健力饮各种提取物中，以本发明提取物的总还原能力最强。

4 清除过氧自由基(·O₂)能力

过氧自由基(·O₂)是机体内产生的一种常见的自由基，能诱发机体疾病及衰老。本文采用连苯三酚自氧化法测定清除过氧自由基(·O₂)能力[2](Marklund S，Marklund G，1974.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and convenient assayfor superoxide dismutase.Eur.J.Biochem 47，469-474).连苯三酚在碱性条件下发生自氧化生成过氧自由基(·O₂)，同时，生成半醌。由于半醌在λ325nm处有吸收，因此，可以通过检测λ325nm处的A值的增大速率(ΔA/Δt)来衡量样品的清除过氧自由基(·O₂)能力。将各提取物配成1mg/mL，分别取50、100、200、300、400、500μL，加入到Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.2，含1mmol/L EDTA)中，并使总反应体积为1475μL。再加25μL连苯三酚溶液(6mmol/L，溶于10mmol/L盐酸溶液中)，迅速混合，开始计时。在分光光度计325nm处测A值，以Tris-HCl缓冲液为空白。从60秒开始读数，此后，每隔30秒读数一次，到300秒为止。以A值的增加速率(ΔA/Δt)衡量抗氧化活性，ΔA/Δt值越小，表明样品抑制连苯三酚自氧化效果越强。抑制率依下式计算：(式中，当取样量为0μL时，即为对照组。)

表5 强肌健力饮各提取物清除过氧自由基·O₂能力(％，n＝3，Mean±SD)

 

浓度μg/mL	阳性对照组GSH	石油醚提取物	乙酸乙酯提取物	无水乙醇提取物	95％乙醇提取物	水提物
							33.3	20.78±0.68	3.22±1.64	11.25±3.88	3.22±2.29	3.43±1.29	3.70±3.05
66.7	35.62±1.25	0.75±1.84	27.44±2.20	7.18±2.12	10.61±1.39	4.61±3.56
							133.4	50.15±0.15	25.40±0.69	51.45±2.74	18.65±0.45	24.54±3.28	5.03±3.16
200.1	55.30±0.97	33.87±1.09	75.35±0.99	31.62±1.54	37.73±0.76	8.36±2.29
							266.8	58.96±0.32	57.77±2.63	90.99±0.45	46.52±0.84	55.95±1.58	9.65±1.64
333.5	62.66±0.23	74.28±1.31	97.21±0.40	65.06±1.54	71.81±0.84	9.86±2.58

从以上结果可以看出，强肌健力饮各种提取物中，以乙酸乙酯提取物的清除过氧自由基·O₂能力最强。

5 清除脂质过氧化能力

脂质过氧化也是机体内常见的氧化损伤形式，它可以影响细胞，人类的许多重大疾病都与之有关[8]。(Sevanian，A.，Ursini，F.，2000.Lipid peroxidation in membranes and lowdensitylipoproteins：similarities and differences.Free Radical Biol.Med.29，306-311.

本文所采用的方法依据文献[9]略作修改(Siddhuraju P.，2006.Antioxidant activity ofpolyphenolic compounds extracted from defatted raw and dry heated Tamarindus indica seed coat.LWT，doi：10.1016/j.1wt.2006.07.010.)：取312.6mg亚油酸和78.2mg Tween20加入到20mL 30％(v/v)乙醇中，充分混合摇匀，得亚油酸乳液。在1.5mL亚油酸乳液中，加入各种浓度的样品液0.1mL，并用蒸馏水调至总体积2.0mL。该混合液置于敞口玻璃中，室温反应72小时后，取出0.15mL置于试管内。依次加入3.65mL 75％(V/V)乙醇、0.1mLNH4SCN(30g/100mL)、0.1mL FeSO4(0.02mol/L溶于3.6％HCl中)，混合。3分钟后，在500nm处测A值，以75％乙醇为空白(Unico 2100分光光度计，上海)。计算公式：

脂质过氧化的抑制率＝(1—A_样品/A₀)×100％

式中，A_样品＝加样时的A值；A₀＝样品量为0μL的A值。

表6 强肌健力饮各提取物清除过氧自由基·O₂能力(％，n＝3，Mean±SD，GSH为对照组)

 

浓度μg/mL	对照组GSH	石油醚提取物	乙酸乙酯提取物	无水乙醇提取物	95％乙醇提取物	水提物
							8	0.30±0.54	0.082±1.33	0.13±0.63	1.36±2.78	-0.61±1.28	-0.80±1.06
16	0.19±1.13	1.31±2.43	6.38±2.85	0.90±0.86	-0.36±1.39	-0.71±1.12
							24	0.0032±1.28	9.80±3.61	14.42±4.79	0.73±0.52	-0.34±1.45	-0.98±0.71
32	-0.044±0.46	12.26±6.58	28.0±7.67	0.11±0.87	0.26±1.33	-0.90±1.21
							40	-0.53±1.048	8.65±2.15	40.70±2.96	0.33±1.46	-0.61±0.83	-0.78±0.82
60	0.11±0.67	35.06±2.48	61.16±6.84	3.38±0.89	0.62±1.08	-0.89±0.99

结果如表6所示，本发明提取物对过氧自由基·O₂具有很好的清除能力。

三、本发明提取物对骨髓间充质干细胞保护作用

1、试剂和实验动物

细胞培养及免疫组化试剂：低糖DMEM(L-DMEM)、Percoll和胎牛血清(FBS)为GIBCOL公司产品，抗体免抗CD34、CD44、CD45、生物素化二抗(羊抗兔)、SABC、DAB染色试剂盒均购自武汉博士德公司。MTT为SIGMA公司产品。清洁级SD大鼠10只，220-250g，雌性，由广东省实验动物中心提供(粤检证字2005A010号)。

2、MSC分离、扩增与鉴定

将大鼠骨髓用L-DMEM冲出，充分混匀，转入离心管，300g离心10分钟，去上清，D-Hanks重悬，离心去上清后，加4mL D-Hanks混匀。Percoll贮存液按0.56：0.44混合，取4mL放入10mL离心管内，吸骨髓液在离液面2cm处贴管壁缓缓加入。水平离心机900g离心30分钟，收集单核细胞层，用DMEM洗涤两次。然后计数细胞，调整密度，按1×106/cm2密度接种，37℃，5％饱和湿度的CO2孵箱培养，培养液为含10％FBS的L-DMEM，3d后更换培养液，弃去未贴壁细胞，2-3天换液1次，接近融合的MSC用含0.25％胰酶室温消化2-3分钟，按1×104/cm2传代，传至第3代得到1×107/cm2个细胞。将部分MSC接种至含盖片的24孔培养板内，滴加含10％胎牛血清的DMEM培养液，2小时后细胞处于贴壁未分化状态，取出盖片做Brdu，CD44免疫组化及两者结合的免疫组化双重染色。

3、H₂O₂损伤MSC模型传3代MSC分为对照组、H₂O₂损伤组、本发明提取物组、石油醚提取物组、无水乙醇提取物组、95％乙醇提取物组和水提物组。对照组：加入含10％胎牛血清的DMEM培养液；H₂O₂损伤组：在含10％胎牛血清的DMEM培养液加H2O2损伤；本发明提取物组、石油醚提取物组、无水乙醇提取物组、95％乙醇提取物组和水提物组：MSC经H₂O₂损伤3小时后，换分别含有不同浓度的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、无水乙醇提取物、95％乙醇提取物和水提取物的培养液。上述7组在作用24小时后分别MTT法检测。

含各种提取物的培养液的配制：将所述4提取物分别称取30mg，乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、无水乙醇提取物、95％乙醇提取物分别溶于1ml二甲亚矾中，水提物溶于1ml蒸馏水中，得到不同溶剂提取物供试液各30mg/ml。

4、MTT法测细胞活性MTT法原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。因此，MTT光吸收值，反应了活细胞数量多少。制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔板，每孔200μL。每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，MSC37℃孵育4小时，弃上清。每孔加入二甲基亚砜150μL，振摇10分钟，于490nm波长测光吸收值(A)。

5、结果

由表7可见，H₂O₂损伤组细胞吸光值明显减少，与对照组比较具有显著性差异(P<0.01)，说明H₂O₂损伤MSC模型造模成功；随乙酸乙酯提取物浓度的增大，细胞吸光值逐渐增高，与对照组和与H₂O₂损伤组比较，差别有显著性(P<0.01)。乙酸乙酯提取物以浓度依赖方式对H₂O₂损伤MSC具有修复作用。实验结果显示，石油醚提取物、乙醇提取物和水提取物对H₂O₂损伤MSC修复作用无影响。研究结果表明本发明提取物对H₂O₂损伤MSC具有保护作用。

表7

 

最终浓度μg/mL	阳性对照组GSH	石油醚提取物	乙酸乙酯提取物	无水乙醇提取物	95％乙醇提取物	水提取物
							13.33	42.74±0.99	35.86±1.79	43.33±1.49	33.23±0.76	33.99±3.36	31.03±0.368
33.33	49.43±0.25	40.88±1.05	58.19±1.15	38.28±0.98	35.64±0.22	33.33±0.57
							66.67	58.65±2.64	44.87±0.13	72.58±2.38	42.88±0.19	41.08±0.52	38.04±0.099
100	64.39±1.08	49.95±1.19	86.78±9.41	46.29±0.58	44.74±3.31	41.47±0.30
							133.33	69.53±0.51	58.06±4.27	87.098±2.05	47.10±0.91	47.92±1.14	44.80±0.82
166.67	72.93±1.59	56.86±0.61	90.158±1.98	54.01±0.69	50.89±1.57	47.75±0.63

近代医学研究结果表明谷胱甘肽为(GSH)作用强的抗氧化剂，因此本发明选用GSH为阳性对照与本发明提取物作用比较，结果表明本发明提取物比GSH作用强。以上结果提示本发明提取物具有进一步研发新型对骨髓间充质干细胞保护作用药物的潜力，并且可能获得比传统抗氧化剂更好的效果。

附图说明

图1是以连苯三酚为对照品绘制的标准工作曲线。

图2是实施例1所得提取物的气相色谱-质谱图

图3是实施例2所述提取物的高效液相图谱。

图4是实施例2所述提取物的气相色谱-质谱图。

图5是实施例3所述提取物的高效液相图谱。

图6是实施例4所述提取物的高效液相图谱。

具体实施方式

例1

一、本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过20目筛为所需强肌健力细粉。

2、有效部位的提取

取40g强肌健力细粉用250ml乙酸乙酯(分析纯)加热至90℃继续回流提取12小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状提取物。

二、所得提取物的鉴定

将所得到的咖啡色膏状强肌健力提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，然后按以下方法(气相色谱-质谱方法)标定：取强肌乙酸乙酯的提取物(凝固状)18.3mg溶于330mg四氢呋喃(THF，色谱纯，迪马公司)中，并用滤膜(0.45μm)过滤后，在下述条件进行GC/MS检测：

气相色谱条件：分离采用DB-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.)，载气为氦气，分流比为1/10，进样口温度为280℃；升温程序为：起始温度为60℃，以8℃/min升至280℃，保留20min；

质谱条件：EI源，离子源温度250℃，轰击电子能量70eV，电子倍增器电压1.7kV，质量扫描范围28～400amu。进样量1μL；

仪器：Agilent 5973N GC/MSD。

结果如图6所示，1号峰(14.8min)和2号峰(16.8min)为非典型峰，因为信号太弱；3号峰(18.65±0.05min)的结构存在两种可能：

或

4号峰(19.58min)、5号峰(21.39min)和6号峰(27.49min)的结构未知；7号峰(34.05±0.05min)为甾体类化合物，存在四种不同的可能结构：

实施例2

一、本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过20目筛为所需强肌健力细粉。

2、脱脂

取40g强肌健力细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加250ml石油醚(分析纯)，加热至50℃，回流提取12小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用250ml乙酸乙酯(分析纯)加热至90℃继续回流提取12小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状提取物0.4g。

二、所得提取物的鉴定

1、高效液相色谱分析：将所得提取物用无水乙醇(分析纯)溶解，配成1mg/mL浓度，并用滤膜(0.45μm)过滤后，进行高效液相HPLC检测。洗脱条件为水：甲醇：乙腈：THF＝25：70：3：2。检测所用的仪器是高效液相仪DIONEX summit P680(单泵)，检测器UVD-170，波长250nm；色谱柱Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm；进样量20uL；流速0.500mL/min。检测结果如图2所示，所得提取物特有的主要吸收峰为：1号峰保留时间Ret.Time为5.307min，相对峰面积Rel.Area为5.99％；2号峰保留时间Ret.Time为5.898min，相对峰面积Rel.Area为48.52％；3号峰保留时间Ret.Time为6.270min，相对峰面积Rel.Area为2.02％。

2、化学成份分析：将所得到的咖啡色膏状强肌健力提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，然后使用气相色谱-质谱方法标定(具体方法同例1)，结果如图3和表8所示。

表8

三、本发明提取物注射液(Injectio)的制备

本品为中药强肌健力经提取有效成分制成的无菌水溶液。2ml相当于强肌健力有效成分10mg。

1、精制

将所得到的咖啡色膏状强肌健力提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，即为本发明提取物精制品。

2、处方

本发明提取物精制品500mg，1，2丙二醇20ml，吐温-802ml。制成注射液100ml。

3、制法

取本发明提取物精制品(无色蜡状固体)500mg，加1，2丙二醇20ml溶解，振摇使强肌健力精制有效成分完全溶解，再加注射用水至100ml。然后，加活性碳0.5％(V/V)，充分搅拌，过滤，最后以G3重熔玻璃漏斗过滤，灌封，100℃流通蒸气灭菌30min，即得。

四、本发明提取物注射液的使用方法

肌肉注射和穴位注射，首次4ml，以后每次2ml，一日1-2次。

实施例3

一、本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力药物进行粉碎，过40目筛为所需强肌健力细粉。

2、脱脂

取60g强肌健力细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加500ml石油醚(分析纯)，加热至50℃，回流提取10小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用500ml乙酸乙酯(分析纯)加热至70℃继续回流提取10小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状强肌健力提取物0.6g。

二、所得提取物的鉴定

1、高效液相色谱分析：将所得提取物用无水乙醇(分析纯)溶解，配成1mg/mL浓度，并用滤膜(0.45μm)过滤后，进行高效液相HPLC检测。洗脱条件为水：甲醇：乙腈：THF＝25：70：3：2。检测所用的仪器是高效液相仪DIONEX summit P680(单泵)，检测器UVD-170，波长275nm；色谱柱Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm；进样量20uL；流速0.500mL/min。检测结果如图3所示，所得提取物特有的主要吸收峰为：1号峰保留时间Ret.Time为5.266min，相对峰面积Rel.Area为10.48％；2号峰保留时间Ret.Time为5.746min，相对峰面积Rel.Area为32.9％；3号峰保留时间Ret.Time为6.591min，相对峰面积Rel.Area为1.75％。

2、化学成份分析：将所得到的咖啡色膏状强肌健力提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱2次，得无色蜡状固体，然后使用气相色谱-质谱方法标定(具体方法同例1)，所述提取物中含有十四碳羧酸5.5％、十六碳羧酸10.36％、十八碳羧酸14.33％，十六碳羧酸甲酯16.80％、十六碳羧酸乙酯10.8％、十八碳羧酸乙酯7.00％、十八碳-9-烯羧酸甲酯14.00％、多酚8.11％，3-胆甾醇6.64％，3，5二胆甾烯3.01％。

三、本发明提取物胶囊(Capsulae)的制备

处方 咖啡色膏状强肌健力提取物250mg，碳酸钙45mg，淀粉5mg。每个胶囊重300mg。

制法 将碳酸钙与淀粉混匀，过筛，再与适量乙醇稀释的浸膏混合，过120目筛，于60-70℃烘干2h，装胶囊。

四、本发明提取物胶囊的使用方法

常用量每日1次，每次1-2粒，4周为一疗程，可再服两个疗程，药量可酌减。

例4

一、本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过10目筛为所需强肌健力细粉。

2、脱脂

取60g强肌健力细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加600ml石油醚(分析纯)，加热至70℃，回流提取8小时，去除石油醚提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用600ml乙酸乙酯(分析纯)加热至80℃继续回流提取8小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状强肌健力提取物0.6g。

二、所得提取物的鉴定

1、高效液相色谱分析：将所得提取物用无水乙醇(分析纯)溶解，配成1mg/mL浓度，并用滤膜(0.45μm)过滤后，进行高效液相HPLC检测。洗脱条件为水：甲醇：乙腈：THF＝25：70：3：2。检测所用的仪器是高效液相仪DIONEX summit P680(单泵)，检测器UVD-170，波长300nm；色谱柱Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm；进样量20uL；流速0.500mL/min。检测结果如图4所示，所得提取物特有的主要吸收峰为：1号峰保留时间Ret.Time为5.304min，相对峰面积Rel.Area为4.43％；2号峰保留时间Ret.Time为5.887min，相对峰面积Rel.Area为56.03％；3号峰保留时间Ret.Time为6.235min，相对峰面积Rel.Area为1.80％。

2、化学成份分析：将所得到的咖啡色膏状强肌健力提取物经硅胶柱层析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脱1次，得无色蜡状固体，然后使用气相色谱-质谱方法标定(具体方法同例1)，所述提取物中含有十四碳羧酸2.5％、十六碳羧酸13.36％、十八碳羧酸7.33％，十六碳羧酸甲酯15.60％、十六碳羧酸乙酯9.36％、十八碳羧酸乙酯6.50％、十八碳-9-烯羧酸甲酯13.00％、多酚7.53％，3-胆甾醇3.64％，3，5二胆甾烯2.4％。

三、本发明提取物片剂(Tablet)的制备

处方：咖啡色膏状强肌健力提取物400mg，碳酸钙90mg，淀粉10mg。每片重500mg。

制法：将碳酸钙与淀粉混匀，过筛，再与适量乙醇稀释的浸膏混合，过90目筛，于60-70℃烘干，压片。

四、本发明提取物片剂的使用方法

作用与用途 本品有促进MSC生长和促进MSC作用，主要用于治疗骨病、再障和神经疾病，肿瘤化疗后骨髓保护。

用法与用量 常用量每日1次，每次1-2片，4周为一疗程，可再服两个疗程，药量可酌减。

例5

本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过10目筛为所需强肌健力细粉。

2、有效部位的提取

取60g强肌健力细粉，720ml乙酸乙酯(分析纯)加热至80℃继续回流提取8小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯。

3、脱脂

将步骤2所得的提取物装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加720ml石油醚(分析纯)，加热至70℃，回流提取12小时，去除石油醚提取部位，得到咖啡色膏状强肌健力提取物。

例6

本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过10目筛为所需强肌健力细粉。

2、有效部位的提取

取60g强肌健力细粉，720ml乙酸乙酯(分析纯)加热至80℃继续回流提取8小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状强肌健力提取物。

3、脱脂

将步骤2所得的提取物装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加720ml***(分析纯)，加热至70℃，回流提取8小时，去除***提取部位。

例7

本发明提取物制备：

1、粉碎

采用万能磨粉机将强肌健力进行粉碎，过20目筛为所需强肌健力细粉。

2、脱脂

取40g强肌健力细粉，装入滤筒中，然后放入索氏提取器内，加250ml异丙醇(分析纯)，加热至90℃，回流提取12小时，去除异丙醇提取部位。

3、有效部位的提取

将经石油醚提取除杂后的残渣用250ml乙酸乙酯(分析纯)加热至87℃继续回流提取12小时，然后减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏状提取物。

Claims (7)

1、一种具有抗氧化活性的中药提取物，该提取物是强肌健力方中药的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色谱具有以下图谱特征：在保留时间依次为5.30±0.05min、5.80±0.10min和6.55±0.35min处有吸收峰，所述吸收峰的相对峰面积依次为4.43～10.48％、32.9～56.03％和1.75～2.02％；其中，

所述的高效液相色谱条件为：

色谱柱：Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm；

样品：1mg/mL的所述提取物的无水乙醇溶液；

进样量：20μL；

流动相：体积比为25∶70∶3∶2的水、甲醇、乙腈和THF混合物；

流速：0.500ml/min；

检测波长：225nm；

所述强肌健力方中药由以下重量份的药材组成：黄芪560，党参168，白术140，当归113，升麻87，柴胡80，陈皮28和甘草28。

2、权利要求1所述的提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)粉碎：将强肌健力方中各种药材粉碎成10～40目的细粉；

(2)提取：剩下的药渣加入6～12倍的乙酸乙酯在80～90℃下回流提取8～12小时，减压并加热浓缩去除乙酸乙酯即可。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于用乙酸乙酯提取的温度为87℃，时间为12小时。

4、如权利要求2或3所述的提取物的制备方法，其特征在于该方法还包括一个在步骤(2)前或步骤(2)后进行的脱脂步骤，该步骤为：用6～12倍的有机溶剂在80～90℃下回流提取8～12小时，弃去有机溶剂提取物；其中所述的有机溶剂为石油醚、***或异丙醇。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于该方法还包括以下步骤：将所得提取物上硅胶层析柱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱2次，取洗脱液蒸发浓缩成无色蜡状固体即可；所述的梯度洗脱的程序为：石油醚的用量从100％按1％递减至0，乙酸乙酯的用量相应递增。

6、权利要求1所述提取物在制备保护骨髓间充质干细胞药物中的应用。

7、一种保护骨髓间充质干细胞的药物，该药物由权利要求1所述的提取物和药学上可接受的辅料组成。

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