JP7307715B2 - オートファジーの促進剤としての相乗作用組成物 - Google Patents
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Description
- 植物ガレオプシスの少なくとも一部分を粉砕する工程、
- 溶媒、好ましくは生理的に許容できる溶媒で抽出する工程、
- 上記抽出成分を濾過する工程、
- 濾過された上記抽出成分を、好ましくは溶媒を用いてカラムの中を溶出させることにより精製する工程、
- 精製された上記抽出成分を乾燥する工程、
- 乾燥された精製後の上記抽出成分を粉砕する工程。
流体の抽出成分では、1mlの抽出成分が、1gの植物薬に可溶な生物活性成分を含有し、
軟質の抽出成分では、溶媒は、特に抽出成分が濾紙を湿らさない程度まで、部分的に蒸発除去され、
乾燥抽出成分では、溶媒は、ほぼ完全に蒸発除去され、粉末が得られる。
ガレオプシス・セゲツムの抽出成分の調製
ガレオプシス・セゲツム乾燥抽出成分の調製を、エタノール40%を用いる抽出及びその後のカラム精製により、実施した。これらの工程を以下の段落に記載する。
ガレオプシス・セゲツムの粉砕し乾燥した地上部を、50℃で2時間、40%エタノールで2回抽出した。固形分及び液体を傾斜分離器により分離した。
予め95%エタノールに浸漬し接触したまま10時間維持したイオン交換XAD7HP吸着剤樹脂をカラムに充填した。次いでこの充填カラムを水で洗浄し、これを、溶出物の電気伝導率がロードした水と同じ値に到達するまで続けた。
ガレオプシス・テトラヒトの抽出成分の調製
ガレオプシス・セゲツムの抽出について上記の段落に記載したのと全く同じ手順に従って、ガレオプシス・テトラヒト乾燥抽出成分の調製を実施した。
材料及び方法
イムノブロット分析
U2OS細胞を4mM L-グルタミン、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するダルベッコ改変イーグル培地高グルコース(4.5g/lD-グルコース)中で80%コンフルエンスまで成長させ、スペルミジン(ロット2010112716)、ガレオプシス・セゲツム(IDN 6781)、ビオチン(ロット2014124160)又はこれらの組み合わせで処置した。タンパク質試料を、以前に報告された(De Mei C、Ercolani L、Parodi C、Veronesi M、Vecchio CL、Bottegoni Gら、Dual inhibition of REV-ERBβ and autophagy as a novel pharmacological approach to induce cytotoxicity in cancer cells. Oncogene.2015;34(20):2597-608)RIPA緩衝液中で抽出した。p62/SQSTM1及びGAPDHのレベルを抗p62/SQSTM1特異性抗体及び抗GADPH特異性抗体を用いて分析した。イムノブロット実験を、5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するTBS-T緩衝液中で実施した。抗LC3B抗体及び抗GAPDH抗体を、それぞれ、1:1000及び1:50000に希釈した。補完のHPR結合二次抗体を1:10000に希釈した。ECLウエスタンブロット法検出試薬との反応の際、LAS-4000発光イメージアナライザーを用いて化学発光シグナルを取得し、Photoshop画像解析ソフトウェアを用いて特定のバンドシグナルの光学密度を算出した。GAPDHをローディング対照として採用し、GAPDHシグナルを、異なる試料間のp62タンパク質レベルを規格化するために使用した。
U2OS細胞を、予めゼラチン溶液でコーティングされた48穴プレート、No.1.5 Uncoated Coverslip、6mmガラス直径、に3000細胞/ウェルで播種し、キメラタンパク質p62-赤色蛍光タンパク質(p62-RFP)を含有する、10000細胞あたりバキュロウイルス0.2μlで形質導入した。形質導入後48時間に、この細胞をスペルミジン、ビオチン、ガレオプシス、又はビヒクルで処置し、NIKON Live Cell Imaging顕微鏡法を使用して24時間モニターした。
ビオチン及び/又はガレオプシス・セゲツム抽出成分がオートファジーに影響を及ぼしうるかを評価するために、本発明者らは、培養下のU2OS細胞におけるオートファゴソームの蓄積をライブの蛍光顕微鏡法(Klionsky DJ、Abdelmohsen K、Abe A、Abedin MJ、Abeliovich H、Acevedo Arozena Aら、Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy.2016;12(1):1-222)によってモニターした。このようにして、細胞を赤色蛍光タンパク質(RFP)と融合されたオートファジータンパク質、LC3を含有する構築物で形質導入した。次いで、ビオチン(200ng/ml)又はガレオプシス乾燥抽出成分(100ng/ml)の添加後の蛍光性LC3ドットの蓄積を、30分ごとに6時間に画像を取得することによりモニターした。スペルミジン(10μM)をオートファジー誘導因子化合物の陽性対照として採用した(Pietrocola F、Lachkar S、Enot D、Niso-Santano M、Bravo-San Pedro J、Sica Vら、Spermidine induces autophagy by inhibiting the acetyltransferase EP300. Cell Death & Differentiation.2015;22(3):509-16)。
等モル用量のN1-メチルスペルミジン及びスペルミジンで処置したヒトU2OS細胞の脂質化LC3及びSQSTM1のレベルを評価した。結果として、ビヒクルと比べて、両方の化合物は、脂質化LC3-II形態のレベルを増加させ、SQSTM1のオートファジー介在性分解を刺激した。具体的には、培養下のヒトU2OS細胞をビヒクル又は等モル用量のスペルミジン及びN1-メチルスペルミジン(100μM)で6時間処置した。次に、脂質化LC3(LC3-II)及びSQSTM1のレベルを、特異的抗体を用いて実施例8のように免疫ブロット法分析によって評価した。アクチンシグナルをローディング対照として採用した。タンパク質シグナルの濃度測定分析を、アクチンによって規格化した相対的タンパク質レベルとして報告する。ビヒクル試料の値を1に設定した。平均±SEM、n=3として示す。*P<0.05及び**P<0.01、化合物対ビヒクル。結果を図3(A及びB)に報告する。これらの結果は、N1-メチルスペルミジンがその脱メチル化類似体のようにオートファジーを誘導するための活性を保持することを立証する。
Claims (15)
- ガレオプシス・セゲツム種の植物の地上部、ガレオプシス・テトラヒト種の植物の地上部又はこれらの混合物の水、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール及びエタノールと水の混合物から選択される極性プロトン性溶媒による抽出成分と、R-N1-スペルミジン又はその塩、ビオチン及びこれらの混合物から選択されるオートファジーを促進する化合物とを含む発毛を促進するため及び毛髪脱落の予防のためのヒト頭皮の毛包細胞におけるオートファジー誘導のための相乗作用組成物であって、Rは水素又はメチルである相乗作用組成物。
- 前記ガレオプシス・セゲツム種の植物又はガレオプシス・テトラヒト種の植物の抽出成分が、
- 前記ガレオプシス・セゲツム種の植物又はガレオプシス・テトラヒト種の植物の少なくとも地上部を粉砕する工程、
- 生理的に許容できる極性プロトン性溶媒で抽出する工程、
- 前記抽出成分を濾過する工程、
- 濾過された前記抽出成分を、好ましくは、水、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール及びエタノールと水の混合物から選択される溶媒を用いてカラムの中を溶出させることにより精製する工程、
- 精製された前記抽出成分を乾燥する工程、
- 乾燥された精製後の前記抽出成分を粉砕する工程、及び
- 任意選択的に、賦形剤を添加する工程
を含む方法によって得られた乾燥抽出成分である請求項1に記載の相乗作用組成物。 - 前記賦形剤が、マルトデキストリン及び/又は無水のコロイド状シリカゲルを含む請求項2に記載の相乗作用組成物。
- スペルミジンが、三塩酸塩の形態で前記組成物の中に存在する請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の相乗作用組成物。
- 請求項1から請求項4のいずれか一項に記載の相乗作用組成物と、局所投与に好適な少なくとも1種の賦形剤とを含む発毛を促進するため及び毛髪脱落の予防のためのヒト頭皮の毛包細胞におけるオートファジー誘導のための局所処方物。
- 前記ガレオプシス・セゲツム種の植物又はガレオプシス・テトラヒト種の植物の抽出成分の量が、前記組成物の総重量に対して0.0003重量%~0.01重量%の範囲にある請求項5に記載の局所処方物。
- ビオチンの量が、前記組成物の総重量に対して0.0006重量%~0.075重量%の範囲にある請求項5又は請求項6に記載の局所処方物。
- 前記組成物が、前記組成物の総重量に対して0.0005~0.1重量%の範囲のR-N1-スペルミジン又はその塩を含み、Rはメチル又は水素である請求項5から請求項7のいずれか一項に記載の局所処方物。
- シャンプー、ゲル、コンディショナー、ローション剤、バーム、乳剤、フォーム、メイクアップ及びクリームからなる群から選択される形態にある請求項6から請求項8のいずれか一項に記載の局所処方物。
- 請求項1から請求項4のいずれか一項に記載の相乗作用組成物と、経口投与に好適な少なくとも1種の賦形剤とを含む発毛を促進するため及び毛髪脱落の予防のためのヒト頭皮の毛包細胞におけるオートファジー誘導のための経口処方物。
- 前記経口処方物の中の前記ガレオプシス・セゲツム種の植物又はガレオプシス・テトラヒト種の植物の乾燥抽出成分の量が単回用量で0.1mg~20mgの範囲にある請求項10に記載の経口処方物。
- 前記経口処方物の中のビオチンの量が、単回用量で0.03mg~0.08mgの範囲にある請求項10又は請求項11に記載の経口処方物。
- 前記組成物が、単回用量で0.3mg~0.8mgの範囲のR-N1-スペルミジン又はその塩を含み、Rはメチル又は水素である請求項10又は請求項11に記載の経口処方物。
- 錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤及び丸剤からなる群から選択される固体処方物である請求項10から請求項13のいずれか一項に記載の経口処方物。
- 男性型脱毛症又は脱落の処置のための請求項5から請求項9のいずれか一項に記載の局所処方物又は請求項10から請求項14のいずれか一項に記載の経口処方物。
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