CN101239030A - 红参提取物制备方法及其护肤产品开发 - Google Patents

Abstract

本发明提供一个红参提取物的制备方法，其技术特征如下：将干燥的红参主根粉碎成粗粉、浸泡、超声提取、过滤、减压浓缩成浸膏，此工艺适用于工业生产。以红参提取物为主要有效成分，制备护肤化妆品的药物组合物，其特征在于：红参提取物中含有精氨酸糖苷(AFG)，精氨酸糖苷(AFG)为化妆品的基本活性成分。给出了几种护肤化妆品如半透明微乳液化妆水、营养霜、洗面乳液、护发素等的具体的实施例。同时阐述了红参水提液不同组分对超氧阴离子的清除作用，红参水提液的抗组胺游离作用。

Description

红参提取物制备方法及其护肤产品开发

发明领域

本发明涉及红参提取物的制备及精氨酸糖苷(AFG)的分离、鉴定，以红参为主要有效成分的化妆品的制造，开发了红参提取物的新用途。

发明背景：

目前研究表明，红参主要含有人参皂苷、多糖、氨基酸、蛋白质和挥发油等化学成分。红参中含有的精氨酸糖苷(AFG)是生晒参的数倍，在人参地上部分未见含有AFG的报道，另外，精氨酸糖苷(AFG)也未见有用于美容护肤化妆品的报道。

发明内容

本发明提供一种红参提取物的制备方法，适用于工业化生产。

本发明还公开了以红参提取物中精氨酸糖苷(AFG)为基本活性成分的化妆品。

本发明进一步提供了以红参提取物为主要成分配合其他成分，制备护肤化妆品的药物组合物。

红参提取物及精氨酸糖苷(AFG)的制备和鉴定，技术解决方案如下：将干燥的红参主根粉碎成粗粉加入5～10倍量的0～70％的乙醇水溶液，浸泡6～12h，超声提取3次，每次30分钟，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩成浸膏。将上述提取物加入一定量的水，取红参浸膏加入一定量的水，透析，得透析外液，浓缩，冷冻干燥，制成含H₂O提取物80mg·ml^-1，上NKA大孔树脂柱，收集水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥。取干燥提取物3g，水溶解，过葡聚糖凝胶LH-20，蒸馏水洗脱，流速(13ml/h)，每3ml收集1管。茚三酮反应阳性者，用氨基酸自动分析仪检查，与标准精氨酸糖苷(AFG)进行比较，合并保留时间一致的组分，再用硅胶柱层析纯化，即得精氨酸糖苷(AFG)。

红参中精氨酸糖苷(AFG)的鉴定：水合茚三酮检验显紫色，MS(m/e)：M⁺498.4，元素分析分子式为C₁₈H₃₄N₄O₁₂；Rf＝0.20(HPTLC，展开剂∶n-butanol-acetic acid-water＝2∶1∶1)。

IR(KBr)cm^-1：3425(OH)，2928，2858(CH)，1678(C＝O)，1633(C＝N)。

DEPT显示有3个甲基，6个亚甲基，9个次甲基，¹H NMR(δppm)：1.64(m，2H)，1.90(m，2H)，3.16(t，J＝6.72Hz，2H)，5.00(d，J＝3.66Hz)，5.05(d，J＝3.66Hz)，5.09(J＝3.66Hz)。¹³CNMR数据见下表：

                      表AFG的¹³CNMR数据归属

c	δppm	c	δppm	c	δppm
						123456	173.50(s)63.13(d)27.26(t)24.71(t)41.23(t)157.57(s)	1′2′3′4′5′6′	53.14(t)96.19(s)69.72(d)78.38(d)70.02(d)64.76(t)	1″2″3″4″5″6″	101.38(d)72.49(d)73.55(d)70.36(d)73.19(d)61.30(t)

碱水解：该化合物30mg加入3mol.L^-1 NH₄OH(30ml)，于100℃条件下加热1h。反应液用Bio-gel P-2柱分离并纯化，得水合茚三酮阳性反应物5mg和糖9mg。

水合茚三酮阳性反应物以TLC和氨基酸分析仪进行分析，Rf值和保留时间与精氨酸相似。¹³CNMR(δppm)：184.84(-COOH)，160.11(H2N-C＝NH)，58.67(-CH-COOH)，44.22(-CH₂-NH)，34.16(CH₂-CH₂)，27.69(CH₂-CH₂-CH₂)。¹H NMR(δppm)：1.50(m，-CH₂-)，1.53(m，-CH₂-)，3.10(t，J＝4.88Hz，-NH₂-CH-COOH)，以上数据与精氨酸数据一致。

糖部分3mg与0.8ml TMS试剂搅拌30sec，反应液静止5分钟后3000rpm离心。上清液用气-质联机分析。保留时间与三甲基硅烷化的果糖一致，所以确定化合物的糖部分为果糖。鉴定该化合物为精氨酸果糖葡萄糖苷(AFG)，简称精氨酸糖苷。

本发明中的药物组合物，其中含有精氨酸糖苷(AFG)0.5～3％、人参皂苷0.1～1％，还有人参多糖、蛋白质、氨基酸、微量元素以及梅拉德反应产物等。本领域技术人员可以理解到，这些物质的存在会增强本发明的药物组合物的护肤保健作用。

另外，应特别指出的是，可根据需要在发明的药物组合中加入一种或多种天然或合成的其它与本提取物具有协同或辅助作用的成分，这些可能被加入的天然或合成的辅助成分是本领域或技术人员已知的和可以想到的。可将所说的组合物配制成基础化妆品、美容化妆品、身用化妆品、头发用化妆品。

可以将本提取物与一种或多种化妆品上可以接受的载体或赋形剂按适当比例混合成适用于化妆品上使用的不同剂型的药物组合物，例如可将组合物制成化妆水、乳液、膏霜、面膜、护发素和浴用剂。

实验例1

红参提取物抗细胞衰老作用

D.Hannan等人提出自由基导致细胞衰老学说，认为机体内的自由基产生过量时会引起细胞膜上的不饱和脂肪酸氧化，从而造成细胞及其重要组分如DNA、蛋白质和酶变性，加速细胞衰老。近代生物医学又发现：自由基在体内代谢失调对机体的损伤是导致休克、中毒、炎症、某些心血管疾病、肿瘤及其它自身免疫性疾病的主要原因之一。寻找和筛选自由基清除剂，用来延缓衰老、预防和治疗这些疾病已经成为目前研究的热点。

本研究对红参水提液及其不同组分在体外清除次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离于的作用进行了研究。采用化学发光法，通过体外直接清除氧自由基可以部分揭示红参的药理活性；为进一步开发安全有效的清除自由基药物提供一定的理论基础。

材料与方法

材料：红参、人参茎叶总皂苷粉：本室自制加工；葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)：上海化学试剂厂进口分装。高效薄层板：DC-Plastikfollen Kiseigel 60，德国Merck公司生产。

试剂：次黄嘌呤(HX)购自FLUKA公司，黄嘌呤氧化酶(XO)购自Sigma公司；鲁米诺(Luminol)购自Merck公司。其它试剂均为分析纯。

红参水提液及其不同组分的分离

将红参切片，分别加八倍量、四倍量、四倍量的水煎煮三次，每次一小时，合并煎煮液，过滤后浓缩，得到红参总水提液；加入四倍量的乙醇，放入4℃冰箱中静置，过滤，得到乙醇沉淀相，滤液减压回收乙醇至无醇味后分别用***、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到红参***相、红参乙酸乙酯相、红参正丁醇相和红参水相。将红参总液配成浓度10mg/ml，红参乙醇沉淀相、红参正丁醇相、红参水相、人参茎叶总皂苷粉分别配成浓度1mg/ml的溶液作为待测样。

超氧阴离子自由基的产生及测定

利用次黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系产生超氧阴离子：黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，与此同时产生超氧阴离子，它进一步与化学发光剂鲁米诺(三—氨基邻苯二甲酸肼)反应，使之激发，当返回基态时，向外发光，通过发光测量，以抑制发光的程度表示对超氧阴离子的清除率。

化学发光法测定自由基清除率

清除率(％)＝(I_对照-I_样品)×100％

I_对照：对照发光强度(cpm)

I_样品：加样品后发光强度(cpm)

结果与分析

试验结果表明红参总水提液在浓度800μg/ml，红参水相、红参乙醇沉淀相、红参正丁醇相在80μg/ml时均可显著清除超氧阴离子，其清除率的顺序为红参正丁醇相＞红参水相＞红参乙醇沉淀相。人参茎叶总皂苷粉没有作用，如表1-1和图1-1所示。

已有报道，人参中醚溶部分如麦芽酚等具有抗氧化作用，红参总水提液经乙醇沉淀，***、乙酸乙酯萃取后，红参正丁醇相、红参水相，乙醇沉淀相亦可显著清除超氧阴离子，说明红参水提液对超氧阴离子的清除作用是多方面多组分协同作用的结果。如表1-1

         表1-1红参水提液不同组分对超氧阴离子的清除作用

溶液	浓度(μl/ml)	发光强度(cpm)	清除率(％)
				对照红参总水提液红参正丁醇相红参水相红参乙醇沉淀相人参茎叶总皂苷粉	-80080808080	3.94±0.321.43±0.08**2.33±0.06**2.60±0.06**2.79±0.26**3.98±0.37**	-63.6640.8533.8329.07-

n＝3，X±S，^**P＜0.01相对于对照，以上浓度均为反应终浓度。

实验例2

红参提取物抗过敏作用

组胺可引起搔痒和其它皮肤异常反应，为防止组胺产生，可使用各种抗组胺剂。植物番石榴(Psidilum guajava L)具有很强的抗组胺作用，本品的抗组胺作用超过番石榴。日本学者发现红参水提液对Compound 48/80刺激产生的组胺游离具有抑制作用，对多种人参皂苷抗组氨的研究中发现红参水提液和20S-人参皂苷Rg3对神经肽SP和Compound48/80刺激产生的组胺游离具有较强的抑制作用，20S-人参皂苷Rg3是在人参加工过程中产生的，其含量非常低，仅占万分之几，而且在50～100μg/ml时对组胺游离才有较强的抑制作用，其他皂苷无作用或作用很弱。我们发现生晒参水提物对组胺游离亦有较强的抑制作用。还发现以人参组方的化妆品对组胺游离具有很强的抑制作用。

材料与方法

材料

实验动物：250g雄性Wister-King大鼠。

实验材料：红参护肤霜、红参提取物。

脂肪细胞的采集

将大鼠用***麻醉后，切断颈动脉致死，将其腹部自两侧向中间挤压90秒后剖开腹部，用移液管将腹腔液移(3只鼠)至30ml塑料离心管中，280×g离心1分钟，使腹水细胞沉淀(含有6～8％的脂肪细胞)，弃去上清夜。在沉淀中加入2ml Buffer A缓冲液，摇匀，得混悬液。

向上述混悬液6ml中加入38％的白蛋白溶液4ml，置于塑料离心管中，静置25分钟后离心20分钟(350×g)，弃去上清夜，得到脂肪细胞。再将得到的脂肪细胞加入3ml Buffer A缓冲液，离心20分钟(250×g)，两次，得到干净的脂肪细胞。脂肪细胞中加入1ml Buffer A缓冲液，备用。

样品抗组胺活性的测定

1)将测定材料溶于Buffer B缓冲液中。

2)取100μl，其中加入100μl脂肪细胞溶液，于37℃孵化5分钟。

3)另取两支加入100μl脂肪细胞溶液的试管，分别加入10μl的Buffer C缓冲液和BufferD缓冲液。

4)向3)的2个试管中，分别取2)的溶液40μl加入，于37℃孵化10分钟后，置于冰水中以停止反应。

5)于4C离心4分钟(1500×g)，分别取上清液30μl，加入0.1M盐酸溶液30μl进行搅拌，分取20μl注入高效液相色谱进行分析。

结果与分析

表2-1样品抗组胺游离活

试验结果表明红参提取物10倍稀释液抗组胺游离作用，其抑制率为16.8％，4倍提取液抑制率为92.6％，2倍提取液抑制率为84.4％，结果表明，红参提取物有很强的抗组胺游离作用，并且不完全和浓度成正比，在一定浓度下作用最强。如表2-1和图2-1所示。

测试材料	Compound48/80	游离组胺(ng/20ul)		抑制率(％)
					测定值	游离组胺量
		对照1	-				29.1517	89.1073	-
对照2	+			118.2590
		红参护肤霜(200μg/ml)	-		22.7620	28.1032	68.5
+	50.8652
			红参提取物10倍稀释液PH 7.12	-	3.9067			74.1788	16.8
+	78.0855
		红参提取物4倍稀释液PH 7.08		-	98.5637	6.6026	92.6
+	105.1663
			红参提取物2倍稀释液PH 6.81	-	150.5940			13.9219	84.4
+	164.5159

皮肤的粗糙瘙痒与组胺的过量产生有关，如能抑制组胺的游离就可使皮肤软化，增加弹性，也可使色素沉着明显减轻，发挥良好的止痒功效。从以上结果可知，本课题组研制的红参美容霜对由Compound 48/80刺激引起的组胺游离的抑制率为68.5％，采用红参提取物4倍稀释液制成的美容液对组胺游离的抑制率达92.6％。本化妆品具有抗组胺游离作用可能是红参提取物中所含不同成分协同作用的结果。

实验例3

红参提取物增白作用

皮肤白嫩几乎是所有女性的愿望，但是由于日照黑色素沉着或者由于植物神经失调引起的黑色素沉着，都会影响皮肤的美观。随着科技的发展，现今世界化妆品发展的趋势正逐步走向生物化与功能化，天然产物化妆品，特别是加有中草药有效活性成分的化妆品的开发越来越受到国内外厂商的高度重视。我国中医素有许多传统的医治方法。孙思邈《干金要方》第九卷载有若干方剂，其中以白芷、川芎、藁本、防风、当归、独活、羌活最为常用。沙参、羌活对使黑色素沉着的酶——酪氨酸酶有较强的抑制作用。90年代掀起的回归自然的潮流使人们不再喜欢用厚厚的粉底来遮盖面部色素的沉着，因此迫切需要能彻底抑制体内黑色素生成的活性物质，从而达到真正意义上的肌肤光洁。若要人为的阻止色素的沉着，应改善皮肤中的色素细胞的酪氨酸酶的代谢，限制酪氨酸向黑色素的转化，抑制酪氨酸酶的活性。雀斑、黄褐斑、老人斑等的形成，实际上是体内酪氨酸代谢的失调、色素的异常沉积造成，色素的生成过程如下面的反应方程式所示：

酪氨酸酶分别作用于酪氨酸转化为多巴和多巴醌两个过程。如要人为地阻止老人斑、雀斑的形成，归根到底就是要限制酪氨酸酶的活性，美白食品、美白化妆品中添加物之一就有酪氨酸酶的抑制剂。

材料与方法

试样及试剂：L一酪氨酸(第二军医大学药学系合成药物研究所)：0.05％的溶液；酪氨酸酶(Sigma公司)：25000U/mg，0.7mg/ml溶液；以上溶液均用0.025M的pH6.86的磷酸缓冲液配制。

测试样品的制备  分别取红参护肤液(本研究中试产品)、红参营养霜(本研究中试产品)、人参水提物加0.025M的pH6.86的磷酸缓冲液，稀释成不同浓度，在16000g下，离心15分钟，得上清液，备用。

酪氨酸酶抑制作用的测定  测定前，用吸管按下表所示的体积准确吸取C1、C2、T1及T2四组反应液，每组设平行三组试管，先置37℃水浴中保温10分钟。

       表3-1酪氨酸酶抑制作用测定反应液组成

反应液组成	反应液体积(ml)
					C1	C2	TI	T2
	L一酪氨酸样品磷酸缓冲液合计	0.5000.951.45	001.451.45	0.500.500.451.45					00.500.951.45

测定时分别将C1、C2、T1、T2四组反应液混匀，加入0.05ml的酪氨酸酶溶液，混匀，开始计时，3分钟时转移至3ml的比色皿中，在475nm处测吸光度(以下简称O.D)。

计算时分别将C1、C2、T1、T2四组反应液的三个平行O.D值相加取平均值，然后按下列公式求酪氨酸酶活性的抑制率：抑制率＝[1-(T1-T2)/(C1-C2)]×100其中(C1-C2)是在没有抑制条件下的反应液的O.D值的改变，C2是本底；(T1-T2)是在有抑制条件卜的反应液的O.D值的改变，T2是本底。

结果与分析

不同样品对酪氨酸酶的抑制率见表3-2，由表可知红参护肤液与红参营养霜对酪氨酸酶均有抑制活性，且红参护肤液活性高于红参营养霜。说明本研究中试产品具有一定增白作用。

        表3-2样品对酪氨酸酶的抑制作用

样品	浓度	抑制率(％)
			人参水提物(生晒参)	1mg/ml	22.5
人参水提物(红参)	1mg/ml	69.8
			红参护肤液	原液1/21/41/8	57.813215699.97
红参营养霜	1/81/4	48.3104.76

附图说明

图1-1红参水提液不同组分对超氧阴离子的清除作用

图1-1纵坐标代表清除率(％)，CK为对照，溶液为水，其值为0，无清除作用。柱A为红参总水提液，其值为63.66，柱B为红参正丁醇相，其值为40.85，柱C为红参水相，其值为33.83，柱D为红参乙醇沉淀相，其值为29.07，柱E为人参茎叶总皂苷粉，其值为0，无清除作用。

图2-1红参水提液的抗组胺游离作用

图2-1纵坐标代表抑制率(％)，横坐标CK为对照，溶液为水，其值为0，表示无抑制作用。柱A为10倍稀释液，其值为16.8，柱B为4倍稀释液，其值为92.6，抑制作用最强，柱C为2倍稀释液，其值为84.4，显现了红参较好的抗组胺游离作用。

具体实施方式

以红参为主要有效成分的化妆品的制作

实施例1营养霜

红参提取物	4.0％
		凡士林白油硅油单甘酯丙三醇9022防腐剂粘合剂精制水	1.01.71.01.06.02.0适量适量80.5

实施例2

半透明微乳液化妆水

红参提取物		4.0％
			保湿剂软化剂表面活性剂乙醇香料色料防腐剂缓冲剂防褪色剂精制水	1，3丁二醇甘油橄榄油POE(20)失水山梨醇单硬脂酸酯	7.06.00.51.510适量适量适量适量适量70.4

实施例3

洗面乳液(含有粘液质的O/W型，非离子表面活性剂)

红参提取物		4.0％
			油分保湿剂表面活性剂粘液质碱防腐剂螯合剂香料精制水	十八烷醇硬化棕榈油液体石蜡二丙二醇失水山梨醇倍半油酸酯聚丙烯酸(1.0％水溶液)氢氧化钾	0.53.035.06.01.615.00.1适量适量适量32.0

实施例4

护发素

红参提取物	4.0％
		液体石蜡鲸蜡醇硬脂酸甘油香料色素防腐剂精制水	1.01.51.03.7适量适量适量85.4

实施例5

结合型身用清洁剂

红参提取物	4.0％
		N-月桂酰-谷氨酸三乙醇胺(30％水溶液)N-月桂醇-甲基牛磺酸钠(30％水溶液)月桂酸三乙醇胺肉豆蔻酸三乙醇胺丙二醇精制水香料染料防腐剂金属离子螯合物	20.015.010.015.07.028.0适量适量适量适量

Claims (3)

1、本发明公开一个红参提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将干燥的红参主根粉碎成粗粉加入5～10倍量的0～70％的乙醇水溶液，浸泡6～12h，超声提取3次，每次30分钟，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩成浸膏。

2、权利要求1所述制备方法得到的红参根提取物在制备美容、护肤化妆品中的应用。

3、一种从红参提取物中提取精氨酸糖苷(AFG)的方法，其特征在于：取红参浸膏加入一定量的水，透析，得透析外液，浓缩，冷冻干燥，制成含H₂O提取物80mg·ml^-1，上NKA大孔树脂，收集水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥。取干燥提取物3g，水溶解，过葡聚糖凝胶LH-20，蒸馏水洗脱，流速(13ml/h)，每3ml收集1管。茚三酮反应阳性者，用氨基酸自动分析仪检查，与标准精氨酸糖苷(AFG)进行比较，合并保留时间一致的组分，再用硅胶柱层析纯化，即得精氨酸糖苷(AFG)。