CN113049724A

CN113049724A - 桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法

Info

Publication number: CN113049724A
Application number: CN202110271446.8A
Authority: CN
Inventors: 徐彤彤; 刘青; 林碧珊; 张文芳; 袁春平; 魏梅; 孙冬梅; 梁浩明; 曾杉; 朱德全
Original assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd; Sinopharm Group Guangdong Medi World Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd; Sinopharm Group Guangdong Medi World Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN113049724B

Abstract

本发明公开了一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法，该指纹图谱构建方法包括以下步骤：(1)精密称定桂枝芍药知母汤组合物，加水后以超声波处理，得到供试品溶液；(2)将没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱等22种对照品制成参照物溶液；(3)精密吸取供试品溶液和各参照物溶液，注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，检测波长为210nm，得到供试品指纹图谱和参照物色谱图谱，制定桂枝芍药知母汤组合物的标准指纹图谱。通过该标准指纹图谱可全面的反应待检测产品的质量，能够有效的控制桂枝芍药知母汤制剂的产品质量。

Description

桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量检测技术领域，尤其涉及一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法。

背景技术

桂枝芍药知母汤属于2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制订《古代经典名方目录(第一批)》中的100首经典名方之一。出自东汉名家张仲景《金匮要略》一书，该方由桂枝、附子(炮)、芍药、麻黄、生姜、白术、知母、防风和甘草九味药组成。其中桂枝和附子为君药，桂枝辛甘温，温通经脉，善利关节而祛风邪；附子辛甘大热，为通十二经纯阳之要药；两药合用能祛风除湿以通脉，温经散寒以助阳。麻黄、防风、白术为臣药，麻黄辛微苦温，防风辛甘微温，白术苦甘温，三者合用能疏风散寒，祛湿止痛。知母、芍药和生姜为佐药，知母清热滋阴，白芍养血和营，生姜和胃止呕。甘草为使药，调和诸药。本方具祛风除湿，温经宣痹，养阴清热之功，以桂枝、芍药、知母在方中的特殊性而命名，称之为桂枝芍药知母汤。

经典名方是指至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂。中药汤剂是传统中医临床用药的主流，其中的经典名方更是中医药数千年临床实践的结晶，具有组方合理、疗效确切、安全性高等特点，为中医药理论的精髓之一，但煎煮、携带不便，标准难以统一，严重影响其临床应用，因此简便易用、满足现代生活节奏的经典名方标准颗粒的研发意义重大。经典名方临床疗效确切，运用现代分析技术对其质量进行控制，不仅保障了复方制剂的质量稳定，也能更好的促进经典名方的临床应用。

现有技术中也有关于桂枝芍药知母汤指纹图谱检测方法的研究，如专ZL201910285906.5桂枝芍药知母汤的检测方法，以没食子酸、芒果苷、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和甘草酸铵为对照品，以50％甲醇提取桂枝芍药知母汤的成分，色谱条件的检测波长为254nm。然而，桂枝芍药知母汤由九味药制成，其中的化学成分多达几十甚至上百种，仅以八个化学对照品检测该药剂的质量，不能有效的进行质量控制。而且，该专利中以50％甲醇提取桂枝芍药知母汤的成分和以254nm波长进行检测，也影响质量控制的有效性。

发明内容

本发明的目的在于提出一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法，能够有效的控制桂枝芍药知母汤制剂的产品质量。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

(1)精密称定桂枝芍药知母汤组合物，加水后以超声波处理，得到供试品溶液；

(2)将没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、肉桂醇、肉桂酸、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III、白术内酯II、6-姜辣素、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵、新芒果苷、芒果苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品制成参照物溶液；

(3)精密吸取供试品溶液和各参照物溶液，注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，检测波长为210nm，得到供试品指纹图谱和参照物色谱图谱，制定桂枝芍药知母汤组合物的标准指纹图谱。

进一步的，所述步骤(3)中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速0.25ml/min，柱温：30℃；

以流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为***进行梯度洗脱，洗脱顺序为：

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。

进一步的，所述标准指纹图谱包括33个特征峰，以15号峰芒果苷色谱峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.142，2号峰相对保留时间RRT为0.272，3号峰相对保留时间RRT为0.309，4号峰相对保留时间RRT为0.336，5号峰相对保留时间RRT为0.380，6号峰相对保留时间RRT为0.429，7号峰相对保留时间RRT为0.488，8号峰相对保留时间RRT为0.523，9号峰相对保留时间RRT为0.573，10号峰相对保留时间RRT为0.626，11号峰相对保留时间RRT为0.672，12号峰相对保留时间RRT为0.749，13号峰相对保留时间RRT为0.792，14号峰相对保留时间RRT为0.945，15号(S)峰相对保留时间RRT为1.000，16号峰相对保留时间RRT为1.013，17号峰相对保留时间RRT为1.043，18号峰相对保留时间RRT为1.053，19号峰相对保留时间RRT为1.067，20号峰相对保留时间RRT为1.081，21号峰相对保留时间RRT为1.129，22号峰相对保留时间RRT为1.178，23号峰相对保留时间RRT为1.197，24号峰相对保留时间RRT为1.253，25号峰相对保留时间RRT为1.307，26号峰相对保留时间RRT为1.327，27号峰相对保留时间RRT为1.396，28号峰相对保留时间RRT为1.608，29号峰相对保留时间RRT为1.895，30号峰相对保留时间RRT为1.916，31号峰相对保留时间RRT为1.926，32号峰相对保留时间RRT为2.190，33号峰相对保留时间RRT为2.243。

进一步的，所述标准指纹图谱中1、7、8、12、13、15、18、21、23、25、26、28、29、31、32和33号色谱峰依次与没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、儿茶素、新芒果苷、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、升麻素苷、芹糖甘草苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、亥茅酚苷、甘草酸铵和6-姜辣素对照品色谱峰保留时间相对应。

进一步的，所述步骤(1)中，精密称定桂枝芍药知母汤组合物0.18g，置10ml量瓶中，加水以超声处理10～30分钟，放冷，加水稀释至10ml刻度，过滤得到所述的供试品溶液。

进一步的，所述桂枝芍药知母汤组合物的制备方法为：

将桂枝12g、白芍9g、知母12g、麻黄6g、炮附片6g、防风12g、生姜15g、白术5g和甘草6g置于5L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，煎煮得到400ml煎液；

将煎液趁热用350目滤布滤过，滤液浓缩后冷冻干燥并粉碎，得到所述的桂枝芍药知母汤组合物。

进一步的，所述步骤(2)中，制成参照物溶液的方法为：

精密称定没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品，加甲醇制成白芍混合参照物溶液；

精密称定肉桂醇和肉桂酸对照品，加甲醇制成桂枝混合参照物溶液；

精密称定升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷对照品，加甲醇制成防风混合参照物溶液；

精密称定5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III和白术内酯II对照品，加甲醇制成白术混合参照物溶液；

精密称定6-姜辣素对照品，加甲醇制成生姜参照物溶液；

精密称定芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷和甘草酸铵对照品，加甲醇制成甘草混合参照物溶液；

精密称定新芒果苷和芒果苷对照品，加甲醇制成知母混合参照物溶液；

精密称定盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品，加甲醇制成麻黄混合参照物溶液。

进一步的，所述没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、肉桂醇、肉桂酸、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III、白术内酯II、6-姜辣素、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵、新芒果苷、芒果苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品，在各参照物溶液中的含量均为每1ml含10～100μg。

一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

将待测桂枝芍药知母汤组合物采用水提方法制成待测样品溶液；

将待测样品溶液注入超高效液相色谱仪进行色谱分析，生成待测样品图谱；

以上述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法制定的标准指纹图谱作为对照图谱，计算待测样品图谱和所述标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9即为质量合格。

进一步的，将待测样品溶液注入超高效液相色谱仪进行色谱分析的色谱条件为：

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。

本发明的有益效果为：

本发明以水提方法制备供试品溶液，对于水溶性好的成分有更好的反应效果，本发明能反应获得更多的色谱峰，更全面的表征样品，有利于提高产品质量检测的准确性。

本发明采用检测波长为210nm，桂枝芍药知母汤组合物在210nm波长处的峰信息量最大。在此波长获得的色谱可表征麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱成分，而麻黄碱类物质及其单方制剂在我国被作为易制毒化学品进行严格管控，因此，确定210nm为桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱的检测波长可更全面的反映产品成分。

本发明中对照品的种类达到27种，对应桂枝芍药知母汤组合物中除白术和附子的其余七味中药材。本发明提供的桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱可全面反映桂枝芍药知母汤的质量信息，从而全面、有效地控制桂枝芍药知母汤制剂产品的质量。

附图说明

图1是供试品溶液的三维图谱；

图2是供试品溶液在不同波长下的指纹图谱；

图3是供试品溶液采用不同流动相检测的指纹图谱；

图4是不同提取剂制备的供试品溶液检测所得指纹图谱；

图5是白芍混合参照物溶液色谱图；

图6是桂枝混合参照物溶液色谱图；

图7是防风混合参照物溶液色谱图；

图8是白术混合参照物溶液色谱图；

图9是生姜参照物溶液色谱图；

图10是甘草混合参照物溶液色谱图；

图11是知母混合参照物溶液色谱图；

图12是麻黄混合参照物溶液色谱图；

图13是5批桂枝芍药知母汤组合物拟合图；

图14是桂枝芍药知母汤组合物对照指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

本发明提供一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

进一步的，所述步骤(3)中，色谱条件如下：

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。

上述的洗脱程序的运行时间短和流动相消耗少。本发明采用上述的色谱条件采用UPLC进行检测，使得指纹图谱构建方法中有更短的运行时间和更少的流动相消耗，可节约时间和耗材成本。

本发明通过将测定的5批桂枝芍药知母汤组合物色谱图导入相似度评价***，选择其中相对保留时间稳定且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，经多次试验研究，最终确定33个特征峰，达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。

进一步的，所述标准指纹图谱中1、7、8、12、13、15、18、21、23、25、26、28、29、31、32和33号色谱峰依次与没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、儿茶素、新芒果苷、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、升麻素苷、芹糖甘草苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、亥茅酚苷、甘草酸铵和6-姜辣素对照品色谱峰保留时间相对应。根据各成分的出峰顺序，同时借助二极管阵列检测器全波长扫描，可以将各成分的紫外吸收光谱与桂枝芍药知母汤中的色谱峰对比，从而可以确认出16个已知峰。

进一步的，所述步骤(1)中，精密称定桂枝芍药知母汤组合物0.18g，置10ml量瓶中，加水以超声处理10～30分钟，放冷，加水稀释至10ml刻度，过滤得到所述的供试品溶液。通过以方法所得的供试品溶液可包含更多的化学成分，有利于对桂枝芍药知母汤组合物进行全面的检测。

进一步的，所述桂枝芍药知母汤组合物的制备方法为：

将桂枝12g、白芍9g、知母12g、麻黄6g、炮附片6g、防风12g、生姜15g、白术5g和甘草6g置于5L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，煎煮得到400ml煎液；将煎液趁热用350目滤布滤过，滤液浓缩后冷冻干燥并粉碎，得到所述的桂枝芍药知母汤组合物。

进一步的，所述步骤(2)中，制成参照物溶液的方法为：

精密称定6-姜辣素对照品，加甲醇制成生姜参照物溶液；

本发明的指纹图谱构建方法中，将多种对照品制成混合参照物溶液，比单独的参照溶液更节省实验时间，而且，通过各成分的出峰顺序，能得出对照品对应标准图谱中的特征峰，而指纹图谱的生姜归属峰只有一个，而6-姜辣素是生姜常见且较容易检出的成分，因此只选择6-姜辣素作为生姜的参照溶液。

进一步的，所述没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、肉桂醇、肉桂酸、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III、白术内酯II、6-姜辣素、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵、新芒果苷、芒果苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品，在各参照物溶液中的含量均为每1ml含10～100μg。对照品含量在该范围内能有较好的检测效果。

相应的，本发明还提供了一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

以标准指纹图谱作为对照图谱来检测桂枝芍药知母汤组合物的质量，能全面的反映桂枝芍药知母汤的质量信息，从而全面、有效地控制桂枝芍药知母汤制剂产品的质量

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。

该指纹图谱检测方法中的色谱条件与标准指纹图谱构建的色谱条件保持一致，能够减小检测误差。

以下通过实施例进一步阐述本发明。

下述实施例的试药及仪器如下。

试药：

没食子酸(批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院)；

儿茶素对照品(批号：877-200001，中国食品药品检定研究院)；

芍药内酯苷对照品(批号：5583，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

芍药苷对照品(批号：110736-201943，中国食品药品检定研究院)；

1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(批号：3367，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

肉桂醇(批号：18070404，成都普菲德生物技术有限公司)

肉桂酸对照品(批号：110786-201604，中国食品药品检定研究院)；

升麻素对照品(批号：111710-200602，中国药品生物制品检定所)；

升麻素苷(批号：111522-201712，中国食品药品检定研究院)；

5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：111523-201610，中国食品药品检定研究院)；

亥茅酚苷对照品(批号：111714-200501，中国药品生物制品检定所)；

5-羟甲基糠醛(批号：111626-201610，中国食品药品检定研究院)；

新绿原酸(批号：DST180130-015，成都德斯特生物技术有限公司)；

绿原酸(批号：110753-201817，中国食品药品检定研究院)；

隐绿原酸(批号：DST170210-035，成都德斯特生物技术有限公司)；

白术内酯III(批号：11978-201501，中国食品药品检定研究院)；

白术内酯II(批号：111976-201501，中国食品药品检定研究院)；

6-姜辣素对照品(批号：111833-201505，中国食品药品检定研究院)；

芹糖甘草苷对照品(批号：5569，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

甘草苷对照品(批号：111610-201607，中国食品药品检定研究院)；

甘草素(批号：4280，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

异甘草苷(批号：6387，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

甘草酸铵对照品(批号：110731-201720，中国食品药品检定研究院)；

新芒果苷对照品(批号：3671，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；

芒果苷对照品(批号：111607-201704，中国食品药品检定研究院)；

盐酸麻黄碱对照品(批号：0714-990，中国药品生物制品检定所)；

盐酸伪麻黄碱对照品(批号：171237-200807，中国药品生物制品检定所)；

桂枝芍药知母汤组合物(自制)，甲醇(美国BCR公司，色谱纯)、

乙睛(美国BCR公司，色谱纯)，水为超纯水。

仪器：

Waters H-class超高效液相色谱仪；Waters PDA检测器；Empower工作站；

Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)色谱柱；

万分之一分析天平(AL104，梅特勒-托利多公司)；

十万分之一分析天平(MS105DU，梅特勒-托利多公司)；

超声清洗机(KQ-500DE昆山市超声仪器有限公司)；

超纯水***(默克股份有限公司，MILLIPORE Synergy UV)。

TRL-05型冷冻干燥机(大连双瑞科技有限公司)。

实施例1

白芍混合参照物溶液：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸100μg、儿茶素100μg、芍药内酯苷10μg、芍药苷20μg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖80μg的溶液，作为混合参照物溶液；

桂枝混合参照物溶液：取肉桂醇、肉桂酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含肉桂醇30μg、肉桂酸20μg的溶液，作为混合参照物溶液；

防风混合参照物溶液：取升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含升麻素苷60μg、升麻素10μg、5-O-甲基维斯阿米醇苷60μg、亥茅酚苷10μg的溶液，作为混合参照物溶液；

白术混合参照物溶液：取5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III、白术内酯II对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含5-羟甲基糠醛100μg、新绿原酸50μg、绿原酸50μg、隐绿原酸50μg、白术内酯III100μg、白术内酯II100μg的溶液，作为混合参照溶液；

生姜参照物溶液：取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6-姜辣素50μg的溶液，作为参照物溶液；

甘草混合参照物溶液：取芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芹糖甘草苷20μg、甘草苷20μg、甘草素20μg、异甘草苷20μg、甘草酸铵20g的溶液，作为混合参照物溶液；

知母混合参照物溶液：取新芒果苷、芒果苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含新芒果苷50μg、芒果苷50μg的溶液，作为混合参照物溶液；

麻黄混合参照物溶液：取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱50μg、盐酸伪麻黄碱100μg的溶液，作为混合参照物溶液。

通过与上述混合参照物溶液定位对比，见图5-图12，得到桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱中16个已知峰，包括没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、儿茶素、新芒果苷、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、升麻素苷、芹糖甘草苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、亥茅酚苷、甘草酸铵、6-姜辣素。

实施例2桂枝芍药知母汤组合物的制备和供试品溶液的制备

按重量份计称取如下饮片：桂枝12g，白芍9g，知母12g，麻黄6g，炮附片6g，防风12g，生姜15g，白术5g，甘草6g；将九味饮片置于5L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，加盖，加煮沸，保持微沸至煎液400ml，趁热用350目滤布滤过，滤液减压浓缩至适量，冷冻干燥，粉碎，混匀，即得桂枝芍药知母汤组合物。

取上述的桂枝芍药知母汤组合物约0.18g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量水，以超声处理10～30分钟(功率250W、频率40kHz)，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

实施例3指纹图谱色谱条件的考察

(1)检测波长的选择

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速0.25ml/ml，柱温：30℃。

表1：指纹图谱流动相梯度程序

采用二极管阵列检测器对实施例2的供试品溶液进行全波长检测，根据收集的三维图谱(见图1)，并同时收集210nm、230nm、254nm、270nm、280nm波长处的图谱(见图2)。综合考察，相比其他波长，桂枝芍药知母汤组合物在210nm波长处的峰信息量最大，可表征麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱成分，因此确定210nm为桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱的检测波长(见图1、图2)。

(2)色谱***的考察

基于(1)的色谱条件，桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱的检测波长选定为210nm，若以乙腈-甲酸水溶液或乙腈-醋酸水溶液为流动相，在210nm波长下存在干扰，故分别考察了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水***：精密吸取实施例2中供试品溶液注入色谱仪，进行色谱分析，指纹图谱检测见图3。

结果表明：桂枝芍药知母汤组合物在乙腈-磷酸水水溶液***下基线平稳，色谱峰峰型和分离效果明显优于其他流动相体系，因此确定流动相***为乙腈-磷酸水溶液。

实施例4供试品制备方法的考察

基于实施例3考察的最优色谱条件，分别考察不同溶剂60％甲醇、60％乙醇和水对桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱的提取效果。

不同溶剂的供试品溶液的制备：

取实施例2的桂枝芍药知母汤组合物0.18g三份，精密称定，置10ml量瓶中，分别加60％甲醇、60％乙醇、水适量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，分别用相应溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别精密吸取1μl，注入液相色谱仪，按实施例3考察的最优色谱条件测定。

结果见图4，水对桂枝芍药知母汤组合物提取峰个数最多，综合考虑，操作方便且溶剂安全，因此选择水作为桂枝芍药知母汤组合物指纹图谱的提取溶剂。

实施例5方法学考察

5.1专属性试验

分别精密吸取实施例1的对照品溶液、实施例2的供试品溶液、空白溶剂各1μl，注入液相色谱仪，按照实施例3的最优色谱条件进行指纹图谱方法测定，结果供试品色谱中与对照品色谱相应位置出现相对应色谱峰，空白样品上没有相应峰，表明阴性无干扰，本方法专属性强。

5.2精密度试验

按照指纹图谱精密度规定方法操作，取S1批的样品以实施例2的方法制备供试品溶液，按照实施例3的最优色谱条件，连续进样6次，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明仪器精密度良好。

5.3稳定性试验

按照指纹图谱稳定性测定方法操作，取S1批的样品以实施例2的方法制备供试品溶液，于制备完成后的第0、4、8、12、20、24h按照实施例3的最优色谱条件分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明供试品溶液在制备完成后的24h内稳定性良好。

5.4重复性试验

按照指纹图谱重复性测定方法操作，取S1批的样品以实施例2的方法制备供试品溶液，共6份，按照实施例3的最优色谱条件分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本方法重复性良好。

5.5中间精密度试验

由不同实验人员在不同日期按照指纹图谱重复性测定方法操作，取S1批的样品以实施例2的方法制备供试品溶液，共6份，按照实施例3的最优色谱条件分别进样测定，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”软件计算相似度，结果相似度均在0.95以上，表明本方法中间精密度良好。

以上试验结果表明，该分析方法较稳定性、重复性良好。

实施例6共有峰的确定及对照指纹图谱的建立

采用不同批次饮片，分别制备5批桂枝芍药知母汤组合物，以实施例2的方法制备供试品溶液，以实施例3的最优色谱条件进行检测得到指纹图谱，将5批次供试品溶液指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”，采用平均数法进行全谱匹配，确定其共有特征峰为33个，以15号芒果苷色谱峰为S峰，计算5批样品共有峰相对保留时间。所述的33个共有特征峰的相对保留时间偏差RSD均小于2％，即：

1号峰相对保留时间RRT为0.142，RSD％为0.78％；

2号峰相对保留时间RRT为0.272，RSD％为1.11％；

3号峰相对保留时间RRT为0.309，RSD％为1.20％；

4号峰相对保留时间RRT为0.336，RSD％为0.75％；

5号峰相对保留时间RRT为0.380，RSD％为1.16％；

6号峰相对保留时间RRT为0.429，RSD％为0.90％；

7号峰相对保留时间RRT为0.488，RSD％为0.87％；

8号峰相对保留时间RRT为0.523，RSD％为0.76％；

9号峰相对保留时间RRT为0.573，RSD％为0.87％；

10号峰相对保留时间RRT为0.626，RSD％为0.76％；

11号峰相对保留时间RRT为0.672，RSD％为1.17％；

12号峰相对保留时间RRT为0.749，RSD％为0.39％；

13号峰相对保留时间RRT为0.792，RSD％为0.25％；

14号峰相对保留时间RRT为0.945，RSD％为0.12％；

15号峰相对保留时间RRT为1.000，RSD％为0.00％；

16号峰相对保留时间RRT为1.013，RSD％为0.09％；

17号峰相对保留时间RRT为1.043，RSD％为0.02％；

14号峰相对保留时间RRT为1.053，RSD％为0.08％；

18号峰相对保留时间RRT为1.129，RSD％为0.11％；

16号峰相对保留时间RRT为1.197，RSD％为0.09％；

17号峰相对保留时间RRT为1.307，RSD％为0.14％；

18号峰相对保留时间RRT为1.053，RSD％为0.08％；

19号峰相对保留时间RRT为1.067，RSD％为0.19％；

20号峰相对保留时间RRT为1.081，RSD％为0.12％；

21号峰相对保留时间RRT为1.129，RSD％为0.11％；

22号峰相对保留时间RRT为1.178，RSD％为0.27％；

23号峰相对保留时间RRT为1.197，RSD％为0.09％；

24号峰相对保留时间RRT为1.253，RSD％为0.19％；

25号峰相对保留时间RRT为1.307，RSD％为0.14％；

26号峰相对保留时间RRT为1.327，RSD％为0.14％；

27号峰相对保留时间RRT为1.396，RSD％为0.32％；

28号峰相对保留时间RRT为1.608，RSD％为0.40％；

29号峰相对保留时间RRT为1.895，RSD％为0.20％；

30号峰相对保留时间RRT为1.916，RSD％为0.28％；

31号峰相对保留时间RRT为1.926，RSD％为0.37％；

32号峰相对保留时间RRT为2.190，RSD％为0.49％；

33号峰相对保留时间RRT为2.243，RSD％为0.48％；其中，15号S峰是参照物的色谱峰。

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)”对5批桂枝芍药知母汤组合物样品进行拟合(见图13)，生成桂枝芍药知母汤对照指纹图谱(见图14)。采用夹角余弦法计算样品相似度，结果表明，5批桂枝芍药知母汤组合物相似度在0.900～0.991之间，相似度较高，表明化学成分稳定，质量好。

表2 5份桂枝芍药知母汤组合物相似度评价结果

根据本发明实施例的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法和检测方法的其他构成等以及操作对于本领域普通技术人员而言都是已知的，这里不再详细描述。

在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，色谱条件如下：

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。

3.根据权利要求1所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述标准指纹图谱包括33个特征峰，以15号峰芒果苷色谱峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.142，2号峰相对保留时间RRT为0.272，3号峰相对保留时间RRT为0.309，4号峰相对保留时间RRT为0.336，5号峰相对保留时间RRT为0.380，6号峰相对保留时间RRT为0.429，7号峰相对保留时间RRT为0.488，8号峰相对保留时间RRT为0.523，9号峰相对保留时间RRT为0.573，10号峰相对保留时间RRT为0.626，11号峰相对保留时间RRT为0.672，12号峰相对保留时间RRT为0.749，13号峰相对保留时间RRT为0.792，14号峰相对保留时间RRT为0.945，15号(S)峰相对保留时间RRT为1.000，16号峰相对保留时间RRT为1.013，17号峰相对保留时间RRT为1.043，18号峰相对保留时间RRT为1.053，19号峰相对保留时间RRT为1.067，20号峰相对保留时间RRT为1.081，21号峰相对保留时间RRT为1.129，22号峰相对保留时间RRT为1.178，23号峰相对保留时间RRT为1.197，24号峰相对保留时间RRT为1.253，25号峰相对保留时间RRT为1.307，26号峰相对保留时间RRT为1.327，27号峰相对保留时间RRT为1.396，28号峰相对保留时间RRT为1.608，29号峰相对保留时间RRT为1.895，30号峰相对保留时间RRT为1.916，31号峰相对保留时间RRT为1.926，32号峰相对保留时间RRT为2.190，33号峰相对保留时间RRT为2.243。

4.根据权利要求3所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述标准指纹图谱中1、7、8、12、13、15、18、21、23、25、26、28、29、31、32和33号色谱峰依次与没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、儿茶素、新芒果苷、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、升麻素苷、芹糖甘草苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸、亥茅酚苷、甘草酸铵和6-姜辣素对照品色谱峰保留时间相对应。

5.根据权利要求1所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，精密称定桂枝芍药知母汤组合物0.18g，置10ml量瓶中，加水以超声处理10～30分钟，放冷，加水稀释至10ml刻度，过滤得到所述的供试品溶液。

6.根据权利要求5所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述桂枝芍药知母汤组合物的制备方法为：

7.根据权利要求1所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，制成参照物溶液的方法为：

精密称定6-姜辣素对照品，加甲醇制成生姜参照物溶液；

8.根据权利要求7所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、肉桂醇、肉桂酸、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、5-羟甲基糠醛、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、白术内酯III、白术内酯II、6-姜辣素、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵、新芒果苷、芒果苷、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品，在各参照物溶液中的含量均为每1ml含10～100μg。

9.一种桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以权利要求1-8任一项所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱构建方法制定的标准指纹图谱作为对照图谱，计算待测样品图谱和所述标准指纹图谱的相似度，相似度大于0.9即为质量合格。

10.根据权利要求9所述的桂枝芍药知母汤组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，将待测样品溶液注入超高效液相色谱仪进行色谱分析的色谱条件为：

0～16min，乙腈3％，0.1％磷酸溶液97％；

6～8min，乙腈3％→5％，0.1％磷酸溶液97％→95％；

8～16min，乙腈5％→8％，0.1％磷酸溶液95％→92％；

16～23min，乙腈8％→14％，0.1％磷酸溶液92％→86％；

23～29min，乙腈14％→16％，0.1％磷酸溶液86％→84％；

29～33min，乙腈16％，0.1％磷酸溶液84％；

33～45min，乙腈16％→35％，0.1％磷酸溶液84％→65％；

45～49min，乙腈35％→60％，0.1％磷酸溶液65％→40％；

49～53min，乙腈60％→95％，0.1％磷酸溶液40％→5％。