CN103257191A - 补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：先制备补肾益寿胶囊溶液，具体为准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入溶媒，再进行超声处理溶解，冷却后用溶媒补足，然后离心收集上清，得补肾益寿胶囊溶液；然后将制备的补肾益寿胶囊溶液注入液相色谱，用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱，柱温为25-35℃，流速为0.8-1.2mL，流动相以乙腈与水在体积比为2-100:0-98范围内梯度洗脱，在检测波长为265-275nm条件下进行检测，得补肾益寿胶囊指纹图谱，利用此方法测定的指纹图谱精密度高、稳定性好、重现性好，为快速鉴定补肾益寿胶囊提供了简便、准确的方法。
Description
技术领域
本发明属于中药鉴定领域，涉及补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法。
背景技术
补肾益寿胶囊为中药复方制剂，由红参、制何首乌、淫羊藿、丹参、枸杞子、珍珠、灵芝、甘草和黄精共九味药构成，药味较多，质量控制难度较大。原质量标准收载于中华人民共和国***药品标准十四册，质量标准中分别采用人参皂苷Rb1、Re、Rg1、淫羊藿苷和原儿茶醛为对照品，对其中的红参、淫羊藿、丹参三味药材进行了薄层鉴别，但是由于鉴定成分种类少不足以反映该三味药的质量。并且也未对制何首乌、枸杞子、灵芝、甘草、黄精等其他药材进行质量监控，不足以对产品质量进行有效控制。
因此建立一种综合的、宏观的、可量化的鉴别和测定有效成分含量的方法是鉴定中药复方制剂的发展方向。中药指纹图谱是指某种中药或某些中药制剂经适当处理后，采用色谱方法得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。近年来，很多中药都进行了指纹图谱的研究，但对大复方中药的指纹图谱研究较少，主要是由于大复方中药药味多，药材质量波动大，成品相似度低。补肾益寿胶囊为我厂独家品种，为保证产品质量，建立补肾益寿胶囊指纹图谱对控制产品质量具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，解决了现有技术对补肾益寿胶囊质量控制难的问题。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
a.制备补肾益寿胶囊溶液：准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入溶媒，再进行超声处理溶解，冷却后用溶媒补足，然后离心收集上清，得补肾益寿胶囊溶液；所述溶媒为甲醇、乙醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
b.色谱条件：色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶，柱温为25-35℃，流速为0.8-1.2mL，检测波长为265-275nm，流动相以乙腈与水在体积比为2-100:0-98范围内梯度洗脱；
c.测定：取步骤a制备的补肾益寿胶囊溶液注入液相色谱仪，按照步骤b的条件进行高效液相色谱测定，得补肾益寿胶囊指纹图谱。
优选的，所述步骤a是准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入甲醇或体积分数为50%的乙醇，超声处理15~45分钟，冷却后用甲醇或体积分数为50%的乙醇补足，然后在转速大于10000 r/min条件下离心至少10 min。
优选的，所述步骤a是准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入体积分数为50%的乙醇，超声处理30分钟，冷却后用体积分数为50%的乙醇补足，然后在转速为10000 r/min条件下离心10 min。
更优选的，所述超声处理的频率40 kHz。
优选的，所述步骤b中，色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶，柱温为30℃，流速为1mL，检测波长为270nm，流动相为乙腈和水，在如下条件下梯度洗脱：
洗脱时间大于等于0分钟小于20分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；洗脱时间大于等于20分钟小于40分钟时20分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；洗脱时间大于等于40分钟小于55分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；洗脱时间大于等于55分钟小于80分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；洗脱时间大于等于80分钟小于85分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；洗脱时间大于等于85分钟小于90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；洗脱时间大于等于90分钟小于92分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；洗脱时间大于等于92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。
优选的，所述步骤c中，注入液相色谱仪的补肾益寿胶囊溶液为15-25μL。
更优选的，所述步骤c中，注入液相色谱仪的补肾益寿胶囊溶液为20μL。
本发明的有益效果在于：本发明公开了补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，通过梯度洗脱方法，能够将复方制剂中多个成分有效分离和检测，峰的分离效果好，无重叠峰，并且峰形好，能分离到复方制剂中几乎所有药味的特征成分，并能实现补肾益寿胶囊最大可能的化学成分检测，因此能有效表征补肾益寿胶囊的质量，有利于产品质量的全面控制；并且该方法具有简便、稳定性好、精密度高，重现性好等优点；精密度测试显示，连续进样6次后特征峰相对峰面积的RSD为0.23~1.60%，相对保留时间的RSD为0.08~0.34%；稳定性测试显示，在不同时间进样后特征峰相对峰面积的RSD为0.20~1.75%，相对保留时间RSD为0.05~0.17%；重现性测试显示，同一批次进行6个重复实验，得到的特征色谱峰（峰面积/称样量）相对值的RSD为0.29~1.83%，相对保留时间RSD为0.02~0.44%；与原质量标准中三个简单的薄层控制相比质量控制更为全面。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实施例1的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图2为实施例4的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图3为实施例5的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图4为实施例6的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图5为实施例7的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图6为实施例8的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图7为实施例9的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图8为实施例10的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图9为实施例11的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图10为实施例12的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图11为实施例13的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图12为实施例14的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图13为实施例15的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图14为实施例16的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图15为实施例17的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图16为实施例18的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图17为实施例19的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图18为实施例20的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图19为实施例21的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图20为实施例22的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图21为实施例23的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图22为实施例24的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图23为实施例25的方法检测补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图24为淫羊藿提取液的HPLC图谱。
图25为淫羊藿标准品的HPLC图谱。
图26为丹参提取液的HPLC图谱。
图27为何首乌提取液的HPLC图谱。
图28为甘草提取液的HPLC图谱。
图29为枸杞提取液的HPLC图谱。
图30为灵芝提取液的HPLC图谱。
图31为珍珠粉提取液的HPLC图谱。
图32为黄精提取液的HPLC图谱。
图33 为红参提取液HPLC图谱。
图34为补肾益寿胶囊溶液的HPLC图谱。
图35为不同批次补肾益寿胶囊指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
a.补肾益寿胶囊提取液的制备：准确称取0.15 g补肾益寿胶囊内容物，置于具塞锥形瓶中，然后量取25 mL体积分数为50%的乙醇，密塞，称重，在功率为250 W、频率为40 kHz 条件下超声处理30分钟，放冷后再称重，失重用体积分数为50%的乙醇补足，摇匀，在转速为10000 r·min-1条件下离心10 min，得补肾益寿胶囊提取液，备用；
b.色谱检测：色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶，柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为270nm，流动相乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱；
梯度洗脱顺序如下：
洗脱时间大于等于0分钟小于20分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；洗脱时间大于等于20分钟小于40分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；洗脱时间大于等于40分钟小于55分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；洗脱时间大于等于55分钟小于80分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；洗脱时间大于等于80分钟小于85分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；洗脱时间大于等于85分钟小于92分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；洗脱时间大于等于92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。
获得如图1所示的色谱图。
实施例2
溶媒考察
补肾益寿胶囊溶液的制备：准确称取4份0.15 g的补肾益寿胶囊内容物（批号：11050088），分别置于具塞锥形瓶中，然后分别量取25 mL甲醇、体积分数为50%的甲醇、体积分数为50%的甲醇、体积分数为95%的乙醇和体积分数为50%的乙醇，密塞，称重，在功率为250 W、频率为40 kHz 条件下超声处理30分钟，按实施例1的条件进行HPLC，选取保留时间为12.586分钟、16.990分钟、50.637分钟、71.667分钟、73.535分钟、75.082分钟和77.866分钟共7个峰的作为考察指标（7个色谱峰面积之和占总峰面积的95%以上），以峰面积/称样量相对值作为考察依据，结果如表1所示。
表1、溶媒考察一览表
由表1和参考不同溶媒的HPLC图谱峰型，甲醇和体积分数为50%的乙醇为溶媒效果更佳，而体积分数为50%的乙醇无毒、环保，因此最优选定体积分数为50%的乙醇作为溶媒。
实施例3
超声时间考察
补肾益寿胶囊溶液的制备：准确称取3份0.15 g的补肾益寿胶囊内容物（批号：11050088），分别置于具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，称重，在功率为250 W，频率为40 kHz条件下分别超声15分钟、30分钟和45分钟，静置后再称重，失重部分用体积分数为50%的乙醇补足，摇匀，然后再转速为10000 r·min-1条件下离心10 min，得补肾益寿胶囊溶液。然后按照实施例1的HPLC条件测定样品，选取保留时间为12.586分钟、16.990分钟、50.637分钟、71.667分钟、73.535分钟、75.082分钟和77.866分钟共7个色谱峰作为考察指标（7个色谱峰面积之和占总峰面积的95%以上），以峰面积/称样量相对值作为考察依据，结果如表2所示。
表2. 超声时间对补肾益寿胶囊溶液的影响
由表2可知，在超声时间为30分钟时，时间长短合适，因此最佳超声时间为30分钟。
实施例4
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
洗脱时间0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；10分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；50分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；60分钟时，流动相A为80%的乙腈溶液，流动相B为20%水溶液；65分钟时，流动相A为100%的乙腈溶液，流动相B为0%水溶液；70分钟时，流动相A为100%的乙腈溶液，流动相B为0%水溶液；71分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；86分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图2所示。
实施例5
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.2mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；15分钟时，流动相A为15%的乙腈溶液，流动相B为85%水溶液；20分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；35分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；
40分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；55分钟时，流动相A为80%的乙腈溶液，流动相B为20%水溶液；65分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；70分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
72分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；87分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图3所示。
实施例6
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；15分钟时，流动相A为15%的乙腈溶液，流动相B为85%水溶液；17分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；32分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
34分钟时，流动相A为55%的乙腈溶液，流动相B为45%水溶液；49分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；59分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；64分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
66分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；87分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图4所示。
实施例7
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；10分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；15分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；30分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
35分钟时，流动相A为45%的乙腈溶液，流动相B为55%水溶液；55分钟时，流动相A为55%的乙腈溶液，流动相B为45%水溶液；65分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；70分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
72分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；87分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图5所示。
实施例8
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.2mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；10分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；45分钟时，流动相A为27.5%的乙腈溶液，流动相B为72.5%水溶液；65分钟时，流动相A为70%的乙腈溶液，流动相B为30%水溶液；70分钟时，流动相A为80%的乙腈溶液，流动相B为20%水溶液；
75分钟时，流动相A为80%的乙腈溶液，流动相B为20%水溶液；77分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；92分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；本实施例获得的色谱图如图6所示。
实施例9
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.2mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；10分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；12分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；24分钟时，流动相A为22%的乙腈溶液，流动相B为78%水溶液；
26分钟时，流动相A为35%的乙腈溶液，流动相B为65%水溶液；41分钟时，流动相A为40%的乙腈溶液，流动相B为60%水溶液；51分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液，流动相B为50%水溶液；56分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
61分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；63分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；78分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图7所示。
实施例10
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.2mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；10分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；12分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；24分钟时，流动相A为22%的乙腈溶液，流动相B为78%水溶液；
44分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；59分钟时，流动相A为40%的乙腈溶液，流动相B为60%水溶液；69分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液，流动相B为50%水溶液；74分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
79分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；81分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液；96分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为97.5%水溶液。本实施例获得的色谱图如图8所示。
实施例11
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；32分钟时，流动相A为22%的乙腈溶液，流动相B为78%水溶液；
37分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；57分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；67分钟时，流动相A为55%的乙腈溶液，流动相B为45%水溶液；69分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
74分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；76分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；91分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图9所示。
实施例12
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；35分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
40分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；60分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；75分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液，流动相B为40%水溶液；80分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
85分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；87分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；102分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；109分钟时，流动相A为2.5%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图10所示。
实施例13
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；25分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；35分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
40分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；60分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；70分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液，流动相B为40%水溶液；75分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
80分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；82分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；97分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图11所示。
实施例14
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1.1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为15%的乙腈溶液，流动相B为85%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
45分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；70分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；80分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；82分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
87分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；89分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；104分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图12所示。
实施例15
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为17%的乙腈溶液，流动相B为83%水溶液；35分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
40分钟时，流动相A为27%的乙腈溶液，流动相B为73%水溶液；55分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；60分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液，流动相B为40%水溶液；70分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
75分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；77分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图13所示。
实施例16
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；45分钟时，流动相A为26%的乙腈溶液，流动相B为74%水溶液；65分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；70分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；80分钟时，流动相A为75%的乙腈溶液，流动相B为25%水溶液；
82分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；87分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；89分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；104分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图14所示。
实施例17
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2 %的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
45分钟时，流动相A为26%的乙腈溶液，流动相B为74%水溶液；65分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；85分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；95分钟时，流动相A为75%的乙腈溶液，流动相B为25%水溶液；
97分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；102分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；104分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；119分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图15所示。
实施例18
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
45分钟时，流动相A为26%的乙腈溶液，流动相B为74%水溶液；65分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；70分钟时，流动相A为40%的乙腈溶液，流动相B为60%水溶液；90分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；
92分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；97分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；99分钟时，流动相A为2 %的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；114分钟时，流动相A为2 %的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图16所示。
实施例19
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
45分钟时，流动相A为26%的乙腈溶液，流动相B为74%水溶液；65分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；95分钟时，流动相A为65%的乙腈溶液，流动相B为35%水溶液；97分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
102分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；104分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；119分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图17所示。
实施例20
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
45分钟时，流动相A为26%的乙腈溶液，流动相B为74%水溶液；65分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；100分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液，流动相B为40%水溶液；102分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；107分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；109分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；124分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图18所示。
实施例21
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为30℃，流速为0.9mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为16%的乙腈溶液，流动相B为84%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；45分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；65分钟时，流动相A为28%的乙腈溶液，流动相B为72%水溶液；75分钟时，流动相A为45%的乙腈溶液，流动相B为55%水溶液；85分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液，流动相B为50%水溶液；90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；95分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；97分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；112分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图19所示。
实施例22
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为35℃，流速为0.9mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；15分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；20分钟时，流动相A为15%的乙腈溶液，流动相B为85%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
50分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；70分钟时，流动相A为28%的乙腈溶液，流动相B为72%水溶液；80分钟时，流动相A为42%的乙腈溶液，流动相B为58%水溶液；95分钟时，流动相A为55%的乙腈溶液，流动相B为45%水溶液；
100分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；105分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；107分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；122分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图20所示。
实施例23
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为35℃，流速为0.9mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；20分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；50分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；70分钟时，流动相A为28%的乙腈溶液，流动相B为72%水溶液；80分钟时，流动相A为40%的乙腈溶液，流动相B为60%水溶液；85分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；107分钟时，流动相A为2 %的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图21所示。
实施例24
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为35℃，流速为0.85mL/min，进样量为20μL，检测波长为265nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；20分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；55分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液； 80分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；85分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；107分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图22所示。
实施例25
本实施例与实施例1相同，其区别在于柱温为25℃，流速为0.8mL/min，进样量为25μL，检测波长为275nm，流动相为乙腈和水按如下条件进行梯度洗脱：
0分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；20分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；40分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；65分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液； 85分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；95分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；97分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；
112分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。本实施例获得的色谱图如图23所示。
实施例26
按照实施例1的方法分别制备淫羊藿、丹参、何首乌（制）、甘草、枸杞、灵芝、珍珠粉、黄精和红参的提取液，然后进行HPLC检测，分别获得色谱图（图24-33），同时将补肾益寿胶囊按实施例1方法制备检测液，并按照实施例22的条件进行然后进行HPLC，获得如图34所示的色谱图。分析补肾益寿胶囊HPLC图谱中各色谱峰的归属情况，结果显示补肾益寿胶囊的HPLC图谱中具有代表其药材的特征峰共有16个，具体如表3所示。其中16个特征峰中峰号8、9和11三个特征峰的峰面积较小，指纹图谱方法学考察不合格，且三个特征峰分别对应的药材，在HPLC图谱中另有其它特征峰更能代表其对应药材，如峰号12~16，对应药材为淫羊藿，峰号5、6对应药材为甘草，根据文献报道可知，16号峰为淫羊藿苷，12~14号峰分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C（参见：张华峰，高翔，卢大炎等．HPLC法同时测定淫羊藿中朝藿定A、B、C与淫羊藿苷的含量．分析测试学报，2007，26（2）：198-201．裴利宽，郭宝林，黄文华等.淫羊藿属主要资源种类的HPLC指纹图谱特征和种类鉴定[J].中国中药杂志，2008，33(14)：1662-1668．陈彦，赵艳红，贾晓斌等．RP-HPLC法同时测定不同品种淫羊藿药材中5种主要黄酮类成分的含量．中国药房，2008，19（6）：431-433．）。通过以上分析，最终选定补肾益寿胶囊HPLC图谱中13个色谱峰作为其指纹图谱的特征峰（删除峰号8、9、11）。
表3．补肾益寿胶囊HPLC图谱中特征峰归属情况
实施例27
指纹图谱分析
运用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A版对14个批次的补肾益寿胶囊的指纹图谱进行了相似度分析，首先将色谱工作站的数据导人中药指纹图谱相似度计算软件中，选定上述13个特征峰进行谱峰匹配，并以批号10060078为参照谱，通过均值法计算得出样品指纹图谱的共有模式，并依此共有模式为标准，进行整体相似度评价，各批次补肾益寿胶囊指纹图谱见图35，相似度评价结果见表4。
表4．补肾益寿胶囊样品相似度结果
从表4可知，不同批次补肾益寿胶囊样品的相似度值均在97%以上，表明相似度良好，各批次样品具有相同的色谱特征峰，因此化学成分一致性较好，所建立的指纹图谱具有稳定性和可控性，可作为控制补肾益寿胶囊质量的评价依据。
按照本发明方法测定的补肾益寿胶囊指纹图谱中，通过对不同批次补肾益寿胶囊样品的HPLC图谱中的色谱峰进行比较和编号，并结合药材原料的HPLC图谱中的色谱峰信息，最终选定具有代表性的13个色谱峰作为共有峰，共有峰占总峰面积95%以上，分别为：
1号峰，平均保留时间RT为12.812min，RSD为0.23%，峰面积与称样量比值为759674，RSD为29.09%；
2号峰，平均保留时间RT为17.403min，RSD为0.52%，峰面积与称样量比值为7325599，RSD为47.85%；
3号峰，平均保留时间RT为20.813min，RSD为0.41%，峰面积与称样量比值为445658，RSD为26.02%；
4号峰，平均保留时间RT为31.006min，RSD为0.28%，峰面积与称样量比值为403201，RSD为14.20%；
5号峰，平均保留时间RT为49.220min，RSD为0.15%，峰面积与称样量比值为1831518，RSD为20.87%；
6号峰，平均保留时间RT为49.925min，RSD为0.19%，峰面积与称样量比值为845317，RSD为52.84%；
7号峰，平均保留时间RT为51.365min，RSD为0.20%，峰面积与称样量比值为4420173，RSD为24.35%；
8号峰，平均保留时间RT为61.770min，RSD为0.08%，峰面积与称样量比值为1081885，RSD为26.07%；
9号峰，平均保留时间RT为71.595min，RSD为0.11%，峰面积与称样量比值为2279481，RSD为18.89%；
10号峰，平均保留时间RT为73.443min，RSD为0.12%，峰面积与称样量比值为2775409，RSD为23.88%；
11号峰，平均保留时间RT为74.949min，RSD为0.13%，峰面积与称样量比值为20039687，RSD为20.39%；
12号峰，平均保留时间RT为76.208min，RSD为0.14%，峰面积与称样量比值为549428，RSD为44.39%；
13号峰，平均保留时间RT为77.800min，RSD为0.12%，峰面积与称样量比值14924163为，RSD为14.09%；
上述指纹图谱中，单峰面积占总峰面积的比值大于5%的峰有四个，分别为：
2号峰，平均保留时间RT为17.403min，RSD为0.52%，峰面积与称样量比值为7325599，RSD为47.85%；
7号峰，平均保留时间RT为51.365min，RSD为0.20%，峰面积与称样量比值为4420173，RSD为24.35%；
11号峰，平均保留时间RT为74.949min，RSD为0.13%，峰面积与称样量比值为20039687，RSD为20.39%；
13号峰，平均保留时间RT为77.800min，RSD为0.12%，峰面积与称样量比值14924163为，RSD为14.09%；
实施例28
方法学考察
1.***适应性试验
取淫羊藿苷标准品，按照实施例1的色谱条件进行HPLC，计算淫羊藿苷的理论踏板数，结果显示淫羊藿苷的理论塔板数为179488。
精密度试验
按实施例1方法制备补肾益寿胶囊溶液并进行HPLC分析，连续进样6次，记录色谱图，计算得到特征色谱峰相对峰面积的RSD为0.23~1.60%，相对保留时间的RSD为0.08~0.34%，结果表明精密度良好。
稳定性试验
按实施例1方法制备补肾益寿胶囊溶液并进行HPLC分析，分别在0小时、3小时、6小时、9小时、12小时和24小时进样，记录色谱图，计算得到各特征峰相对峰面积的RSD为0.20~1.75%，相对保留时间RSD为0.05~0.17%。结果表明供试品溶液在24 小时内基本稳定。
重现性试验
同一批的补肾益寿胶囊6份（批号：12110125），按实施例1方法制备补肾益寿胶囊溶液并进行HPLC分析，分别进样，记录色谱图，计算得各特征色谱峰（峰面积/称样量）相对值的RSD为0.29~1.83%，相对保留时间RSD为0.02~0.44%，结果表明重现性良好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.制备补肾益寿胶囊溶液：准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入溶媒，再进行超声处理溶解，冷却后用溶媒补足，然后离心收集上清，得补肾益寿胶囊溶液；所述溶媒为甲醇、乙醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
b.色谱条件：色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶，柱温为25-35℃，流速为0.8-1.2mL，检测波长为265-275nm，流动相以乙腈与水在体积比为2-100:0-98范围内梯度洗脱；
c.测定：取步骤a制备的补肾益寿胶囊溶液注入液相色谱仪，按照步骤b的条件进行高效液相色谱测定，得补肾益寿胶囊指纹图谱。
2.根据权利要求1所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤a是准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入甲醇或体积分数为50%的乙醇，超声处理15~45分钟，冷却后用甲醇或体积分数为50%的乙醇补足，然后在转速大于10000 r/min条件下离心至少10 min。
3.根据权利要求1所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤a是准确称取补肾益寿胶囊内容物，加入体积分数为50%的乙醇，超声处理30分钟，冷却后用体积分数为50%的乙醇补足，然后在转速为10000 r/min条件下离心10 min。
4.根据权利要求1-3任一项所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述超声处理的频率40 kHz。
5.根据权利要求1所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤b中，色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶，柱温为30℃，流速为1mL，检测波长为270nm，流动相为乙腈和水，在如下条件下梯度洗脱：
洗脱时间大于等于0分钟小于20分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液；
洗脱时间大于等于20分钟小于40分钟时20分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液，流动相B为90%水溶液；
洗脱时间大于等于40分钟小于55分钟时，流动相A为20%的乙腈溶液，流动相B为80%水溶液；
洗脱时间大于等于55分钟小于80分钟时，流动相A为25%的乙腈溶液，流动相B为75%水溶液；
洗脱时间大于等于80分钟小于85分钟时，流动相A为30%的乙腈溶液，流动相B为70%水溶液；
洗脱时间大于等于85分钟小于90分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
洗脱时间大于等于90分钟小于92分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液，流动相B为10%水溶液；
洗脱时间大于等于92分钟时，流动相A为2%的乙腈溶液，流动相B为98%水溶液。
6. 根据权利要求1所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤c中，注入液相色谱仪的补肾益寿胶囊溶液为15-25μL。
7. 根据权利要求6所述补肾益寿胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤c中，注入液相色谱仪的补肾益寿胶囊溶液为20μL。
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