CN104894018A - 一种卢娜林瑞链霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种卢娜林瑞链霉菌及其应用。所述的卢娜林瑞链霉菌从枯萎病发病区的蕉园取土壤样品中分离筛选得到，命名为卢娜林瑞链霉菌B-03(Streptomyces lunalinharesii)，于2015年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015148。该菌株对香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病菌、香蕉大灰斑病菌、贡蕉眼斑病菌、香蕉叶缘枯萎病菌、荔枝炭疽菌等病原菌均有抑制作用；其菌株发酵液也具有显著的抑菌效果。

Description

一种卢娜林瑞链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种卢娜林瑞链霉菌及其应用。

背景技术

链霉菌属(streptomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5～10个孢子；孢子为节孢子,由菌丝断裂而成，有的脱去外鞘，有的携带外鞘或残余，外鞘决定孢子的表面结构；DNA中的G+C克分子含量为69～76％。本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。

香蕉是为芭蕉科芭蕉属多年生草本植物，是热带、亚热带主要水果之一。由于香蕉栽培区域广泛，导致多种病虫害的爆发，如香蕉枯萎病、香蕉炭疽病、叶斑病等等，其中尤其以香蕉枯萎病危害最为严重，一旦大规模爆发，会给当地香蕉栽培带来毁灭性的打击。香蕉枯萎病是一种由真菌侵染引起的土传病害。此病原菌为尖孢镰刀菌，是一种土壤习居菌，土壤消毒，降低土壤中病原菌的数量是防治香蕉枯萎的重要手段之一。而本研究通过对香蕉枯萎病发病区的蕉园土壤中微生物进行筛选，以期得到抑制香蕉枯萎病菌的菌株。

发明内容

本发明提出一种链霉菌及其应用，对多种病原菌均有抑制作用，抑菌效果显著。

本发明的第一个方面提供一种卢娜林瑞链霉菌，命名为卢娜林瑞链霉菌(Streptomyces lunalinharesii)B-03，于2015年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M2015148。

所述卢娜林瑞链霉菌B-03的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制备防治香蕉枯萎病菌制剂中的应用。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制备抑制香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病、香蕉大灰斑病、贡蕉眼斑病、香蕉叶缘枯萎病、荔枝炭疽菌的制剂的应用。

本发明的第四个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液，将本发明第一个方面所述的卢娜林瑞链霉菌B-03接种于大豆粉发酵培养基28℃培养3～5d后得到发酵种子液，将所述发酵种子液接种于豆饼培养基中，28℃～30℃，180rpm震荡培养7～10d，得到所述的菌株发酵液。

进一步，所述的大豆粉培养及的组成，按重量份记为：大豆粉5～10份、NaCl1～5份、CaCO3 1～3份、蛋白胨2～5份、葡萄糖5～10份；所述大豆粉培养基pH值为7.0～7.5；所述的豆饼发酵培养基的组成，按重量份记为：红糖180～200份，豆饼50～70份，水800～1200份。

本发明的第五个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制尖孢镰刀菌1号小种、尖孢镰刀菌4号小种和胶孢炭疽菌制剂的应用。

本发明的第六个方面是提供一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制香蕉枯萎病制剂的应用

进一步，将本发明第六个方面所述的菌株发酵液稀释后，直接施用于大田作物。

进一步，所述的菌株发酵液稀释50～100倍后灌根或者地面喷施。

本发明所述的卢娜林瑞链霉菌菌株，经多项鉴定，确定为卢娜林瑞链霉菌(Streptomyces lunalinharesii)B-03，并于2015年3月23日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M2015148。

本发明的有益效果：

本发明所述的卢娜林瑞链霉菌B-03，对香蕉枯萎病菌具有较好的抑制作用，制备的菌株发酵液施用在盆栽香蕉苗上，对香蕉枯萎病具有显著的防控效果。此外，本发明所述的链卢娜林瑞链霉菌同时对香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病、香蕉大灰斑病、贡蕉眼斑病、香蕉叶缘枯萎病以及荔枝炭疽菌等病原菌也具有较好的抑制作用，具有广泛的抗菌效果，对于植物病害的综合防控，尤其是香蕉栽培过程中多发、高发病害的综合防控，具有重大的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为卢娜林瑞链霉菌B-03在不同培养基上的生长状态图片；

图中，ISP1为高氏一号培养基；ISP2为酵母膏麦芽膏琼脂培养基；燕麦片ISP3为琼脂培养基；ISP4为无机盐淀粉琼脂培养基；ISP5为葡萄糖-天冬素琼脂培养基；ISP6为蛋白胨-酵母浸膏琼脂培养基；ISP7酪氨酸琼脂培养基。

图2为卢娜林瑞链霉菌B-03对贡蕉眼斑病菌抑制活性检测图片；

图3为卢娜林瑞链霉菌B-03对荔枝炭疽病菌抑制活性检测图片；

图4为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉大灰斑病菌抑制活性检测图片；

图5为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉枯萎病菌抑制活性检测图片；

图6为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉叶缘枯萎病菌抑制活性检测图片；

图7为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉长形叶斑病菌抑制活性检测图片；

图8为卢娜林瑞链霉菌B-03对香蕉炭疽菌抑制活性检测图片；

在图2～图8中，a为卢娜林瑞链霉菌B-03菌株，b为贡蕉眼斑病病菌，c为荔枝炭疽病菌，d为香蕉大灰斑病菌，e为香蕉枯萎病病菌，f为香蕉叶缘枯萎病菌，g为香蕉长形叶斑病菌，h为香蕉炭疽菌。

图9为采用生物自显影薄层色谱法检测卢娜林瑞链霉菌B-03发酵液原液对不同病原菌的抑制作用图片。

图9中，A为胶孢炭疽菌，B为尖孢镰刀菌1号小种，C为尖孢镰刀菌4号小种。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、菌株的筛选

分别于海南省南宝镇新营农场枯萎病发病区的蕉园取土壤样品。取样方法为每个田块采用五点随机取样混合为一个样品，采集香蕉植株根围土壤(10cm～30cm土层)。从田间采集的新鲜样品放入塑料样品采集袋中，并置于冰盒中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用。

采用梯度稀释法将上述土壤样品制成10^-2～10^-4浓度梯度系列悬浮液，放线菌的分离，采用高氏一号培养基(使用前要加入3％重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长)；细菌的分离，采用LB培养基和10^-4～10^-6稀释度。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.1mL，滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，培养皿倒置，于25～28℃温箱中培养2～5d，根据平板上长出的菌落的颜色、形态、大小的细菌、和放线菌的单菌落挑出到新的培养基上进行纯化培养，对纯化后的菌株分别编号，保存并记录不同样品分离到的菌株数目。

采用平板对峙培养法，检测上述分离到的各种细菌、放线菌菌株(以下称“待测菌株”)对尖孢镰刀菌4号生理小种(以下称“靶标菌株”)的抑菌活性，用打孔器(直径6mm)在提前3d活化并培养好靶标菌株菌落边缘切取菌丝块，并转接在另一个PDA平板中央，再将活化后的待测菌株接种在距靶标菌株菌丝块2～3cm处，每平板接种四个待测菌株，以不接任何待测菌株的靶标菌株为对照，每个菌株三次重复。25～28℃恒温培养一段时间后，测量待测菌株与靶标菌株之间的抑菌带宽度，筛选出对尖孢镰刀菌4号生理小种具有拮抗作用的菌株B-03。

LB培养基组成：胰蛋白陈10.0g、酵母粉5.0g、NaCl 10.0g、琼脂17～20.0g、水1000.0mL，用1mol/L NaOH调pH值至7.5。不加琼脂的为LB培养液。

PDA培养基组成：马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、琼脂粉17～20.0g、水1000.0mL。

二、菌株的鉴定

1.菌株B-03的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.菌株B-03的16S rDNA基因测序BLAST结果如下表1所示。

表1菌株B-03的16S rDNA基因测序BLAST结果

3.菌株B-03的进化树

4.菌株B-03的生长情况和形态

在不同的培养基分别培养分离得到的链霉菌菌株，比较其培养性状，如表2所示，菌株在不同培养基的培养性状如图1所示，菌种显微镜(1000X)下照片如图2-7所示。培养基按照以下配方配制。

高氏一号培养基(ISP1)：可溶性淀粉20.0g、NaCl 0.5g、KNO₃ 1.0g、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、MgSO ₄·7H₂O 0.5g、FeSO ₄·7H₂O 0.01g、琼脂15-20g、H₂O 1000mL。大豆粉发酵培养基：大豆粉10.0g、NaCl 2.5g、CaCO₃ 2.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖10.0g，pH 7.2～7.4。

酵母膏麦芽膏琼脂培养基(ISP2)：酵母膏10g、麦芽浸粉10g、葡萄糖4g、pH 7.3。燕麦片琼脂培养基(ISP3)：麦片20g，微量盐溶液1mL。

无机盐淀粉琼脂培养基(ISP4)：淀粉10g、K₂HPO₄1g、MgSO₄·7H₂O 1g、NaCl1g。

葡萄糖-天冬素琼脂培养基(ISP5)：天门冬酰胺10g、甘油10g、K₂HPO₄ 1g、微量盐1mL、pH 7.0-7.2。

蛋白胨-酵母浸膏琼脂培养基(ISP6)：蛋白胨15g、示蛋白胨5g、柠檬酸铁铵0.5g、磷酸氢二钾1g、硫代硫酸钠0.08g、酵母膏1g、蒸馏水1L、琼脂20g，pH7.0-7.4。

酪氨酸琼脂培养基(ISP7)：甘油15g、酪氨酸0.5g、天门冬酰铵1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.5g、硫酸亚铁0.01g、微量盐溶液1mL、pH 7.2-7.4。微量盐溶液：FeSO₄·7H₂O 0.1g、MnCl₂·4H₂O 0.1g、ZnSO₄·7H₂O 0.1g、蒸馏水100mL。

表2不同培养基菌株培养性状统计

由表2可知，菌株B-03在上述7种培养基上均可生长，在上述7种培养基上未产生可溶性色素。

5.菌株B-03的碳源利用如下表3所示。

表3菌株B-03碳源利用情况

+：阳性，-：阴性，w：弱阳性

综合以上检测结果，菌株B-03鉴定为卢娜林瑞链霉菌(Streptomyceslunalinharesii)，并于2015年3月23日将该菌株在中国典型培养物保藏中心进行保藏，并证明存活，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015148。

三、卢娜林瑞链霉菌B-03抑菌活性检测

采用平板对峙培养法，测试卢娜林瑞链霉菌B-03对病原真菌的抑菌活性。先将活化后的卢娜林瑞链霉菌B-03菌株接种在距病原菌菌丝块2～3cm处，每平板接种四个卢娜林瑞链霉菌B-03菌株，以不接任何卢娜林瑞链霉菌B-03菌株的病原菌为对照，每个菌株三次重复，25～28℃恒温培养3d后，测量卢娜林瑞链霉菌B-03菌株与病原真菌菌株之间的抑菌带宽度作为抑菌作用强弱的指标。抑菌检测结果如图2至图8所示，抑菌带宽度如表4所示。

表4卢娜林瑞链霉菌B-03对不同菌株的抑制作用

由表4可知，卢娜林瑞链霉菌B-03对上述病原菌均有不同程度的抑制作用，对常见的香蕉病原菌均可达到抑制作用，其中对香蕉长形叶斑病抑制效果最好，其次为香蕉枯萎病病菌。对于综合防控植物病害，尤其是香蕉多发、高发病害，具有一定应用价值。

四、卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液的制备

首先将保存的斜面卢娜林瑞链霉菌B-03菌株在YE培养基上活化培养，培养温度为28℃，将活化后的菌株接种于大豆粉发酵培养基：大豆粉5～10g、NaCl1～5g、CaCO₃ 1～3g、蛋白胨2～5g、葡萄糖5～10g；所述大豆粉培养基pH值为7.0～7.5，28℃培养3～5d后得到发酵种子液；将上述种子液接种于豆饼发酵培养基中，接种量按照豆饼发酵培养基体积的10％取发酵种子液；所述的豆饼培养基配方为：红糖180～200g，豆饼50～70g，水800～1200g，28℃～30℃，180rpm震荡培养7～10d，得到菌株发酵液。上述发酵液可以稀释直接用于大田作物。应用大田作物时，可以随水肥管道灌根或地面喷施均可。

YE培养基组成为：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽粉10g，水1000ml，PH7.2-7.4。五、卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液对病原菌的抑制作用

采用薄层层析板(硅胶板)检测卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液的抑菌活性，并采用生物自显影薄层色谱法检测抑菌圈的大小。具体操作为：将得到的卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液原液4ul和8ul，分别编号为D1-F4和D1-F8，采用毛细管分别点至2个硅胶板中央，风干后备用；将发酵液原液采用冷冻干燥仪冻干，得到干样，将得到的干样0.5g溶于1ml乙醇中，充分溶解后，取4ul和8ul，分别编号为D1-DF4和D1-DF8，采用上述方法分别点至2个硅胶板中央，分别将不同的病原菌的分生孢子悬浮液溶于50％琼脂浓度的PDB中，并将孢子终浓度调整为1.0x 10⁶CFU，分别将不同的病原菌分生孢子均匀喷洒在事先点样的硅胶板上，保湿并于光照培养箱25℃，培养4天后观察抑菌圈直径。如表5所述，菌株发酵液原液对三种病原菌抑制作用如图9所示。

表5卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液对真菌的抑制作用

由表5可以看出，卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液对三种实验菌株均有较好的抑制活性，且在菌株发酵液浓度相同的情况下，发酵原液抑菌活性比冻干的发酵液抑菌活性更为显著。说明在通过冻干处理，影响了卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液的抑菌活性，因此，用于防治病原菌，优先选择卢娜林瑞链霉菌B-03菌株发酵液原液。

六、卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液对盆栽香蕉苗枯萎病的防治效果

盆栽试验检测卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液对香蕉枯萎病的防治效果，温室的条件控制为温度28℃～30℃，湿度为70％，自然光照，选取长势一致的香蕉苗，营养钵装土500g/钵，将香蕉苗栽入其中。试验设3个处理，1)空白处理：施用清水；2)发酵液处理：病原菌+施用发酵液原液；3)CK：病原菌+施用清水。各处理设3个重复，每个重复30株香蕉苗。病原菌处理方法为：将FOC4在PDA平板上活化培养5d，采用无菌水冲洗的方法洗出病原菌孢子，制成孢子悬浮液，镜检并将孢子悬浮液稀释为10⁵CFU/mL浓度。移栽前，采用灌根法接种病原菌，接种浓度为10⁵CFU/mL的孢子悬浮液。各处理组在移栽1天后，发酵液处理组施入稀释50倍的发酵液原液，施用量为200mL/钵；CK组和空白处理组施入等量清水；每隔5天再重复施用一次，共计9次。试验期间，各处理其他管理措施一致。在香蕉移栽第60d时，记录各处理每株香蕉黄化叶片和正常叶片数并计算病情指数等级，其结果见表6。

香蕉病情指数及防病效果按照以下公式进行计算：

病情指数＝Σ(病害的级别×该级别的植株数)/供试植株

病情分级：0级为无症状；1级为整株叶片只有最下部1片叶片发黄轻度萎蔫；2级为1-2片叶片变黄萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片变黄萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片变黄萎蔫；5级为全株3/4以上叶片变黄萎蔫或整株死亡。

表6菌株发酵液对盆栽香蕉苗枯萎病的防治效果

由表6可以看出，施用发酵液原液+病原菌的处理组，病情指数比施用病原菌+清水的处理组明显降低，防病效果可达69.82％以上。说明本发明所述的卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液对盆栽香蕉苗枯萎病具有显著的防治作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种卢娜林瑞链霉菌，其特征在于，命名为卢娜林瑞链霉菌(Streptomyceslunalinharesii)B-03，于2015年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M2015148。

2.根据权利要求1所述的一种卢娜林瑞链霉菌，其特征在于：所述卢娜林瑞链霉菌B-03的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制备防治香蕉枯萎病菌制剂中的应用。

4.所述的卢娜林瑞链霉菌B-03在制备抑制香蕉炭疽菌、香蕉长形叶斑病菌、香蕉大灰斑病菌、贡蕉眼斑病菌、香蕉叶缘枯萎病菌、荔枝炭疽病菌的制剂的应用。

5.一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液，其特征在于：将卢娜林瑞链霉菌B-03接种于大豆粉发酵培养基28℃培养3～5d后得到发酵种子液，将所述发酵种子液接种于豆饼培养基中，28℃～30℃，180rpm震荡培养7～10d，即得到所述的菌株发酵液。

6.根据权利要求5所述的卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液，其特征在于：所述的大豆粉培养及的组成，按重量份记为：大豆粉5～10份、NaCl 1～5份、CaCO₃1～份、蛋白胨2～5份、葡萄糖5～10份；所述大豆粉培养基pH值为7.0～7.5；所述的豆饼发酵培养基的组成，按重量份记为：红糖180～200份，豆饼50～70份，水800～1200份；按照豆饼发酵培养基体积的10％取发酵种子液。

7.根据权利要求5或6所述的一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制尖孢镰刀菌1号小种、尖孢镰刀菌4号小种和胶孢炭疽菌制剂的应用。

8.根据权利要求5或6所述的一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液在制备抑制香蕉枯萎病制剂的应用。

9.根据权利要求7或8所述的一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液的应用，其特征在于，所述的菌株发酵液稀释后，直接施用于大田作物。

10.根据权利要求9所述的一种卢娜林瑞链霉菌菌株发酵液的应用，所述的菌株发酵液施用方法为，菌株发酵液稀释50～100倍后灌根或者进行地面喷施。