CN107043726A - 一株放线菌svfj‑07及其在防治兰花炭疽病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株放线菌SVFJ‑07及其在防治兰花炭疽病病害中的应用，属于微生物技术领域。该放线菌为链霉菌属的酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ‑07，保藏号为：CGMCC No.14020。该酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ‑07可防治兰花炭疽病菌等引起的植物病害，特别可以与兰花共生，在兰花植株体内稳定生存并有效防治兰花炭疽病。

Description

一株放线菌SVFJ-07及其在防治兰花炭疽病中的应用

技术领域

本发明涉及一株放线菌SVFJ-07及其在防治兰花炭疽病病害中的应用，属于微生物防治领域。

背景技术

当前对植物病害的防治主要以化学防治为主，然而化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及致病菌产生抗药性等诸多问题，而生防菌以其低毒、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们公认为为理想的微生物。放线菌是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的生物活性物质中，近70%是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中广泛应用，如阿维菌素，中生菌素等。土壤放线菌具有效果持久、针对性强和对环境友好等优点，应用前景良好。

兰花是（Cymbidium spp.）是兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年生单子叶草本植物，栽培历史悠久，品种较多，具有较高的观赏价值和经济价值。随着种植时间的延长及栽培集约化程度的提升，胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病对兰花的生长、观赏甚至存活造成严重影响。该病害主要危害叶片，受害叶片初期表面产生浅褐色凹陷小点，后期扩大为不规则形或椭圆形的病斑，病部凹陷十分明显，中间灰褐色，边缘深褐色，产生许多轮状排列的小黑点，严重时多个病斑相连，病叶逐渐枯死，兰株不开花甚至整株死亡。为有效控制该病原菌侵染为害，已有学者对其生物学特性及防治药剂进行了深入研究，提出了一些可行的防控技术方案。目前，防治炭疽病的主要策略为化学防治和培育抗病品种，化学防治污染环境且危害人类健康，抗病品种培育困难且存在抗性减弱的风险，因此，生物防治因其安全、高效、无残留成为人们最青睐的方法。土壤是各种微生物良好的栖息场所，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。在生防菌株的筛选上，考虑到植物与微生物之间的相互作用关系，人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选，这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一株放线菌SVFJ-07及其在防治兰花炭疽病病害中的应用，可用于防治由兰花炭疽病引起的植物病害。

本发明提供的放线菌为酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07，已于2017年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为：CGMCC No.14020，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供了所述的放线菌SVFJ-07在防治兰花炭疽病病害中的应用。所述植物病害为兰花炭疽病菌引起的植物病害。

以上述酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07为活性成分的生物菌剂也属于本发明

的保护范围，在需要的时候，该菌剂中还包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

所述解酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07在高氏一号培养基、PDA培养基上生长良好。高氏：气丝白，基丝橙红。 Isp2：气丝白，基丝橙。 Isp3：气丝白，基丝橙黄，产浅黄色可溶性色素。 Isp4：气丝橙褐，基丝褐。 Isp5：气丝橙褐，基丝褐。光学显微镜下观察其孢子丝直、柔曲，末端带钩。孢子卵圆形、长圆形，表面光滑。菌株SVFJ-07对D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇和D-果糖等碳源均有不同程度的利用能力，不利用L-***糖、蔗糖、棉子糖；淀粉不水解；不产H₂S和类黑色素；牛奶不凝固，但胨化；明胶液化缓慢。在多个特征上与对比菌株（Streptomyces vinaceus）相似。

本发明的显著优点：本发明的酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07对兰花炭疽病有很强的抑制作用，具有对其引起的真菌病害起到防治作用的潜力。

本发明的酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07分离自兰花植株根际周围土壤，实验证明接种兰花植株后能够有效防治兰花炭疽病，为兰花炭疽病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。

附图说明

图1为菌株酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07在PDA培养基上的培养特征。

图2 为菌株SVFJ-07依据16S rDNA序列构建的***发育树。

图3为菌株酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07孢子悬浮液对兰花茎腐病的防效结果，以及只接茎腐病菌孢子悬浮液为对照（CK）的实验结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分比（%），如无特别说明，均表示质量百分比。

其中兰花炭疽病菌菌株离自兰花发病症状典型的叶部，按常规方法进行组织分离培养获得，单孢纯化后按柯赫氏法则验证其致病性后移入PDA培养基试管斜面保存。菌株保藏于福建省农业科学院植物保护研究所生态调控室。

实施例1：放线菌的筛选与鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：拮抗放线菌酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07分离自土层土壤；兰花炭疽病菌（C. gloeosporioides）、兰花茎腐病菌（Fusarium oxysporum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、榕树黑斑病菌（Alternaria alternata）、榕树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）均由本实验室保存。

主要试剂及培养基：供试碳源D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、D-果糖、棉子糖、L-***糖、蔗糖和L-肌醇为Amersco公司产品；放线菌基因组提取试剂盒、Taq PCR MasterMix等相关试剂购自TaKaRa公司；放线菌序列扩增通用引物16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由英杰上海生物公司合成。其它试剂均为进口或国产分析纯。放线菌筛选培养基为改良HVA培养基，放线菌菌株的活化与保存采用高氏1号培养基；液体摇瓶发酵为液体高氏1号培养基； r-Taq酶等PCR相关试剂购自TaKaRa公司；链霉菌培养基2号（ISP2）、链霉菌培养基3号（ISP3）、链霉菌培养基4号（ISP4）和链霉菌培养基5号（ISP5）等培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

方法

1.2.1 放线菌的分离培养

将采集到的士壤样品自然风干过筛后，采用平板稀释法分离：称取土壤样品1 g，加到备有9 mL 无菌水的离心管中，振荡30 min，然后配制成10^{- 3}、10^{- 4} 、10^{- 5} 的悬浮液。取不同浓度的悬浮液各0.1 mL 于改良HVA培养基平板中，均匀涂布，每一放度培养3皿，置于28℃的恒温箱中倒置培养。培养7d挑取培养基上生长的单菌落进行转接纯化。根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株。纯化的放线菌菌株接种斜面培养基中培养后置于4℃冰箱保存备用。

拮抗放线菌的筛选

参考杜宜新或者鹿连明等的方法，分别采用平板对峙培养法和放线菌培养过滤液抑制率法初筛和复筛对兰花炭疽病菌有拮抗活性的放线菌，将分离获得的放线菌接种于高氏一号培养基平板内，28℃培养7 d 后取直径5 mm 的菌碟放置于PDA平板边缘，中间接种兰花炭疽病菌，28℃培养5 d，观察抑菌带的有无，筛选抑菌带较宽的菌株。将平板对峙筛选出抑菌带宽度在10 mm以上的放线菌菌种接种于发酵培养基中。发酵用500 mL 三角瓶，每瓶装液量为200 mL，于28℃180 r /min培养7 d 。发酵液经10000 g 离心10 min 后，取上清液用0.22μm 微孔滤膜过滤，取滤液0.5 mL 加入到直径9 cm 的培养皿中，与冷至50℃的9. 5mL PDA 培养基混匀制成带菌平板，用5 mm无菌打孔器打取供试病原菌菌饼，置于带菌平板的中央，以无菌水与PDA 制成的平板为对照，3次重复。28℃培养7 d 后，用十字交叉法测量菌落直径，计算生长抑制率，按以下公式计算生长抑制率：生长抑制率=（对照平板菌落直径－处理平板菌落直径）/（对照平板菌落直径－菌饼直径）×100% 。

拮抗放线菌的抑菌谱测定

采用牛津杯法测定筛选出的放线菌的抗菌谱，用接种针将靶标菌菌丝和孢子刮下制成菌悬液1 mL 与PDA 培养基10 mL 混合后倒入9 cm 的培养皿中制成平板，将灭菌牛津杯置于混好靶标菌的PDA 平板中央，杯中加入200μL 无菌发酵滤液，分别置28℃培养3 d后测定抑菌圈直径，试验设置3次重复。

拮抗放线菌的鉴定

（1）形态特征测定：将筛选获得的拮抗放线菌SVFJ-07于高氏一号培养基上用无菌接种环划线接种，然后将灭菌后的盖玻片（1 cm×1 cm）斜***培养基内，于28℃培养箱内培养5d后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株的孢子和菌丝形态。

（2）培养特征测定：参照《链霉菌鉴定于册》中的方法进行。

（3）生理生化特征测定：参照《放线菌快速鉴定与***分类》和《链霉菌鉴定手册》中所述的方法，对菌株SVFJ-07的生理生化特性如碳源利用、黑色素产生、H₂S产生、七叶苷利用、纤维素利用、明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固及冻化、纤维素水解、硝酸盐还原等指标进行测定。

（4）16S rDNA序列分析：菌株SVFJ-07于高氏一号液体培养基中培养4-5 d的菌液，置无菌离心管中离心后收集菌体沉淀。称取0.1~0.2 g菌体于无菌研钵中，加入少量PVP后用液氮研磨成粉末，采用放线菌基因组提取试剂盒提取菌体总DNA。以通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′扩增放线菌16S rDNA。将PCR产物上样于含有GelRed染料的琼脂糖凝胶中电泳后回收目的条带，送交上海杰李生物公司测序。利用NCBI Blast对所测序列进行比对分析，选取GenBank中与之同源性较高的菌株的16S rDNA序列，利用Clustal X软件对其进行多重比对，分析菌株SVFJ-07与参比菌株之间的序列相似性，并通过Mega4.1软件中的Neighbor joining方法构建***发育树。

数据分析

利用Excel2003对试验数据进行统计整理， SAS 9.1软件的Duncan氏新复极差法对各处理进行差异显著性分析。

结果与分析

2.1 拮抗放线菌的分离和筛选

将分离获得25 株放线菌，经过平板对峙培养法筛选出6株对兰花炭疽病菌拮抗效果均较好的放线菌菌株。采用放线菌培养滤液分别测定6株菌株对兰花炭疽病菌的抑制率，结果表明（表1），初筛的6株放线菌过滤液稀释100 倍后对兰花炭疽病菌均有一定的抑制作用，其中编号为SVFJ-8、SVFJ-15和SVFJ-18的菌株过滤液抑制作用较强，抑制率均大于70% ，编号为SVFJ-07 的菌株抑制作用最强，抑制率达到近85%。

表1 6株放线菌发酵液对兰花炭疽病菌的抑菌活性

同列数据后标有不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

拮抗放线菌对植物病原菌的抑菌活性

通过平板对峙法，筛选获得一株对兰花炭疽病菌抑菌活性较强的菌株，将其命名为SVFJ-07。该菌株对供试7株植物病原菌均具有不同程度的抑制作用（表2），其中，对菌株兰花炭疽病菌（C. gloeosporioides）和榕树炭疽病菌（C. gloeosporioides）抑制作用最强，而对水稻纹枯病菌（R. solani）的抑菌活性较弱。对兰花茎腐病菌（F. oxysporum）、榕树黑斑病菌（A. alternata）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum）、番茄早疫病菌（A. solani）等具有较强的抑制作用。

表2 菌株SVFJ-07对供试植物病原菌的抑制作用

同列数据后标有不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

菌株SVFJ-07的鉴定

2.3.1 形态特征及培养特性

菌株SVFJ-07在高氏一号培养基、PDA培养基上生长良好。高氏：气丝白，基丝橙红。Isp2：气丝白，基丝橙。 Isp3：气丝白，基丝橙黄，产浅黄色可溶性色素。 Isp4：气丝橙褐，基丝褐。 Isp5：气丝橙褐，基丝褐。光学显微镜下观察其孢子丝直、柔曲，末端带钩。孢子卵圆形、长圆形，表面光滑。

生理生化特征

菌株SVFJ-07对D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇和D-果糖等碳源均有不同程度的利用能力，不利用L-***糖、蔗糖、棉子糖；淀粉不水解；不产H₂S和类黑色素；牛奶不凝固，但胨化；明胶液化缓慢。在多个特征上与对比菌株（Streptomyces vinaceus）相似。

序列分析

经NCBI Blast比对分析发现，所分离放线菌的16S rDNA序列（序列如SEQ ID No.1所示）与GenBank中链霉菌属的多个种均具有较高的同源性，选取10个典型菌株的16S rDNA序列用MEGA 5.0软件构件***发育树（图2）。结果表明，菌株SVFJ-07与（S. vinaceus）属于同一分支，其中与菌株（S. vinaceus）相似性达99%以上，结合形态学和培养特征，将菌株鉴定为酒红链霉菌（S. vinaceus）。

实施例2 ：菌株SVFJ-07温室盆栽防效试验

兰花品种为盆栽兰花。每株浇灌50ml SVFJ-07菌株发酵液(10⁶个孢子/mL)。24h 后针刺接种炭疽病菌，接种浓度1×10⁶个孢子/mL，接种病原菌后第4天进行第二次发酵液处理。以72%农用链霉素灌根处理的植株作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理5株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到90%以上时结束实验。

病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：每叶病斑1～3个或病斑面积5.0%以下；

3级：每叶病斑4～6个或病斑面积5.1%～10.0%；

5级：每叶病斑7～10个或病斑面积10.1%～15.0%；

7级：每叶病斑11～20个或病斑面积15.1%～25.0%；

9级：每叶病斑20个以上或病斑面积占全叶面积25.1%以上。

发病率(%)=发病株数/总株数×100%

病情指数(%)=[ I:病级数×该病级植株数) / (最高病级数×总植株数)] ×100%

防治效果(%)=[ (对照病情指数一处理病情指数) /对照病情指数] ×100%(对照指清水对照处理)

实验结果表明(表3)，供试酒红链霉菌（S. vinaceus）SVFJ-07 发酵液能够显著降低兰花炭疽病的病情指数，防治效果高达70.06%，显著高于45%咪鲜胺SC1500倍的防治效果54.56%。另外从表中还可以看出，发酵培养基处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，但两者差异不显著。温室盆栽实验结果说明，SVFJ-07菌株能够有效防治兰花炭疽病，展现出良好的应用潜力。

表3 放线菌SVFJ-07对兰花炭疽病的盆栽防治效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一株放线菌SVFJ-07及其在防治兰花炭疽病中的应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 链霉菌属（Streptomyces sp.）

<400> 1

gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tacttaacac atgcaagtcg aacgatgaac 60

cacttcggtg gggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gccctgcact 120

ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatact gatcatcttg ggcatccttg 180

gtgatcgaaa gctccggcgg tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtgaggt 240

aatggctcac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga 360

aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420

gcagggaaga agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg gcgcgagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg 540

taggcggctt gtcgcgtcgg ttgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcagtcgat 600

acgggcaggc tagagttcgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc 660

agatatcaga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg gccgatactg acgctgagga 720

gcgaaagcgt gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aacggtgggc 780

actaggtgtg ggcgacattc cacgtcgtcc gtgccgcagc taacgcatta agtgccccgc 840

ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900

cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatacacc 960

ggaaaaccct ggagacaggg tcccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg 1020

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcccgtg 1080

ttgccagcag gcccttgtgg tgctggggac tcacgggaga ccgccggggt caactcggag 1140

gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac 1200

aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct 1260

cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag taatcgcaga 1320

tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga 1380

aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct gtcgaaggtg 1440

ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaa 1467

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaggaggtga tccagccgca 20

Claims (3)

1. 一株放线菌，其特征在于：所述放线菌为酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）SVFJ-07，于2017年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏在管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.14020。

2.一种包含权利要求1所述放线菌的生物菌剂。

3.如权利要求1所述的放线菌在防治兰花炭疽病中的应用。