CN104833754B - 一种附甘药物检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种附甘药物质量检测方法，其特征在于：采用以极性***连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱鉴别及测定附子含量，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善；采用薄层色谱法鉴别甘草；采用高效液相色谱法控制双酯型生物碱含量；经过相关方法学验证及实例考察，表明本发明能简便准确的鉴别附甘药物、控制双酯型生物碱含量、检测附子及甘草含量，在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。

Description

一种附甘药物检测方法

技术领域

本发明涉及一种附甘药物质量检测方法，属药品技术领域。

技术背景

中国发明专利(ZL201210536161.3)一种治疗过敏性鼻炎和支气管哮喘的药物,由附子6－18份，甘草9－1份为原料制成(命名为“附甘药物”)，对于过敏性鼻炎和支气管哮喘有很好的疗效。

过敏性鼻炎及支气管哮喘均为Ⅰ型***反应密切相关的呼吸***疾病。属多发病、疑难病，且患病率有逐年增高的趋势。现有治疗过敏性鼻炎的药物主要有抗组胺类、糖皮质激素类、抗白三烯药、抗胆碱能药及拟肾上腺素药等，主要是鼻腔给药，长期使用易产生副作用和耐药性，愈后复发率高，长期疗效差。此外脱敏免疫治疗由于疗程长等原因受到限制而不能大面积临床推广。目前国内外此类药物的研究主要是现有药的剂型改造，重点是喷雾剂、吸入剂的长效剂型，以减少用药次数，降低副作用，提高患者的依从性。上述化药的特点是起效快，作用明显，但长期效果差，不能根治，易产生耐药性和副作用。

本发明已有的临床应用结果表明，本品对过敏性鼻炎及支气管哮喘的疗效确切、长期效果好、未见不良反应，在一定程度上弥补了化药只控制症状、长期效果差等的缺陷。

附甘药物的处方含有附子，附子所含生物碱主要有双酯类生物碱，单酯类生物碱和胺基醇类生物碱。其中双酯类生物碱毒性最大，属于难溶于水的脂溶性成分；单酯类生物碱属亲水性成分，毒性小，仅为双酯类生物碱的1/200；胺基醇类生物碱属强亲水性成分，毒性甚微，仅是双酯类生物碱的1/2000～1/4000。附子中剧毒成分为双酯型生物碱主要为乌头碱、新乌头碱与次乌头碱。口服双酯类生物碱3～4mg可致人死亡(急性毒性研究的LD₅₀为11.8mg/Kg)，说明双酯类生物碱毒性极强，其是临床应用受限的主要原因。

本发明所述附甘药物，现有技术没有制剂的质量检测方法，无法在生产和使用中有效保证产品质量，因此，为了保证附甘药物质量和临床用药效果及安全，提供一套简便、可靠的质量检测方法非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种附甘药物的质量检测方法，确定有效成分含量及毒性成分(双酯生物碱)的限度，以保证药物的安全性、有效性和质量可控性。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明所述的一种附甘药物的质量检测方法，其特征在于：

【性状】本品内容物为棕黄色至棕褐色，味微甜、微苦；

【鉴别】(1)附子鉴别：照附子含量测定项下的方法试验，供试品色谱中应呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰；

(2)甘草鉴别：取本品内容物0.5～2.5g，加***40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-乙醇(5﹕2﹕1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

【检查】双酯型生物碱：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃(25﹕15)为流动相A，以含0.03mol/L磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算应不低于30000；

表1梯度洗脱程序

对照品溶液的制备取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

固相萃取柱***适用性试验精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.lmol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％磷酸溶液(30﹕70)的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液；

分别精密吸取上述固相萃取柱***适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95；

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取1～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，用乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取25ml续滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，滤液照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

其他应符合《中国药典》2010年版一部附录制剂通则项下有关的各项规定；

【含量测定】附子含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与***适用性试验：以极性***连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.1％的磷酸溶液(23﹕77)为流动相；检测波长为232nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于5000；

对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱***适用性试验用对照品溶液，分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液；

固相萃取柱***适用性试验：精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25％的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液；

分别精密吸取上述***适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95；

供试品溶液的制备取附甘颗粒，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

甘草含量测定：照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.5％冰醋酸溶液(18﹕82)为流动相；检测波长为276nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，取0.2～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

至此，完成了本发明，本发明的有益效果是采用了多种方法对附甘药物进行全面的质量控制，可保证药物的质量，严格控制了毒性成分的含量，保证有效成分含量达到要求。

为了进一步说明本发明对于附甘药物的质量可控性，以下通过本发明质量标准研究过程进一步说明本发明的有益效果。质量标准研究旨在进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。

一、测定样品制备

1、制备附甘颗粒剂

制法：取附子15kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。

按照上述制备方法，制备四批样品，批号分别为130901、140101、140102、140103。

2、制备不含附子的阴性颗粒剂

取甘草300g，照制备附甘颗粒剂的方法制成不含附子的阴性颗粒剂。

3、制备不含甘草的阴性颗粒剂

取附子750g，照制备附甘颗粒剂的方法制成不含甘草的阴性颗粒剂。

二、质量标准研究过程

【性状】根据多批样品观察结果：本品为棕黄色至棕褐色的颗粒，味微甜、微苦。

【鉴别】

1.附子

1.1鉴别方法

照附子含量测定项下的方法试验，供试品色谱中，应呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰。

1.2方法学验证

见样品【含量测定】附子项下。

1.3四批样品中附子的鉴别

取四批样品检验，结果，四批供试品色谱中，均呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰。

2甘草

2.1鉴别方法

采用薄层色谱法鉴别。

取附甘颗粒研细，称取2g，加***40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用等体积水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-乙醇(5﹕2﹕1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂。

2.2、方法学验证

2.2.1、专属性

取附甘颗粒(130901批)2g，照上述方法制备供试品溶液。

取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

取不含甘草的阴性制剂2g，照供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。

吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇-浓氨试液-乙醇(5﹕2﹕1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。

结果，供试品色谱中，在与甘草对照药材和甘草苷对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；阴性样品溶液在相应位置无斑点。说明本法鉴别甘草专属性良好。

2.2.2、耐用性

2.2.2.1、溶液稳定性

取专属性项下供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及展开剂，室温下放置，分别于第0、4、8小时点样、展开。结果显示上述各溶液在室温放置8小时内稳定性良好，可有效对甘草进行鉴别。。

2.2.2.2、展开温度

取供试品溶液、对照药材溶液及对照品溶液点于同一薄层板上，分别于10℃、20℃、30℃下展开。

结果显示此方法在上述温度范围内展开良好，可有效对甘草进行鉴别。

2.3测定

取三批样品(140101批，140102批，140103批)，照前述方法鉴别甘草，结果，三批供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上均显相同颜色的荧光斑点。

【检查】

1.双酯型生物碱限度检查

附子所含双酯型生物碱是附子药材的主要毒性成分，为保证安全性，应对其限度进行控制，参考《中国药典》2010年版(第二增补本)附桂骨痛胶囊项下双酯型生物碱检查方法进行试验，研究过程如下：

1.1测定方法

色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-四氢呋喃(25﹕15)为流动相A，以含0.03mol/L磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为232nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于30000。

表2梯度洗脱程序

对照品溶液的制备取新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

固相萃取柱***适用性试验精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以0.lmol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％磷酸溶液(30﹕70)的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液。

分别精密吸取上述固相萃取柱***适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95。

供试品溶液的制备取研细后本品内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，滤过，滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，滤液照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.2方法学验证

1.2.1固相萃取柱***适用性实验

取新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品，照上述方法制备对照品溶液；

取对照品贮备液，照上述方法制备固相萃取柱***适用性试验供试品溶液。

照上述液相条件及测定法进行测定，结果，固相萃取柱***适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值均大于于0.95，固相萃取柱***适用性良好。

1.2.2专属性

取130901批样品及不含附子的阴性制剂，照上述方法制备供试品溶液；

照上述液相条件及测定法进行测定，结果，供试品色谱在与对照品色谱相应位置上有相应色谱峰检出(仅检出次乌头碱)，且与相邻色谱峰分离良好；阴性制剂样品色谱在与对照品色谱相应位置未检出色谱峰，表明本法专属性良好。

1.2.3检测限

取双酯型生物碱对照品溶液，并逐级稀释，以S/N为3﹕1时的进样量为检测限，进行试验，结果双酯型生物碱检测限分别为：乌头碱8ng、次乌头碱8ng、新乌头碱8ng。

1.2.4耐用性

1.2.4.1溶液稳定性

取130901批样品，制备供试品溶液，取供试品溶液室温放置，分别于第0、6、12、18、24小时吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见表3。

表3溶液稳定性试验结果

结果，供试品溶液在24小时内稳定。

1.2.4.2流动相比例

取样品，采用不同流动相比例进行测定，结果见表4。

表4不同流动相比例试验结果

结果表明，流动相A相在上述范围内变动时，供试品色谱中各项参数均符合要求，耐用性良好。

1.2.4.3色谱柱

取样品，采用不同厂牌的色谱柱进行测定，结果见表5。

表5不同色谱柱试验结果

结果表明，本法色谱柱耐用性良好。

1.3三批样品中双酯型生物碱限度检查

取三批样品(140101批，140102批，140103批)，依法检验双酯型生物碱的限度，结果见表6。

表6三批样品测定结果

结果显示，三批样品中双酯型生物碱的检查结果在23.9～25.6μg/袋之间。

【含量测定】

1附子

参照《中国药典》2010年版(第二增补本)附桂骨痛胶囊含量测定(附子、制川乌)及《中国药典》2010年版一部高效液相色谱法(附录VID)试验。测定样品中单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱)的含量。

1.1测定方法

照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定。

色谱条件与***适用性试验：以极性***连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.1％的磷酸溶液(23﹕77)为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于5000。

对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱***适用性试验用对照品溶液。分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液。

固相萃取柱***适用性试验：精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25％的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈-浓氨试液(90﹕10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液。

分别精密吸取上述***适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。

供试品溶液的制备取附甘颗粒，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.2药典法和本发明法单酯型生物碱含量测定适用性比较

《中国药典》2010年版一部第二增补本附桂骨痛颗粒项下附子单酯型生物碱含量测定法(以下简称“药典法”)与本发明附子单酯型生物碱含量测定法，用于附甘颗粒剂附子单酯型生物碱含量测定的适用性比较比较。

1.2.1“药典法”测定附甘颗粒剂单酯型生物碱适用性试验

色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(以下简称：C₁₈柱)；以乙腈-0.1％磷酸溶液(22:78)为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算均不低于10000。

对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取附甘颗粒研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟5000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，加在固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90:10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1％磷酸溶液(20:80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得。

测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定了3个不同厂家的C₁₈柱，供试品溶液拖尾因子结果见表7。

表7不同厂牌C₁₈柱拖尾因子测定结果

结果显示，“药典法”测定本品单脂型生物碱含量时，3个不同厂牌的C₁₈柱，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰均拖尾严重，峰型差，影响峰面积的准确测量，因此，C₁₈柱不适用于附甘药物单酯型生物碱的含量测定。

1.2.2本发明方法测定附甘颗粒剂单酯型生物碱适用性试验

按照上述“药典法”所述实验方法，液相条件、对照品溶液制备方法、供试品溶液制备方法、测定法均不变，只是将色谱柱改为以极性***连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱(以下简称：苯基柱)，对附甘颗粒单酯型生物碱进行含量测定。测定了3个不同厂家的苯基柱，供试品溶液拖尾因子结果见表8：

表8不同厂牌苯基柱拖尾因子测定结果

结果表明，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰拖尾因子均在0.95～1.05，色谱峰峰形好，***适用性良好，表明本发明方法适用于附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定。

1.3药典法和本发明法单脂型生物碱含量测定专属性试验比较

1.3.1“药典法”测定附甘颗粒剂单酯型生物碱专属性试验

取附甘颗粒剂和不含附子的阴性颗粒剂，按照“药典法”所述液相条件及供试品溶液制备方法进行试验。结果，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置处有色谱峰，但峰形较差，拖尾严重，苯甲酰新乌头原碱色谱峰分离度小于1.5；阴性样品溶液在与苯甲酰新乌头原碱对照品色谱相应位置处有色谱峰检出，表明“药典法”测定附甘颗粒中单酯型生物碱专属性差。详细结果见表9。

表9“药典法”专属性结果

1.3.2本发明方法测定附甘颗粒剂单酯型生物碱专属性试验

另取附甘颗粒剂和不含附子的阴性颗粒剂，按照按本发明方法所述液相条件及供试品溶液制备方法进行试验。结果，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置处有色谱峰，且峰形良好，分离度良好，阴性样品溶液在与对照品溶液相应位置处无色谱峰检出，表明本发明方法测定附甘颗粒中单酯型生物碱专属性良好。详细结果见表10。

表10本发明方法专属性结果

1.4本发明单酯型生物碱含量测定方法学研究

1.4.1固相萃取柱***适用性试验

取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品，照上述方法进行固相萃取柱***适用性试验。

结果：固相萃取柱***适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积比值均大于0.95，详细结果见表11。

表11固相萃取柱***适用性结果

1.4.2准确度实验

对照品贮备液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含3.7μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取研细的附甘颗粒0.25g，精密称定6份，分别精密加入上述对照品贮备液25ml，照本发明方法所述供试品溶液的制备方法，自“密塞，称定重量”起，依法操作，得供试品溶液。

液相条件及测定法同本发明方法所述，测定，计算回收率，结果见表12。

表12准确度试验结果

结果，准确度良好。

1.4.3精密度

1.4.3.1重复性

取研细的附甘颗粒0.5g，精密称定6份，按照本发明所述方法测定，结果见表13。

表13重复性试验结果

结果表明，重复性良好。

1.4.3.2不同仪器

分别在不同仪器上对同一供试品进行测定，考察仪器变动对精密度的影响，结果见表14。

表14不同仪器试验结果

结果，不同仪器之间精密度良好。

1.4.3.3不同试验人员

由不同人员对同一供试品进行测定，考察***对精密度的影响，结果见表15。

表15不同人员试验结果

结果，不同人员之间精密度良好。

1.4.3.4不同日期

由同一分析人员分别在不同日期对同一供试品进行测定，考察日期变动对精密度的影响，结果见表16。

表16不同时间试验结果

结果，不同日期之间精密度良好。

1.4.4耐用性

1.4.4.1溶液稳定性

取供试品溶液室温放置，分别于第0、3、6、9、12小时吸取20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积，结果见表17。

表17溶液稳定性试验

结果，供试品溶液在12小时内稳定。

1.4.4.2检测波长

取本品供试品溶液，分别在227nm、232nm、237nm波长下进行测定，结果见表18。

表18不同波长试验结果

结果，波长耐用性良好。

1.4.4.3流速

取本品供试品溶液，分别采用0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min流速进行测定，结果见表19。

表19不同流速试验结果

结果，流速耐用性良好。

1.4.4.4流动相比例

取本品供试品溶液，采用不同流动相比例进行测定，结果见表20。

表20不同流动相比例试验结果

结果，流动相比例耐用性良好。

1.4.4.5柱温

取本品供试品溶液，分别采用25℃、30℃、35℃柱温进行测定，结果见表21。

表21不同柱温试验结果

结果，柱温耐用性良好。

1.4.4.6色谱柱厂牌

取本品供试品溶液，采用不同厂牌的色谱柱进行测定，结果见表22。

表22不同色谱柱试验结果

结果，色谱柱耐用性良好。

1.4.5、线性

1.4.5.1苯甲酰新乌头原碱

取苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1％磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲酰新乌头原碱3.3、9.8、16.3、22.9和32.7μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰新乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y＝29732x－11339，r＝0.9997。

结果，苯甲酰新乌头原碱在3.3～33.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

1.4.5.2苯甲酰乌头原碱

取苯甲酰乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1％磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲酰乌头原碱0.8、1.6、2.4、5.6和8.0μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y＝245551x－2211.9，r＝0.9999。

结果，苯甲酰乌头原碱在0.8～8.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

1.4.5.3苯甲酰次乌头原碱

取苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1％磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲次乌头原碱0.8、1.6、2.4、4.0、5.6和8.0μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰次乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y＝23916x－3973.3，r＝0.9995。

结果，苯甲酰次乌头原碱在0.8～8.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

1.4.6范围

分别按0.5g的80％、100％、120％称取本品内容物，制备供试品溶液，测定单酯型生物碱含量，结果见表23。

表23范围试验结果

结果，在0.5g±20％的取样范围内未发现测定结果有明显差异。

1.5三批样品中单酯型生物碱的含量测定

取三批支敏颗粒(140101批，140102批，140103批)，测定单酯型生物碱含量，结果见表24。

表24三批样品含量测定结果

2甘草

参考《中国药典》2005年版(一部)及《中国药典》2010年版(一部)甘草药材含量测定项下的方法进行试验，测定研制产品中甘草苷的含量。

2.1方法

色谱条件与***适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.5％冰醋酸(18﹕82)为流动相；检测波长为276nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取附甘颗粒研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2方法学验证

2.2.1专属性

供试品溶液的制备取130901批支敏颗粒及不含甘草的阴性制剂，照上述方法制备供试品溶液。

照上述液相条件及测定法进行测定，结果，供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰，分离度良好，阴性样品溶液在相应位置无色谱峰检出，表明阴性无干扰，本法测定甘草专属性良好。

2.2.2准确度

准确度试验用对照溶液的制备取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液。

准确度试验供试品溶液的制备取130901批内容物研细，取0.25g，精密称定，共6份，分别精密加入上述甘草苷对照品溶液(0.1mg/ml)5ml，照优选的供试品溶液制备方法，自“置具塞锥形瓶中”起，依法操作，即得。

表25准确度试验结果

结果，准确度良好。

2.2.3精密度

2.2.3.1重复性

取130901批内容物研细，取0.5g，精密称定，共6份，按优选的供试品溶液制备方法操作，分别测定甘草苷含量。结果见表26。

表26重复性试验结果

结果，重复性良好。

2.2.3.2不同人员

取130901批支敏颗粒，分别由不同人员测定甘草苷含量，考察***对精密度的影响，结果见表27。

表27不同人员试验结果

结果，不同人员试验的精密度良好。

2.2.3.4不同仪器

取130901批支敏颗粒，分别在不同仪器上测定甘草苷含量，考察仪器变动对精密度的影响，结果见表28。

表28不同仪器试验结果

结果，不同仪器试验的精密度良好。

2.2.3.5不同时间

取130901批支敏颗粒，分别在不同日期测定甘草苷含量，考察日期变动对精密度的影响。结果见表29。

表29不同时间试验结果

结果，不同时间试验的精密度良好。

2.2.4线性

取甘草苷对照品适量，用70％乙醇分别制成浓度为每1ml含甘草苷8、16、32、48、64μg的对照品溶液；分别精密吸取上述对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以甘草苷对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y＝19203x+2039.4，r＝0.9997。

结果表明，甘草苷在8～64μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5耐用性

2.2.5.1溶液稳定性

取130901批支敏颗粒制备供试品溶液，室温放置，分别于第0、5、10、15、20小时，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录甘草苷色谱峰面积，结果见表30。

表30溶液稳定性试验结果

结果，供试品溶液在20小时内稳定。

2.2.5.2柱温

取130901批支敏颗粒制备供试品溶液，分别采用25℃、30℃、35℃柱温分析，测定甘草苷含量，结果见表31。

表31不同柱温试验结果

结果，不同柱温试验的耐用性良好。

2.2.5.3流速

取130901批支敏胶囊制备供试品溶液，分别采用0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min流速分析，测定甘草苷含量。

表32不同流速试验结果

结果，流动相不同流速试验的耐用性良好。

2.2.5.4检测波长

取130901批支敏颗粒制备供试品溶液，分别在227nm、232nm、237nm波长下分析，测定甘草苷含量，结果见表33。

表33不同波长试验结果

结果，不同检测波长试验的耐用性良好。

2.2.5.5流动相比例

取130901批支敏颗粒制备供试品溶液，分别采用不同流动相比例分析，测定甘草苷含量，结果见表34。

表34不同流动相比例试验结果

结果，不同流动相比例试验的耐用性良好。

2.2.5.6色谱柱

取130901批支敏颗粒制备供试品溶液，采用不同厂牌的色谱柱分析，测定甘草苷含量，结果见表35。

表35不同色谱柱试验结果

结果，不同色谱柱试验的耐用性良好。

2.2.6范围

取130901批支敏颗粒内容物研细，分别按取样量0.5g的50％、100％、150％精密称测定甘草苷含量，结果见表36。

表36范围试验结果

结果，在0.5g±0.25g的取样范围内未发现测定结果有明显差异。

2.3三批样品中甘草苷的含量测定

取三批样品(140101批，140102批，140103批)，依法测定甘草苷含量，结果见表37。

表37三批样品中甘草苷含量测定的结果

结果，三批样品中甘草苷的含量在3.22～3.63mg/粒之间。

具体实施方式

实施例1：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定

1)制备颗粒剂：取附子6kg，甘草1kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。

2)检验

取样品，按照本发明所述质量标准进行检验，检验结果见下表：

表38检验结果

实施例2：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定

1)制备颗粒剂：取附子18kg，甘草9kg，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煎煮1.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。

2)检验

取样品，按照本发明所述质量标准进行检验，检验结果见下表：

表39检验结果

实施例3：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定

1)制备颗粒剂：取附子10kg，甘草5kg，加水煎煮三次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1小时，第三次加6倍量水，煎煮1小时，合并三次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。

2)检验

取样品，按照本发明所述质量标准进行检验，检验结果见下表：

表40检验结果

实施例4：附甘片剂单酯型生物碱含量测定

1)制备片剂：取附子10kg，甘草4kg，加水煎煮3次。第一次加入原药材质量的10倍量的水，煎煮2h，第二、三次分别各加8倍量的水，分别煎煮1.5h，合并3次煎煮液，过滤，取滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)，加入乙醇，便加便搅拌混匀，使含醇量达70％，静置24h,滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.25(60℃),60℃以下减压干燥，粉碎，加入淀粉适量，制粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，包糖衣，得附甘药物的片剂。

2)检验

取样品，按照本发明所述质量标准进行检验，检验结果见下表：

表41检验结果

实施例5：附甘胶囊剂单酯型生物碱含量测定

1)制备胶囊剂：取附子18kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，过滤，取滤液减压浓缩至相对密度为1.15(60℃)，加入乙醇，便加便搅拌混匀，使含醇量达80％，静置12h，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.2(60℃),60℃以下减压干燥，粉碎，加入微粉硅胶适量，制粒，减压干燥，装入胶囊，得附甘药物的胶囊剂。

2)检验：

取样品，按照本发明所述质量标准进行检验，检验结果见下表：

表42检验结果

Claims (1)

1.一种附甘药物检测方法，其特征在于：用高效液相色谱法鉴别附子，用薄层色谱法鉴别甘草，用高效液相色谱法测定双酯型生物碱限度，用高效液相色谱法测定附子与甘草含量；

【性状】本品内容物为棕黄色至棕褐色，味微甜、微苦；

【鉴别】(1)附子鉴别：照附子含量测定项下的方法试验，供试品色谱中应呈现与苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即确定是含有附子的制剂；

(2)甘草鉴别：取本品内容物0.5-2.5g，加***40ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇﹕浓氨试液﹕乙醇＝5﹕2﹕1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，即确定是含有甘草的制剂；

【检查】双酯型生物碱：照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹕四氢呋喃＝25﹕15为流动相A，以含0.03mol/L磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液为流动相B，按下述规定进行梯度洗脱，检测波长为232nm；理论板数按乌头碱峰计算应不低于30000；

梯度洗脱程序：在0～38分钟，流动相A的比例由15％升高至26％，流动相B的比例由85％降低至74％；在38～39分钟，流动相A的比例由26％升高至35％，流动相B的比例由74％降低至65％；在39～49分钟，流动相A的比例为35％，流动相B的比例为65％；

对照品溶液的制备取新乌头碱对照品、次乌头碱对照品、乌头碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液各5ml，置50ml量瓶中，加0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

固相萃取柱***适用性试验精密量取对照品贮备液各3ml，混匀，室温减压回收至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液50ml使溶解，精密量取5ml，置于处理好的固相萃取柱上，依次以0.lmol/L盐酸溶液、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈﹕浓氨试液＝90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈﹕0.1％磷酸溶液＝30﹕70的混合溶液3ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液；所述固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱；

分别精密吸取上述固相萃取柱***适用性试验溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液和对照品溶液各相应成分峰面积比值，不得小于0.95；

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取1～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈﹕浓氨试液＝90﹕10的混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，用乙腈﹕浓氨试液＝90﹕10的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取25ml续滤液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，滤过，滤液照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱上”起，依法操作，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

其他应符合《中国药典》2010年版一部附录制剂通则项下有关的各项规定；

【含量测定】附子含量测定：照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验：以极性***连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈﹕0.1％的磷酸溶液＝23﹕77为流动相；检测波长为232nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于5000；

对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱***适用性试验用对照品溶液，分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1％的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液；

固相萃取柱***适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱上，依次以水3ml，1.25％的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液＝90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱***适用性试验溶液；所述固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，规格为150mg、6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱；

分别精密吸取上述***适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算***适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95；

供试品溶液的制备取本品适量，研细，称取0.2～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱***适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

甘草含量测定：照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈﹕0.5％冰醋酸溶液＝18﹕82为流动相；检测波长为276nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，取0.2～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。