CN104825455B

CN104825455B - 依鲁替尼的用途

Info

Publication number: CN104825455B
Application number: CN201410258423.3A
Authority: CN
Inventors: 刘青松; 刘静; 王蓓蕾; 王傲莉; 吴宏; 胡晨; 王文超; 陈程; 王黎; 李希祥
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2034-06-11
Also published as: CN104825455A; WO2015188738A1

Abstract

本发明公开了依鲁替尼(PCI‑32765)的一种新用途，具体地，本发明发现依鲁替尼可以治疗携带EGFR T790M突变和/或EGFR L858R突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌，特别是携带EGFR L858R和EGFR T790M双突变的非小细胞肺癌。

Description

依鲁替尼的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及依鲁替尼(PCI-32765)的一种新用途。

背景技术

肺癌是临床常见的肺部恶性肿瘤，一般分为小细胞肺癌(Small Cell LungCancer，SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)两大类。肺癌的发病率和死亡率均列恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌占绝大多数，最为普遍。非小细胞肺癌在全世界的发病率逐年上升，严重威胁着人类健康。非小细胞肺癌是美国、日本和西欧国家癌症致死的主要原因。对于晚期患者而言，化学疗法虽然在一定程度上改善生存率，但化疗药物对人体也有显著的毒性，因而非常需要能特异性地靶向与肿瘤生长有关的关键基因的治疗剂(Schiller JH等,N.Engl.J.Med.,346:92-98,2002)。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是生长促进致癌基因erbB或ErbBl的蛋白质产物，其为家族原癌基因(proto-oncogenes)的ERBB家族的一个成员，据信在人类许多癌症的发生和发展中起关键作用。特别地，在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR增强的表达。致癌基因的ERBB家族编码四种结构上相关的跨膜受体，即EGFR、HER-2/neu(erbB2)、HER-3(erbB3)和HER-4(erbB4)。临床上，已有报道显示肿瘤中的ERBB致癌基因扩增和/或受体过度表达与疾病复发和患者预后差相关，且与疗法的响应相关(L.Harris等,1999,Int.J.Biol.Markers,14:8-15；J.Mendelsohn和J.Baselga,2000,Oncogene,19:6550-6565)。

目前，以EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如易瑞沙(Gefitinib，吉非替尼)和特罗凯(Erlotinib，埃罗替尼))等药物已在非小细胞肺癌的临床治疗中获得巨大成功。然而，接受TKI抑制剂治疗的患者往往由于形成TKI耐药性而面临复发的困境。第二代EGFR非可逆抑制剂如卡奈替尼(Canertinib)、阿法替尼(Afatinib)、来那替尼(Neratinib)、培利替尼(Pelitinib)等已进入临床试验，但这些分子对EGFR突变体的选择性差，导致药物的临床耐受剂量较低。结果，在最大耐受剂量下，药物无法在体内达到有效浓度，因而对多数耐药病人无效。

另外，据研究，在使用吉非替尼或埃罗替尼治疗EGFR-TKI敏感型的非小细胞肺癌(NSCLC)时，患者往往在6～12个月后出现继发性耐药，其中约50％包含由外显子20编码的T790M突变。研究认为，T790M突变阻碍EGFR与EGFR小分子抑制剂(如吉非替尼和埃罗替尼)的结合或者增加EGFR与ATP的亲和力，因而导致耐药(Yun CH et al.,Proc Natl Acad SciU S A.2008Feb 12；105(6):2070-5)。

依鲁替尼(Ibrutinib，也称为PCI-32765)是一种布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton'styrosine kinase，Btk)的抑制剂，其可以通过单独使用或者与其它治疗剂联合使用的方式用于治疗自身免疫性疾病或病症、异种免疫性疾病或病症、癌症包括淋巴瘤以及炎性疾病或病症。目前，还未见关于使用依鲁替尼(PCI-32765)治疗携带EGFR T790M突变和/或EGFRL858R突变和/或EGFR delE746_A750突变的耐药性非小细胞肺癌患者的相关报道。

发明内容

鉴于前述的技术问题，发明人进行了广泛的研究。结果，发明人意外地发现，依鲁替尼(PCI-32765)这种布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂能有效地治疗携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的耐药性非小细胞肺癌，特别是治疗携带EGFR L858R/T790M双突变的耐药性非小细胞肺癌。更具体地，发明人发现，可通过使用依鲁替尼来抑制携带不同组合的前述突变类型的肺癌细胞的增殖(IC50<1μM)，促进细胞凋亡并抑制细胞集落的大小和数量，而对于携带EGFR WT(野生型)的正常细胞，依鲁替尼(PCI-32765)并不产生明显的抑制作用。因此，依鲁替尼非常适合于临床治疗携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌。进一步地，由于在治疗过程中对化疗药物产生耐药性的原因往往与前述的EGFR L858R和/或EGFR T790M和/或EGFR delE746_A750突变相关，对这样的耐药性患者施用依鲁替尼能够改善患者的耐药性情况并发挥治疗非小细胞肺癌的效力。本发明是基于以上发现而完成的。

一方面，本发明涉及依鲁替尼(PCI-32765)在制备用于治疗携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌患者的药物中的用途。具体地，该患者可以仅携带EGFR T790M突变，或仅携带EGFR L858R突变，或仅携带EGFRdelE746_A750突变，但优选同时携带EGFR L858R/T790M这两种突变。

在治疗过程中，该药物可以根据情况单独或与一种或多种其它的治疗剂组合使用。可以通过注射、口服、吸入、直肠和经皮施用中的至少一种将包含依鲁替尼的药物施用给非小细胞肺癌患者。其它的治疗剂可以选自以下药物：免疫抑制剂(例如他克莫司、环孢菌素、雷帕霉素、甲氨蝶呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、巯嘌呤、麦考酚酯或FTY720)、糖皮质激素类药(例如***、醋酸可的松、***龙、甲泼尼龙、***、倍他米松、曲安西龙、氢羟强的松龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮、醛固酮)、非甾体抗炎药(例如水杨酸盐、芳基烷酸、2-芳基丙酸、N-芳基邻氨基苯甲酸、昔康类、考昔类或硫酰替苯胺)、***反应疫苗、抗组胺药、抗白三烯药、β-激动剂、茶碱、抗胆碱药或其它选择性激酶抑制剂(例如mTOR抑制剂、c-Met抑制剂)或her2抗体-药物。另外，其它治疗剂还可以是雷帕霉素(Rapamycin)、克唑替尼(Crizotinib)、他莫昔芬、雷洛昔芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、赫赛汀^TM(曲妥珠单抗)、格列卫^TM(伊马替尼)、紫杉醇^TM(紫杉醇)、环磷酰胺、洛伐他汀、美诺四环素(Minosine)、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)、紫杉特尔^TM(多西他赛)、诺雷德^TM(戈舍瑞林)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、替尼泊苷、依托泊苷、健择^TM(吉西他滨)、埃博霉素(Epothilone)、诺唯本、喜树碱、柔红霉素(Daunonibicin)、更生霉素、米托蒽醌、安吖啶、多柔比星(亚德里亚霉素)、表柔比星或伊达比星。或者，其它治疗剂也可以是细胞因子例如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)。或者，其它治疗剂也可以是，例如但不限于，CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)、CAF(环磷酰胺、亚德里亚霉素和5-氟尿嘧啶)、AC(亚德里亚霉素和环磷酰胺)、FEC(5-氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺)、ACT或ATC(亚德里亚霉素、环磷酰胺和紫杉醇)或CMFP(环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和***)。

在另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含依鲁替尼(PCI-32765)和药学上可接受的载体或助剂。该组合物还可以进一步包含一种或多种其它的治疗剂。这里提及的其它治疗剂如上文所限定。

在又一方面，本发明涉及使用依鲁替尼治疗携带EGFR L858R突变和/或EGFRT790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌患者的方法。在治疗过程中，可以通过注射、口服、吸入、直肠或经皮将依鲁替尼施用给非小细胞肺癌患者。还可以根据情况将有效量的依鲁替尼单独或与一种或多种其它的治疗剂组合使用。所提及的其它的治疗剂如上文所限定。在治疗过程中，还可以将使用依鲁替尼(PCI-32765)的化学疗法联合放射疗法进行施用。

附图说明

图1显示依鲁替尼(PCI-32765)的酶活实验结果。

图2显示依鲁替尼(PCI-32765)的平板细胞集落形成实验结果。

图3显示依鲁替尼(PCI-32765)的细胞计数实验结果。

图4显示依鲁替尼(PCI-32765)对NCI-H1975、NCI-H460、A549以及A431细胞中EGFR上下游通路的影响的结果。

具体实施方式

在对本发明进一步说明之前，为了更好地理解本发明，对一些术语进行说明。

定义

“依鲁替尼(Ibrutinib，也称为PCI-32765)”是一种布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton'styrosine kinase，BTK)的抑制剂。作为一种小分子BTK抑制剂，它能够与BTK活性中心的半胱氨酸残基共价结合，从而抑制其活性。依鲁替尼具有以下式(I)所示的结构：

术语“表皮生长因子受体”(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是在多种上皮肿瘤中表达的酪氨酸激酶受体，其是肿瘤治疗的靶点。本文使用的术语“表皮生长因子受体治疗”是指一种靶向于表皮生长因子受体的癌症疗法。

术语“EGFR突变”：EGFR基因突变的非小细胞肺癌(NSCLC)对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)非常敏感。最常见的EGFR基因突变位点包括18号(G719X)、19号(结构内缺失)和21号(L858R和L861Q)外显子。EGFR突变与TKI药物治疗的耐药性反应密切相关。

本申请中涉及的“L858R突变”是由于外显子21第858位密码子处发生碱基替换，导致EGFR蛋白中与该位点对应的亮氨酸(L)变成精氨酸(R)，故命名为“L858R突变”。另外，还发现一些在外显子20出现的突变——T790M突变。这种突变是由于外显子20第790位密码子发生碱基替换，导致EGFR蛋白中与该位点对应的苏氨酸(T)变成蛋氨酸(M)，故命名为“T790M突变”。本申请中涉及的“EGFR delE746_A750突变”为外显子19突变，即为第2235-2249位碱基的缺失，导致EGFR中第746-750位连续5个氨基酸缺失(delE746-A750)，故命名为EGFR delE746_A750缺失突变。

本文使用的术语“给药”或“施用”包括将化合物引入受试者中以实现其预定功能和作用的途径。可以使用的给药途径的例子包括注射(皮下注射、静脉注射、肠胃外注射、腹膜内注射、鞘内注射)、口服、吸入、直肠和经皮等。可以通过适于各种给药途径的形式来施用药物制剂。

本文使用的术语“药学可接受的”是指，在合理的医学判断的范围内，适合用于与人和其他哺乳动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的利益/风险比相称的组分。

本文使用的术语“有效量”包括就剂量和必要的时间周期而言，有效达到所期望的结果(例如，足以治疗本文中描述的疾病或病症)的量。本发明化合物的有效量可以根据例如如下的因素而不同：受试者的疾病状态、年龄、和体重、及化合物在细胞中或在受试者中引起期望的响应的能力。可以调节给药方案以提供最佳的治疗反应。

在本发明的实施方式中，在根据本发明对患有非小细胞肺癌的受试者施用依鲁替尼进行治疗时，给定药物的量取决于诸多因素，如具体的给药方案、疾病或病症类型及其严重性、需要治疗的受治疗者或宿主的独特性(例如体重)，但是，根据特定的周围情况，包括例如已采用的具体药物、给药途径、治疗的病症、以及治疗的受治疗者或宿主，施用剂量可由本领域已知的方法常规决定。通常，就成人治疗使用的剂量而言，施用剂量典型地在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。本领域技术人员可以理解的是，尽管给出了上述剂量范围，但依鲁替尼的有效量可根据患者的情况并结合医师诊断而适当调节。

本文使用的术语“耐药性”是指生物或细胞(在本文中具体涉及肿瘤细胞和肿瘤患者)对于药物作用的耐受性。例如，在肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性后，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。

本文使用的“IC50”又称半数抑制浓度，其是指在测量某种效应的分析中获得最大效应的50％抑制(例如对Btk激酶活性的抑制)时特定抑制剂的量、浓度或剂量。

本发明的应用

在本发明的一些实施方式中，根据本发明施用依鲁替尼来治疗非小细胞肺癌，特别是携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌。治疗可以包括单一治疗，也可以包括系列治疗。

在本发明的一些实施方式中，在施用依鲁替尼之前，患者可能已经经历了表皮生长因子受体治疗。例如，在一些具体的实施方式中，患者已经经历过酪氨酸激酶抑制剂的化学治疗。在更具体的实施方式中，在酪氨酸激酶抑制剂治疗中采用的治疗剂是吉非替尼或埃罗替尼。在一些实施方式中，患者已接受吉非替尼或埃罗替尼治疗6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或数年。

在患者已经经历了表皮生长因子受体治疗的一些实施方式中，患者可能已经对所采用的治疗剂(如吉非替尼和埃罗替尼)产生耐药性。在本发明的一些实施方式中，患者对表皮生长因子受体治疗的耐药性与EGFR突变有关。更具体地，该耐药性与EGFR L858R和/或EGFR T790M和/或EGFR delE746_A750突变有关。换言之，在一些具体的实施方式中，患者可携带有EGFR L858R、EGFR T790M、EGFR delE746_A750突变中的一种。在更优选的实施方式中，患者可同时携带有L858R和T790M这两种突变。根据本发明，对受试者施用依鲁替尼可以治疗携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌。

在本发明的一些实施方式中，可以对患者每天、隔日或每周施用一定剂量的依鲁替尼，并持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或数年。可以理解的是，对患者施用的依鲁替尼的剂量可以在治疗期间根据患者情况和治疗需求而适当增加或降低。

在本发明的一些实施方式中，可以同时或顺序地对受试者施用依鲁替尼和一种或多种其它的治疗剂。或者，在本发明的一些实施方式中，可以对受试者施用一种药物组合物，该组合物配制为包含依鲁替尼和药学上可接受的载体或助剂，以及任选的一种或多种其它的治疗剂。

用于治疗非小细胞肺癌(特别是携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌)的依鲁替尼可以被配制成合适的药物制剂，以便用于口服给药(例如，以溶于溶剂的液体形式比如含水或不含水的液体、或在固体载体内)、经直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、腹膜内给药、局部给药(通过粉剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、滴剂、透皮贴剂或经皮贴剂)、口腔给药、经支气管形式或作为口腔喷剂或鼻喷剂等。具体而言，依鲁替尼可以被配制成，例如，用于口服给药的溶液、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂等。在注射给药的实施方式中，依鲁替尼也可以配制成合适的注射剂。

可以每日、每周、每月、隔月、每季度或按任何其他给药日程以单剂量注射或输注、多剂量、或以连续剂型进行给药。本发明制剂的给药可以对受试者是间歇性的，或者处于渐进、连续、恒定或受控的速度。此外，一天中施用剂型的时间和每日施用剂型的次数可以不同。在本发明的一些实施方式中，施用给患者的依鲁替尼制剂可以在0.02-5000mg/天，例如约1-1500mg/天的范围。该所需剂量可以方便地被表现为一剂、或同时给药的(或在短时间内)或在适当的间隔的分剂量，例如每天二、三、四剂或更多分剂。

用于治疗非小细胞肺癌(特别是携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFR delE746_A750突变的非小细胞肺癌)的包含依鲁替尼的药物组合物可以被配制成溶液、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂等剂型。该组合物可以含有0.02-5000mg的依鲁替尼，但所使用活性成分的有效剂量可以根据具体使用的给药方案、给药途径、和被治疗的病症的严重程度不同而改变。技术人员可以理解，用于各个患者的有效剂量可依疾病严重程度、个体遗传变异或代谢速率不同而变化。然而，通常以约0.5-1000mg的每天剂量，任选一天2-4次分剂量或以缓释形式给予本发明化合物时，得到期望的结果。计划每天总剂量约1-1000mg，可优选约2-500mg。

下面将通过实施例并结合附图来说明本发明。应理解，示出的实施例和附图仅用于帮助理解本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例

实验材料：在实施例中使用WZ4002作为对照。依鲁替尼(PCI-32765)及WZ4002均购自Hao Yuan Chemexpress公司(上海)。WZ4002是第一个经过验证的广为接受的EGFR T790M突变敏感的小分子抑制剂，WZ4002选择性地不可逆抑制突变型EGFR(EGFR L858R、EGFRL858R/T790M)，IC50<20nM。WZ4002也抑制其他突变型EGFR，如EGFR E746_A750、EGFR E746_A750/T790M，而对正常EGFR细胞作用很弱，因此副作用较小。WZ4002作用于非小细胞肺癌(NSCLC)细胞时抑制EGFR、AKT和ERK1/2的磷酸化作用(Zhou W,et al.,Novel mutant-selective EGFR kinase inhibitors against EGFR T790M.Nature.2009；462(7276):1070-4)。

实施例1：依鲁替尼(PCI-32765)对癌细胞生长的影响

通过测试依鲁替尼(PCI-32765)对癌细胞生长的影响，我们进一步评估依鲁替尼(PCI-32765)抑制癌细胞增殖的选择性。本实施例中我们选用了人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975(表达EGFR L858R/T790M双突变型基因)、人肺腺癌细胞NCI-H3255(表达EGFR L858R突变型基因)、小鼠EGFR-T790M BaF3细胞(稳定表达TEL-EGFR-T790M活化突变激酶)、人源非小细胞肺癌细胞PC-9(表达EGFR delE746_A750突变型基因)、人皮肤鳞癌细胞A431(表达野生型EGFR基因)、人非小细胞肺癌细胞NCI-H460(表达野生型EGFR基因)、人肺腺癌细胞A549(表达野生型EGFR基因)、人非小细胞肺癌细胞NCI-H358(表达野生型EGFR基因)。上述细胞购自ATCC(美国)。在实施例中将不同浓度(0.000508μM，0.00152μM，0.00457μM，0.0137μM，0.0411μM，0.123μM，0.370μM，1.11μM，3.33μM，10μM)的依鲁替尼(PCI-32765)及WZ4002分别加入到上述细胞中，并孵育72小时，用Cell(Promega，美国)化学自发光法细胞活力检测试剂盒，通过对活细胞中的ATP进行定量测定来检测活细胞数目。

结果如表1所示：依鲁替尼(PCI-32765)对于携带EGFR T790M突变、EGFR L858R突变、EGFR delE746_A750突变及EGFR L858R/T790M双突变的非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用都很明显，它们的IC50均小于1μM，即其抑制效果与WZ4002相当。而对表达野生型EGFR(EGFR WT)的细胞，依鲁替尼(PCI-32765)对生长基本无抑制作用，其IC50均大于10μM；而WZ4002的IC50大于4。实施例1的结果支持了依鲁替尼(PCI-32765)对于携带EGFR T790M突变、EGFR L858R突变、EGFR delE746_A750突变及EGFR L858R/T790M双突变非小细胞肺癌细胞治疗的选择性。

表1.PCI-32765的细胞测定数据

实施例2：依鲁替尼(PCI-32765)的体外抑制活性(酶活)

如下所述，在体外酶活实验测定中测定依鲁替尼(PCI-32765)对EGFR(WT)、EGFR/T790M、EGFR L858R/T790M的IC50值。将EGFR的胞内段(699-1068)区域克隆到昆虫表达载体pAcG2T中，利用昆虫表达体系BaculoGold^TM Baculovirus Expression System(BDPharmingen)进行蛋白表达，并带有GST标签。同时对T790M及L858R位点进行突变，分别得到EGFR的T790M单突变载体和T790M/L858R双突变载体。将构建好的载体转染至SF9包装病毒，用病毒感染SF9表达蛋白。

取纯化的EGFR(WT)、EGFR(T790M)、EGFR(T790M/L858R)蛋白激酶9μL(6ng/μL)分别与三倍梯度稀释的药物WZ4002及PCI-327651μL室温反应4小时(药物终浓度为10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM)；

加入2μL ATP和3μL底物Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide(Promega，美国)(终浓度分别为10μM和0.2μg/μL)，37℃反应1小时；

取5μL反应后的激酶溶液，加入5μL ADP-Glo^TM(Promega，美国)试剂室温反应40min以终止激酶反应并消耗完剩余的ATP；

加入10μL激酶检测试剂将ADP转化成ATP，使用偶联的萤光素酶/萤光素反应检测新合成的ATP，利用Envision读数后作图，计算IC50值。

实验结果如图1所示：依鲁替尼(PCI-32765)对EGFR L858R/T790M双突变型蛋白具有强烈的抑制作用，IC50＝3nM；对EGFR T790M单突变型蛋白具有明显的抑制作用，IC50＝50.77nM。其作用结果与WZ4002相当。这些结果说明依鲁替尼(PCI-32765)是T790M突变型EGFR及L858R/T790M双突变型EGFR的抑制剂。

实施例3：平板克隆形成实验

采用常规胰酶消化传代方法，将指数生长期的携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975人非小细胞肺癌细胞制成细胞悬浮液。细胞悬浮液反复吹打，使细胞充分分散。对携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975人非小细胞肺癌细胞计数，并用培养基调节细胞浓度。

根据携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975人非小细胞肺癌细胞的增殖能力，按10⁵细胞/孔的浓度接种到含2mL培养基的六孔板(直径4cm)中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。

将培养皿置于37℃、5％CO₂中培养24小时后给药，药物浓度如下：依鲁替尼(PCI-32765)为10μM，1μM，0.1μM，0.01μM，0.001μM于DMSO中；空白对照采用同体积的DMSO。

培养72小时后，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次。用甲醇固定15分钟，弃去甲醇。用结晶紫染色。

实验结果如图2所示：依鲁替尼(PCI32765)与WZ4002均在0.1μM就明显抑制细胞集落的形成，并在1μM时能够强烈地抑制细胞集落的形成，在10μM时基本上已无细胞集落形成。

实施例4：细胞计数实验

采用常规胰酶消化传代方法，将指数生长期的携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975非小细胞肺癌细胞制成细胞悬液。细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散。对细胞记数，并用培养基调节细胞浓度。

根据携带EGFR L858R/T790M突变的NCI-H1975非小细胞肺癌细胞的增殖能力，按10⁵细胞/孔的浓度接种到含2mL培养基的六孔板(直径4cm)中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。

将培养皿置于37℃、5％CO₂中培养24小时后给药，药物浓度如下：依鲁替尼(PCI-32765)为10μM，1μM，0.1μM，0.01μM，0.001 μM于DMSO中；空白对照采用同体积的DMSO。

培养72小时后，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，加入胰酶消化后对细胞计数，根据细胞数量计算IC50值。

实验结果如图3所示：经计算，依鲁替尼(PCI-32765)的IC50值为172.7nM，说明依鲁替尼(PCI-32765)起到与WZ4002相当的作用，都表现出对非小细胞肺癌细胞NCI-H1975(EGFR L858R/T790M)的生长抑制作用。

实施例5：依鲁替尼(PCI-32765)对细胞中上下游信号通路的影响

通过测定许多细胞生物化学终点和功能性终点，我们评估了依鲁替尼(PCI-32765)对与抑制EGFR相对密切相关的蛋白激酶AKT、ErK、STAT3的影响。用不同浓度0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM的依鲁替尼(PCI-32765)分别处理携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975人非小细胞肺癌细胞(EGFR L858R/T790M)、人皮肤鳞癌细胞A431(EGFR WT)、人非小细胞肺癌细胞NCI-H460(EGFR WT)、人肺腺癌细胞A549(EGFR WT)4小时，收集样品。测定化合物对这四个细胞系的信号通路的影响。

实验结果如图4所示：在携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975人非小细胞肺癌细胞中，依鲁替尼(PCI-32765)与WZ4002能够有效地抑制EGFR-Tyr1068、AKT-Ser473、AKT-Thr308、ERK-Thr202/Tyr204的磷酸化，依鲁替尼浓度为100nM时抑制率大于50％。而在表达野生型EGFR基因的三个细胞系中(人皮肤鳞癌细胞A431(EGFR WT)、人非小细胞肺癌细胞NCI-H460(EGFR WT)、人肺腺癌细胞A549(EGFR WT)，依鲁替尼和WZ4002都对相应的信号通路基本无影响。这些结果说明依鲁替尼及WZ4002都是突变型EGFR的抑制剂。同时也进一步验证了依鲁替尼(PCI-32765)对携带EGFR L858R/T790M双突变的NCI-H1975非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用及选择性。

Claims

1.依鲁替尼在制备用于治疗携带EGFR T790M突变和/或EGFR L858R突变和/或EGFRdelE746_A750突变的非小细胞肺癌患者的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述非小细胞肺癌患者携带EGFR L858R和EGFRT790M双突变。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中依鲁替尼单独施用或者与一种或多种其它的治疗剂组合施用。

4.一种非治疗目的的抑制携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFRdelE746_A750突变的非小细胞肺癌细胞的方法，包括将所述细胞与依鲁替尼相接触。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述细胞选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975、人肺腺癌细胞NCI-H3255、小鼠EGFR-T790M BaF3细胞和人源非小细胞肺癌细胞PC-9。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述细胞携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变。

7.依鲁替尼在制备用于抑制携带EGFR L858R突变和/或EGFR T790M突变和/或EGFRdelE746_A750突变的非小细胞肺癌细胞的药物中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述细胞选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975、人肺腺癌细胞NCI-H3255、小鼠EGFR-T790M BaF3细胞和人源非小细胞肺癌细胞PC-9。

9.如权利要求7所述的用途，其中所述细胞携带EGFR L858R和EGFR T790M双突变。