CN112957357B - 一种靶向klf4泛素化的小分子抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药和分子治疗领域，具体涉及一种靶向KLF4蛋白泛素化的小分子抑制剂及其应用。一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂，其结构通式如下：
Figure DDA0002956397420000011
所述小分子抑制剂能够抑制KLF4泛素化，增加KLF4蛋白表达，进而起到抑制胃癌细胞增殖的作用。所述靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物和所述的药物组合物在制备用于治疗胃癌药物中的应用。本发明提供的小靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂和药物组合物可用于抑制KLF4泛素化，具有较高的选择特异性，针对性强，IC50较小，证明亲和力强，临床上使用效果较好，缓解率较高。靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂在胃癌分子靶向治疗领域发挥重要作用，为胃癌的临床治疗提供新的靶向治疗药物。

Description

一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子治疗领域，具体涉及一种靶向KLF4蛋白(Krüppel-like factor4)泛素化的小分子抑制剂及其在抑制和杀伤胃癌细胞等中的应用。
背景技术
癌症是21世纪严重威胁人类健康的疾病之一。恶性肿瘤是死亡率最高的疾病。据统计，世界上每四个人中就有一人具有患癌症的风险。目前，世界上癌症患者的数量逐年增加，并有年轻化趋势。全球癌症发病及死亡率继续增长的趋势预示，癌症将成为人类的第一杀手，已构成对公共卫生的巨大挑战。改善癌症患者的预后情况是提高病人生存率的关键因素。肿瘤的产生是一个多种机制共同参与的过程，多种蛋白发生了异常的表达。所以针对癌症的靶点进行药物研究与开发是急需解决的问题。
泛素-蛋白酶体系是蛋白降解的途径之一，选择性降解特意靶蛋白。泛素-蛋白酶体不仅降解蛋白，还能参与细胞增殖和细胞周期等生物过程的调控。此外，泛素途径还调控多种细胞过程，如细胞自噬、凋亡、信号转导、受体内吞控制、抗原处理、降解抗病毒蛋白以及病毒的增殖过程。细胞内泛素-蛋白酶体通路是由泛素激活酶E1、泛素结合酶E1和泛素连接酶E3和26S蛋白酶复合物组成，蛋白泛素化降解分两步完成，先是由E1-E2-E3构成的级联反应泛素化修饰底物蛋白，后由proteasome降解。目前发现泛素化调节蛋白质降解在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。
KLF4在不同组织中能够作用于不同的靶基因，将抑癌或促癌效应发挥出来，在胃肠道肿瘤中主要发挥抑癌作用。KLF4在细胞内作用受到泛素-蛋白酶体途径的严密调控，泛素化(Ubiquitination)是KLF4翻译后修饰的重要途径。抑制KLF4泛素化、促进核转位是KLF4发挥其转录调控作用的关键环节。研究表明，F-box家族(FBXW、FBXL及FBXO)可通过形成E3连接酶的SCF(Skp1-Cullin1-F-box)复合体，介导泛素底物的识别与招募，从而在蛋白泛素化及癌症发展过程中起到重要作用。预测发现，F-box家族蛋白如FBXO22、FBXO32及SKP2等均可靶向结合KLF4蛋白序列中的E3潜在识别位点，zf-H2C2_2结构域，从而促进KLF4泛素化，抑制其在肿瘤中的表达水平，从而促进肿瘤的发生和发展。
目前现有技术中未公开针对KLF4泛素化的小分子抑制剂，因此，针对KLF4及其泛素化进行开发研究和研制一种针对KLF4蛋白的靶向治疗药物成为目前亟待解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种针对KLF4泛素化抑制剂及其在在抑制和杀伤胃癌细胞等中的应用，本发明针对KLF4泛素化位点设计针对KLF4泛素化抑制剂，该抑制剂对KLF4的亲和力较高，在纳摩尔水平，对KLF4的特异性较强，对KLF4的泛素化有较好的抑制作用，从而增加KLF4蛋白表达，对用于治疗胃癌有一定的作用。本发明通过高通量药物筛选，筛选出针对KLF4蛋白zf-H2C2_2结构域的小分子靶向药物,并根据里宾斯基五原则对该化合物进行结构改造，使该药物的溶解度更好，对KLF4的亲和力更强，最后得到全新的针对KLF4泛素化的小分子抑制剂LK-SI3A。通过CCK8实验检测LK-SI3A对胃癌细胞的IC50值，通过平板克隆形成实验检测LK-SI3A对胃癌细胞的抑制作用，通过Westernblot确定该有效的化合物是针对KLF4靶点，进而有继续研究针对KLF4泛素化的小分子抑制剂的价值与意义。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂，该小分子抑制剂的结构通式如下：
Figure BDA0002956397400000021
进一步地，所述靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂LK-SI3A的结构式如下：
Figure BDA0002956397400000022
进一步地，所述小分子抑制剂能够抑制KLF4泛素化，增加KLF4蛋白表达，进而起到抑制胃癌细胞增殖的作用。
一种药物组合物，包括上述靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物和药学上可接受的载体。
所述靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂、其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物和所述的药物组合物在制备用于治疗胃癌药物中的应用。
所述药物为药物治疗学上任何可接受的剂型。
优选的，所述药物剂型为注射制剂。
所述药物为药物治疗学上任何可接受的剂量。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明通过高通量药物筛选，筛选出针对KLF4蛋白zf-H2C2_2结构域的小分子靶向药物，并根据里宾斯基五原则对该化合物进行结构改造，使该药物的溶解度更好，对KLF4的亲和力更强，最后得到全新的针对KLF4泛素化的小分子抑制剂LK-SI3A。通过CCK8实验检测LK-SI3A对胃癌细胞的IC50值，通过平板克隆形成实验检测LK-SI3A对胃癌细胞的抑制作用，通过Western blot确定该有效的化合物是针对KLF4靶点，进而有继续研究针对KLF4泛素化的小分子抑制剂的价值与意义。
本发明提供的小靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂和药物组合物可用于抑制KLF4泛素化，具有较高的选择特异性，针对性强，IC50较小，证明亲和力强，临床上使用效果较好，缓解率较高。靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂在胃癌分子靶向治疗领域发挥重要作用，为胃癌的临床治疗提供新的靶向治疗药物。
附图说明
图1是KLF4泛素化抑制剂LK-SI3A与人源KLF4蛋白泛素化结构域zf-H2C2的Arg473的结合3D模型示意图及评分。
图2是KLF4泛素化抑制剂LK-SI3A与人源KLF4蛋白泛素化结构域zf-H2C2的Arg473的结合2D模型示意图。
图3是LK-SI3A对胃癌细胞HGC-27的杀伤作用及IC50值。
图4是LK-SI3A对胃癌细胞HGC-27的抑制增殖作用。
图5是LK-SI3A对KLF4蛋白泛素化的调节作用。
图6是LK-SI3A增加KLF4蛋白水平诱导胃癌细胞HGC-27发生细胞焦亡。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。
实施例。
1.实验材料。
1.1细胞系。
人胃癌细胞系HGC-27。
1.2实验试剂。
RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，0.5％结晶紫，CCK8试剂。
2.实验方法。
2.1 MOE软件进行药物筛选。
首先通过MOE同源建模KLF4的蛋白结构,结构优化后进行分子对接，最后筛选出评分较好的LK-SI3A(药明康德合成)，结构式如下：
Figure BDA0002956397400000041
2.2细胞增殖CCK8实验。
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐))。WST-8可被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒产物的数量与活细胞的数量成正比。本实验中，取对数生长期的胃癌细胞HGC-27细胞接以4×103个细胞/孔的密度接种到96孔板上。然后，用不同浓度的LK-SI3A处理细胞24小时，随后换新鲜培养液100μl后，每孔分别加入10μl CCK8(DojindoMolecular Technologies Inc.，Japan)处理1小时。使用多模式读取酶标仪(LD942，北京，中国)测量450nm处的吸光度。每组设6个复孔，control组加入等量的培养基，同时设置不含细胞和待测物质的空白孔。细胞存活率＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/(control组OD值-空白孔OD值)×100％。
2.4细胞平板克隆形成实验。
用1×PBS缓冲液小心清洗对数生长期的HGC-27细胞株三次，用适量胰酶消化细胞，用计数板计数，用培养基将细胞稀释到500个/每组。将500个细胞加入到含有2mL培养基，充分混匀后，加入到六孔板中，且加入终浓度为0.4μM的LK-SI3A，保持平衡将细胞放置到细胞培养箱中培养。持续培养7天后观察细胞集落形成情况并换液，即用1×PBS缓冲液小心清洗三次后，重新加入相应的新鲜培养基继续培养，14天后取出培养皿。移除培养基，1×PBS缓冲液小心清洗2次，用4％的多聚甲醛固定20min。再用1×PBS缓冲液小心清洗两次，加入苏木素覆盖细胞，染色30min。最后用1×PBS缓冲液小心清洗两次后可以观察细胞集落形成情况并成像用于后期统计观察。
2.5细胞转染以及Western Blot。
根据细胞生长速度选择合适的密度进行铺大皿。转染前细胞汇合达到70-80％，转染2天后汇合度90％左右。培养基中不含有抗生素。KLF4质粒3000g离心，杂菌被离心到下层，用时取上清(或用75％的乙醇沉淀细菌)。配制转染以1mL体系为例：500μL无血清培养基+lipo2μL，轻轻混匀，室温放置5min。500μL无血清培养基+质粒2000ng，轻轻混匀，室温放置5min。将两个管合并，混匀，放置20min，转染试剂配制完成。吸走原培养基，用1×PBS洗两遍，加入配好的转染试剂，来回轻柔摇晃细胞培养板。将培养好的细胞加入400nM的LK-SI3A，培养24h后，提取蛋白，蛋白定量后，进行蛋白变性，配胶，上样后，进行电泳，转膜，封闭和一抗二抗孵育，最后进行化学发光。
2.6细胞形态学观察。
将终浓度为0.4μM的LK-SI3A加入胃癌细胞HGC-27中，培养24h后利用显微镜进行形态学拍照，如图1-6所示。图1表明本发明的KLF4泛素化小分子抑制剂LK-SI3A与KLF4蛋白的3D结合情况以及位点，LK-SI3A与KLF4蛋白的结合的结合能为-6.6051J/mol。图2表明LK-SI3A与KLF4蛋白的2D结合情况。图3表明LK-SI3A对胃癌细胞HGC-27的抑制作用，随着LK-SI3A浓度的升高，细胞抑制率增加，且LK-SI3A的IC50为399.1nM。图4表明终浓度0.4μM的LK-SI3A对胃癌细胞HGC-27的抑制情况。图5表明添加终浓度为0.4μM的LK-SI3A后促进胃癌细胞HGC-27的焦亡。图6初步表明LK-SI3A通过抑制KLF4蛋白泛素化使胃癌细胞HGC-27发生焦亡。

Claims (7)

1.一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂，其特征在于，所述小分子抑制剂为LK-SI3A，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.如权利要求1所述的一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂，其特征在于，所述小分子抑制剂能够抑制KLF4泛素化，增加KLF4蛋白表达，进而起到抑制胃癌细胞增殖的作用。
3.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物和药学上可接受的载体。
4.如权利要求1所述的一种靶向KLF4泛素化的小分子抑制剂或其药学上可接受的盐、水合物和权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗胃癌药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为药物治疗学上任何可接受的剂型。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射制剂。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为药物治疗学上任何可接受的剂量。
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