CN113876780A - 一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用，所述药物组合物的药学有效成分包括第一组分和第二组分，其中，第一组分为吉非替尼，第二组分为具有通式(Ⅰ)所示结构的化合物A，化合物A能够增强吉非替尼对EGFR‑突变的NSCLC细胞的活性、侵袭和迁移的抑制能力，并增强吉非替尼对EGFR‑突变的NSCLC细胞凋亡的促进能力，通过化合物A与吉非替尼联合使用，有效拓展了吉非替尼的应用范围，改善NSCLC患者对吉非替尼的原发性耐药和获得性耐药，有利于提高吉非替尼对NSCLC患者的治疗效果，对吉非替尼在NSCLC治疗方面的临床应用具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用。
背景技术
肺癌已经成为全世界癌症死亡的首要原因，大约80％的肺癌属于非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)。治疗NSCLC的传统方法包括手术化疗和放疗，但即使采用最有效的铂基化疗方案，目前NSCLC患者的5年生存率仍低于20％。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)基因突变在NSCLC中具有重要意义，约有17％的NSCLC患者具有EGFR基因突变，而在中国NSCLC患者中，EGFR基因突变率超过30％。对于存在EGFR基因突变的NSCLC患者，通常使用EGFR抑制剂进行治疗。
吉非替尼属于表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，化学名称为N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺，CAS号为184475-35-2。吉非替尼通过竞争细胞表面的表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)的催化区域Mg-ATP结合位点，阻断EGFR生成信号传递至细胞内，以抑制EGFR与配体结合后受体发生磷酸化，并抑制EGFR与其他受体分子形成各种同源或异源二聚体，造成下游一系列信号通路如P13K/AKT、RAS/RAF/MAPK等活化的下调，从而阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成，并可诱导肿瘤细胞的调亡。2005年2月中国国家食品药品监督管理局批准吉非替尼用于治疗既往接受过化疗的局部晚期或转移性非小细胞肺癌，并于2010年11月批准吉非替尼作为对EGFR-TKI基因具有敏感突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的临床一线治疗用药。但是临床发现，越来越多的NSCLC患者因长期服用吉非替尼而产生获得型耐药，此外，部分NSCLC患者对吉非替尼存在原发性耐药，导致即使首次服用吉非替尼也不会明显改善症状或无疗效。
因此，寻找一种能够与吉非替尼产生协同作用的物质，改善NSCLC患者对吉非替尼的原发性耐药和获得性耐药，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用。
本发明的技术方案如下所述：
第一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物的药学有效成分包括第一组分和第二组分，其中，所述第一组分为吉非替尼，所述第二组分为化合物A，所述化合物A具有下面通式(Ⅰ)所示的结构：
在式(Ⅰ)中，R选自双键氧原子(羰基)、卤素或吗啉乙基。
进一步地，所述第一组分：所述第二组分的重量比为(0.4～7)：1。
进一步地，所述药物组合物为口服片剂。
进一步地，所述药学组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料为赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂，其中，所述赋形剂的重量占所述药学组合物总重量的10％至20％，所述崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至10％，所述粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％，所述润滑剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％。
进一步地，所述赋形剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉以及结晶纤维素中的至少一者；所述崩解剂选自预胶化淀粉、明胶、结晶纤维素以及羧甲纤维素中的至少一者；所述粘合剂选自玉米淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素以及聚维酮中的至少一者；所述润滑剂选自滑石粉或硬脂酸镁。
进一步地，所述崩解剂为羧甲纤维素，所述崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的5％至8％；并且所述粘合剂为聚维酮，所述粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至3％。
进一步地，所述药物组合物包括包衣，所述包衣的材料为胃溶衣或肠溶衣。
可选地，所述药物组合物为第一制剂和第二制剂的组合剂，其中，所述第一制剂为含有所述第一组分的制剂，所述第二制剂为含有所述第二组分的制剂。
进一步地，所述第一制剂和所述第二制剂依次施用，或所述第一制剂和所述第二制剂同时施用。
第二方面，本申请还提供了一种如第一方面中任意一种所述的药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用。
本申请提供了一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用，产生如下的技术效果：所述药物组合物的药学有效成分包括第一组分和第二组分，其中，第一组分为吉非替尼，第二组分为具有通式(Ⅰ)所示结构的化合物A，化合物A能够增强吉非替尼对EGFR-突变的NSCLC细胞的抗肿瘤作用，具体表现为：化合物A能够增强吉非替尼对EGFR-突变的NSCLC细胞的活性、侵袭和迁移的抑制能力，并增强吉非替尼对EGFR-突变的NSCLC细胞凋亡的促进能力。通过化合物A与吉非替尼联合使用，有效拓展了吉非替尼的应用范围，改善NSCLC患者对吉非替尼的原发性耐药和获得性耐药，有利于提高吉非替尼对NSCLC患者的治疗效果，对吉非替尼在NSCLC治疗方面的临床应用具有重要价值。
本申请进一步地提供了所述药物组合物的口服片剂，所述口服片剂在特定比例的崩解剂和粘合剂的作用下，可保持良好的药物活性稳定性和生物利用度，从而为所述药物组合物的临床应用提供了重要保障。
附图说明
下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
图1为HCC827细胞和HCC827Ge-r细胞经不同剂量的吉非替尼处理后的细胞活性水平，其中，A为CCK-8法检测HCC827细胞经不同剂量的吉非替尼处理后的细胞活性水平图，B为CCK-8法检测HCC827Ge-r细胞经不同剂量的吉非替尼处理后的细胞活性水平图。
图2为HCC827Ge-r细胞经化合物A1和不同剂量的吉非替尼联合处理后的细胞活性水平图。
图3为HCC827Ge-r细胞经化合物A2和不同剂量的吉非替尼联合处理后的细胞活性水平图。
图4为HCC827Ge-r细胞经化合物A3和不同剂量的吉非替尼联合处理后的细胞活性水平图。
图5为实施例3中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞克隆形成效果图，其中，A为实验组二的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞克隆形成效果图，B为对照组一的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞克隆形成效果图，C为对照组四的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞克隆形成效果图，D为对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞克隆形成效果图。
图6为实施例4中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的细胞体外侵袭实验图，其中，其中，A为实验组二的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的体外侵袭效果图，B为对照组一的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的细胞体外侵袭效果图，C为对照组四的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的细胞体外侵袭效果图，D为对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的细胞体外侵袭效果图，E为实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞在细胞体外侵袭实验中的相对细胞侵袭率结果图。
图7为实施例4中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的划痕实验图，A1和A2分别为实验组二的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞在0h和24h的迁移效果图，B1和B2分别为对照组一的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞在0h和24h的迁移效果图，C1和C2分别为对照组四的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞在0h和24h的迁移效果图，D1和D2分别为对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞在0h和24h的迁移效果图。
图8为实施例4中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞中MMP2和MMP9的表达水平图。
图9为实施例5中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的凋亡情况图。
图10为实施例5中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase3、caspase3以及GAPDH的表达水平图。
图11为实施例6中动物实验的结果图，其中，A为从第0天至第21天实验组A、实验组B、实验组C以及实验组D中裸鼠的体重数据图，B为从第0天至第21天实验组A、实验组B、实验组C以及实验组D中裸鼠的肿瘤组织大小数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除特殊说明，本实施例/对比例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为商购获得或本领域常规方法制备而成，无特殊说明的实验方法也为本领域常规实验方法，例如：分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展，并按照“动物福利伦理审查实验室动物指南”处理动物。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本申请的各个实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
本申请实施例提供了一种药物组合物，药物组合物的药学有效成分包括第一组分和第二组分，其中，第一组分为吉非替尼，第二组分为化合物A，化合物A具有下面通式(Ⅰ)所示的结构：
在式(Ⅰ)中，R选自双键氧原子、卤素原子或吗啉乙基。
如本申请所用，“药物组合物”包括治疗目的的组合物，“治疗目的”是指改善或减轻NSCLC的至少一种症状，可以延迟NSCLC的恶化或进展，或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。
如本申请所用，“药学有效成分”是指药物中存在的一种或多种具有药理活性的物质，所述物质在NSCLC的治疗、症状缓解或预防中具有主导功效。
在本申请的一些实施例中，化合物A为化合物A1、化合物A2以及化合物A3中的一种或多种，其中，化合物A1的结构式如式(Ⅱ)所示：
化合物A2的结构式如式(Ⅲ)所示：
化合物A3的结构式如式(Ⅳ)所示：
在本申请实施例中，化合物A联合吉非替尼对EGFR突变的NSCLC细胞的协同抑制作用和/或协同诱导凋亡作用，所述协同抑制作用基于化合物A增强吉非替尼对EGFR突变的NSCLC细胞的活性、侵袭和迁移的抑制能力，所述协同诱导凋亡作用基于化合物A增强吉非替尼对EGFR突变的NSCLC细胞凋亡的促进能力。
在本申请的一些实施例中，第一组分：第二组分的重量比为(0.4～7)：1。
在本申请的一些实施例中，药物组合物为口服片剂。
在本申请的一些实施例中，药学组合物还包括药学上可接受的辅料，辅料为赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂，其中，赋形剂的重量占所述药学组合物总重量的10％至20％，崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至10％，粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％，润滑剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％。
在本申请的一些实施例中，赋形剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉以及结晶纤维素中的至少一者；崩解剂选自预胶化淀粉、明胶、结晶纤维素以及羧甲纤维素中的至少一者；粘合剂选自玉米淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素以及聚维酮中的至少一者；润滑剂选自滑石粉或硬脂酸镁。
在本申请的一些实施例中，崩解剂为羧甲纤维素，崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的5％至8％，并且粘合剂为聚维酮，粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至3％，既能保证片剂具有理想的硬度，又能提高吉非替尼和化合物A的溶出速率，促进药物吸收。
在本申请的一些实施例中，药物组合物包括包衣，包衣的材料为胃溶衣或肠溶衣。
可以理解的是，本申请实施例的药物组合物还可以是药学上可接受的其他剂型，例如：胶囊剂、粉剂、喷雾剂、混悬液剂、乳剂、注射剂、纳米吸入剂等。药物组合物可以为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型可以是为口服片剂、纳米吸入剂或喷雾剂，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型可以是注射剂。
在本申请的一些实施例中，药物组合物为第一制剂和第二制剂的组合剂，其中，第一制剂为含有第一组分的制剂，所述第二制剂为含有第二组分的制剂。
在本申请的一些实施例中，第一制剂和第二制剂依次施用，即第一制剂和第二制剂，按照特定的先后顺序施用，例如：先施用第一制剂，后施用第二制剂；又如：先施用第二制剂，后施用第一制剂。
在本申请的一些实施例中，第一制剂和第二制剂同时施用。
在本申请的另一些实施例中，所述两种单独的制剂依次施用，即吉非替尼和化合物A按照特定的先后顺序施用，例如：先施用吉非替尼，后施用化合物A；又如：先施用化合物A，后施用吉非替尼。
本申请实施例还提供所述药物组合物在制备治疗NSCLC的药物方面的应用。
本申请实施例还提供了吉非替尼联合化合物A治疗NSCLC的方法，所述方法包括：向NSCLC患者施用有效量的吉非替尼和化合物A。
如本申请所用，“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的NSCLC的一种或多种症状改善的给药剂量，有效量取决于众多因素，例如：药物的活性、采用的递送方式等，且可以由本领域技术人员根据对象的个体情况容易地确定。
在本申请的一示例中，给药剂量为：每日给药250mg的吉非替尼，以及50mg的化合物A。
在本申请的另一示例中，给药剂量为：每日给药50mg/kg的吉非替尼，以及10mg/kg的化合物A。
下面通过具体实施例和对比例对本申请的技术方案及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。
一、本申请实施例和对比例中涉及的材料说明。
(1)HCC827细胞
购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，源自人的EGFR-突变NSCLC细胞系HCC827。培养条件为：37℃、5％CO2，以及含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基。
(2)HCC827Ge-r细胞
HCC827Ge-r细胞为具有吉非替尼获得性耐药的HCC827细胞，是将HCC827细胞置于浓度梯度增加的吉非替尼(购自Selleck(中国上海))的培养环境下获得，培养时间接近6个月。
二、本申请实施例和对比例中涉及的免疫印迹试验(Western blot)说明。
本申请实施例中Western blot包括如下步骤：
S101、向加药处理后的细胞中加入冰冷的RIPA裂解液，裂解充分后离心收集上清液，所述上清液即为细胞裂解液；
S102、采用BCA试剂盒测定步骤S101制得的细胞裂解液的蛋白浓度，然后对细胞裂解液进行10％SDS-PAGE电泳；
S103、电泳结束后，利用湿转法将目标蛋白转印至PVDF膜上，置于冰上2h；
S104、将附着有目标蛋白的PVDF膜浸泡于含5％(重量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中，室温振荡封闭1h；
S105、将PVDF膜浸泡于一抗溶液中，置于4℃反应过夜；
S106、采用PBST溶液清洗PVDF膜，然后将PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，置于室温孵育1h；
S107、通过增强化学发光(ECL)试剂盒显示目标蛋白的条带。
三、本申请实施例和对比例中涉及的统计方法
在本申请实施例和对比例中，使用GraphPad Prism v8.0.1进行统计分析。使用单因素方差分析(ANOVA)评估两组以上的差异，然后进行图基(tukey)事后检验。采用studentt检验比较两组之间的差异。另外，p 小于 0.05被认定为具有统计学差异。
实施例1比较吉非替尼对HCC827细胞的抑制能力与吉非替尼对HCC827Ge-r细胞的抑制能力
将对数生长期的HCC827细胞和HCC827Ge-r细胞分别接种至多孔细胞培养板上，接种孔内的培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基，HCC827细胞和HCC827Ge-r细胞分别分为第一组至第七组，每组设置3个平行样，其中第一组至第七组中吉非替尼的浓度分别为0、0.05μM、0.1μM、1μM、5μM、10μM和15μM。加药处理48h后，向每组的HCC827细胞和HCC827Ge-r细胞中分别加入10μL的CCK-8试剂，处理2h，然后采用微孔板分析仪测定450nm处的吸光度。结果如图1所示。
由图1可知，HCC827细胞(图1A)和HCC827Ge-r细胞(图1B)的活性随吉非替尼浓度的增加而逐渐降低，并且在相同的吉非替尼浓度下，吉非替尼对HCC827Ge-r细胞活性的抑制效果差于吉非替尼对HCC827细胞活性的抑制效果。
实施例2吉非替尼联合化合物A协同抑制HCC827Ge-r细胞的活性
将对数生长期的HCC827Ge-r细胞接种至多孔细胞培养板上，接种孔内的培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基，然后分组，每组设置3个平行样。依照表1中的分组进行加药处理，处理时间为48h。
表1实施例1中各组的加药处理情况一览表
备注：表1中的“×”表示未添加对应的药剂。
各组加药处理结束后，向每孔中加入10μL的CCK-8试剂，处理2h，然后采用微孔板分析仪测定450nm处的吸光度。
由图1至图4可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A均能够抑制HCC827Ge-r细胞的活性；随着吉非替尼浓度的增加，HCC827Ge-r细胞的活性逐渐降低；在相同的吉非替尼浓度下，相较于未添加化合物A的对照组，添加有化合物A的实验组的HCC827Ge-r细胞活性更低，充分说明化合物A增强了吉非替尼对HCC827Ge-r细胞活力的抑制能力。
由图2至图4可知，化合物A2和化合物A3对吉非替尼抑制HCC827Ge-r细胞活力的促进效果优于化合物A1。
实施例3吉非替尼联合化合物A1协同抑制HCC827Ge-r细胞的细胞克隆形成
选择实施例1中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞进行细胞克隆形成实验(Clone formation assay)，将各组经加药处理后的HCC827Ge-r细胞分别接种至六孔板中，接种孔内的培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基，接种量为1000个细胞/孔，每种设置三个平行样，然后置于37℃孵育14天后，将形成的细胞克隆在4％多聚甲醛溶液中固定10min，室温下用0.25％结晶紫染色5min，PBS洗涤1次，烘干。在光学显微镜下对形成的细胞克隆进行计数。
由图5可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A1能够抑制HCC827Ge-r细胞的细胞克隆形成，且有效量的吉非替尼和化合物A1联合使用对HCC827Ge-r细胞的细胞克隆形成的抑制作用更强。
实施例4吉非替尼联合化合物A1协同抑制HCC827Ge-r细胞的侵袭和迁移
选择实施例2中实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞进行划痕实验(Wound healing assay)和细胞体外侵袭实验(Transwellassay)，以及采用Western blot检测实验组二的HCC827Ge-r细胞中与细胞侵袭迁移相关蛋白(MMP2和MMP9)的表达。
其中，划痕实验包括如下步骤：
S201、将经加药处理后的HCC827Ge-r细胞接种至6孔板中，接种孔内的培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基，接种量为2×106个细胞/孔，每种设置三个平行样，然后置于37℃孵育直至形成单层细胞；
S202、采用200μL无菌吸管的尖端在单层细胞上划痕，然后加入无血清的RPMI-1640培养基，置于37℃培养24h；
S203、采用PBS溶液除去脱落细胞后，在光学显微镜下观察细胞迁移情况，并拍照。
细胞体外侵袭实验包括如下步骤：
S211、提供Transwell培养板，采用Matrigel覆盖Transwell培养板中上室的底部；
S212、向Transwell培养板的上室加入经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的单细胞悬液，添加量为5×104个细胞；
S213、向Transwell培养板的下室加入500μL的RPMI-1640培养基，然后置于37℃、5％CO2的条件下培养24h；
S214、培养结束后，用棉签将未侵袭的HCC827Ge-r细胞完全拭去，将侵袭的HCC827Ge-r细胞在4％多聚甲醛溶液中固定10min，0.25％结晶紫染色20min，光学显微镜下观察细胞和拍照。
由图6和图7可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A1能够抑制HCC827Ge-r细胞的侵袭和迁移，有效量的吉非替尼和化合物A1联合使用可进一步地抑制HCC827Ge-r细胞的侵袭和迁移。此外，由图8可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A1能够下调HCC827Ge-r细胞中与细胞侵袭迁移相关蛋白(MMP2和MMP9)的表达，并且有效量的吉非替尼和化合物A1联合使用可进一步地下调HCC827Ge-r细胞中与细胞侵袭迁移相关蛋白(MMP2和MMP9)的表达。
实施例5吉非替尼联合化合物A1协同诱导HCC827Ge-r细胞的凋亡
采用流式细胞仪分析实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞的凋亡情况，以及采用Western blot检测实验组二、对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞中与细胞凋亡相关蛋白的表达，所述与细胞凋亡相关蛋白包括Bcl-2、Bax以及cleaved caspase3。
流式细胞仪分析HCC827Ge-r细胞的凋亡情况包括如下步骤：
S501、将经加药处理后的HCC827Ge-r细胞接种至6孔板中，每孔接种量1×105个细胞/mL，接种孔内的培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基，每种设置三个平行样，然后置于37℃孵育；
S502、孵育处理48h后，用PBS溶液重悬HCC827Ge-r细胞，然后在室温避光条件下，采用10μg/mL PI和50μg/mL Annexin V-FITC染色15min；
S503、采用FACScalibur流式细胞仪分析HCC827Ge-r细胞的凋亡情况。
由图9和图10可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A1能够促进HCC827Ge-r细胞的凋亡，且有效量的吉非替尼和化合物A1联合使用可增强HCC827Ge-r细胞的凋亡，经不同加药处理的HCC827Ge-r细胞中与细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax以及cleavedcaspase3)的表达均发生相应变化，相较于对照组一、对照组四以及对照组八的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞，实验组二的经加药处理后的HCC827Ge-r细胞中Bcl-2表达水平下降、Bax表达水平提高以及cleaved caspase3表达水平提高。
实施例6动物实验验证化合物A增强吉非替尼对HCC827Ge-r细胞的抗肿瘤作用
提供20只雄性裸鼠(SPF；年龄：4周；体重：16g至18g)，购自青龙山动物养殖场(中国南京)，正常饲养七天，然后在每只裸鼠的皮下注射HCC827 Ge-r细胞(注射量为：4×106个细胞)。将20只雄性裸鼠随机分为4组，每组5只，对应实验组A至实验组D。依照表2对各组用药，每3天用电子称测量各裸鼠的体重，并每3天用游标卡尺测量肿瘤的大小，直至第21天采用二氧化碳吸入法使各裸鼠安乐死。动物实验经南京中医药大学附属医院动物护理使用委员会批准。
表2实施例6中各组的用药情况一览表
备注：“√”表示添加对应的药剂，“×”表示未添加对应的药剂；化合物A1药剂是将化合物A1溶于含15％聚氧乙烯35氢化蓖麻油的PBS溶液中制备获得；吉非替尼药剂是将吉非替尼溶于含15％聚氧乙烯35氢化蓖麻油的PBS溶液中制备获得。
由图11可知，有效量的吉非替尼或有效量的化合物A1均能够抑制裸鼠中肿瘤的生长，且有效量的吉非替尼和化合物A1联合使用进一步地抑制了裸鼠中肿瘤的生长。
实施例7
本实施例提供了一种口服片剂及其制备方法，按照重量百分比计算，所述口服片剂的配方包括：60％的吉非替尼、12％的化合物A1、18％的乳糖、4％的羧甲纤维素、5％的聚维酮以及1％的硬脂酸镁，每片的种类为250mg，每片的药学有效成分(吉非替尼和化合物A1)的重量百分比为72％。
所述制备方法为：按照配方量称取吉非替尼、化合物A1、乳糖、羧甲纤维素和聚维酮，加纯水混合均匀后，依次进行制粒、干燥以及整粒工序，再加入配方量的硬脂酸镁，混合均匀后压片，制成口服片剂。
实施例8
本实施例提供了一种口服片剂及其制备方法，按照重量百分比计算，所述口服片剂的配方包括：60％的吉非替尼、12％的化合物A1、18％的乳糖、7％的羧甲纤维素、2％的聚维酮以及1％的硬脂酸镁，每片的种类为250mg，每片的药学有效成分(吉非替尼和化合物A1)的重量百分比为72％。
所述制备方法参照实施例7进行。
实施例9
本实施例提供了一种口服片剂及其制备方法，按照重量百分比计算，所述口服片剂的配方包括：60％的吉非替尼、12％的化合物A1、14％的乳糖、11％的羧甲纤维素、2％的聚维酮以及1％的硬脂酸镁，每片的种类为250mg，每片的药学有效成分(吉非替尼和化合物A1)的重量百分比为72％。
所述制备方法参照实施例7进行。
对比例
本对比例提供了一种口服胶囊剂及其制备方法，按照重量百分比计算，所述口服胶囊剂的配方包括：60％的吉非替尼、12％的化合物A1、18％的乳糖、4％的结晶纤维素、5％的聚维酮以及1％的硬脂酸镁，每粒250mg，每粒胶囊的药学有效成分(吉非替尼和化合物A1)的重量百分比为72％。
所述制备方法包括步骤：将配方量取粉末状的吉非替尼、化合物A1、乳糖、结晶纤维素、聚维酮以及硬脂酸镁混合均匀，然后加入适量纯水制成软材，过筛网制粒，然后在50℃的条件下干燥至水分小于5％，过筛网整粒，充填入空心胶囊，制成硬胶囊剂。
实验例
对实施例7至实施例9的口服片剂进行脆碎度和溶出度检测，并对对比例的口服胶囊剂进行溶出度检测，其中，采用中国药典2020年版四部通则0923的片剂脆碎度检查法检测口服片剂的脆碎度(片重小于0.65g)，采用中国药典2020年版溶出度与释放度测定法第一法和第二法的方法1检测酸中溶出量，实验结果详见下表3：
表3实施例7至实施例10的口服片剂以及对比例的胶囊剂的性能检测结果
由表3可知，相较于对比例的口服胶囊剂，实施例7至实施例9的口服片剂的生物利用度具有明显优势，从而更有利于机体吸收药物。由实施例7至实施例9可知，在药物组合物中，优选崩解剂为羧甲纤维素，崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的5％至8％，并且粘合剂为聚维酮，粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至3％，既能保证口服片剂具有理想的抗脆碎度特性，又能提高吉非替尼和化合物A的溶出速率，促进药物吸收。
在上述实施例中，对各个实施例和对比例的描述都各有侧重，某个实施例/对比例中没有详述的部分，可以参见其他实施例/对比例的相关描述。
以上对本发明实施例所提供的一种药物组合物及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物方面的应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的药学有效成分包括第一组分和第二组分，其中，所述第一组分为吉非替尼，所述第二组分为化合物A，所述化合物A具有下面通式(Ⅰ)所示的结构：
在式(Ⅰ)中，R选自双键氧原子、卤素或吗啉乙基。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述第一组分：所述第二组分的重量比为(0.4～7)：1。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服片剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料为赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂，其中，所述赋形剂的重量占所述药学组合物总重量的10％至20％，所述崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至10％，所述粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％，所述润滑剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至5％。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述赋形剂选自乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉以及结晶纤维素中的至少一者；所述崩解剂选自预胶化淀粉、明胶、结晶纤维素以及羧甲纤维素中的至少一者；所述粘合剂选自玉米淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素以及聚维酮中的至少一者；所述润滑剂选自滑石粉或硬脂酸镁。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述崩解剂为羧甲纤维素，所述崩解剂的重量占所述药学组合物总重量的5％至8％；并且所述粘合剂为聚维酮，所述粘合剂的重量占所述药学组合物总重量的1％至3％。
7.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括包衣，所述包衣的材料为胃溶衣或肠溶衣。
8.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为第一制剂和第二制剂的组合剂，其中，所述第一制剂为含有所述第一组分的制剂，所述第二制剂为含有所述第二组分的制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述第一制剂和所述第二制剂依次施用，或所述第一制剂和所述第二制剂同时施用。
10.根据权利要求1至9任一项中所述的药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
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