CN111281872B - 一种含阿法替尼的药物组合物及其应用 - Google Patents

一种含阿法替尼的药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含阿法替尼的药物组合物及其应用，具体涉及阿法替尼和槲皮素、木犀草素的联合以及他们的组合物在治疗肺癌中的应用。发明人基于中西药联合作用的思路，寻找到与阿法替尼联合的中药单体槲皮素和木犀草素及二者联用时的协同区间，为临床治疗肺癌提供了新的技术方案。

Description

一种含阿法替尼的药物组合物及其应用
技术领域
本申请属于医药领域，具体涉及一种含阿法替尼的药物组合物及其应用。
背景技术
肺癌全球范围内引起癌症相关死亡的首要原因，约占癌症相关总死亡人数的27％。每年新诊断的病例超过180万，其中超过85％为非小细胞肺癌。大部分实体瘤存在EGFR高表达的情况，目前普遍认为EGFR表达失调与肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤转移等密切相关。
阿法替尼(Afatinib)是第二代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，它可以广泛作用于ErbB家族，不可逆地与EGFR，HER2及HER4结合，通过抑制它们的酶活性发挥作用。虽然阿法替尼对癌细胞生长的阻断更全面、更持久，但也不可避免的产生耐药，加上沉重的经济负担，如何开发出更经济有效的治疗模式是当前医学研究急需解决的问题之一。
中西药联合***是目前的研究热点之一，药理作用相同或相似的中成药与西药联合使用可能发挥协同增效的作用，减少西药用量，缩短治疗周期，不过也存在一定的风险，如降低疗效，梅花点舌丹等与维生素C、阿司匹林等酸性药物联合使用时，可使其中的皂苷类有效成分发生分解，导致疗效降低；影响药物代谢，金复康口服液中的黄芪甲苷可显著抑制CYP3A4和CYP2C9的活性等，故而，在具体联用是需要通过实验验证及条件的摸索，从而推动中西药联合使用的合理性。
现有研究中报道过阿法替尼联合利尿酸治疗肺癌，对A549、H1975细胞生长具有抑制作用，但对阿法替尼和中药联合治疗肺癌的报道很少。本申请基于中西药联合作用的思路，寻找到与阿法替尼联合的中药单体——槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)，及二者联用时的协同区间，为槲皮素、木犀草素与阿法替尼的临床联合用药提供基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗癌症的药物组合物，所述组合物由阿法替尼与中药单体组成，所述中药单体为槲皮素、木犀草素。
进一步，槲皮素与阿法替尼浓度比为100-6.25：0.315-5；木犀草素与阿法替尼浓度比为25-3.125：0.315-5。
优选的，槲皮素浓度与阿法替尼的比为100-6.25：0.625-2.5；木犀草素与阿法替尼浓度比为25-3.125：0.625-2.5。
优选的，槲皮素与阿法替尼浓度比为100-6.25：1.5；木犀草素与阿法替尼浓度比为25-3.125：1.5。
更优选的，药物联用时选择阿法替尼浓度为1.5uM和槲皮素浓度为12.5-25uM；药物联用时选择阿法替尼浓度为1.5uM和木犀草素浓度3.125-12.5uM。
本发明的目的在于提供上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，肿瘤为肺癌。
进一步，上述药物组合物在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
进一步，上述药物组合物在制备抗肿瘤细胞迁移药物中的应用。
本发明的优点：
阿法替尼和槲皮素、木犀草素的联合用药在一定配比范围内能明显提高药物抗肿瘤细胞增殖和迁移方面的药效，产生了协同作用，能够有效降低药物成本，提高临床治疗效果，尤其是阿法替尼和木犀草素的组合。
附图说明
图1是槲皮素的IC50值的测定图；
图2是木犀草素IC50值的测定图；
图3是对照组单独用药细胞迁移情况图，左图为0h拍照，右图为24h时拍照；
图4是槲皮素单独用药细胞迁移情况图，左上图为浓度为12.5uM时0h拍照，右上图为浓度为12.5uM时加药后24h时拍照，左下图为浓度为50uM时0h拍照，右下图为浓度为50uM时加药后24h时拍照；
图5是木犀草素单独用药细胞迁移情况图，左上图为浓度为6.25uM时0h拍照，右上图为浓度为6.25uM时加药后24h时拍照，左下图为浓度为25uM时0h拍照，右下图为浓度为25uM时加药后24h时拍照；
图6是阿法替尼单独用药细胞迁移情况图，左图为浓度为6.25uM时0h拍照，右图为浓度为6.25uM时加药后24h时拍照；
图7是槲皮素和阿法替尼联合用药时细胞迁移情况图，左上图为槲皮素浓度为12.5uM+阿法替尼浓度为1.5uM时0h拍照，右上图为槲皮素浓度为12.5uM+阿法替尼浓度为1.5uM时加药后24h时拍照，左下图为槲皮素浓度为50uM+阿法替尼浓度为1.5uM时0h拍照，右下图为槲皮素浓度为50uM+阿法替尼浓度为1.5uM时加药后24h时拍照；
图8是木犀草素和阿法替尼联合用药时细胞迁移情况图，左上图为木犀草素浓度为6.25uM+阿法替尼浓度为1.5uM时0h拍照，右上图为木犀草素浓度为6.25uM+阿法替尼浓度为1.5uM时加药后24h时拍照，左下图为木犀草素浓度为25uM+阿法替尼浓度为1.5uM时0h拍照，右下图为木犀草素浓度为25uM+阿法替尼浓度为1.5uM时加药后24h时拍照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1
1.实验主要试剂
Figure BDA0002434245870000031
Figure BDA0002434245870000041
2.实验主要仪器
仪器名称 仪器型号 厂家
细胞培养箱 STERI-CYCLE Thermo
台式低速离心机 TDZ4A-WS 湘仪
倒置生物显微镜 BM-37XB 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司
电热恒温水浴锅 HI1220 Leica
除菌过滤器(0.22uM) SLGV033RB Millex-HV
一次性使用无菌注射器(10ml) 202004 上海治宇医疗器械有限公司
酶联免疫检测仪 SpectraMax M5 Molecular Devices
3.实验方法
3.1细胞培养及分组
(1)细胞培养：培养人肺癌细胞(A549)，细胞用含10％的FBS、100units/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素以及89％的1640培养基，在37℃、5％CO2以及饱和湿度的条件下培养。适时更换培养基和传代。
(2)细胞分组：
A549—空白不含细胞的培养基
A549—对照正常培养细胞
A549--1槲皮素(quercetin)处理组(不同浓度梯度)
A549--2木犀草素(luteolin)处理组(不同浓度梯度)
A549--3阿法替尼(Afatinib)处理组
A549--5槲皮素(quercetin)+阿法替尼(Afatinib)处理组(不同浓度梯度)
A549--6木犀草素(luteolin)+阿法替尼(Afatinib)处理组(不同浓度梯度)
3.2MTT实验
(1)MTT液配制(250mg MTT溶于50ml的PBS溶液中，0.22μm微孔滤膜过滤，4℃避光保存)。
(2)人肺癌细胞加入培养液PRIM-1640(含有10％新生牛血清、1％双抗)中，放入37℃、5％CO2孵箱中培养，隔日换液1次，0.25％胰酶-EDTA消化传代冻存。
(3)取对数生长期的细胞，调整细胞悬液浓度，加入96孔培养板，每孔100μl细胞悬液(含1×104个细胞)培养24h
(4)细胞贴壁后再加入不同组分的药物培养基进行处理，实验设空白调零组(只加培养液)、细胞对照组(未用药物处理的细胞悬液)和药物处理组(每组药物浓度设5个浓度水平)，阿法替尼(Afatinib)0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20uM；槲皮素(quercetin)3.125、6.25、12.5、25、50、100、200uM；木犀草素(luteolin)1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100uM，每组设3个复孔，不同药物作用24h。
(5)吸取含药培养基，更换无药物的信箱培养基后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，孵育4h，离心弃上清。
(6)每孔加入DMSO 150μL，震荡10min。酶联免疫检测仪检测570nm波长各孔的吸光度(OD)值。
3.3IC50值的测定及联合用药效果的判定
(1)半数抑制浓度(IC50)值的计算：根据不同浓度的药物对细胞的作用，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值。
(2)细胞终止培养后，收集细胞，采用MTT法测定各组细胞活性并计算抑制率(抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％)。
(3)双药联合用药效果的判定：
联合用药效果判断的计算方法：采用金正均q值法进行判定。q值由以下的公式求得：q＝PA+B/(PA+PB-PA×PB)。式中PA、PB和PA+B分别为A药组、B药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用，q＝1说明两药合用后产生相加作用。
3.4细胞划痕实验
将细胞密度调整为1×105/ml接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸去培养基，PBS清洗，用200μl枪头在培养板每孔中央沿纵轴方向划一直线，PBS清洗，分别加入正常培养基及含药培养基继续培养，分别于0、24h时，倒置显微镜下拍照。Image J软件测量各组细胞迁移距离。
4.实验结果
4.1IC50值的测定
结果显示，槲皮素3.125、6.25、12.5、25、50、100、200uM时平均抑制率分别为2.97％、6.63％、15.63％、39.90％、67.22、78.29％％和83.80％，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值为27.06(具体见图1)；木犀草素1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100uM时平均抑制率分别为7.30％、11.70％、21.50％、45.23％、65.96％、77.61％和87.50％，采用GraphPad Prism7软件来计算半数抑制浓度(IC50)值为13.80(具体见图2)；同理，测得阿法替尼半数抑制浓度(IC50)值为2.81。
4.2联合用药效果效果
槲皮素、木犀草素与阿法替尼的联合用药效果：
分组 抑制率 Q值
槲皮素(100uM) 0.7830 -
槲皮素(50uM) 0.6722 -
槲皮素(25uM) 0.3990 -
槲皮素(12.5uM) 0.1563 -
槲皮素(6.25uM) 0.0664 -
阿法替尼(1.5uM) 0.2453 -
槲皮素(100uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.8611 1.029793459
槲皮素(50uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.7722 1.026000472
槲皮素(25uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.8418 1.540447669
槲皮素(12.5uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.4403 1.212170462
槲皮素(6.25uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.2725 0.92239267
木犀草素(50uM) 0.7761 -
木犀草素(25uM) 0.6596 -
木犀草素(12.5uM) 0.4523 -
木犀草素(6.25uM) 0.2151 -
木犀草素(3.125uM) 0.1170 -
木犀草素(50uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.8201 0.986833329
木犀草素(25uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.7700 1.036130877
木犀草素(12.5uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.8596 1.465271748
木犀草素(6.25uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.5794 1.421359565
木犀草素(3.125uM)+阿法替尼(1.5uM) 0.4647 1.393084094
从上述结果中可以看出槲皮素和阿法替尼在一定比例区间内时表现出对肺癌细胞的协同抑制作用；木犀草素和阿法替尼在一定比例区间内时也表现出对肺癌细胞的协同抑制作用。
4.3划痕实验结果
细胞划痕实验主要用于验证肿瘤研究中细胞迁移能力。通过判断对照组与实验组划痕的距离来判断细胞的迁移能力。愈合率越低显示药物对肿瘤细胞迁移能力的影响作用越大。本实验中，首先，测定对照组、槲皮素(12.5uM)、槲皮素(50uM)、木犀草素(25uM)、木犀草素(6.25uM)和阿法替尼(1.5uM)时，各自的愈合率，结果显示，对照组愈合率为76.1％(具体见图3)，槲皮素槲皮素(12.5uM)和槲皮素(50uM)的愈合率分别为70.8％、68.6％(见图4)，木犀草素(25uM)和木犀草素(6.25uM)的愈合率分别为56.9％、72.2％(见图5)，阿法替尼(1.5uM)的愈合率为70.8％(见图6)。进一步根据联合用药的抑制率的结果，挑选2个组合进行划痕实验，计算愈合率，其中槲皮素(12.5uM)和阿法替尼(1.5uM)的联合用药组中，愈合率为62.4％；槲皮素(50uM)和阿法替尼(1.5uM)的联合用药组中，愈合率为57.5％(具体见图7)；木犀草素(6.25uM)和阿法替尼(1.5uM)的联合用药组中，愈合率为64.2％；木犀草素(25uM)和阿法替尼(1.5uM)的联合用药组中，愈合率为25.8％(具体见图8)。

Claims (5)

1.一种治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物由阿法替尼与中药单体组成，其特征在于，中药单体为木犀草素，木犀草素与阿法替尼的摩尔浓度比为25-3.125：1.5。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，阿法替尼浓度为1.5uM和木犀草素浓度3.125-12.5uM。
3.权利要求1-2任意一项所述的药物组合物在制备抗肺癌药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备抗肺癌细胞增殖药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备抗肺癌细胞迁移药物中的应用。
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中药改善EGFR-TKIs治疗进展期非小细胞肺癌产生获得性耐药的机制研究进展;伍晓慧等;《中医药导报》;20171231;第23卷(第24期);第34-36页，特别是第35页第2节 *
吉非替尼联合槲皮素对非小细胞肺癌PC9/GR细胞的协同抗肿瘤作用;王静;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20190115(第12期);E072-144页，特别是摘要、第7页第3段、第25页结论部分 *

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