CN104823844A - 一种莲属植物的组织培养方法 - Google Patents

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姚东瑞
李乃伟
杜凤凤
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，为解决传统的莲属植物繁殖多采用分藕的方式中存在着用种量大、且繁殖系数低、影响扩繁速度的问题，本发明提供一种莲属植物的组织培养方法：（1）双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；（2）将选用的莲属植物藕芽进行外植体消毒；（3）外植体消毒后的藕芽接种在步骤（1）配制的双相诱导分化培养基中进行初代培养20~30天，得到初代培养的丛生芽；（4）将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到步骤（1）配制的双相增殖生根培养基中，培养20~35天增殖生根。本发明可以有效降低水生植物组织褐变率，实现更高的成活率、生长速度和出芽数，同时还可以增加组培快繁体系的稳定性，节省人力物力。

Description

一种莲属植物的组织培养方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种莲属植物的组织培养方法。
背景技术
传统的莲属植物繁殖多采用分藕的方式进行，此法用种量大，且繁殖系数低，影响扩繁速度。随着组织培养技术的发展，组织培养成为莲属植物理想的繁殖方法。虽然目前利用顶芽或腋芽直接诱导出不定芽，繁殖出的后代整齐度好，繁殖系数高，又能保持原品种的优良特性，同时还可避免种藕带菌；但是，在莲属植物芽的离体快繁过程中，污染率极高，容易褐变，且生长缓慢，易产生僵苗，成功率低，很难获得大量整齐的无菌苗。
申请号为201310747637.2的中国专利公开了一种葱莲胚性细胞悬浮培养系的建立和植株再生的方法，该发明在葱莲属植物上建立了胚性细胞悬浮培养系的建立方法，但不能解决莲属植物繁殖存在的问题。
发明内容
为解决传统的莲属植物繁殖多采用分藕的方式中存在着用种量大、且繁殖系数低、影响扩繁速度的问题，本发明提供一种莲属植物的组织培养方法，可以有效降低降低水生植物组织褐变率，实现更高的成活率、生长速度和出芽数，同时还可以增加组培快繁体系的稳定性，节省人力物力。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种莲属植物的组织培养方法为；
(1)双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；
所述的双相诱导分化培养基包括固相诱导分化培养基和液相诱导分化培养基，配制方法为以下步骤：
(a)将组分为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖+活性炭200-400mg/L的培养基灭菌，得到固相诱导分化培养基，然后将固相诱导分化培养基分瓶，凝固，备用；
(b)将组分为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖的培养基灭菌，冷却后加入过滤灭菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L，得到液相诱导分化培养基。
所述的双相增殖生根培养基包括固相增殖生根培养基和液相增殖生根培养基，配制方法为以下步骤：
(a)将组份为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖+活性炭200-400mg/L的培养基灭菌，得到固相增殖生根培养基，然后将固相增殖生根培养基分瓶，凝固，备用；
(b)将组份为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖的培养基灭菌；冷却后加入过滤灭菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培养基。
本发明通过固液双相培养基对莲属植物组织进行培养的方法提高了高水生植物组织培养效率。
作为优选，所述的灭菌方法为120℃高压灭菌。但是200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L加入前为过滤灭菌，半胱氨酸200mg/L加入前为过滤灭菌。
作为优选，冷却后温度低于30℃。
MS培养基是目前使用最普遍的培养基。具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。
(2)将选用的莲属植物藕芽进行外植体消毒；
作为优选，选用莲属植物藕芽外植体的消毒方法为：清水冲洗后75％酒精表面灭菌60秒、0.10％氯化汞灭菌20min。
(3)将步骤(2)外植体消毒后的藕芽接种在步骤(1)配制的双相诱导分化培养基中进行初代培养20～30天，得到初代培养的丛生芽；
具体步骤为：将步骤(2)消毒后的莲属植物藕芽接种在固体诱导分化培养基中，然后将液体诱导分化培养基覆盖在接种后的固体诱导分化培养基上面，培养20～30天，得到初代培养的丛生芽；作为优选，液体诱导分化培养基的液面高于固相诱导分化培养基表面1～3cm。
(4)将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到步骤(1)配制的双相增殖生根培养基中，培养20～35天.增殖生根。
具体步骤为：将步骤(3)初代培养的丛生芽切成单芽，接种入固相增殖生根培养基中，然后将液相增殖生根培养基覆盖在接种后的固相增殖生根培养基上面，培养20～35天，作为优选，液相增殖生根培养基的液面高于固相增殖生根培养基表面1～3cm。
作为优选，上述的培养方法都在干净的工作台上进行。
将经此方法培养得到的带根小苗出瓶，放置于温室中生长15天以上，然后可以露地栽培，当年可开花。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)可以有效降低降低水生植物组织褐变率，实现更高的成活率、生长速度和出芽数；
(2)可以增加组培快繁体系的稳定性，节省人力物力。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。实施例中所述的培养方法都在干净的工作台上进行，MS培养基粉末为市购产品，实施例中所述的室温为20～25℃。
实施例1
(1)双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；
将组分为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖+活性炭200g/L的培养基在120℃高压灭菌，得到固相诱导分化培养基，然后在超净工作台分瓶，充分凝固，备用；
将组分为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌，冷却到室温后加入过滤灭菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L，得到液相诱导分化培养基；
将组份为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖+活性炭200mg/L的培养基120℃高压灭菌，得到固相增殖生根培养基，然后将固相增殖生根培养基分瓶，凝固，备用；
将组份为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌；冷却到室温后加入过滤灭菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培养基，备用。
(2)以中国莲“贵妃醉酒”为例
将中国莲“贵妃醉酒”的藕芽进行外植体消毒；清水冲洗后75％酒精表面灭菌60秒、0.10％氯化汞灭菌20min。
(3)将消毒后的中国莲“贵妃醉酒”藕芽接种在固体诱导分化培养基中，然后将液体诱导分化培养基覆盖在接种后的固体诱导分化培养基上面，液体诱导分化培养基的液面高于固相诱导分化培养基表面1cm，培养30天，得到初代培养的丛生芽；
(4)将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到固相增殖生根培养基中，然后将液相增殖生根培养基覆盖在接种后的固相增殖生根培养基上面，液相增殖生根培养基的液面高于固相增殖生根培养基表面1cm，培养35天，增殖生根。
将经此方法培养得到的带根小苗出瓶，放置于温室中生长15天以上，然后可以露地栽培，当年可开花。
实施例2
(1)双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；
将组分为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖+活性炭400g/L的培养基在120℃高压灭菌，得到固相诱导分化培养基，然后在超净工作台分瓶，充分凝固，备用；
将组分为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌，冷却到室温后加入过滤灭菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L，得到液相诱导分化培养基；
将组份为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖+活性炭400mg/L的培养基在120℃高压灭菌，得到固相增殖生根培养基，然后将固相增殖生根培养基分瓶，凝固，备用；
将组份为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌；冷却到室温后加入过滤灭菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培养基，备用。
(2)以美洲莲“杏黄”为例
将美洲莲“杏黄”的藕芽进行外植体消毒；清水冲洗后75％酒精表面灭菌60秒、0.10％氯化汞灭菌20min。
(3)将消毒后的美洲莲“杏黄”藕芽接种在固体诱导分化培养基中，然后将液体诱导分化培养基覆盖在接种后的固体诱导分化培养基上面，液体诱导分化培养基的液面高于固相诱导分化培养基表面3cm，培养20天，得到初代培养的丛生芽；(4)将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到固相增殖生根培养基中，然后将液相增殖生根培养基覆盖在接种后的固相增殖生根培养基上面，液相增殖生根培养基的液面高于固相增殖生根培养基表面3cm，培养20天，增殖生根。
将经此方法培养得到的带根小苗出瓶，放置于温室中生长15天以上，然后可以露地栽培，当年可开花。
实施例3
(1)双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；
将组分为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖+活性炭300g/L的培养基在120℃高压灭菌，得到固相诱导分化培养基，然后在超净工作台分瓶，充分凝固，备用；
将组分为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌，冷却到室温后加入过滤灭菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L，得到液相诱导分化培养基；
将组份为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖+活性炭300mg/L的培养基120℃高压灭菌，得到固相增殖生根培养基，然后将固相增殖生根培养基分瓶，凝固，备用；
将组份为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖的培养基120℃高压灭菌；冷却到室温后加入过滤灭菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培养基，备用。
(2)以中国莲“中国古代莲”为例
将中国莲“中国古代莲”的藕芽进行外植体消毒；清水冲洗后75％酒精表面灭菌60秒、0.10％氯化汞灭菌20min。
(3)将消毒后的中国莲“中国古代莲”藕芽接种在固体诱导分化培养基中，然后将液体诱导分化培养基覆盖在接种后的固体诱导分化培养基上面，液体诱导分化培养基的液面高于固相诱导分化培养基表面2cm，培养25天，得到初代培养的丛生芽；
(4)将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到固相增殖生根培养基中，然后将液相增殖生根培养基覆盖在接种后的固相增殖生根培养基上面，液相增殖生根培养基的液面高于固相增殖生根培养基表面2cm，培养27天，增殖生根。
将经此方法培养得到的带根小苗出瓶，放置于温室中生长15天以上，然后可以露地栽培，当年可开花。

Claims (9)

1.一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，所述的培养方法为：
(1)双相诱导分化培养基和双相增殖生根培养基的配制；
(2)将选用的莲属植物藕芽进行外植体消毒；
(3)将步骤(2)外植体消毒后的藕芽接种在步骤(1)配制的双相诱导分化培养基上进行初代培养20～30天，得到初代培养的丛生芽；
(4)将初代培养的丛生芽切成单芽，接种到步骤(1)配制的双相增殖生根培养基中，培养20～35天增殖生根。
2.根据权利要求1所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的双相诱导分化培养基包括固相诱导分化培养基和液相诱导分化培养基，配制方法为以下步骤：
(a)将组分为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖+活性炭200-400mg/L的培养基灭菌，得到固相诱导分化培养基，然后将固相诱导分化培养基分瓶，凝固，备用；
(b)将组分为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+5％蔗糖的培养基灭菌，冷却后加入过滤灭菌后的200mg/L谷胱甘肽+抗坏血酸150mg/L+柠檬酸500mg/L，得到液相诱导分化培养基。
3.根据权利要求1所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的双相增殖生根培养基包括固相增殖生根培养基和液相增殖生根培养基，配制方法为以下步骤：
(a)将组份为MS+琼脂10g/L+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖+活性炭200-400mg/L的培养基灭菌，得到固相增殖生根培养基，然后将固相增殖生根培养基分瓶，凝固，备用；
(b)将组份为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+5％蔗糖的培养基灭菌；冷却后加入过滤灭菌后的半胱氨酸200mg/L，得到液相增殖生根培养基。
4.根据权利要求1或2所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，将步骤(2)消毒后的莲属植物藕芽接种在固体诱导分化培养基中，然后将液体诱导分化培养基覆盖在接种后的固体诱导分化培养基上面，培养20～30天。
5.根据权利要求4所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，液体诱导分化培养基的液面高于固相诱导分化培养基表面1～3cm。
6.根据权利要求1或3所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，将步骤(3)初代培养的丛生芽切成单芽，接种在固相增殖生根培养基中，然后将液相增殖生根培养基覆盖在接种后的固相增殖生根培养基上面，培养20～35天。
7.根据权利要求6所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，液相增殖生根培养基的液面高于固相增殖生根培养基表面1～3cm。
8.根据权利要求1所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，选用莲属植物藕芽外植体的消毒方法为：清水冲洗后75％酒精表面灭菌60秒、0.10％氯化汞灭菌20min。
9.根据权利要求2或3所述的一种莲属植物的组织培养方法，其特征在于，冷却后温度低于30℃。
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