CN105766641B - 一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法。通过离体培养甜薯的成熟幼嫩的单节茎段，筛选出了最佳实验条件，建立了甜薯组织培养的最佳快速繁殖体系，可以得出诱导培养基中最佳激素浓度是AD 0.8 mg/L，继代培养基最佳激素浓度是6‑BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L，生根培养最佳的激素浓度是IBA 2 mg/L。该方法能够快速获得甜薯的脱毒苗，能够快速提高甜薯的品质和产量，为甜薯的产业化生产提供了理论依据和实践指导。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，涉及一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法。
背景技术
甜薯（D. esculenta (Lout) brukill）为山药同属不同种食用植物，广泛分布于热带、南亚热带地区，如中国广东、广西、海南及非洲尼日利亚等。其食用部分为类似马铃薯状的球形块茎，肉质细嫩、食味佳、入口绵软，可做蔬菜、杂粮或药用等。
目前甜薯是品种丰富但无规模栽培的农家小种，我们近年来从海南农家引种，并通过耐寒性筛选获得了在江苏适生的品系，通过营养成分检测发现，其多糖含量为目前市场公认的多糖含量最高的铁棍山药的3~4倍；且与江苏主栽的直根类山药品种不同，甜薯为浅根类植物，种植无需挖深沟、筑高垄、套管等，收获也容易，因此，极大地降低了生产成本；甜薯一棵植株可生长30-40个球状块茎，亩产可达3000斤以上，产量大；同时，就其社会效益来看，甜薯抗旱耐肥、少病虫害且长势强，适合在江苏省缺水缺肥的低山丘陵地区种植，并且因其对光照要求不高，不仅可种植在已有的耕地上，还可以在次生林、经济林间的空地种植，不用与现有农作物抢占土地资源，从而缓解土地资源日益匮乏的矛盾。多糖含量高、浅根系易种好收、产量高、江苏适生等诸多优点，使得甜薯成为一个新兴的、开发潜力大、前景好的山药新种。
此外，传统的山药种植是在收获季节选健壮、无病虫害的块茎贮藏，次年种植季节取出切断种植，这种传统的“春种、秋收、冬藏”方式存在种块严重浪费、繁殖速度很慢、人力物力消耗大等问题；而且，由于长期的无性繁殖，导致病毒和病害的积累与传播，致使品质退化、产量下降。前人研究表明，通过组织培养脱除病毒的方法不仅可以极大提高山药繁殖系数，而且也会解决长期营养繁殖所造成的病毒病和品质退化等问题，在很多种或品种如铁棍山药、怀山药、叉蕊薯蓣等中已有很多报道。甜薯中尚未见组织培养获得脱毒苗的研究报道，本发明将以甜薯为研究对象，通过不同外植体、不同激素种类与浓度处理等多因素多水平的实验设计，筛选出了最佳实验条件，建立了甜薯组织培养的最佳快速繁殖体系，为甜薯的产业化生产提供了理论依据和实践指导。
发明内容
本发明提供了一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法，通过组织培养技术，选择甜薯外植体，消毒灭菌后接种入不同的激素和浓度的培养基进行培养，并筛选出最佳快速获得脱毒苗的体系，解决甜薯长期无性繁殖品质退化、产量下降的问题。
为了达到上述目的，本发明采用的技术步骤如下：
（1）将所采健康甜薯的幼嫩茎段进行灭菌消毒；
（2）将步骤（1）中消毒后的茎段切成单节茎段；
（3）将步骤（2）中的单节茎段接入已经灭菌的MS培养基中进行诱导出芽；
（4）将步骤（3）中的芽苗转入1/2MS培养基进行继代培养；
（5）将步骤（4）中生长成的无根幼苗转入生根培养基进行生根培养。
其中步骤（1）中的幼嫩茎段可采甜薯生长三个月之后成熟植株顶端幼嫩茎段；
步骤（2）中单节茎段要切除接触升汞的伤口及叶片；
步骤（3）中的操作最好在超净工作台上完成，要保持在无菌条件下操作；
步骤（4）中要分株继代培养；
步骤（5）中幼苗的基部一定要***培养基里生长。
本发明提供获得甜薯脱毒苗快速繁殖的最佳组培体系，以提高甜薯的品质和产量，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1是单节茎段刚开始接入培养基。
图2是茎段培养出了腋芽及叶片。
图3是继代培养的芽苗。
图4是将培养出的无根小苗接入生根培养基长出根的脱毒苗。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。MS培养基、蔗糖、琼脂、激素AD（腺嘌呤）KT（激动素）均由索莱宝公司生产，酒精由南京化学试剂有限公司生产，聚乙烯吡咯烷酮K-30（PVP）由国药集团化学试剂有限公司生产，激素NAA（a-萘乙酸）和IBA（3-吲哚丁酸）由上海楷洋生物技术有限公司生产，激素6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）购自上海瑞永生物科技有限公司，实验中甜薯是在南京中山植物园内种植的。下面对其培养过程进行详细描述。
采样
自南京中山植物园园内引种的甜薯中取生长壮、无病虫危害植株枝蔓上部约3-5cm的嫩茎,用自来水冲洗干净,剪掉开展的叶片,用无菌水漂洗3～5min。
培养基的制备
诱导培养基：采用 MS 基本培养基，加入蔗糖 30 g/L 和 琼脂 10g/L， 附加不同浓度的AD（0.5 mg/L，0.8 mg/L，1.0 mg/L）。 在诱导培养的基础上，适当调整，做继代培养基。
生根培养基：采用 1/2 MS 培养基，加入蔗糖 30 g/L 和 琼脂 10g/L附加不同浓度的 NAA 1.0 mg/L 或 IBA （1 mg/L，2 mg/L）以及NAA 0.5 mg/L + IBA 0.5 mg/L共设 4个处理，灭菌前将培养基的 pH 值调至 5.8，封口后高压灭菌（121℃）20 min。
以上培养基均加入PVP0.01%，冷却凝固后备用。
外植体消毒
在超净工作台上，将洗净的茎段用 75% 乙醇消毒10-15s，再放入 0.1% HgCl2溶液中消毒5-6min，消毒后，用无菌水冲洗 4-5次。
接种外植体于诱导培养基上
将消毒后的外植体切成长1 cm 左右的单节茎段，接种在诱导培养基上，每个处理10 瓶，每瓶接种4个茎段。
．诱导培养
培养接种后放入培养室内，温度（24±2）℃，每天光照 16 h，光照强度 2 000 lx。定期观察记录污染情况，每两周换一次培养基，30 d 后统计无污染的诱导率。待萌发展叶后，继代培养，30 d 后调查增殖及生长情况。
．生根培养
芽苗长到 2~3 cm 时，选取生长健壮的芽苗接种于生根培养基中诱导生根，每个处理 10 瓶，每瓶接种2个芽苗，30d 后调查组培苗生根率。
观察统计生长结果
由表1可以看出诱导培养基中最佳激素浓度是AD 0.8 mg/L，由表2可以看出继代培养基最佳激素浓度是6-BA 0.5 mg/L + KT 0.5 mg/L，由表3可以看出生根培养最佳的激素浓度是IBA 2 mg/L。
表1 不同激素浓度对芽苗的诱导的影响
| 处理号 | 激素AD浓度（mg/L） | 诱导率（%） |
| 1 | 0.5 | 70.2 |
| 2 | 0.8 | 86.8 |
| 3 | 1.0 | 65.6 |
表2 不同激素浓度对芽苗增殖的影响
表3 不同激素种类和浓度对芽苗生根的影响
Claims (1)
1.一种甜薯茎段离体快速繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取甜薯生长三个月之后成熟植株顶端幼嫩茎段3-5cm，用自来水冲洗干净，剪掉开展的叶片，用无菌水漂洗3-5次，然后再用75%乙醇消毒10-15s，再放0.1%HgCl2溶液中消毒5-6min，消毒后，用无菌水冲洗4-5次；
（2）将步骤（1）中消毒后的茎段切成长1cm带有一个茎节且切除接触升汞的伤口及叶片的单节茎段；
（3）将步骤（2）中的单节茎段接入已经灭菌的MS培养基，并加入30g/L的蔗糖、10g/L琼脂、0.8mg/L的AD、0.01%的PVP进行诱导出芽，其培养条件为：温度（24±2）℃，每天光照16h，光照强度2000lx；
（4）将步骤（3）中的芽苗转入增殖培养基进行继代培养，所述增殖培养基为1/2MS培养基，并加入30g/L的蔗糖、10g/L的琼脂、0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的KT、0.01%的PVP，其培养条件为：温度（24±2）℃，每天光照16h，光照强度2000lx；
（5）将步骤（4）中增殖生长的芽苗长到2-3cm无根幼苗时，选取生长健壮的芽苗接种于生根培养基中诱导生根，每个处理10瓶，每瓶接种2个芽苗，所述生根培养基为1/2MS培养基，并加入30g/L的蔗糖、10g/L的琼脂、2mg/L的IBA、0.01%的PVP，其培养条件为：温度（24±2）℃，每天光照16h，光照强度2000lx。
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Granted publication date: 20170922 Termination date: 20180328 |
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