CN104818234A - 一株具有耐镉特性的链霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对现有技术是微生物对污染土壤的适应性较差，与植物的兼容性较低，微生物存活率低，筛选出了一种耐镉细菌，以及针对污染土壤修复方法，属于重金属污染治理技术领域。该菌种对污染土壤的适应性较强，能较好的与植物生长共生，存活率高。该菌种自身富集重金属镉能力强，对污染土壤修复能力强，减少镉污染对环境的破坏。

Description

一株具有耐镉特性的链霉菌及其应用

所属技术领域

本发明涉及一株具有耐镉特性的链霉菌以及针对重金属污染环境进行修复的方法，属于重金属污染治理技术领域。

背景技术

镉是毒性最强的重金属元素之一，危害极其严重。土壤中过量的镉会抑制植物的正常生长，在可食部分的残留还会通过食物链影响到人体健康。近年来，镉污染事件频发，广东北江、广西龙江、湖南株洲、湖南浏阳以及日本镉污染大米等事件令人触目惊心。对镉污染土壤的治理也引起了国内外的广泛关注。

采用工程、物理和化学方法修复镉污染土壤具有一定的局限性，难以大规模处理，并且会导致土壤结构破坏，生物活性下降和土壤肥力退化。农业生态措施其周期太长，效果也不显著。目前，对于重金属污染土壤的修复主要有物理修复、化学修复及生物修复3种途径。传统的物理技术主要有离子交换法、吸附法等，这些方法对小面积污染土壤具有较好的效果，但容易造成二次污染，破坏土壤的结构和肥力，而且成本较高；化学修复技术有化学沉淀法、电化学还原法、氧化还原法等，这些技术虽然简单易行、见效快，但并没有从根本上去除土壤中重金属，只是改变了其存在的形态，容易再次活化，而且化学药剂对生态环境具有一定的破坏作用。

生物修复是利用微生物或植物的生命代谢活动，对土壤中的重金属进行富集或提取。生物修复技术主要包括植物修复和微生物修复。植物修复是指用植物吸收土壤中的重金属，最终达到清除土壤中重金属的一类技术总称，植物修复法具有成本低、绿色净化、不破坏土壤生态环境、无需进行二次处理等优点，是未来修复技术的主要发展方向。用来进行修复的植物可以包括高等植物界的一切植物，如野生的草、威以及栽培的树木、草皮和作物等。其中，有一类植物的重金属吸收量明显超过其他普通植物，即超富集植物。青葙子(Celosia argentea L.)是一种对重金属对镉具有一定富集能力的植物，自然条件下其植物体内的镉含量可以达到50mg/kg以上，其生长迅速、种子易于萌发并具有一定的观赏性，是一种良好的土壤重金属修复植物资源。

然而，植物修复也具有一定的缺陷，例如：重金属富集植物通常生物量低，生长比较慢；对金属有选择性，不适合多种重金属复合污染的治理；植物对重金属的吸收能力往往受到土壤环境和气候条件的限制；此外污染物可能通过落叶重新回到土壤中。这些都限制了植物修复技术在重金属污染土壤治理方面的应用。为了，研究人员考虑采用多种方式来弥补其不足之处。

近几年，采用重金属抗性微生物来提升植物对重金属的吸收能力逐渐成为国内外研究的热点，微生物强化植物对重金属的吸收，其原理主要基于以下两个方面：一是促进植物营养吸收，增强植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修复能力。如菌根真菌可以溶解转运土壤中的无机矿物元素；根瘤菌进行生物固氮等促进植物营养吸收；根部多种微生物的存在所形成的稳定根部微环境，增强了植物抗逆性等，这些都直接或间接地增加了植物的生物量，提高了植物修复能力。二是增加植物根部重金属浓度，促进重金属的吸收或固定。微生物不仅通过其自身的组成成分如菌根外菌丝、几丁质、色素类物质，EPS等吸附重金属，而且通过其分泌的各种有机酸或特殊物质来活化重金属，增加其在植物根部浓度。通过某些植物体内存在的对特定重金属具有转运作用的蛋白，将富集在植物根都的重金属转运到植物体内；或使土壤中重金属吸附于根际，降低其流动性，从而减少其进入食物链的可能，并且在移除植物体时降低土壤中重金属的浓度，借此达到植物吸收和固定的目的。因此，采用根际接种耐镉微生物的方式，促进青葙子对镉的吸收能力，强化其土壤修复效果是一种可行的方式，具有极大的开发潜力。

公开号为CN103551379A的中国专利公开了一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，涉及微生物生态修复技术。本方法是：①将耐镉真菌分离纯化；②将耐镉真菌鉴定；③确定耐镉真菌最适生长条件；④耐镉真菌修复基质制备；⑤修复镉污染土壤。本发明利用镉污染地区优势植物的根际土壤作为耐镉微生物筛选的来源，克服了筛选出的耐镉微生物对修复地土壤环境的适应性问题；应用既有一定能力耐镉性，又与耐镉真菌有兼容性的狗牙根，克服了植物-微生物间的排斥作用；将耐镉真菌接种到锯末中进行施用，确保了微生物生长的养分供应，有效利用了废弃物；成本低廉、操作简便，微生物生长迅速，可大规模繁殖。

公开号为CN103350105A的中国专利公开了一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法，首先在镉污染土壤中种植镉富集植物，然后在镉富集植物根际土壤接种耐镉细菌，常规培养，浇水、保湿，利用镉富集植物对镉的吸收作用和耐镉细菌的强化作用联合富集土壤中镉，重复上述过程可达到修复镉污染土壤的目的。本发明土壤修复方法效果好、费用低，易于管理与操作，不会产生二次污染，具有广泛的应用前景。

公开号为CN103952333A的中国专利公开了一种重金属镉耐性细菌及其抑制作物吸收重金属镉的方法，属于农业和环境污染治理技术领域。所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)TCd-1，已于2013年12月11日在武汉大学中国典型培养物保藏中心登记保藏，菌种保藏号为CCTCC M2013649。菌株TCd-1经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌，对多种重金属具有耐性，对镉、铅和镍的耐性浓度分别达到900mg·L-1、800mg·L-1和600mg·L-1。菌液有效活菌数约为1.85～1.87×109个/毫升。在重金属镉污染的湿润土壤中添加该菌液，每千克土壤添加菌液2mL，能修复镉对水稻生长的抑制作用，并有效降低水稻各部位，特别是糙米的镉含量。

公开号为CN101955925A的中国专利公开了一种基于基因组改组技术进行真核和原核微生物原生质体多亲本融合的方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是：首先对微生物进行人工诱变，经筛选获得对镉具有高效抗镉性能的突变微生物；接下来以具有高效抗镉性能的突变微生物为出发菌株，采用细胞原生质体多亲本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融合，获得具有较好性状抗镉的菌株。采用本发明建立的细胞原生质体多亲本融合方法，对抗镉的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌进行改造，获得2株抗镉性能比原有的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌大幅度提高的优良融合菌株。

公开号为CN102513340A的中国专利公开了一种修复重金属镉污染土壤的方法，其特征在于，所述方法采用修复重金属镉的植物为耐镉品种烟草K326，采用的土壤螯合诱导剂为壳聚糖的盐酸溶液，活化土壤中的重金属镉的微生物为本实验室富集筛选分离到的一株菌株，三者共同作用，对重金属镉污染土壤修复；其过程为：栽培品种K326育苗，培养至三叶一心期后进行移栽；移栽植物前进行壳聚糖的填加；移栽植物前对分离筛选纯化后的菌株进行大量发酵培养，在土壤中加入处于长对数期的重金属镉的活化菌株拌土备用；烟草品种移栽后定期管理即可。本方法采用植物与微生物联合修复方法，并且在土壤中加入一定量的活化重金属的微生物，共同作用，提高修复效率，从而提高重金属污染土壤的修复效率。

从以上资料表明，微生物修复具有下列优点：不破坏植物生长的土壤环境；不会形成二次污染或导致污染物的转移；可最大限度地原地降解污染物；费用低廉；操作简便，有效避免操作人员受污染物直接影响；高效，修复时间短，对周围环境干扰少。目前，微生物在修复重金属污染土壤中也存在下列不足之处：微生物对污染土壤的适应性较差；微生物与植物的兼容性较低；微生物存活率低。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用耐镉放线菌在镉污染环境中进行生态修复的方法。

本发明所述的重金属镉耐性放线菌为链霉菌(Streptomyces sp.)CdTB01菌株，于2014年12月23日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10234。

发明内容之一.从湖南省湘西凤凰县，古丈县，泸溪县3个地区的混合土壤样品中分离得到耐镉能力强的放线菌，经形态、生理生化和分子鉴定，确定为链霉菌(Streptomyces sp.)。该菌株在不同培养基上具有不同的培养特征。在大多数培养基上不产可溶性色素，无气生菌丝，基内菌丝多呈黄白色。主要生物学特性为：产H₂S，水解淀粉为阳性；明胶液化，水解纤维素，牛奶凝固与液化呈阴性。CdTB01菌株能较好的利用蔗糖、葡萄糖、果糖和D-甘露糖，不能利用***糖。

本发明所涉及到的培养基为：LB固体培养基的成份为蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，琼脂12g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。分离培养基的成份分别为1mmol/L CdCl₂(氯化镉)、5mmol/L CdCl₂、10mmol/LCdCl₂、20mmol/L CdCl₂、30mmol/L CdCl₂、40mmol/L CdCl₂、50mmol/L CdCl₂、55mmol/L CdCl₂、60mmol/L CdCl₂的LB固体培养基，121℃灭菌20min。活化培养基采用PDA(蔗糖)培养基，其成分为去皮土豆200g，蔗糖20g，水1000ml，pH自然，115℃灭菌30min。

其中，所述的链霉菌的筛选过程：从湖南省湘西凤凰县，古丈县，泸溪县3个地区的混合土壤样品，采用分离培养基进行筛选，筛选到多个菌株，通过镉耐能力为主要指标进行选择，得到镉耐较高的菌株，经16S rDNA基因序列测定结果见SEQ ID No：3。选育菌种的培养特征、显微特征、rRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为链霉菌(Streptomyces sp.)。

发明内容之二.提供所述链霉菌(Streptomyces sp.)CdTB01菌剂的制备及其在镉污染环境中的应用。

本发明第二个发明目的是链霉菌在镉污染环境中用于快速富集镉的用途。

其中所述的用途包括：用链霉菌发酵剂(固态制剂)拌料(镉污染土壤)处理工艺以及链霉菌菌剂直接处理镉污染废水工艺。

在一个具体实施方案中，使用上述的链霉菌发酵剂(固体粉剂)加入适量无菌水稀释，通过喷雾接种镉污染土壤的处理工艺。可快速发酵富集重金属镉，与传统处理工艺比较，可以缩短处理周期一半以上，同时减少了镉污染重新污染机会，保证镉污染修复的成功率。此外，还可以将制备好的链霉菌菌剂加入含镉废水中充分搅拌吸附，已达到快速去除水体中重金属镉。

其中，用链霉菌发酵液拌料(镉污染土壤)修复处理工艺：采用链霉菌发酵剂(固体粉剂)，每克含微生物数量1×10¹⁰cfu以上，先用无菌水将粉剂稀释，喷雾接种在镉污染土壤表面上，接种后进行直接修复处理，用量是每亩镉污染土壤用链霉菌粉剂0.5kg～2.5kg。

链霉菌菌剂修复镉污染水体处理工艺：将链霉菌菌剂加入镉污染废水中，通过搅拌使其与废水中的镉离子充分接触并吸附于菌剂表面，从而实现镉污染废水的净化处理。

附图说明

图1：链霉菌(Streptomyces sp.)CdTB01在含镉培养基生长后产生的透明圈。1和2分别为含CdCl₂和Cd(NO₃)₂的培养基。

图2：链霉菌(Streptomyces sp.)CdTB01的显微观察结果图。

技术效果

1、该菌种对污染土壤的适应性较强，能较好的与植物生长共生，存活率高。

2、该菌种自身富集重金属镉能力强，对污染土壤修复能力强，对污染废水中镉去除能力强，减少镉污染对环境的破坏。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：菌株CdTB01的筛选

取湖南省湘西凤凰县、古丈县和泸溪县3个地区的混合土壤样品10g于三角瓶内，加入100mL无菌水，室温下振荡30min，静止10min后取0.1mL的上清液稀释至10^-5分别涂布于含1-60mmol/L CdCl₂固体分离培养平板上，30℃恒温培养，从中筛选出具有不同程度耐镉效果的菌株共11株。进一步通过多次重复验证筛选获得一株能耐受55mmol/L的CdCl₂或Cd(NO₃)₂的菌株，该菌株在含有Cd的培养基上生长后能够使菌的周围产生透明圈，说明该菌株可能具有吸附Cd的作用。并且该菌株还能耐受2mmol/L的Pb(NO₃)₂和3mmol/L的NiCl₂。

实施例2：菌株鉴定

一、形态和生化鉴定

1、形态为链霉菌，在光学显微镜下观察CdTB01的菌丝分支多而且浓密，有孢子形成见图2。

2、菌株CdTB01的培养特征如下：

      

      

3、根据《常见细菌***鉴定手册》所述方法对菌株CdTB01的部分生理生化指标和碳源利用情况进行研究，结果如下：

      

注：+为利用，++为利用较好，-为不利用。

二、分子鉴定

1、设计并选择合适引物

根据放线菌的16S rDNA基因序列，设计PCR引物，分别为：

      

SEQ ID No：1	5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3(SEQ ID No：1)
		SEQ ID No：2	5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3(SEQ ID No：2)

相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。

2、通用引物扩增

对链霉菌的DNA，使用ABI 9700型PCR仪，进行生物学实验操作。

(1)PCR的反应体系为：

      

PCR反应缓冲液(10x PCR Buffer with 20mM MgCl2)	2.5μL
		dNTP mix(25mM each)	1μL
高保真Taq酶(PCR Enzyme，5U/μL)	1μL
		SEQ ID No：1(1μM)	1μL
SEQ ID No：2(1μM)	1μL
		放线菌DNA	1μL
超纯水	17.5μL

以上试剂，除放线菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。

(2)PCR的循环参数为：95℃，4分钟，1个循环，95℃，20秒，56℃，30秒，72℃，60秒，45个循环，72℃，3分钟，1个循环，4℃，保存。

3、PCR扩增产物经生工生物工程(上海)有限公司进行测序，获得链霉菌CdTB01的16S rDNA测序结果：见SEQ ID No：3。

实施例3：菌株CdTB01的镉吸收特性

配制含4mmol/L CdCl₂的LB液体培养基(LB液体培养基的成份为蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。)，每瓶装400mL，121℃灭菌20min。接种1mL的CdTB01菌液，30℃，200rpm条件下进行摇床培养3天后，取100mL发酵液后，8000rpm离心10min后，得上清液，消化后采用原子吸收光谱仪测定其镉含量为216mg/L，使镉含量从448mg/L下降到了216mg/L，去除率达到50％以上。

实施例4：菌株CdTB01对镉胁迫下植物生长的修复作用

取15cm的水稻苗，均匀植入含5mg·L^-1氯化镉的土壤(用20L营养钵盆栽)，每个钵中植入4株水稻苗，以植入未添加氯化镉处理的土壤为对照，设置添加500ml蒸馏水、500ml CdTB01菌液两种处理，每个处理重复3次。各处理分别置于25℃的温室中光照培养。每天定量补充水分，20d后测定水稻生物量。结果表明，添加CdTB01菌液处理含镉土壤的水稻生物量与不含镉土壤的水稻生物量非常相近，与添加500ml蒸馏水处理含镉土壤的水稻生物量相比，添加CdTB01菌液处理的水稻株高增加了25.6％、鲜重增加了42.7％，整个水稻植株含镉量下降了50％，修复效果非常显著。

实施例5：菌株CdTB01菌剂的镉吸附效果

取200mL生长稳定期CdTB01菌液，常温下8000rpm，离心10分钟收集菌体，于105℃烘干碾磨成干菌粉。分别配制含镉浓度为100mg/L、500mg/L、900mg/L、1300mg/L、1700mg/L的生理盐水，称取0.1g干菌粉处理含镉生理盐水1h后，8000rpm离心10min，得上清液，消化后采用原子吸收光谱仪测定其镉含量，测定结果如下：

      

初始溶液含镉浓度(mg/L)	处理后上清含镉浓度(mg/L)	CdTB01干菌粉吸附率
			100	2.69	97.31％
500	11.70	97.66％
			900	25.32	97.19％
1300	65.27	96.16％
			1700	68.44	94.74％

CdTB01干菌粉吸附率随着溶液中镉浓度增大而减小，但在含镉浓度较高的环境中，吸附率依然能保持在94％以上，表明该菌对于修复镉污染废水有着明显的效果。

SEQ ID No：3的序列：

5’-GGAGAACTAGTATAGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTGGTTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCAGTCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCACGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGCGCCCATCTCTGGACGTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGTATCGACTGCAGACCCGAGGTTAAGCCTCGGGCTTTCACAATCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTTAACCCTCGCAGATGCCTGCGAGAGTGTTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCACCGAAGTGGTTCATCGTTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCTAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGGCACCTAATGCAGGCCC-3’。

Claims (8)

1.本发明提供一种包含链霉菌(Streptomyces sp.)的分离筛选鉴定，其中所述菌株已于2014年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.10234。

2.根据权利要求1的方法，链霉菌还包括：该菌培养基质及该菌代谢产物。

3.根据权利要求1的方法，链霉菌在镉污染环境中用于快速富集镉的用途。

4.根据权利要求3的方法，其中所述链霉菌用途包括：用链霉菌固态发酵制剂拌镉污染土壤的处理工艺,用链霉菌菌剂处理含镉废水的工艺。

5.根据权利要求4的方法，其中所述链霉菌应用包括：微生物扩大培养机制；镉污染修复土壤管理；含镉废水修复处理；产品开发管理及质量控制。

6.根据权利要求5的方法，其中所述链霉菌固体发酵粉剂加入适量无菌水稀释，通过喷雾接种镉污染土壤的处理工艺；以及采用链霉菌固体发酵粉剂直接处理镉污染废水的修复工艺。

7.根据权利要求6的方法，其中所述链霉菌发酵液拌镉污染土壤修复处理工艺：采用链霉菌固体发酵粉剂，每克含微生物数量1×10¹⁰cfu以上，先用无菌水将粉剂稀释，喷雾接种在镉污染土壤表面上，接种后进行直接修复处理，用量是每亩镉污染土壤用链霉菌粉剂0.5kg～2.5kg。

8.根据权利要求6的方法，采用链霉菌固体发酵粉剂直接处理镉污染废水的修复工艺：将链霉菌固体发酵粉剂，每克含微生物数量1×10¹⁰cfu以上，加入镉污染废水中，通过搅拌使其与废水中的镉离子充分接触并吸附于菌剂表面，从而实现镉污染废水的净化处理。用量是每吨镉污染废水用链霉菌粉剂1kg～2.5kg。