CN105170627A - 一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～20天后待植物发芽生长，向黑麦草根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用黑麦草对镉的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的镉；其中，所述的微生物复合菌剂为蜡状芽孢杆菌(Bacillus？cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)和希瓦氏菌(Shewanella)按湿菌重量比1～10∶1∶1混合制成。本发明方法操作方便、费用低、易于管理、不产生二次污染，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境修复技术领域，涉及微生物菌剂与植物联合修复镉污染土壤的方法。
背景技术
近几年来，无论在中国还是在世界范围内，控制和减轻重金属对环境的污染和危害已成为一个焦点问题。相较于水污染与空气污染，土壤重金属污染具有不可见性和隐蔽性。截至2010年，在中国超过2000万公顷的农田被镉、铬、锌、铅等重金属所污染，大约占到我国耕地总面积的1/5。每年，中国由于重金属污染所损失的粮食量达到了1000万吨。2013年4月爆发了太湖流域的“镉米”事件。据江苏省地调院发布通稿称，由于“太湖边上一乡镇企业聚集地”多家企业将排污口对准厂外河道，导致一条河中的河泥镉含量超过1500毫克/千克，而该河灌溉的稻田中土壤镉含量平均为2.5毫克/千克，该地稻米镉含量一般大于0.5毫克/千克。目前食品安全国家标准《食品中污染物限量》规定，大米的镉含量不得高于0.2毫克/千克，国际通行标准则是不得高于0.4毫克/千克。大于0.5毫克/千克的稻米镉含量无疑同时超过了国内与国际标准。因此，严重危害人体健康。
目前，国内外用来修复土壤重金属的方法主要有物理法、化学法以及生物法。物理法有热解吸法、电化学法和提取法等技术对土壤重会属污染进行治理。其中在实践中常用的工程措施主要包括换土、客土和深耕翻土等措施。但是工程量大，成本高，存在对污土的二次处理问题。化学法常通过添加外来物质，以改变土壤的化学性质，从而改变重金属形态及其生物有效性等，最终抑制或降低作物对重金属的吸收。但其只是改变了重金属的形态，并没有从根本上去除土壤中的重金属，而且添加的化学试剂也可能对生态环境造成二次污染。
生物修复是利用生物技术治理污染土壤的一种新方法，利用生物削减净化土壤中的重金属或降低重金属毒性。生物修复包括植物修复技术和微生物修复技术，目前已成为当前环境保护工程科学和技术研究的一个新热点。而植物修复技术具有绿色、节能、成本低，可原位直接处理等的优点，而受到人们的广泛关注。但用于重金属污染土壤修复的植物(超富集植物)一般生长缓慢，生物量低，限制了其在实际中的应用。而一些微生物可通过其代谢活动，使土壤中固定的重金属活化为可溶解态，或者是促进植物营养吸收，从而提高植物对于重金属的吸收。但目前微生物与植物联合应用的案例还少，多数还是采用单一的微生物，这样往往受环境的变化影响强烈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足和缺陷，提供一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法。通过在镉污染土壤中种植富集植物黑麦草，并在其根际接种微生物菌剂，通过利用微生物菌剂以增强黑麦草对于土壤中镉的吸附能力，实现土壤重金属镉污染的高效、快速安全修复。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～20天后待植物发芽生长，向黑麦草根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用黑麦草对镉的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的镉；其中，所述的微生物复合菌剂为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和希瓦氏菌(Shewanella)按湿菌重量比1～10：1：1混合制成。
其中，黑麦草种子的播种量为2～4g/m2，优选3g/m2。
其中，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子后，上部覆土1cm。
其中，黑麦草在镉污染土壤中的适宜温度为15～38℃，定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60～80％。
其中，优选的是，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，14天后待植物发芽生长，向黑麦草根系土壤中添加微生物复合菌剂。
其中，所述的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)从电镀污泥中筛选得到，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015509，保藏日为2015年9月6日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
其中，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为ATCC23857。
其中，所述的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
其中，所述的微生物复合菌剂优选为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和希瓦氏菌(Shewanella)按湿菌重量比5：1：1混合制成。
其中，三种菌配置在磷酸缓冲溶液中形成微生物复合菌剂，所述的磷酸缓冲液优选50mM、PH7的磷酸缓冲溶液；所述菌体的总浓度为30～50×108cfu。
其中，微生物复合菌剂的在土壤中的用量为0.3～1L/m2，优选0.6L/m2。
其中，所述的镉污染土壤中，镉含量为25～50mg/Kg。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的微生物复合菌剂，其基本组分为复合菌群，比单一菌株对土壤环境的适应能力强，各中组分微生物协同作用，能更好的提高黑麦草对镉的吸收能力，增强富含镉污染土壤的去除效果。
2)采用本发明提供的微生物复合菌剂和黑麦草修复方法，修复效果好、费用低、易于管理、不产生二次污染，具有广泛的应用前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为***发育树。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的黑麦草为市售草种。
以下实施例所用的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2015509，保藏日为2015年9月6日。
以下实施例所用的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为ATCC23857。
以下实施例所用的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
实施例1：蜡状芽胞杆菌JYJ的筛选、鉴定及生物学特征分析
1)土壤样品来源：南京某电镀污泥厂活性污泥
2)菌种筛选：取1g活性污泥加到10ml的液体LB培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。)中富集培养，培养条件37℃180r/min，培养24h；取1ml富集培养液分别接种于含100mg/L镉的新鲜液体培养基,37℃、180r/min培养；待液体选择培养基混浊后，从中取1ml培养液接种于含100mg/L金属离子的液体培养基中，逐级类推提高金属离子浓度。然后用接种环取最高耐受浓度培养液划线接种于含100mg/L镉离子的固体平板上,37℃培养24h。根据平板菌落形态分别挑取单菌落再接种至镉离子选择培养基进行验证，循环三次，以获得金属耐受能力较好的纯菌株。
3)菌种鉴定：
16sRNA序列分析法：PCR扩增采用细菌16sRNA通用引物：
27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
PCR反应体系(2.5μL)：5×扩增缓冲液(5μL)、基因组DNA(0.1μL)、dNTP(2μL)、引物F(0.5μL)、引物R(0.5μL)、TaqDNA聚合酶(0.25μL)、去离子水(16.65μL)。反应条件：98℃预变性10min，98℃变形10s，58℃退火10s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃充分延伸10min。PCR产物直接用于碱基序列测定(如SEQIDNo.：1所示)，然后利用NCBI网站的BLAST进行碱基序列的比对，并构建***发育树(图1)，确定菌株的***分类。***发育树结果表明，筛选得到的JYJ和Bacilluscereus的亲缘关系最近,其同源性达到99％，其生理生化实验中，菌落表面呈毛玻璃状，产芽孢，革兰氏阳性，无荚膜，运动，综合鉴定为蜡状芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015509。
实施例2：
一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子，播种量为2～4g/m2，上部覆土1cm。黑麦草在镉污染土壤中的适宜温度为15～38℃，定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60～80％，10～20天后待植物发芽生长，向黑麦草根系土壤中添加微生物复合菌剂，微生物复合菌剂的在土壤中的用量为0.3～1L/m2，利用黑麦草对镉的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的镉；其中，所述的微生物复合菌剂为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)(CCTCCNO:M2015509)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC23857和希瓦氏菌(Shewanella)ATCC700550按湿菌重量比1～10：1：1混合制成。
实施例3：黑麦草与微生物菌剂不同组合工艺对土壤中镉的富集能力
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成50mg/kg的镉污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的80％，自然平衡一周后，在盆中撒入黑麦草种子，播种量为2g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后10d，开始进行各处理组的实验，其中有微生物菌剂的实验组其加量0.4L/m2。
其中，
第1组为只有黑麦草，不添加任何微生物。
第2组为黑麦草+蜡状芽胞杆菌0.4L/m2。
第3组为黑麦草+枯草芽胞杆菌0.4L/m2。
第4组为黑麦草+希瓦氏菌0.4L/m2。
第5组为黑麦草+蜡状芽胞杆菌+枯草芽胞杆菌(湿菌重量比5:1，湿菌总量共0.4L/m2)。
第6组为黑麦草+蜡状芽胞杆菌+希瓦氏菌(湿菌重量比5:1，湿菌总量共0.4L/m2)。
第7组为黑麦草+枯草芽胞杆菌+希瓦氏菌(湿菌重量比1:1，湿菌总量共0.4L/m2)。
第8组黑麦草+蜡状芽胞杆菌+枯草芽胞杆菌+希瓦氏菌(湿菌重量比5:1:1，湿菌总量共0.4L/m2)。
各处理组，在植物生长的第86d收获，将植物沿着土壤表面剪下，分成地下和地上两部分，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，粉碎装入样品袋。植物样品，通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表1植物生物量以及植物对于镉富集能力的情况
如表1所示，添加微生物的情况下，对黑麦草的生长和富集重金属镉都起到促进作用。在添加单一的蜡状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、希瓦氏菌处理组黑麦草地下部分的镉含量分别增加了26％、25％和16.8％，而地上部分镉含量分别增加了20％、3.3％和6.6％。同时添加两种微生物的情况下，黑麦草富集镉的能力增强，第5,6,7处理组黑麦草地下部分镉含量分别增加了分别为62.6％、55.3％和70.3％，而地上部分镉含量分别增加了23.7％、23.8％和34.5％。同时添加三种微生物的情况下，黑麦草富集镉的能力进一步增强，黑麦草地下部分镉含量分别增加了179％，地上部分镉含量分别增加了150％。
实施例4：微生物菌剂-黑麦草对土壤中镉的富集能力。
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成25mg/kg的镉污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的60％，自然平衡一周后，在盆中撒入黑麦草种子，播种量为4g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后20d，接种0.8L/m2微生物菌液，其中蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)JYJ，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，ATCC23857)，希瓦氏菌(ShewanellaMR-1，ATCC700550)的重量比为8:1:1。同时设定一个对照组，其只加入黑麦草种子，而不加入微生物菌剂。在植物生长的第86d收获，将植物沿着土壤表面剪下，分成地下和地上两部分，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，粉碎装入样品袋，通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表2植物生物量以及植物对于镉富集能力的情况
如表2所示，在25mg/kg浓度的镉污染条件下，接种微生物菌剂对黑麦草的生长发育起到促进作用，其中地下和地上部分的鲜重比对照组高出41.1％和10％。其次，接种微生物菌剂对黑麦草富集土壤中镉的能力加强，其中地下和地上部分的镉含量比对照组高出111％和52％。
实施例5：微生物菌剂-黑麦草对土壤中镉的富集能力。
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成50mg/kg的镉污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的70％，自然平衡一周后，在盆中撒入黑麦草种子，播种量为3g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后14d，，接种0.6L/m2微生物菌液，其中蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)JYJ，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，ATCC23857)，希瓦氏菌(ShewanellaMR-1，ATCC700550)的重量比为5:1:1。同时设定一个对照组，其只加入黑麦草种子，而不加入微生物菌剂。在植物生长的第86d收获，将植物沿着土壤表面剪下，分成地下和地上两部分，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，粉碎装入样品袋。通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表3植物生物量以及植物对于镉富集能力的情况
如表3所示，在50mg/kg浓度的镉污染条件下，接种微生物菌剂对黑麦草的生长发育起到促进作用，其中地下和地上部分的鲜重比对照组高出114％和62％。其次，接种微生物菌剂对黑麦草富集土壤中镉的能力加强，其中地下和地上部分的镉含量比对照组高出227％和135％。
Claims (10)
1.一种微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～20天后待植物发芽生长，向黑麦草根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用黑麦草对镉的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的镉；其中，所述的微生物复合菌剂为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和希瓦氏菌(Shewanella)按湿菌重量比1～10：1：1混合制成。
2.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，黑麦草种子的播种量为2～4g/m2。
3.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，向含镉土壤中均匀撒入黑麦草种子后，上部覆土1cm。
4.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，黑麦草在镉污染土壤中的适宜温度为15～38℃，定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60～80％。
5.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015509，保藏日为2015年9月6日。
6.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为ATCC23857。
7.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
8.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，三种菌配置在磷酸缓冲溶液中形成微生物复合菌剂，菌体的总浓度为30～50×108cfu。
9.根据权利要求8所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，微生物复合菌剂的在土壤中的用量为0.3～1L/m2。
10.根据权利要求1所述的微生物-植物联合修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述的镉污染土壤中，镉含量为25～50mg/Kg。
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