CN104707864B

CN104707864B - 强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂及其制备方法

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Publication number: CN104707864B
Application number: CN201510095228.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋常德; 朱达; 田培根
Original assignee: Beijing Juyichengguang Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Juyichengguang Technology Co., Ltd.
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: CN104707864A

Abstract

本发明提供了一种用于强化植物修复土壤重金属污染的复合光合菌制剂及其制备方法。采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌种经种子活化培养，种子培养，厌氧发酵罐光照培养等培养步骤，得到桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌的高浓度复合光合菌制剂，该复合光合菌制剂可以用于强化植物修复土壤重金属污染，桃红荚硫菌作为硫氧化细菌，能氧化比较稳定的重金属的硫化物，促进土壤硫循环，降低土壤PH，提高重金属在土壤中的活性，桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌作为菌肥，能够促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进植物生长，提高富集重金属植物的生物量，从而强化植物修复土壤重金属的效率。

Description

强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明是属于一种功能性微生物制剂与农业和环境污染治理技术领域，具体的说是涉及到一种用于强化植物修复土壤重金属污染的复合光合菌制剂及其制备方法。

背景技术

由于重金属在土壤中难降解、难迁移、危害期长，土壤重金属污染已成为国内外普遍关注的环境问题之一，世界各国对重金属污染及其治理给予了高度重视。但常用的化学和物理化学修复方法一般投资昂贵、设备复杂且易导致土壤结构破坏；而植物提取修复技术则因为超积累植物通常矮小、生长缓慢、生物量低，对固定的相的铅、镉无法吸收富集等缺点而限制了在实际生产中的应用。

生物修复是利用微生物或植物的生命代谢活动，对土壤中的重金属进行富集或提取。生物修复技术主要包括植物修复和微生物修复。植物修复是指用植物吸收土壤中的重金属，最终达到清除土壤中重金属的一类技术总称，植物修复法具有成本低，绿色净化、不破坏土壤生态环境、无需进行二次处理等优点，是未来修复技术的主要发展方向。用来进行植物修复的植物可以包括高等植物界的一切植物，如草、树木、作物等。其中，有一类植物的重金属吸收明显超过其他普通植物，即超富集植物。

植物修复也具有一定的缺陷，例如：重金属富集植物通常生物量低，生长比较慢；对金属有先择性，不适合多种重金属复合污染的治理；植物对重金属的吸收能力往往受到土壤环境和气候条件的限制；此外污染物可能通过落叶重新回到土壤中。提高重金属的有效性，从而提高修复效率是解决这一个问题的关键，这些都限制了植物修复技术在重金属污染土壤治理方面的应用。为了，研究人员考虑采用多种方式来弥补其不足之处。近几年，采用重金属抗性微生物来提升植物对重金属的吸收能力逐渐成为国内外研究的热点，微生物强化植物对重金属的吸收，其原理主要基于以下两个方面：一是促进植物营养吸收，增强植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修复能力。如菌根真菌可以溶解转运土壤中的无机矿物元素；根瘤菌进行生物固氮等促进植物营养吸收；根部多种微生物的存在所形成的稳定根部微环境，增强了植物抗逆性等，这些都直接或间接地增加了植物的生物量，提高了植物修复能力。二是增加植物根部重金属浓度，促进重金属的吸收或固定。微生物不仅通过其自己身的组成成分如菌根外菌丝、几丁质、色素类物质，EPS等吸附重金属，而通过其分泌的各种有机酸或特殊物质来活化重金属，增加其在植物根部浓度。通过某些植物体内存在的对特定重金属具有转运作用的蛋白，将富集在植物根部的重金属转运到植物体内；或使土壤中重金属吸附于根际，降低其流动性，从而减少其进入食物链的可能，并且在移除植物体时降低土壤中重金属的浓度，借此达到植物吸收和固定的目的。因此，采用根际接种耐镉微生物的方式，促进植物对镉的吸收能力，强化其土壤修复效果是一种可能行的方式，具有极大的开发潜力。

桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌单个细胞外通常有一层粘的荚膜，为多糖物质，能够耐受较高浓度的重金属离子；桃红荚硫菌是一种硫氧化细菌，可通过直接作用和间接作用两种方式对重金属活性产生影响：通过其分泌的胞外多聚物直接吸附在金属硫化物(MS)表面，通过细胞内特有的氧化酶***直接氧化金属硫化物，生成可溶性的硫酸盐：硫与还原硫化物被微生物氧化为硫酸，降低溶液pH值，改变重金属的有效性。

桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌属于光合细菌的一种，作为菌肥，桃红荚硫菌与荚膜红假单日胞菌能促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进作物生长。如四川大学的冯甦对紫硫细菌中的桃红荚硫菌在农业上的应用进行了研究，他认为桃红荚硫菌对青菜生长发育有明显的促进作用，也可明显提高青菜的品质。但要投入实际运用，首要要解决的问题是，该菌的生长速度缓慢，一般要培养两周以后才会有明显的生长趋势，培养20-40天才能做为菌剂使用，且OD650的值不高于1，活菌含量低于1亿/毫升，较长的生长周期不利于大规模的应用。而到目前为止，还未见有关桃红荚硫菌制备方法技术方案公开。也未见有关桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌混合发酵的技术方案公开，也未有其强化植物修复土壤重金属的技术方案进行公开。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌混合培养，菌体生长速度快，菌体含量高，培养时间短，菌肥活性高、稳定性高、具有强化植物修复土壤重金属的复合光合细菌制剂及其制备方法。该复合光合菌制剂可以用于强化植物修复土壤重金属污染，桃红荚硫菌作为硫氧化细菌，能氧化比较稳定的重金属的硫化物，促进土壤硫循环，降低土壤PH，提高重金属在土壤中的活性，桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌作为菌肥，能够促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进作物生长，提高富集重金属植物的生物量，从而强化植物修复土壤重金属的效率。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌按以下步骤进行培养：

、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中，25-30℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；

、荚膜红假单胞菌平板活化：将荚膜红假单胞菌菌种在平板上划线活化，温度25-35℃活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子；

、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿个/毫升即为种子培养液；

、荚膜红假单胞菌种子培养：将挑取大个荚膜红假单胞菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养3-5天，检测种子的OD660≥2，活菌数≥15亿个/毫升即为种子培养液；

、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：3-1：5的接种量接种，同时将荚膜红假单胞菌种子培养液与发酵培养基按1：10-1：20的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加100 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1-2 g/L，培养5-7天，待检测其OD650≥6，活菌数≥50亿个/毫升，其中桃红荚硫菌不低于25亿/毫升，荚膜红假单胞菌不低于20亿/毫升，即可放罐，灌装，包装成品。

其中，所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5 g/L,果糖2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0.5-4g/L, 121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌

其中，所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5 g/L, 果糖2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，氯化钠0.5-4g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

其中，所述的荚膜红假单胞菌种子液体培养基为: 硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5 g/L,果糖1-3g/L，氯化钠1-2g/L,生物素0.1-0.5mg/L ,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

其中，所述的荚膜红假单胞菌平板固体培养基为种子液体培养基加入20 g/L的琼脂形成的。

其中，所述的发酵培养基：硫酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.12g/L，硫酸镁0.2g/L，醋酸钠4 g/L，果糖6g/L，生物素0.3mg/L , 氯化钠1g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2。

所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂的使用方法为：利用500倍光合菌制剂稀释液浸泡即将播种在含有重金属的土壤的植物种子30分钟，待种子发芽后，每隔30天灌根一次，每次用量为5L光合菌制剂/亩；在每次灌根后的第15天，利用1000倍光合菌制剂稀释液叶面喷施一次，每次用量为2L光合菌制剂/亩。

本复合光合制剂中含有的桃红荚硫菌：细胞球形，直径1.2-3微米，一般为1.5微米，单个细胞通常被一层粘的荚膜包住，常见有双球形聚合体，四联体和不规则的堆，它们通常被粘液层所包围。厌氧的光能自养菌：有果糖、甘油或有机酸时所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗条件下生长。光合电子供体：硫化物，硫代硫酸盐，硫和分子氢。可光合同化醋酸盐、果糖、延胡索酸盐、甘油、苹果酸盐、丙酮酸和琥珀酸盐。大多数菌株具有同化型硫酸盐还原作用。桃红荚硫菌也有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH5-9，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。

本复合光合菌肥含有荚膜红假单胞菌，光能异养，兼性好氧，能生长在有光厌氧或黑暗微好氧到好氧。PH：5.5-8.5，在20-35℃生长良好。光同化的有机底物：脂肪酸到壬酸盐、一些三羧酸循环的中间产物、果糖、葡萄糖和一些氨基酸。分子氢是生长的最好的电子供体。荚膜红假单胞菌具有较强的固氮能力，能提高土壤氮素水平，通过其代谢活动能有效地提高土壤中某些有机成分。同时能促进有益微生物的增殖, 使共同参与土壤生态的物质循环。此外, 荚膜红假单胞菌产生的丰富的生理活性物质如脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶、维生素、辅酶Q、类胡萝卜素，胞外多糖等都能被植物直接吸收, 有助于改善作物营养, 激活植物细胞的活性, 促进根系发育, 提高光合作用和生殖生长能力。

本发明的紫硫光合细菌--桃红荚硫菌与紫色非硫光合细菌—荚膜红假单胞菌是从全国各地300多处池塘底泥，河涌底泥，猪粪水处理池，污水处理厂，光合细菌样品，垃圾处理滤池，重金属污染地中分离得到的1000多株光合细菌中筛选出来的，桃红荚硫菌对硫化物降解效率明显，可快速促进硫元素在土壤的物质流动，并且具有较明显的固氮，促进植物生长的作用。荚膜红假单胞菌具有较强固氮能力，且能够与该桃红荚硫菌共生共存，互相促进生长。本桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌经过两年多的耐重金属的驯化试验，本桃红荚硫菌其对多种重金属具有抗性，分别为As²⁺200mg/L，Cd²⁺250mg/L，Pb²⁺1200mg/L，Cu²⁺800mg/L，Zn²⁺1000mg/L，Ni⁺400mg/L，Cr⁶⁺100mg/L，本桃红荚硫菌（Thiocapsa roseopersicina）由本人保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），编号为CGMCCNO.10344。保藏日期为2015年1月12日。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该荚膜红假单胞菌对各重金属的抗性稍差一些，分别为：As²⁺80mg/L，Cd²⁺50mg/L，Pb²⁺200mg/L，Cu²⁺200mg/L, Zn²⁺400mg/L，Ni⁺200mg/L，Cr⁶⁺100mg/L。

该复合光合细菌制剂的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了40多种光合细菌培养基成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，优化后培养总菌数超过50亿/毫升，桃红荚硫菌的浓度超过25亿/毫升，荚膜红假单胞菌超过20亿/毫升，远远高于现有桃红荚硫菌的培养浓度。

采用上述技术方案的有益效果：本发明桃红荚硫菌种子培养基采用的半固体含硫化钠的培养基，能尽快使期形成无氧环境，从而能够快速促进桃红荚硫菌的生长，而发酵培养基中用硫代硫酸钠代替硫化钠，并以流加的方式加入，以减少光合菌液中的硫代硫酸钠对荚膜红假单胞菌的抑制作用。将两种菌种接入发酵培养基的后，前期由于荚膜红假单胞菌的前期延滞期短，在生物素等营养物质的刺激下快速繁殖，经过两至三天的生长，菌含量已经达到较高浓度，而桃红荚硫菌经过两至三天的延滞期，在荚膜红假单胞菌的某些产物的刺激下，特别是流加入硫代硫酸钠后，桃红荚硫菌也在后期快速繁殖起来。从而可达到两种菌体浓度较高的复合型的光合菌制剂。这两种菌都能在微好氧到好氧的条件下进行生长与存活，可作为叶面喷施与根灌施用都可。

本复合光合细菌制剂通过灌根施入含重金属的土壤后，本复合光合细菌制剂中桃红荚硫菌可通过直接作用和间接作用两种方式对重金属活性产生影响：通过其分泌的胞外多聚物直接吸附在金属硫化物(MS)表面，通过细胞内特有的氧化酶***直接氧化金属硫化物，生成可溶性的硫酸盐：硫与还原硫化物被微生物氧化为硫酸，降低溶液pH值，增强了重金属在土壤中的活性及其有效性。

同时通过灌根施入含重金属的土壤和叶面喷施超富集重金属植物，作为菌肥，桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌能促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进超富集重金属植物生长。两种菌都具固氮能力，能提高土壤氮素水平，通过其代谢活动能有效地提高土壤中某些有机成分、氨态氮，并促进有害污染物(如农药、化肥) 的转化。同时能促进有益微生物的增殖, 使共同参与土壤生态的物质循环。此外，荚膜红假单胞菌产生的丰富的生理活性物质如脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶、维生素、辅酶Q、类胡萝卜素，胞外多糖等都能被植物直接吸收，有助于改善作物营养，激活植物细胞的活性，促进根系发育，提高光合作用和生殖生长能力。光合细菌制剂发酵液中含有多种生理活性物质，如叶绿素Ａ、Ｂ，类胡萝卜素，多种维生素(尤其是Ｂ族维生素)，多种植物激素(如IAA、GA3、ABA、乙烯、细胞***素)、核酸、水杨酸、多种氨基酸以及单细胞蛋白质等。这些生理活性物质具有或促进超富集重金属植物根系生长、或促进植株叶片生长、或增加超富集重金属植物产量、或增强超富集重金属植物对重金属的耐受力。这样本复合光合菌制剂从而能显著强化超富集重金属植物对土壤重金属的降解作用。

下面结合试验说明本发明复合光合菌制剂强化植物修复土壤重金属污染的效果

一、本复合光合细菌——二月兰强化修复重金属的盆栽试验效果

1、试验方法：将Cd污染土壤（50mg/Kg）及Pb污染土壤（500mg/Kg）装入塑料盆中，每盆1公斤，加入蒸馏水使土壤含水是为田间持水量的60%左右，平衡一周。将利用500倍稀释的光合菌制剂的稀释液将二月兰种子浸泡30分钟，播种，每盆15粒，以浸泡光合菌制剂培养基液体为对照，每组三个重复，植物生长至一周后间苗，每盆保留6株。每隔30天灌根施一次光合菌1000倍稀释液，灌根后第15天叶面喷施光合菌1000倍稀释液，对照组以未接种的光合细菌培养基液进行喷施。植物生长的整个周期在人工气候室内完成，温度控制在20-25℃，每天光照10h，相对湿度控制在65-75%之间，浇水以保持土壤持水量为60%左右。二月兰在生长至150天收获，分别测其叶片株高、生物量、植物各部分重金属含量；

2、试验结果

从下表1可以明显的看到，二月兰吸收土壤铅（500mg/kg）时，喷施了光合菌制剂的试验组二月兰的地上株重与地下根重明显比对照高40.6%与50.1%，而试验组的二月兰根部和地上部对Pb的含量也比对照组增加147.5%和5.2%。从下表2可以明显的看到，二月兰吸收土壤镉(50mg/kg)，喷施了光合菌制剂的试验组二月兰的地上株重与地下根重明显比对照高32.8%与33.7%，而试验组的二月兰根部和地上部对Cd的含量也比对照组增加126.5%和10.2%。

表1 光合菌制剂强化二月兰吸收土壤铅（500mg/kg）的影响

表2 光合菌制剂强化二月兰吸收土壤镉(50mg/kg)的影响

项目	地上株重	地下株根重	地上含Cd量	根中Cd含量	富集系数	转运系数
							对照组	2.62	0.616	35.4	55.2	0.708	0.641
试验组	3.48	0.824	80.2	60.8	1.604	1.319
							提高率	32.8%	33.7%	126.5%	10.2%

二、本复合光合细菌—油菜强化修复重金属的盆栽试验效果

1、试验方法：将Cd污染土壤（10mg/Kg）及Pb污染土壤（500mg/Kg）装入塑料盆中，每盆1公斤，加入蒸馏水使土壤含水是为田间持水量的60%左右，平衡一周。将利用500倍稀释的光合菌制剂的稀释液将油菜种子浸泡30分钟，播种，每盆5粒，以浸泡光合菌制剂培养基液体为对照，每组三个重复。每隔30天灌根施一次光合菌1000倍稀释液，灌根后第15天叶面喷施光合菌1000倍稀释液，对照组以未接种的光合细菌培养基液进行喷施。植物生长的整个周期在人工气候室内完成，温度控制在20-30℃，每天光照10h，相对湿度控制在65-75%之间，浇水以保持土壤持水量为60%左右。油菜在生长至60天收获，分别测其地上部和根部干重，检测植物各部分重金属含量；

2、试验结果：从下表3可以明显的看到，油菜吸收土壤铅（500mg/kg）时，喷施了光合菌制剂的试验组油菜的地上株重与地下根重明显比对照高40.66%与21.8%，而试验组的油菜根部和地上部对Pb的含量也比对照组增加95.9%和26.4%。从下表4可以明显的看到，油菜吸收土壤镉(10mg/kg)，喷施了光合菌制剂的试验组油菜的地上株重与地下根重明显比对照高41.1%与15.09%，而试验组的油菜根部和地上部对Cd的含量也比对照组增加144%和31.7%。在重金属铅和镉污染土壤修复中，施用光合菌制剂，提高油菜的生物量以及明显强化了油菜富集重金属的效率。

表3 光合菌制剂强油菜吸收土壤铅（500mg/kg）的影响

表4 光合菌制剂强化油菜吸收土壤镉(10mg/kg)的影响

项目	地上株重	地下株根重	地上含Cd量	根中Cd含量	富集系数	转运系数
							对照组	4.72	0.106	5.4	8.2	0.54	0.658
试验组	6.66	0.122	13.2	10.8	1.32	1.22
							提高率	41.1%	15.09%	144%	31.7%

具体实施方式

本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

实施例1

强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂的制备方法，采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌按以下步骤进行培养：

、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中， 30℃光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种；

、荚膜红假单胞菌平板活化：将荚膜红假单胞菌菌种在平板上划线活化，温度30℃活化培养4天，挑取大个菌落作为活化种子；

、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为：2000lux，光照厌氧培养8天，检测种子的OD650为1.5，活菌数≥8亿个/毫升即为种子培养液；

、荚膜红假单胞菌种子培养：将挑取大个荚膜红假单胞菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度25-35℃，光照强度为：2000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为2，活菌数为15.2亿个/毫升即为种子培养液；

、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1:4的接种量接种，同时将荚膜红假单胞菌种子培养液与发酵培养基按1：15的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1.2 g/L，培养5天，待检测其OD650为6.5，活菌数≥55亿个/毫升，其中桃红荚硫菌为28亿/毫升，荚膜红假单胞菌为27亿/毫升，放罐，灌装，包装成品。

其中，所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L,果糖4g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，氯化钠2g/L, 121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

其中，所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1.2g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L, 果糖4g/L，九水硫化钠0.2g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

其中，所述的荚膜红假单胞菌种子液体培养基为: 硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L,果糖2g/L，氯化钠2g/L,生物素0.3mg/L,121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

其中，所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂的使用方法为：利用500倍光合菌制剂稀释液浸泡即将播种在含有重金属的土壤的植物种子30分钟，待种子发芽后，每隔30天灌根一次，每次用量为1mL光合菌制剂/Kg土；在每次灌根后的第15天，利用1000倍光合菌制剂稀释液叶面喷施一次。使用效果见合光合细菌—二月兰强化修复重金属的盆栽试验效果。

实施例2

、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中， 30℃光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌种菌种；

、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为：2000lux，光照厌氧培养8天，检测种子的OD650为1.3，活菌数≥7亿个/毫升即为种子培养液；

、荚膜红假单胞菌种子培养：将挑取大个荚膜红假单胞菌菌落作为活化种子接种到种子培养基中，温度30℃，光照强度为：2000lux，光照静置培养4天，检测种子的OD660为2.2，活菌数为16亿个/毫升即为种子培养液；

、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1:4的接种量接种，同时将荚膜红假单胞菌种子培养液与发酵培养基按1：18的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度30℃，光照强度为：3000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加300 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1.2 g/L，培养6天，待检测其OD650为6.8，活菌数≥60亿个/毫升，其中桃红荚硫菌为28亿/毫升，荚膜红假单胞菌为32亿/毫升，放罐，灌装，包装成品。

其中，所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1.4g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，醋酸钠4 g/L, 果糖4g/L，九水硫化钠0.2g/L，氯化钠2g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

其中，所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂的使用方法为：利用500倍光合菌制剂稀释液浸泡即将播种在含有重金属的土壤的植物种子30分钟，待种子发芽后，每隔30天灌根一次，每次用量为1.2mL光合菌制剂/Kg土；在每次灌根后的第15天，利用1000倍光合菌制剂稀释液叶面喷施一次。使用效果见合光合细菌—油菜强化修复重金属的盆栽试验效果。

Claims

1.强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于：

由紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌混合发酵制成；

采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌按以下步骤进行培养：

桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养基中，25-30℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌菌种；

荚膜红假单胞菌平板活化：将荚膜红假单胞菌菌种在荚膜红假单胞菌平板固体培养基上划线活化，温度25-35℃活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子；

桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿个/毫升即为种子培养液；

荚膜红假单胞菌种子培养：将挑取大个荚膜红假单胞菌菌落作为活化种子接种到荚膜红假单胞菌种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照静置培养3-5天，检测种子的OD660≥2，活菌数≥15亿个/毫升即为种子培养液；

发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以1：3-1：5的接种量接种，同时将荚膜红假单胞菌种子培养液与发酵培养基按1：10-1：20的接种量接入，在光照培养罐中厌氧培养，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加300g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1-2g/L，培养5-7天，待检测其OD650≥6，活菌数≥50亿个/毫升，其中桃红荚硫菌不低于25亿/毫升，荚膜红假单胞菌不低于20亿/毫升，即可放罐，灌装，包装成品。

2.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,果糖2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0.5-4g/L,121℃灭菌15分钟，用苹果酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

3.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,果糖2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，氯化钠0.5-4g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌。

4.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于所述的荚膜红假单胞菌种子液体培养基为:硫酸铵1-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,果糖1-3g/L，氯化钠1-2g/L,生物素0.1-0.5mg/L，121℃灭菌15分钟，用灭菌醋酸调PH至7.0-7.2。

5.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于所述的荚膜红假单胞菌平板固体培养基为荚膜红假单胞菌种子液体培养基加入20g/L的琼脂形成的。

6.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂，其特征在于所述的发酵培养基：硫酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.12g/L，硫酸镁0.2g/L，醋酸钠4g/L，果糖6g/L，生物素0.3mg/L,氯化钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2。

7.根据权利要求1所述的强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂的使用方法，其特征在于：利用500倍光合菌制剂稀释液浸泡即将播种在含有重金属的土壤的植物种子30分钟，待种子发芽后，每隔30天灌根一次，每次用量为0.5mL-2mL光合菌制剂/Kg土；在每次灌根后的第15天，利用1000倍光合菌制剂稀释液叶面喷施一次。