CN109868247B - 链霉菌tj138和产品及其制备方法与应用、降低作物中镉含量的方法及褪黑素的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及镉污染防治技术领域,具体而言,提供了一种链霉菌TJ138和产品及其制备方法与应用、降低作物中镉含量的方法及褪黑素的应用。本发明提供一种链霉菌TJ138及包含其的产品,该链霉菌为发明人筛选得到的菌株,应用于镉污染土壤的作物种植中,可以有效降低作物中的镉含量,从而避免作物的重金属污染,保证食品的安全。此外,该链霉菌还可以有效地提高作物的产量,增加农民的收入。
Description
技术领域
本发明涉及镉污染防治技术领域,具体而言,涉及一种链霉菌TJ138和产品及其制备方法与应用、降低作物中镉含量的方法及褪黑素的应用。
背景技术
水稻是我国第一大粮食作物,全国约有65%人口以稻米为主粮,稻米安全与人体健康密切相关。近些年,水稻主产区的大米镉污染事件屡见不鲜,为保障消费者健康,政府加大了农田镉污染整治力度。
目前治理农田重金属镉污染,主要采取的技术包括:(1)土壤原位钝化技术,该技术主要通过向土壤中添加一些吸附剂、土pH调控剂等物质将土壤中的镉固定起来,或者转化成化学性质不活泼的形态,达到阻止水稻对镉吸收目的。由于该类技术需要向土壤中添加外源物质,故存在给土壤带来二次污染的潜在风险。(2)植物修复技术,该技术通过在镉污染土壤中种植超富集植物从土壤吸收重金属镉,再将超富集植物移除达到修复污染土壤目的。但是超富集植物通常矮小,生物量低,生长缓慢,修复效率低,不易于机械化作业,而且超富集植物无害化处理难度大,容易造成二次污染。(3)微生物修复技术则是利用土壤中的微生物吸收镉。微生物在生长过程中往往能够分泌一定量的氨基酸、有机酸等物质,从而可实现对重金属的固定。目前能够有效用于镉污染处理的链霉菌种类较少,特别是可以帮助降低作物中镉含量的有效菌剂更是鲜有报道。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种链霉菌TJ138,以缓解现有技术中缺少一种可以显著降低作物中镉含量并且不会产生二次污染的微生物。
本发明的第二目的在于提供上述链霉菌TJ138的应用。
本发明的第三目的在于提供一种降低作物中镉含量的产品,该产品显著降低作物中镉含量的同时提高作物产量。
本发明的第四目的在于提供一种降低作物中镉含量的菌剂的制备方法,以缓解现有技术中该用途的菌剂制备过程繁琐,耗时长的问题。
本发明的第五目的在于提供一种降低作物中镉含量的方法,以缓解现有技术中缺少一种有效快速低成本降低作物中镉含量的方法。
本发明的第六目的在于提供褪黑素在微生物发酵过程中的应用。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种链霉菌TJ138,其保藏编号为CGMCC No.17250。
上述链霉菌TJ138在如下A)-C)任一项中的应用
A)降低作物中镉含量;
B)制备降低作物中镉含量的产品;
C)提高作物产量。
进一步地,所述作物包括水稻、小麦、油菜或空心菜。
一种提高作物产量的产品,所述产品包括链霉菌TJ138;
优选地,所述产品为固体菌剂;
优选地,所述产品中链霉菌TJ138的孢子数大于106个/g。
一种降低作物中镉含量的产品,所述产品包括链霉菌TJ138;
优选地,所述产品为固体菌剂;
优选地,所述产品中链霉菌TJ138的孢子数大于106个/g。
一种降低作物中镉含量的菌剂的制备方法,利用固体发酵,将链霉菌TJ138发酵至孢子数大于106个/g,得到所述菌剂。
进一步地,固体发酵过程中添加有褪黑素;
优选地,所述褪黑素的浓度为0.1-1mg/L,优选为0.4-0.6mg/L;
优选地,将1.0L添加有0.4-0.6mg/L褪黑素的种子液与1kg固体发酵培养基混合均匀,26-30℃固体发酵制备获得菌剂。
进一步地,固体发酵所用培养基包括:4500-5500g/L玉米芯粉、25-35g/L葡萄糖、20-30g/L蛋白胨、40-50g/L豆粕粉和25-35g/L酵母粉。
进一步地,固体发酵所用种子液中链霉菌TJ138的孢子浓度为1.0×108个/ml-2.0×108个/ml。
一种降低作物中镉含量的方法,将上述产品或制备方法制备得到的菌剂,按照施用量30-70kg/亩撒施到地表,翻入地下后种植作物。
褪黑素在微生物发酵中的应用,所述褪黑素用于提高微生物的产孢率;
优选地,所述微生物包括链霉菌,进一步优选为链霉菌TJ138。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供一种链霉菌TJ138,该链霉菌为发明人筛选得到的菌株,应用于镉污染土壤的作物种植中,可以有效降低作物中的镉含量,从而避免作物的重金属污染,保证食品的安全。此外,该链霉菌还可以有效地提高作物的产量,增加农民的收入。
本发明提供的降低作物中镉含量的产品和提高作物产量的产品均包括上述链霉菌TJ138,具有该链霉菌的作用优势,在降低作物中镉含量和提高作物产量上具有显著的成效。
本发明提供的降低作物中镉含量的菌剂的制备方法,该方法制备过程简单,耗时短,成本低,通过对孢子数进行控制来保证菌剂的质量和效果。
本发明提供的降低作物中镉含量的方法简便易操作,便于机械化操作,降低成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中菌株TJ138全细胞水解物氨基酸组分层析图;
图2为实施例2中菌株TJ138全细胞水解物糖组分层析图;
图3为实施例3室内浅盘固体发酵图;
图4为实施例4田间翻耕施用菌肥图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中,如果没有特别的说明,本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中,如果没有特别的说明,本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中,如果没有特别的说明,百分数(%)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中,如果没有特别的说明,所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中,除非有其他说明,数值范围“a~b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示,其中a和b都是实数。例如数值范围“6~22”表示本文中已经全部列出了“6~22”之间的全部实数,“6~22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式,可以分别为一个或多个下限,和一个或多个上限。
本发明中,除非另有说明,各个反应或操作步骤可以顺序进行,也可以不按照顺序进行。优选地,本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明中的链霉菌TJ138,于2019年02月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCCNo.17250,该菌株的分类名为环圈链霉菌,拉丁名:Streptomyces glebosus。
本发明提供的链霉菌TJ138,该链霉菌为发明人筛选得到的菌株,应用于镉污染土壤的作物种植中,可以有效降低作物中的镉含量,从而避免作物的重金属污染,保证食品的安全。此外,该链霉菌还可以有效地提高作物的产量,增加农民的收入。
本发明提供上述链霉菌TJ138在如下A)-C)任一项中的应用
A)降低作物中镉含量;
B)制备降低作物中镉含量的产品;
C)提高作物产量。
在一些优选地实施方式中,作物包括水稻、小麦、油菜或空心菜。
一种提高作物产量的产品或降低作物中镉含量的产品,包括链霉菌TJ138。上述两种产品由于包括上述链霉菌TJ138,具有该链霉菌的作用优势,在降低作物中镉含量和提高作物产量上具有显著的成效。
在一些优选地实施方式中,产品为固体菌剂。固体菌剂方便运输和使用,此外可以延长保质期。
在一些优选地实施方式中,产品中链霉菌TJ138的孢子数大于106个/g。孢子更易抵御不同环境的影响,产品中链霉菌TJ138的孢子数越多,产品最终生长的链霉菌数量才可能越多,达到降低作物中镉含量的目的。
一种降低作物中镉含量的菌剂的制备方法,利用固体发酵,将链霉菌TJ138发酵至孢子数大于106个/g,得到菌剂。该方法制备过程简单,耗时短,成本低,通过对孢子数进行控制来保证菌剂的质量和效果。
在一些优选地实施方式中,固体发酵过程中添加有褪黑素。褪黑素作为孢子诱导剂,在固体发酵过程中可以显著提高链霉菌TJ138的产孢率,提高菌剂的品质。
在一些优选地实施方式中,褪黑素的浓度为0.1-1mg/L,优选为0.4-0.6mg/L。
在一些优选地实施方式中,将1.0L添加有0.4-0.6mg/L褪黑素的种子液与1kg固体发酵培养基混合均匀,26-30℃固体发酵制备获得菌剂。
在一些优选地实施方式中,固体发酵所用培养基包括:4500-5500g/L玉米芯粉、25-35g/L葡萄糖、20-30g/L蛋白胨、40-50g/L豆粕粉和25-35g/L酵母粉。该培养基有利于链霉菌的发酵培养和孢子的产生。玉米芯粉典型但非限制性的为4500g/L、4700g/L、5000g/L、5200g/L或5500g/L;葡萄糖典型但非限制性的为25g/L、27g/L、30g/L、32g/L或35g/L;蛋白胨典型但非限制性的为20g/L、23g/L、25g/L、27g/L或30g/L;豆粕粉典型但非限制性的为40g/L、43g/L、45g/L、47g/L或50g/L;酵母粉典型但非限制性的为25g/L、27g/L、30g/L、32g/L或35g/L。
在优选地实施方式中,固体发酵所用种子液中链霉菌TJ138的孢子浓度为1.0×108个/ml-2.0×108个/ml。
在优选地实施方式中,在种子液中加入褪黑素,然后进行固体发酵。
种子液的一种制备方法如下:
将保藏于斜面试管中的菌株TJ138接种到种子固体培养基上,在生化培养箱中于28℃条件下倒置培养4天。刮取表面生长至白色的孢子并转移至装有无菌水的玻璃三角瓶中,在显微镜下计数孢子浓度,调节孢子浓度在1.0×108个/ml—2.0×108个/ml浓度范围内,得到种子液。
种子固体培养基包括:葡萄糖5.0g、蛋白胨3.2g、豆粕粉2.8g、酵母粉0.6g,20g琼脂粉,加入蒸馏水1.0L,PH=8.0-8.5。
一种降低作物中镉含量的方法,将上述降低作物中镉含量的产品或上述制备方法制备得到的菌剂,按照施用量30-70kg/亩撒施到地表,翻入地下后种植作物,其它条件均按照当地种植习惯进行种植和管理。该方法简便易操作,便于机械化操作,降低成本。
本发明最后提供褪黑素在微生物发酵中的应用。尤其是褪黑素用于提高微生物的产孢率方面的应用,优选地,微生物包括链霉菌,进一步优选为链霉菌TJ138。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1TJ138的筛选
(1)本菌株TJ138分离自江苏宿迁地区水稻田土壤。将采集到的田间土壤样品于100℃烘箱中烘干24小时,取出于常温下凉至室温后备用。
(2)菌株固体分离培养基制备方法:分别称取葡萄糖5g、淀粉5g、蛋白胨2.0g、酵母粉2.5g、硫酸铵3g、玉米浆3.0g,碳酸钙0.3g,琼脂粉20g,加入蒸馏水1.0L充分溶解,用0.1M的氢氧化钠调节pH=7.5-8.5之间,再加入20g琼脂粉,混合均匀后按照每瓶200ml的装液量分装于500ml的三角瓶中,于121℃下高温灭菌30min,待培养基于常温下冷却至50-60℃时,分别向每瓶培养基中加入浓度为1000mg/L的无菌制霉菌素水溶液1.0ml,混合均匀后,按照每皿15-20ml的加入量转入直径9cm无菌培养皿中,常温下冷却后制备得到菌株分离固体培养基。
(3)菌株分离过程:称取(1)中经过高温烘干并冷却至室温的土壤样品0.5g于15ml无菌试管中,加入10ml的无菌水,加盖后充分震荡10min,使土壤样品完全分散于无菌水中。静置30min后,吸取上清液0.2ml均匀涂布于(2)中制备好的固体菌株分离平板培养基表面。每个土壤浸提液样品涂布15-20个培养基平板。
(4)将步骤(3)中涂布好的平板培养基放置于28℃的生化培养箱中,培养10-15天,待培养基表面出现白色菌落后,用接种环挑取分离到的单菌落于新制备的分离培养基上。在生化培养箱中倒置培养5-7天,再次分离纯化一次即可获得TJ138的单菌落。
实施例2TJ138的试验验证
1.菌株TJ138细胞化学组份分析
菌株TJ138全细胞水解物氨基酸组分层析结果如图1所示,菌株TJ138全细胞水解物含有LL-DAP(LL-DAP为特征性氨基酸);菌株TJ138全细胞水解物糖组分层析结果如图2所示,菌株TJ138细胞水解物含有的糖组分为***糖、葡萄糖和半乳糖。
对菌株TJ138进行脂肪酸谱检测,结果如表1所示,菌株TJ138优势脂肪酸为:C15:0和iso-C15:0。
表1.菌株TJ138脂肪酸谱
实施例3降低作物中镉含量的产品/提高作物产量的产品
(1)固体培养基制备:分别称取葡萄糖5.0g、蛋白胨3.2g、豆粕粉2.8g、酵母粉0.6g,加入蒸馏水1.0L,用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH=8.0-8.5,加入20g琼脂粉,混匀后于121℃下高温灭菌30min。待培养基在室温下冷却至50℃左右时,在无菌条件下将培养基倒入直径9cm培养皿中于室温下冷却至凝固后备用。
(2)菌株培养:在无菌条件下,将保藏于斜面试管中的菌株TJ138接种到步骤(1)中制备好的固体培养基表面上,在生化培养箱中于28℃条件下倒置培养4天。
(3)孢子悬液制备:在无菌条件下,向步骤(2)中生长好的培养皿中加入10-15ml无菌水,用灭菌后的玻璃棒刮取表面生长至白色的孢子,并将刮取的孢子转移至装有2.0L无菌水的玻璃三角瓶中,在显微镜下计数孢子浓度,调节孢子浓度在1.0×108个/ml—2.0×108个/ml浓度范围内。
(4)孢子萌发诱导剂的制备:称取10mg的褪黑素,溶解于乙醇中,用乙醇定容至100mL,配置成浓度为100mg/L的褪黑素溶液。吸取适当体积,加入到步骤(3)中制备好的孢子悬液中混合均匀,制备成含有褪黑素浓度为0mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L和0.5mg/L的孢子悬液。
(5)接种固体发酵培养基:称取玉米芯粉5000g、葡萄糖30g、蛋白胨25g、豆粕粉45g、酵母粉30g,在121℃下高温灭菌30分钟。常温下冷却至室温,在无菌条件下将步骤(4)中制备的添加有诱导剂的孢子悬液1.0L加入到冷却后的固体培养基中,混合均匀。
(6)固体发酵:将步骤(5)中接种有链霉菌TJ138孢子的固体培养基装入到长40cm宽30cm深6cm的发酵盘中,装入体积约为发酵盘深度的一半高度。将发酵盘至于无菌室中,在26-30℃条件下发酵72小时,室内浅盘固体发酵如图3所示。
(7)孢子计数:待发酵结束后,称取1g步骤(6)中的发酵培养基,在显微镜下计数孢子,孢子数在106个/g以上时表明产品合格。不同褪黑素浓度发酵条件下的产品孢子数如下表所示:
从表中的数据可以看出,褪黑素的添加可以有效的提高链霉菌的产孢率,可以达到约50倍左右的增长。从0.1mg/L开始随着浓度的增加,孢子数显著增加,0.4和0.5mg/L的孢子数基本相同,在0.4和0.5mg/L时,产孢率较高。
实施例4稻田应用中稻米的产量
田间应用:试验用田块选用湖南省湘潭市湘潭农科所实验田块。水稻品种为黄花粘。在设施菜地种植番茄以前,按照0kg/亩、10kg/亩、20kg/亩、30kg/亩、40kg/亩和50kg/亩的施用量,将实施例3(褪黑素用量为0.5mg/L)发酵获得的产品均匀的撒施到地表,旋耕机或人工将菌剂翻入地下,田间翻耕施用菌肥如图4所示,其它条件均按照当地种植习惯进行种植和管理。统计不同施用量的试验组中水稻的产量,结果如下表所示:
施用量(kg/亩) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
稻米产量(kg) | 680 | 685 | 683 | 691 | 710 | 714 |
从表中结果可以看出,随着菌剂施用量的增加,稻米的产量也随之增加,增加了农民收入。
实施例5稻田应用中稻米的镉含量
利用实施例4中的试验,对不同施用量的试验组水稻中的镉含量进行检测,结果如下表所示:
施用量(kg/亩) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
稻米镉含量(mg/kg) | 0.69 | 0.63 | 0.58 | 0.52 | 0.47 | 0.46 |
镉降低率(%) | 0 | 8.70 | 15.94 | 24.64 | 31.88 | 33.33 |
从表中结果可以看出,本发明提供的链霉菌及菌剂确实可以显著的降低在镉污染的土壤中种植的作物中的镉含量,提供更多的安全保障。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (14)
1.一种环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138,其保藏编号为CGMCC No.17250。
2.权利要求1所述的环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138在如下A)-C)任一项中的应用;
A)降低作物中镉含量;
B)制备降低作物中镉含量的产品;
C)提高作物产量;
所述作物为水稻。
3.一种提高水稻产量或降低水稻中镉含量的产品,其特征在于,所述产品包括环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138,环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138保藏编号为CGMCC No.17250。
4.根据权利要求3所述的产品,其特征在于,所述产品为固体菌剂。
5.根据权利要求3或4所述的产品,其特征在于,所述产品中环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138的孢子数大于106个/g。
6.一种降低水稻中镉含量的菌剂的制备方法,其特征在于,利用固体发酵,将环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138发酵至孢子数大于106个/g,得到所述菌剂;
环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138保藏编号为CGMCC No.17250。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,固体发酵过程中添加有褪黑素。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述褪黑素的浓度为0.1-1mg/L。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,褪黑素的浓度为0.4-0.6 mg/L。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,将1.0L添加有0.4-0.6mg/L褪黑素的种子液与1kg固体发酵培养基混合均匀,26-30℃固体发酵制备获得菌剂。
11.根据权利要求6-10任一项所述的制备方法,其特征在于,固体发酵所用培养基包括:4500-5500g/L玉米芯粉、25-35g/L葡萄糖、20-30g/L蛋白胨、40-50g/L豆粕粉和25-35g/L酵母粉。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,固体发酵所用种子液中环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138的孢子浓度为1.0×108个/ml-2.0×108个/ml。
13.一种降低水稻中镉含量的方法,其特征在于,将权利要求4-6任一项所述的产品或权利要求6-12任一项所述制备方法制备得到的菌剂,按照施用量30-70kg/亩撒施到地表,翻入地下后种植水稻。
14.褪黑素在提高环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138的产孢率中的应用;
环圈链霉菌(Streptomyces glebosus)TJ138保藏编号为CGMCC No.17250;
所述褪黑素的浓度为0.2-0.5mg/L。
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外源褪黑素处理对镉胁迫下水稻种子萌发的影响;刘仕翔 等;《农业环境科学学报》;20160630;第35卷(第6期);第1034-1041页 * |
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