CN104818227B - 一种表面锚定人i型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用 - Google Patents

一种表面锚定人i型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备方法和应用，步骤如下：(1)通过重叠PCR将cA基因与hMT基因拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA‑hMT基因；(2)将重组cA‑hMT基因和表达载体进行连接，得到的连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞；(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达重组融合蛋白，收获菌体超声破碎后离心，上清液直接与食品级乳酸乳球菌孵育，融合蛋白无需纯化则锚定至乳酸乳球菌表面。本发明方法制备的这种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸菌，能够富集重金属，制备方法具有高效、安全无毒性、成本低、不需蛋白纯化等优点。

Description

一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌及制备 方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域的基因重组表达技术领域，具体涉及一种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法及应用。
背景技术
金属硫蛋白(Metallothionein,MT)具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，广泛分布于动物、植物和微生物中，是一类富含半胱氨酸、低分子量(6000～7000道尔顿)、具有较强结合金属离子能力的蛋白质(Vasak M.Advances in metallothioneinstructure and functions.J Trace Elem Med Biol,2005,l19:13–17.)。MT具有结合重金属、清除自由基、抗辐射、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要生理功能(Yang F etal.High-yield expression in Escherichia coli of soluble human MT2A withnative functions.Protein Expr Purif,2007,53:186–194.)。目前，MT已成为医学、生物化学、分子生物学以及环境保护等科研领域的热门研究课题。同时由于MT高效的重金属解毒功能与安全性，已被广泛应用于医疗、化妆品、保健品及环保等生产领域。
利用重金属诱导动物可获得可溶性MT，但产量低且提纯步骤复杂繁琐，导致生产成本极高，限制了MT的应用。由于MT分子量小，半胱氨酸含量高，在原核体系中表达易形成包涵体，尚未见用大肠杆菌大量生产可溶性MT的报道(Butt TR et al.Ubiquitin fusionaugments the yield of cloned gene products in Escherichia coli.Proc Natl AcadSci USA,1989,86:2540-2544)。目前，均采用GST、Sumo等促溶标签重组表达MT蛋白(HuangY et al.Expression and purification of glutathione transferase-smallubiquitin-related modifier-metallothionein fusion protein and its neuronaland hepatic protection against D-Galactose-induced oxidative damage in mousemodel,JPET,2009,329:469–478.)。
乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一种人体内的益生菌，被广泛应用于奶制品生产，肉、蔬菜、面包的发酵等方面，因此被普遍认为是安全级微生物(Generally RecognizedAs Safe,GRAS；Gilliland SE.Health and nutritional benefits from lactic acidbacteria.FEMS MicrobiolRev.1990,7(1-2):175-188)。从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌尤其是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的生物学特性和分子机制进行研究。乳酸乳球菌作为表面展示外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，其自身分泌的蛋白质少，胞外蛋白酶的活性低，目的蛋白质的表达不会受到乳酸乳球菌自身蛋白质的影响；其次，抗原性弱，不会产生内毒素，进入人体不会引起强烈的免疫应答；最后，乳酸乳球菌不在胃肠道内定殖，可以避免因其长期定殖而导致的免疫耐受(冯金，乳酸乳球菌表面展示技术，生命的化学，2013,33(1):91-95)。因此乳酸乳球菌现已作为一种食品级表达宿主用于表达和表面展示各种抗原、生长因子以及功能蛋白(Ribeiro LA,et al.Productionand targeting of the Bmedhabortus antigen L7/L12in Lactococcuslactis:a firststep towards food-grade live vaccines against Brucellosis,Applied andEnvironmental Microbiology 2002,68(2):910-916)。但利用乳酸菌表达外源基因存在表达量低，重组乳酸菌会引入外源基因，使用抗生素作为筛选标记会引入抗性基因等一些不容忽视的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面锚定有人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法，首次在大肠杆菌中高效表达可以锚定在乳酸乳球菌表面的功能性人I型金属硫蛋白(hMT)，细菌破碎后不需经过纯化等繁琐的步骤即可将hMT锚定至食品级乳酸菌表面。
同时本发明提供一种锚定hMT后的乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌不携带任何抗性基因与外源基因，因此可安全地应用于食品、保健品和化妆品等行业。
为能简单高效地获得锚定有hMT的乳酸乳球菌，并使其能大规模应用，本发明技术方案如下：
一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌制备方法，包括如下步骤：
(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体：
通过重叠PCR将cA基因与hMT基因拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)将重组cA-hMT基因和表达载体pET21a连接，得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞；
(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达重组融合蛋白cA-hMT，收获菌体后超声破碎细胞，上清液直接和乳酸乳球菌孵育，融合蛋白cA-hMT无需纯化则锚定至菌体表面。
步骤(2)重组蛋白表达时为提高可溶蛋白表达量，还需加入分子伴侣，具体步骤如下：
将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。
所述分子伴侣为dnaK，dnaJ，grpE，groES和groEL中的一种或两种以上。
除湿菌体可直接锚定外，对所述乳酸乳球菌的湿菌体加醋酸(pH＝1)处理并煮沸30min，PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定，可显著提高重组融合蛋白锚定至乳酸菌的效率。
步骤(3)诱导工程菌表达重组融合蛋白cA-hMT的步骤如下：
a.将工程菌接种于含氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基，于37℃、180rpm振摇过夜，然后按1：100的比例接种于含有氨苄青霉素、氯霉素、L-***糖的液体LB培养基中，当OD达0.4～0.8时加入终浓度为0.5～1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm，低温继续培养12h后收集菌液，离心，去除上清液；
b.用PBS缓冲液洗涤步骤a所得菌体2次，用细菌裂解液重悬，置于冰浴下超声破碎，取超声后的匀浆物离心，分别收集上清液和包涵体。
步骤(3)将融合蛋白cA-hMT锚定到乳酸乳球菌表面的步骤如下：
将上清液与乳酸乳球菌重悬，室温静置1h，9000g离心2min弃上清，沉淀用PBS溶液洗涤3次，重悬至4℃保存。
步骤(3)所述乳酸乳球菌为乳球菌MG1363、MG1614、LM0230、粪肠球菌FA2-2、OGIX或植物乳杆菌。
所述乳酸乳球菌的培养步骤如下：
将乳酸乳球菌在GM17液体培养基中培养，30℃厌氧静置培养至对数生长期晚期或平台期，OD600nm达3～4，室温9000g离心5min，收集湿菌体。
上述方法制得的表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌可添加于食品、化妆品和环境保护领域，用于人体重金属解毒、修复重金属氧化损伤、金属离子代谢调节以及废水废气处理和环境修复。
将锚定有hMT的乳酸菌进行Cd2+、Pb2+吸附实验
按步骤3的锚定方式将hMT锚定至乳酸乳球菌后，加入1mL的Cd2+或Pb2+(100μM)重悬，室温放置2h，期间充分混匀，使蛋白充分吸附重金属。8000rpm离心1min，弃上清，菌体用PBS洗3次后放入65℃干燥箱干燥12h，得到的干菌体称重后，用60％的硝酸过夜彻底消化。加ddH2O稀释至5mL用于原子吸收光谱测定。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明利用分子伴侣(dnaK或dnaJ或grpE或groES或groEL)共表达体系在大肠杆菌中可融表达hMT重组蛋白，总表达量达176mg/L，其中可溶性重组蛋白达134mg/L，可溶性表达量远远超过文献报道含GST、SUMO融合标签的重组MT蛋白。
(2)对重组菌体进行超声破碎后离心，上清液即可直接与乳酸菌进行锚定，省去了重组蛋白分离纯化的繁琐步骤，降低了蛋白的损耗。
(3)破菌后的部分重组蛋白包涵体可用8M尿素溶解，经透析复性进行正确折叠，复性率高达82％，复性后的重组蛋白也可与乳酸菌进行锚定。
(4)本发明使用的锚定蛋白为乳酸乳球菌N-乙酰胞壁质酶的C端，可与革兰氏阳性菌的细胞壁进行特异性非共价结合，其锚定宿主菌可不局限于一种。
(5)锚定了hMT的乳酸菌是食品级微生物，既没有外源基因投放到环境的危害，也不携带任何抗性基因。
本发明所述的乳酸菌表面展示金属硫蛋白的制备方法具有高效、安全无毒性、成本低和不需纯化等优点，从而为金属硫蛋白乳酸菌的食品和化妆品的大规模制备及其应用奠定基础。
附图说明
图1 pET21a-cA-hMT重组质粒构建图；
图2重组质粒双酶切鉴定图；其中：泳道M:DNA Marker，泳道1：pET21a-cA-hMT重组质粒双酶切；
图3重组cA-hMT表达的SDS-PAGE鉴定；其中：泳道M：protein Marker，泳道1：未诱导全菌，泳道2：未诱导上清，泳道3：未诱导沉淀，泳道4：诱导全菌，泳道5：诱导上清，泳道6：诱导沉淀；
图4重组cA-hMT锚定至乳酸菌前后上清液中总蛋白SDS-PAGE电泳鉴定；其中：泳道M：protein Marker，泳道1：未锚定上清，泳道2：锚定后上清；
图5重组cA-hMT锚定至乳酸菌后ELISA检测；其中：1：表面锚定hMT的乳酸菌，2：hMT重组蛋白，3：乳酸菌4：PBS溶液；
图6重组cA-hMT锚定至乳酸菌后稳定性检测；
图7重组cA-hMT锚定至乳酸菌后对Cd2+(a)、Pb2+(b)吸附检测；其中：1：活性乳酸菌，2：表面锚定GFP的活性乳酸菌，3：表面锚定hMT的活性乳酸菌，4：酸处理后的乳酸菌，5：表面锚定GFP的酸处理乳酸菌，6：表面锚定hMT的酸处理乳酸菌。
具体实施方式
以下将参照附图和具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
重组cA-hMT蛋白工程菌的构建
通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，经NdeI和XhoI双酶切后与表达载体pET21a连接，即可实现重组质粒pET21a-cA-hMT的构建，其具体构建过程如图1所示。
1.目的基因片段、引物的设计与合成
根据乳酸乳球菌MG1363N-乙酰胞壁质酶基因序列(GenBank ID:CAL96887.1)，在其C端引入linker(SEQ ID No.3)，由此设计引物，其中正向引物为F1:
5’-AATTCCATATGGGATCCAATACTAATTCTGGTGGCTC-3’，含酶切位点NdeI(下划线标记部分)，反向引物为R1:
5’-TGAACAATTAGGATCCATCTGCAGACCACCACCTTTTATTCGTAGATACT-3’，含有linker序列(斜体部分为linker互补序列)。
根据人I型金属硫蛋白序列(SEQ ID No.2)，在其N端引入linker序列，由此设计引物，其中正向引物为F2:
5’-CAGTATCTACGAATAAAAGGTGGTGGTCTGCAGATGGATCCTAATTGTTC-3’，斜体部分为linker序列，反向引物为R2:
5’-CCACTCGAGAGCACAACAGGAACACT-3’，含有酶切位点XhoI(下划线标记部分)。
2.PCR扩增及重组质粒构建
以乳酸乳球菌MG1363基因组为模板，以F1、R1所示的核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增cA，其反应体系如下：
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到大小为713bp的包含酶切位点和linker序列的基因片段，对此片段切胶回收。
以pET28a-hMT为模板，以F2、R2所示的核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增hMT，其反应体系如下：
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到大小为225bp的包含酶切位点和linker序列的基因片段，对此片段切胶回收。
以cA、hMT为模板，以F1、R2所示的核苷酸序列为上、下游引物进行重叠PCR扩增cA-hMT，其反应体系如下：
PCR扩增程序如下：
所得重叠PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到大小为888bp的包含酶切位点和linker序列的基因片段，对此片段切胶回收。
上述所得重叠PCR产物用NdeI和XhoI于37℃双酶切5h,pET21a也用NdeI和XhoI于37℃双酶切3h。双酶切体系如下：
切胶回收双酶切产物，于16℃连接10h，连接体系如下：
所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。
3.重组质粒鉴定
方法：上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取9个单克隆扩大培养，并进行菌液PCR鉴定，PCR条件同步骤2，选取经菌液PCR鉴定为阳性的克隆提取质粒，NdeI和XhoI 37℃双酶切2h，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。选择相应的阳性克隆送样至华大基因进行测序鉴定。
结果：如图2所示，重组质粒双酶切后得到与pET21a大小一致的大片段和与cA-hMT基因大小一致的小片段，其双酶切图谱如图2所示，证明此克隆为阳性克隆。测序结果与预期核苷酸序列完全一致。
结论：pET21a-cA-hMT重组质粒成功构建。
实施例2
cA-hMT重组蛋白的表达及鉴定
方法：上述实施例1中的阳性克隆提取得到的质粒与含有分子伴侣(dnaK，dnaJ，grpE，groES和groEL)质粒转化至大肠杆菌表达菌株感受态细胞BL21(DE3)中，挑取经菌落PCR鉴定的阳性克隆接种至3mL含有100μg/mL Amp、25μg/mL氯霉素、1mg/mL L-***糖的LB液体培养基中37℃扩大培养，于OD600为0.5时加入0.5mM IPTG，低温诱导12h后离心收集菌体，超声裂解，上清和沉淀分别加入上样缓冲液沸水煮5min。浓缩胶80V，分离胶120V进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕用考马斯亮蓝染色液染色，脱色液脱色。
结果：如图3所示，重组cA-hMT蛋白成功得到诱导表达。重组cA-hMT在上清和沉淀中都有分布，其中可溶性重组cA-hMT蛋白占上清总蛋白的39.0％。
结论：cA-hMT重组蛋白表达成功。
实施例3
重组hMT融合蛋白锚定至乳酸菌及检测
1.乳酸乳球菌的培养及酸处理乳酸乳球菌的制备
方法：
取少量甘油冻存菌种划线至GM17平板固体培养基中，置于培养箱30℃静置培养24h。挑取单菌落接种于5mL GM17液体培养基中于30℃静置培养12h。取L.lactis MG1363过夜培养物，按1:100接种到500mL新鲜GM17培养基，30℃静置培养16h。离心收集菌体，用250mL无菌水洗涤一次，100mL的醋酸溶液(pH＝1)重悬菌体，并于沸水中煮沸30min。250mL无菌的PBS缓冲液洗涤3次，用50mL无菌的PBS缓冲液重悬菌体，置于4℃保存。
2.cA-hMT蛋白回向锚定至乳酸乳球菌
方法：取5mL过夜诱导的重组工程菌离心，弃培养上清，菌体用1mL PBS缓冲液重悬后于冰浴中超声破碎(功率10％，总时间7min，3s开5s关)，12000rpm离心10min，收集上清液，取少量上清加上样缓冲液沸水煮5min。取5mL经酸处理(或过夜培养)的乳酸乳球菌离心，弃上清，菌体用上述超声破碎后的上清液重悬，室温静置1h，9000rpm离心1min后取少量上清加上样缓冲液于沸水中煮沸5min，其他上清弃掉，菌体用PBS洗涤三次，4℃放置。
结果：如图4所示，加入乳酸菌后，重组hMT融合蛋白特异性锚定至乳酸菌，上清中cA-hMT的量明显减少。
结论：hMT融合蛋白能特异地锚定至乳酸菌。
3.ELISA检测锚定在乳酸菌表面的hMT
方法：将包被液稀释后的锚定了hMT的乳酸菌加入酶标板中，100μL每孔，4℃包板过夜。PBST洗板1次，洗板过程中PBST浸泡30-60s。用含3％BSA的PBST溶液37℃封闭2h。Anti-hMT单克隆抗体用PBST溶液稀释1000倍，按100μL每孔的量，双孔对照加入酶标板中，37℃孵育1h，洗板3次。加入5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min，洗板3次。加入TMB底物溶液100μL每孔，显色反应10min。2M硫酸50μL每孔，终止显色反应，酶标仪OD450读数。
结果：如图5所示。
结论：证实hMT融合蛋白能锚定在乳酸菌表面。
4.测定乳酸菌锚定hMT后的稳定性
方法：同步骤3，每24h测定一次，连续测定120h。
结果：如图6所示。
结论：hMT锚定至乳酸菌后稳定性较好，4℃下可稳定保存120h。
实施例4
重组hMT融合蛋白锚定至乳酸菌后对Cd2+、Pb2+的吸附能力检测
方法：实验组按实施例3的方式将hMT锚定至乳酸菌，平行做3组，加入1mL的Cd2+(100um)重悬，室温放置2h，期间充分混匀，使蛋白充分吸附重金属。8000rpm离心1min，弃上清，菌体用PBS洗3次后放入65℃干燥箱干燥12h，得到的干菌体称重后，用60％的硝酸消化过夜。彻底消化完后加ddH2O稀释至5mL用于原子吸收光谱测定。本实验共设6组，1组为没有锚定蛋白的活性乳酸菌，2组为锚定GFP(本课题组表达的cA-GFP重组蛋白)的活性乳酸菌，3组为锚定hMT的活性乳酸菌、4组为没有蛋白的酸处理乳酸菌、5组为锚定GFP的酸处理乳酸菌、6组为锚定hMT的酸处理乳酸菌。对Cd2+、Pb2+的吸附能力用nmol/mg干重菌体表示。吸附能力＝原子吸收测定的重金属浓度(mg/L)x5mLx10-6/Cd2+、或Pb2+的摩尔质量(112.41或207.2g/mol)/干重菌体(mg)x10-9。
结果：如图7(a)、7(b)所示。
结论：锚定了hMT的乳酸菌对Cd2+、Pb2+的吸附能力有显著提高。

Claims (10)

1.一种表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建含锚定单元的人I型金属硫蛋白的重组融合表达载体：
通过重叠PCR将cA基因与hMT基因进行拼接，两基因之间引入linker，N端引入促表达标签，得到重组cA-hMT基因；cA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)将重组cA-hMT基因连接至表达载体pET21a，再将得到的连接产物pET21a-cA-hMT转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经过鉴定得到工程菌；
(3)将步骤(2)得到的工程菌诱导表达融合蛋白cA-hMT，收获菌体后超声破碎，将上清液直接与乳酸乳球菌室温孵育，融合蛋白cA-hMT则锚定到乳酸乳球菌表面。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的重组表达还需加入分子伴侣，具体步骤如下：
将步骤(2)所述的连接产物pET21a-cA-hMT和含有分子伴侣的表达载体先后转化至大肠杆菌的表达菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣为dnaK，dnaJ，grpE，groES和groEL中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌还经如下预处理：将乳酸乳球菌湿菌体加醋酸处理并煮沸30min，PBS洗涤后再与重组融合蛋白cA-hMT进行锚定。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)工程菌诱导表达重组融合蛋白cA-hMT的步骤如下：
a.将工程菌接种于含氨苄青霉素和氯霉素的液体LB培养基，于37℃、180rpm振摇过夜，然后按1：100的比例接种于含有氨苄青霉素、氯霉素、L-***糖的液体LB培养基中，当OD达0.4～0.8时加入终浓度为0.5～1.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm、低温继续培养12h后收集菌液，离心得到菌体；
b.用PBS缓冲液洗涤步骤a所得菌体2次，用细菌裂解液重悬，置于冰浴下超声破碎，取超声后的匀浆物离心，分别收集上清液和包涵体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)将融合蛋白cA-hMT锚定到乳酸乳球菌表面的步骤如下：
将上清液直接与乳酸乳球菌重悬，室温静置1h，9000g离心2min弃上清，沉淀用PBS溶液洗涤3次，重悬至4℃保存。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述乳酸乳球菌为MG1363、MG1614、LM0230。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌的培养步骤如下：
将乳酸乳球菌在GM17液体培养基中培养，30℃厌氧静置培养至对数生长期晚期或平台期，OD600nm达3～4，室温9000g离心5min，收集湿菌体。
9.权利要求1～8任一项方法制得的表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌。
10.权利要求9所述表面锚定人I型金属硫蛋白的食品级乳酸乳球菌的应用，其特征在于，所述乳酸乳球菌用于人体重金属解毒、修复重金属氧化损伤、金属离子代谢调节以及废水废气处理和环境修复。
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