CN108588107A - 缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株 - Google Patents

缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株 Download PDF

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CN108588107A CN201810307288.5A CN201810307288A CN108588107A CN 108588107 A CN108588107 A CN 108588107A CN 201810307288 A CN201810307288 A CN 201810307288A CN 108588107 A CN108588107 A CN 108588107A
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Abstract

本发明公开了一种缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株，是以猪霍乱沙门菌C500株为载体，对其染色体进行基因改造，使猪霍乱沙门菌C500的asd基因缺失，构建猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株；同时将araC PBAD‑lacI序列置于缺失的asd基因阅读框中，使C500株在缺失asd基因的同时，引入araC PBAD‑lacI表达框，可在***糖存在时表达LacI蛋白；此外，构建了含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514‑EGFP，通过western blot实验检测LacI对Ptrc启动子的负调控作用；本发明提供一种全新的基于平衡‑致死***的调控表达外源抗原基因的C500菌株及表达质粒，为将来利用C500菌株表达外源抗原成分奠定基础。

Description

缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株。
背景技术
沙门氏菌病又名副伤寒，是由沙门氏菌属细菌引起动物疾病的总称，猪霍乱沙门菌是导致月龄仔猪副伤寒的主要病原之一，此病原菌可引起断奶仔猪大批发病，表现为不同的临床反应，包括败血症及其它组织的局部炎症、也可使怀孕母畜发生流产导致急性流行性爆发，其在养殖业中具有重要的地位。沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，能运动，不形成芽孢，兼性厌氧，具周身鞭毛。最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。沙门氏菌生命力顽强，对外界的抵抗力较强，对干燥腐败等因素有一定的抵抗力，在7~45℃都能繁殖，冷冻或冻干后仍存活。沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌，其减毒后具有良好旳侵袭能力，在体内生长缓慢，能够有效地持续刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。
C500株是由房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门菌通过醋酸陀体外传代培养的方式筛选出来的，其毒力弱、遗传稳定、免疫原性好，用其制成的仔猪副伤寒弱毒活疫苗，经田间试验和区域试验证明安全有效。有研究人员认为其有毒力返强的危险，研制更加安全并保持C500良好免疫原性的弱毒株，可以采用基因工程的方法对C500进行再减毒加工，更有利于将其开发为适于黏膜免疫的基因疫苗活载体。目前已有研究利用C500株为宿主菌表达外源抗原，在研制新型猪用口服疫苗开辟了新思路。
传统的细菌载体疫苗多利用抗生素筛选标记维持蛋白表达质粒在宿主菌中的稳定存在，随着绿色健康养殖概念的推广，抗生素筛选标记由于存在抗性漂移的风险，越来越不被接受。2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelicacid，DAP)是所有革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，Asd基因是DAP生物合成途径中必需的酶，该基因的缺失可导致该突变株在无外源DAP存在的条件下溶菌死亡。人和动物体内合成不了DAP，只有含有asd+质粒的细菌才能在无外源DAP的宿主内存活。基于这个原理构建的宿主菌-质粒共存表达***无需抗生素筛选压力，是一种新型的食品级表达***。CurtissIII等构建了asd基因缺失株，成功构建了平衡致死***，结果表明此突变株携带质粒并表达外源抗原能力增强。在国内，赵站勤等也对猪霍乱沙门菌株的生物学特性、毒力、生物安全性等进行了研究。徐引弟等构建了只缺失asd单基因的△asdC500株，并将增强型绿色荧光蛋白转化到△asdC500进行表达特性研究，结果显示其可以用来作为宿主载体平衡致死***来高效表达外源基因。
值得指出的是，以往的研究中外源抗原的表达不受调控，即抗原表达为组成型表达，这种长期表达的外源抗原对宿主菌造成了额外的代谢负担，一定程度上影响了宿主菌的稳定性，对最终的免疫效果起到负面作用。AraCPBAD启动子是一种受***糖调控的启动子，在***糖存在时可启动PBAD启动子后面基因的表达。将LacI基因置于PBAD启动子后面，当***糖存在时启动LacI的表达，进而抑制Ptrc启动子活性，达到抑制Ptrc启动子后抗原基因表达的目的。
发明内容
本发明目的是为解决外源抗原影响宿主菌稳定性、导致影响免疫效果的问题，而提供一种全新的基于平衡-致死***的调控表达外源抗原基因的C500菌株。
质粒pRE112-asd+araCPBAD-lacI，它的基因序列如序列表SEQIDNo.3所示。
缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株，其特征在于，它是由下述方法制备的：
将权利要求1所述的质粒pRE112-asd+araCPBAD-lacI转化大肠杆菌感受态细胞χ7232中；再用得到χ7232转化χ7213；χ7213再与猪霍乱沙门菌C500株共培养转化。
缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株的制备方法，它包括：
一、质粒pRE112-asd的构建：
1、提取猪霍乱沙门菌C500基因组DNA；
2、以C500基因组DNA为模板；用引物
Asd-F1：CGTCGTCCTACCTTCAGG
Asd-F2：GAGCTCGGTACCAGCCTGCAGTCTAGAGTAGTGGCTATTGCAGCGC
Asd-R1：TCTAGACTGCAGGCTGGTACCGAGCTCCCTGCAAAGAGATGTGCTGT
Asd-R2：GCATGGCAATCGCCCAACG
扩增C500基因组中asd上、下游片段；
3、1）asd上、下游片段用PrimeStar酶融合，获得asd上下游融合片段；
2）以步骤1）获得的融合片段为模板，用引物：
Asd-F1：CGTCGTCCTACCTTCAGG
Asd-R2：GCATGGCAATCGCCCAACG；
扩增asd上下游融合片段；
4、用AhdI单酶切asd上下游融合片段和载体pRE112后，连接，获得质粒pRE112-asd；
二、携带araCPBAD-lacI的***质粒的构建：
1、以含araCPBAD-lacI的pYA3879为模板，用引物：
araC-KpnI-F：ATAGGTACCTGATTACTGTCTGGGGTG
lacI-xbaI-R：TATTCTAGAGAATTCCCGGGAGAGCTC
扩增基因araCPBAD-lacI；
2、用KpnI、XbaI双酶切pRE112-asd和基因araCPBAD-lacI，连接，获得pRE112-asd+araCPBAD-lacI；
3、连接产物pRE112-asd+araCPBAD-lacI转化大肠杆菌感受态细胞χ7232；
4、χ7232转化χ7213；
三、缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株(C500Δasd：：araCPBAD-lacI)的同源重组构建：
1、挑取χ7213单个菌落接至5ml含有氯霉素和50ug/mlDAP的LB液体培养基中，猪霍乱沙门菌C500株接种至5mlLB液体培养基中，37℃摇菌过夜；
2、取摇菌后的χ7213菌液1ml，5000rpm离心5min，弃上清，加入500ul猪霍乱沙门菌C500菌液，混匀后置于含有50ug/mlDAP的LB固体培养基，37℃正置过夜；
3、挑菌，划线于含有25ug/ml氯霉素的XLD固体培养基，37℃培养过夜；
4、挑取单菌落，划单克隆于含有25ug/ml氯霉素的LB固体培养基，37℃过夜；
5、挑取3个克隆，分别接种1ml含有50ug/mlDAP的LB液体培养基，37℃摇菌至微混（3-4h）；
6、得到的菌液稀释10倍，分别取100ul，涂布于含有50ug/mlDAP的LB固体培养基和10%蔗糖的无NaCl的LB固体培养基，室温静置2-3天；
7、单菌落划线于含有50ug/mlDAP的LB平板，37℃培养过夜；生长的菌落为缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株。
所述的asd上下游融合片段基因序列如序列表SEQIDNo.1所示；
所述的araCPBAD-lacI基因序列如序列表SEQIDNo.2所示；
所述的连接产物pRE112-asd+araCPBAD-lacI基因序列如序列表SEQIDNo.3所示。
本发明公开了缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株，是以猪霍乱沙门菌C500株为载体，对其染色体进行基因改造，使猪霍乱沙门菌C500的asd基因缺失，构建猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株；同时将araCPBAD-lacI序列置于缺失的asd基因阅读框中，使C500株在缺失asd基因的同时，引入araCPBAD-lacI表达框，可在***糖存在时表达LacI蛋白；此外，构建了含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514-EGFP，通过westernblot实验检测LacI对Ptrc启动子的负调控作用。本发明提供一种全新的基于平衡-致死***的调控表达外源抗原基因的C500菌株及表达质粒，为将来利用C500菌株表达外源抗原成分奠定基础。
附图说明
图1asd基因上下游PCR结果：M：DL5000marker，1：asd上游片段PCR扩增结果结果，2：asd下游片段PCR扩增结果；
图2asd基因上下游融合PCR结果：M：DL10000marker；1：asd上下游片段融合PCR结果；
图3菌落PCR鉴定图：M：DL10000marker；1-6：连接产物pRE112-asd转化大肠杆菌感受态细胞7232(Cm)菌落PCR鉴定结果；7：阴性对照；8：阳性对照；
图4▲asd：：araCPBAD-lacI示意图；
图5araCPBAD-lacIPCR电泳图：M：DL10000marker；1-3：基因araCPBAD-IacI的PCR扩增结果；
图6pRE112-asd质粒KpnI、XbaI双酶切电泳图：M：DL10000marker；1-5：pRE112-asd用KpnI和XbaI双酶切鉴定结果；
图7菌落PCR鉴定图：M：DL10000marker；1-6：菌落PCR鉴定；7：阴性对照；8：阳性对照；
图8菌落PCR鉴定图：M：DL5000marker；1-6：菌落PCR鉴定；7：阴性对照；8：阳性对照；
图9突变菌株DAP生长依赖性结果：A：LB平板；B：LB+DAP平板；
图10EGFP基因PCR电泳图：M：DL5000marker；1-3：基因EGFP的PCR扩增结果；
图11载体pYA4514双酶切电泳图：M：DL10000marker；1：pYA4514PstI、HindIII双酶切；
图12菌落PCR鉴定图：M：DL2000marker；1-9：菌落PCR鉴定；
图13双酶切鉴定结果：M：DL5000marker；1-5：质粒PstI、HindIII双酶切鉴定；
图14LacI表达western结果：M：ProteinMarker;1.C500空菌；2.C500Δasd：：araCPBADlacI，LB+DAP培养；3.C500Δasd：：araCPBADlacI，LB+DAP+Arabinose培养；
图15EGFP表达western结果：M：ProteinMarker；1.C500Δasd：：araCPBADlacI(4514-EGFP)，LB+***糖培养；3.C500Δasd：：araCPBADlacI(4514-EGFP)，LB+***糖培养，IPTG诱导4h。
具体实施方式
实施例1Asd缺失***质粒的构建
1、C500基因组的提取
猪霍乱沙门菌C500基因组DNA的提取，参照微量细菌基因组提取试剂盒的说明书进行。
2、扩增C500基因组中asd上下游片段
1）引物的合成
Asd-F1：CGTCGTCCTACCTTCAGG
Asd-F2：GAGCTCGGTACCAGCCTGCAGTCTAGAGTAGTGGCTATTGCAGCGC
Asd-R1：TCTAGACTGCAGGCTGGTACCGAGCTCCCTGCAAAGAGATGTGCTGT
Asd-R2：GCATGGCAATCGCCCAACG；
2）目的基因PCR1（上游）和PCR2（下游）的扩增
a.PCR1反应体系如下：
PCR1反应条件如下：
b.PCR2反应体系如下：
PCR1反应条件如下：
c.PCR结果电泳图如图1所示；
d.PCR产物的回收与纯化
采用DNA凝胶回收试剂盒对PCR1、PCR2产物进行胶回收。
3、融合PCR
1）将上述回收的asd基因上下游PCR产物分别回收后，利用两种PCR产物末端的同源序列（TCTAGACTGCAGGCTGGTACCGAGCTC）进行融合PCR，得到仅包含asd基因上下游序列而缺失asd基因的融合PCR产物，其中加粗部分分别为XbaI（TCTAGA）、KpnI（GGTACC）酶切位点：
a.PCR反应体系如下：
b.PCR反应条件如下：
2）融合PCR片段全长的扩增：
a.PCR反应体系如下：
b.PCR反应条件如下：
c.融合PCR产物的回收
采用DNA凝胶回收试剂盒对融合PCR产物进行胶回收，asd基因上下游融合片段基因序列如序列表SEQIDNo.1所示；PCR结果见图2。
4、目的基因融合PCR产物与表达载体pRE112(AhdI单酶切）连接
目的片段融合PCR产物浓度128ng/μl、载体pRE112浓度为38ng/μl。
连接体系如下：
16℃点水浴过夜。
5、连接产物pRE112-asd转化大肠杆菌感受态细胞7232(Cm)
电转：5μl连接产物+100μl大肠杆菌7232感受态细胞冰上1min转入电极杯，冰浴10min，放入电转仪，按照操作说明进行电转；电转完成后加600μl的含有氯霉素的LB培养基到电极杯，转到1.5ml的EP管中，37℃温箱摇菌1h后，5000rpm离心3min，弃上清，剩100μl，混匀，用枪打入含有氯霉素的LB固体培养基，涂匀待干放入37℃温箱过夜，待其长出菌落；Cm为氯霉素(chloramphenicol)。
6、筛选阳性克隆
菌落PCR：含有氯霉素的LB固体培养基上选6个菌，并作阳性、阴性对照。菌落PCR八联管，体系各为20μl，rTaq酶10μl、DDW9μl、引物10×asd-F1、10×asd-R2各0.5μl。1-6号菌各挑一半加入1-6号管，阴性对照不加菌不加模版为7号管，阳性对照加模版pRE112-asd质粒0.2μl至8号管。
PCR反应条件如下：
0.8%琼脂糖凝胶电泳验证，菌落PCR鉴定结果如图3；阳性菌接至含有氯霉素的LB培养基，37℃温箱摇菌过夜；采用质粒小提试剂盒进行质粒提取，并将所提取质粒送至生物公司测序。
实施例2携带araCPBAD-lacI的***质粒的构建
1、目的基因araCPBAD-lacI的扩增
1）引物的设计与合成
araC-KpnI-F：ataGGTACCTGATTACTGTCTGGGGTG
lacI-xbaI-R：tatTCTAGAGAATTCCCGGGAGAGCTC
2）目的基因araCPBAD-LacI（SEQIDNo.2）的PCR扩增
a、PCR反应体系如下：
b.PCR反应条件如下：
C.PCR结果电泳图如图5所示；
d.PCR产物的回收
采用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收。
2、将胶回收产物分别进行双酶切
a.酶切体系如下：
37℃酶切过夜。
b.使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化。
3、载体pRE112-asd质粒双酶切
a、酶切体系如下：
37℃酶切过夜；0.8%琼脂糖凝胶电泳验证图见图6。
b、使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物进行胶回收。
4、酶切后的目的基因araCPBAD-lacI与表达载体pRE112-asd连接
连接体系如下：
16℃连接过夜。
5、连接产物pRE112-asd+araCPBAD-lacI转化大肠杆菌感受态细胞χ7232(Cm)
连接产物pRE112-asd+araCPBAD-lacI序列如序列表SEQIDNo.3所示。
电转：10μl连接产物+100μlχ7232感受态细胞冰上1min转入电极杯，冰浴10min，放入电转机，按照操作说明进行电转。电转完成后加600μl的含有氯霉素的LB培养基到电极杯，转到1.5ml的EP管中，37℃温箱摇菌1h后，5000rpm离心3min，弃上清，剩100μl，混匀，用枪打入含有氯霉素的LB固体培养基，涂匀待干放入37℃温箱过夜，待其长出菌落。
将单个菌落接至含有氯霉素的LB培养基，37℃温箱摇菌过夜；采用质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取重组质粒(携带araCPBAD-lacI)。
6、筛选阳性克隆
菌落PCR：含有氯霉素的LB固体培养基上选6个菌，并作阳性、阴性对照。菌落PCR八联管，体系各为20μl，rTaq酶10μl、DDW9μl、引物araC-KpnI-F/LacI-XbaI-R各0.5μl。1-6号菌各挑一半加入1-6号管，阴性对照不加菌不加模版为7号管，阳性对照加模版araCPBAD-IacI质粒0.2μl至8号管。
PCR反应条件如下：
0.8%琼脂糖凝胶电泳验证图如图7；
7、χ7232(pRE112-asd-araCPBAD-lacI)转化χ7213
χ7232和χ7213均为RoyCurtissIII(佛罗里达大学)惠赠的用于沙门氏菌同源重组的中间宿主菌，允许***质粒pRE112在其中复制，其中χ7232为克隆宿主菌，χ7213为接合宿主菌，可与沙门菌之间通过菌毛连接将***质粒转移至沙门菌中，达到同源重组的目的。
电转：5μl质粒（pRE112-asd-araCPBAD-lacI)+100μlχ7213感受态细胞冰上1min转入电极杯，冰浴10min，放入电转机，按照操作说明进行电转；电转完成后加600μl的含有氯霉素和50ug/mlDAP的LB培养基到电极杯，转到1.5毫升的EP管中，37℃温箱摇菌1h后，5000rpm离心3min，弃上清，剩100μl，混匀，用枪打入含有氯霉素和50ug/mlDAP的LB固体培养基，涂匀待干放入37℃温箱过夜。
实施例3缺失asd、表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株(C500Δasd：：araCPBAD-lacI)的同源重组构建过程
1、Day1，晚上挑取χ7213(pRE112-asd-araCPBAD-lacI）单个菌落接至5ml含有氯霉素和50ug/mlDAP的LB液体培养基中，C500接种至5mlLB培养基中，37℃摇菌过夜；
2、Day2，χ7213（pRE112-asd-lacI）取1ml，5000rpm离心5min，弃上清，加入500ulC500，混匀后置于含有50ug/mlDAP的LB固体培养基，37℃正置过夜，使χ7213与C500菌通过菌毛发生接合，***质粒转移至C500中后与C500的基因组发生同源重组；
3、Day3，挑菌划线于含有25ug/ml氯霉素的XLD固体培养基，37℃培养过夜；XLD培养基可选择性分离C500菌，达到分离混合菌中有氯霉素抗性C500菌的目的，这种有氯霉素抗性的C500菌即为发生第一次同源重组的菌株；
4、挑取单菌落，划单克隆于含有25ug/ml氯霉素的LB固体培养基，37℃过夜；达到进一步纯化氯霉素抗性C500菌株的目的；
5、挑取3个克隆，分别接种1ml含有50ug/mlDAP的LB液体培养基，37℃摇菌至微混（3-4h），使菌株发生二次同源重组；
6、原液、稀释10倍，分别取100ul涂布于含有50ug/mlDAP和10%蔗糖的无NaCl的LB固体培养基，室温静置2-3天；10%蔗糖可特异性筛选发生了二次同源重组的菌株，切无NaCl的培养基利于这种筛选，发生了二次重组的菌株由于缺失了asd基因，所以必须在含有DAP的培养基上才能生长；
7、单菌落分别划线于含有50ug/mlDAP的LB平板、含有50ug/mlDAP及25ug/ml氯霉素的LB平板，37℃培养过夜；发生了二次重组的C500菌株因丢失了氯霉素抗性基因而无法在氯霉素抗性的平板上生长；
8、选择只在含有50ug/mlDAP的LB平板上生长的菌落进行PCR鉴定；并作阳性、阴性对照。体系各为20μl，rTaq酶10μl、DDW9μl、引物araC-KpnI-F/LacI-XbaI-R各0.5μl。1-6号菌各挑一半加入1-6号管，阴性对照不加菌不加模版为7号管，阳性对照加模版araCPBAD-lacI质粒0.2μl至8号管；
PCR反应条件如下：
0.8%琼脂糖凝胶电泳验证图见图8；
9、选取PCR鉴定阳性菌株，分别在LB、含有50ug/mlDAP的LB固体培养基平板划线培养，结果如图9所示，结果表明asd突变菌株只在加DAP的平板上生长，表现为DAP依赖表型。
实施例4pYA4514-EGFP(绿色荧光、含asd基因）的构建
1、目的基因EGFP的扩增
1）引物的设计与合成
EGFP-PstI-F：ACctgcagcATGGTGAGCAAGGGCGAG
EGFP-HindIII-R：CACaagcttTCACTTGTACAGCTCGTCCAT；
2）目的基因EGFP的PCR扩增
a、PCR反应体系如下：
b.PCR反应条件如下：
c.PCR结果电泳图如图10；
d.PCR产物的回收与纯化
采用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收。
2、将胶回收产物(目的基因)分别进行双酶切
a.酶切体系如下：
37℃酶切过夜；
b.使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化。
3、载体pYA4514质粒双酶切
a、酶切体系如下：
37℃酶切过夜；
b、使用DNA纯化回收试剂盒对酶切产物进行胶回收。
4、酶切后的目的基因EGFP与表达载体pYA4514连接
连接体系如下：
电水浴16℃连接过夜。
5、连接产物pYA4514-EGFP转化6212(LB)
电转：5μl连接产物+100μlχ6212感受态细胞冰上1min转入电极杯，冰浴10min，放入电转机，按照操作说明进行电转。电转完成后加600μl的LB到电极杯，转到1.5ml的EP管中，37℃温箱摇菌1h后，5000rpm离心3min，弃上清，剩100μl，混匀，用枪打入LB固体培养基，涂匀待干放入37℃温箱过夜。
6、筛选χ6212(pYA4514-EGFP)阳性克隆
鉴定1：菌落PCR：LB培养基上选6个菌，并作阳性、阴性对照。菌落PCR八联管，体系各为20μl，rTaq酶10μl、DDW9μl、引物PstI-F0.5微升、HindIII0.5微升；1-6号菌各挑一半加入1-6号管，阴性对照不加菌不加模版为7号管，阳性对照加模版EGFP质粒0.2μl至8号管。
PCR反应条件如下：
0.8%琼脂糖凝胶电泳验证图（图12）；
将0.8%琼脂糖凝胶电泳验证阳性菌接至LB液体培养基，37℃温箱摇菌过夜。
鉴定2：验证为阳性菌提取质粒，酶切鉴定；
a.酶切体系如下：
37℃水浴2小时。
b.0.8%琼脂糖凝胶电泳验证，如图13。
鉴定3：将所提取质粒送至生物公司测序，测序正确。
实施例5pYA5414-EGFP的调控表达
1、C500Δasd：：araCPBAD-lacI感受态细胞制备
将C500Δasd：：araCPBAD-lacI制作成电转感受态细胞，步骤如下：将C500Δasd(含araCPBAD-lacI)划线于含有50ug/mlDAP的LB固体培养基，37℃温箱过夜；第二天挑取单克隆于5ml含有50ug/mlDAP的LB培养基中，7~8小时后转接至20ml含有50ug/mlDAP的LB培养基中，37℃摇床培养至OD值达到0.4~0.6，冰浴20min，4℃下5000rpm离心10min；弃上清，沉淀用蒸馏水悬起，同样条件下离心10min；弃上清，用10%甘油悬起离心10min，重复一次，最后弃上清，用2ml10%甘油悬起，每管100μl分管至1.5ml离心管中，-80℃保存备用。
2、pYA4514-EGFP电转至猪霍乱沙门菌C500Δasd：：araCPBAD-lacI感受态细胞
电转：5μl质粒pYA4514-EGFP+100μlC500Δasd：：araCPBAD-lacI感受态细胞冰上1min转入电极杯，冰浴1min，放入电转仪，按照操作说明进行电转；电转完成后加600μl的LB到电极杯，转到1.5毫升的EP管中，37℃温箱摇菌1h后，5000rpm离心3min，弃上清，剩100μl，混匀，用枪打入LB固体培养基，涂匀待干放入37℃温箱过夜。
3、验证结果：westernblot
分别以LacI抗体、EGFP抗体为一抗对新构建的突变菌株进行Westernblot检测，结果如图14；可见当培养基中存在***糖时突变菌株表达大量的LacI蛋白。
为了检测pYA4514-EGFP中EGFP的表达是否受LacI的调控，我们将质粒pYA4514-EGFP电转入C500Δasd：：araCPBAD-lacI后，分别比较了IPTG诱导前后EGFP的表达，结果如图15所示；表明当***糖存在时，表达的LacI能一直pYA4514-EGFP质粒上Ptrc启动子的活性，而当IPTG存在时能消除LacI对Ptrc启动子的抑制作用，诱导了EGFP的表达。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtcgtccta ccttcaggtt aggcttaata cccgcgggat taagctaccc ttaaagaata 60
gccaatgctc tgcttaactc ctgataaaaa tgaaacatct gcgtttactc ctgtattacg 120
caaaaaaagg gtgacgatgc acccctggtt taacacaaat ttccccgccg gatggcggcg 180
ctgacgcgcc ttatccggcc tacagaacca cacgcaggcc cgataagcgc tgcaatagcc 240
actactctag actgcaggct ggtaccgagc tccctgcaaa gagatgtgct gtgtatgcgc 300
gccagtatcc tgtggcgcat ccttcaccat acaaaaagca gccaaagtcg caagtgaaat 360
taatcaatga tagcgaagcc atcagtaatg cgacttatcc tgccttaccg cgcaagcaga 420
aagtccagtg gcgattatca gggaatttgc gttaggaagg gaatcatttc cgtcgctgtt 480
ttattgatcc taattatgga tcagcgtaga aatttgcctg tttttatgcg cgtactgaaa 540
catggcgagg caaaacgtcg ttgggcgatt gccatgc 577
<210> 2
<211> 2751
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgattactgt ctggggtgcc ggtgcatttt ttaaataccc gcgagaaata gagttgatcg 60
tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc gggtggtgct caaaagcagc 120
ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga cgctaatccc taactgctgg 180
cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat gctgtgcgac gctggcgata 240
tcaaaattgc tgtctgccag gtgatcgctg atgtactgac aagcctcgcg tacccgatta 300
tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc gccgcagtaa caattgctca 360
agcagattta tcgccagcag ctccgaatag cgcccttccc cttgcccggc gttaatgatt 420
tgcccaaaca ggtcgctgaa atgcggctgg tgcgcttcat ccgggcgaaa gaaccccgta 480
ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt aggcgcgcgg acgaaagtaa 540
acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac cgtagtgatg aatctctcct 600
ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt ctcgtccctg atttttcacc 660
accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt tcattcccag cggtcggtcg 720
ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta aacccgccac cagatgggca 780
ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt cagccatact tttcatactc 840
ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca gacattgccg tcactgcgtc 900
ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc ttattaaaag cattctgtaa 960
caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa gtgtctataa tcacggcaga 1020
aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct atgccatagc atttttatcc 1080
ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac tctctactgt ttctccatac 1140
ccgttttttt gggctagcga agtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc 1200
ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa 1260
acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca 1320
caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg 1380
cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc 1440
gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat 1500
cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc 1560
attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag 1620
acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat 1680
ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg 1740
gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata 1800
gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg 1860
aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca 1920
atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 1980
gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt 2040
cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 2100
aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat 2160
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 2220
tcccgactgg aaagcgggca gtgagtaaat aaaagcagtt tacaactcct agaattgtga 2280
atatattatc acaattctag gatagaataa taaaagatct aagggaccag gcctaccgaa 2340
gtcggtaagc cggtaatcat tacatgcgct cgaacagaac cattgattcc agatgtcctg 2400
tgtgcgggaa catgtcgagc atcgctaaac gcgtaacctc atatcccgca ttgaccagcg 2460
cttcactatc gcgcgccagc gtcgccgggt tacaggatac ataaacaatg cgaataggtt 2520
ttaattttat aatatgtcgc atcactcctg tagcccccgc acgcgcagga tcgagtaaga 2580
ctttgtcaaa gccgtttttc gcccacggct gcttcgtgac atcttcctcc aggttctcat 2640
ggaagaatgt cacattatgt aaaccattgc ggatggcgtt ttcacggcct ttttctacca 2700
gcgccggaac gccctcgagc tctcccggga attgagctct cccgggaatt c 2751
<210> 3
<211> 3319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtcgtccta ccttcaggtt aggcttaata cccgcgggat taagctaccc ttaaagaata 60
gccaatgctc tgcttaactc ctgataaaaa tgaaacatct gcgtttactc ctgtattacg 120
caaaaaaagg gtgacgatgc acccctggtt taacacaaat ttccccgccg gatggcggcg 180
ctgacgcgcc ttatccggcc tacagaacca cacgcaggcc cgataagcgc tgcaatagcc 240
actactctag agaattcccg ggagagctca attcccggga gagctcgagg gcgttccggc 300
gctggtagaa aaaggccgtg aaaacgccat ccgcaatggt ttacataatg tgacattctt 360
ccatgagaac ctggaggaag atgtcacgaa gcagccgtgg gcgaaaaacg gctttgacaa 420
agtcttactc gatcctgcgc gtgcgggggc tacaggagtg atgcgacata ttataaaatt 480
aaaacctatt cgcattgttt atgtatcctg taacccggcg acgctggcgc gcgatagtga 540
agcgctggtc aatgcgggat atgaggttac gcgtttagcg atgctcgaca tgttcccgca 600
cacaggacat ctggaatcaa tggttctgtt cgagcgcatg taatgattac cggcttaccg 660
acttcggtag gcctggtccc ttagatcttt tattattcta tcctagaatt gtgataatat 720
attcacaatt ctaggagttg taaactgctt ttatttactc actgcccgct ttccagtcgg 780
gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 840
gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 900
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg 960
cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg 1020
tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc 1080
attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca 1140
ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc 1200
gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc 1260
gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc 1320
agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt 1380
gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca 1440
atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga 1500
agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc 1560
acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg 1620
tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt 1680
tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc 1740
gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca 1800
ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cttcgctagc ccaaaaaaac 1860
gggtatggag aaacagtaga gagttgcgat aaaaagcgtc aggtaggatc cgctaatctt 1920
atggataaaa atgctatggc atagcaaagt gtgacgccgt gcaaataatc aatgtggact 1980
tttctgccgt gattatagac acttttgtta cgcgtttttg tcatggcttt ggtcccgctt 2040
tgttacagaa tgcttttaat aagcggggtt accggtttgg ttagcgagaa gagccagtaa 2100
aagacgcagt gacggcaatg tctgatgcaa tatggacaat tggtttcttc tctgaatggc 2160
gggagtatga aaagtatggc tgaagcgcaa aatgatcccc tgctgccggg atactcgttt 2220
aatgcccatc tggtggcggg tttaacgccg attgaggcca acggttatct cgattttttt 2280
atcgaccgac cgctgggaat gaaaggttat attctcaatc tcaccattcg cggtcagggg 2340
gtggtgaaaa atcagggacg agaatttgtt tgccgaccgg gtgatatttt gctgttcccg 2400
ccaggagaga ttcatcacta cggtcgtcat ccggaggctc gcgaatggta tcaccagtgg 2460
gtttactttc gtccgcgcgc ctactggcat gaatggctta actggccgtc aatatttgcc 2520
aatacggggt tctttcgccc ggatgaagcg caccagccgc atttcagcga cctgtttggg 2580
caaatcatta acgccgggca aggggaaggg cgctattcgg agctgctggc gataaatctg 2640
cttgagcaat tgttactgcg gcgcatggaa gcgattaacg agtcgctcca tccaccgatg 2700
gataatcggg tacgcgaggc ttgtcagtac atcagcgatc acctggcaga cagcaatttt 2760
gatatcgcca gcgtcgcaca gcatgtttgc ttgtcgccgt cgcgtctgtc acatcttttc 2820
cgccagcagt tagggattag cgtcttaagc tggcgcgagg accaacgtat cagccaggcg 2880
aagctgcttt tgagcaccac ccggatgcct atcgccaccg tcggtcgcaa tgttggtttt 2940
gacgatcaac tctatttctc gcgggtattt aaaaaatgca ccggcacccc agacagtaat 3000
caggtaccga gctccctgca aagagatgtg ctgtgtatgc gcgccagtat cctgtggcgc 3060
atccttcacc atacaaaaag cagccaaagt cgcaagtgaa attaatcaat gatagcgaag 3120
ccatcagtaa tgcgacttat cctgccttac cgcgcaagca gaaagtccag tggcgattat 3180
cagggaattt gcgttaggaa gggaatcatt tccgtcgctg ttttattgat cctaattatg 3240
gatcagcgta gaaatttgcc tgtttttatg cgcgtactga aacatggcga ggcaaaacgt 3300
cgttgggcga ttgccatgc 3319

Claims (3)

1.质粒pRE112-asd+araC PBAD-lacI，它的基因序列如序列表SEQ ID No.3所示。
2.缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株，其特征在于，它是由下述方法制备的：
将权利要求1所述的质粒pRE112-asd+araC PBAD-lacI转化大肠杆菌感受态细胞χ7232中；再用得到χ7232转化χ7213；χ7213再与猪霍乱沙门菌C500株共培养转化。
3.缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株的制备方法，其特征在于：它包括：
(一)、质粒pRE112-asd的构建：
(1)、提取猪霍乱沙门菌C500基因组DNA；
(2)、以C500基因组DNA为模板；用引物
Asd-F1：CGTCGTCCTACCTTCAGG
Asd-F2：GAGCTCGGTACCAGCCTGCAGTCTAGAGTAGTGGCTATTGCAGCGC
Asd-R1：TCTAGACTGCAGGCTGGTACCGAGCTCCCTGCAAAGAGATGTGCTGT
Asd-R2：GCATGGCAATCGCCCAACG
扩增C500基因组中asd上下游片段；
(3)、融合PCR
1）asd上、下游片段融合；
2）以步骤1）获得的融合片段为模板，用引物：
Asd-F1： CGTCGTCCTACCTTCAGG
Asd-R2： GCATGGCAATCGCCCAACG；
扩增asd上下游融合片段；
(4)、用AhdI单酶切asd上下游融合片段和载体pRE112后，连接，获得质粒pRE112-asd；
(二)、携带araC PBAD-lacI的***质粒的构建：
1)、以含araC PBAD-lacI 的pYA3879为模板，用引物：
araC-KpnI-F：ATAGGTACCTGATTACTGTCTGGGGTG
lacI-xbaI-R：TATTCTAGAGAATTCCCGGGAGAGCTC
扩增基因araC PBAD-lacI；
2)、用Kpn I、Xba I双酶切pRE112-asd和基因araC PBAD-lacI，连接，获得pRE112-asd+araC PBAD-lacI；
3)、连接产物pRE112-asd+araC PBAD-lacI转化大肠杆菌感受态细胞χ7232；
4)、步骤3）得到的χ7232转化χ7213；
(三)、缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株(C500Δasd：：araC PBAD-lacI)的同源重组构建：
1)、挑取χ7213单个菌落接至5ml 含有氯霉素和50 ug/ml DAP的LB液体培养基中，猪霍乱沙门菌C500株接种至5ml LB液体培养基中，37℃摇菌过夜；
2)、取摇菌后的χ7213菌液1ml，5000rpm离心5min，弃上清，加入500ul 猪霍乱沙门菌C500菌液，混匀后置于含有50 ug/ml DAP的LB固体培养基，37℃正置过夜；
3)、挑菌，划线于含有25ug/ml 氯霉素的XLD 固体培养基，37℃培养过夜；
4)、挑取单菌落，划单克隆于含有25ug/ml 氯霉素的LB固体培养基，37℃过夜；
5)、挑取3个克隆，分别接种1ml 含有50 ug/ml DAP的LB液体培养基，37℃摇菌至微混3-4h；
6)、得到的菌液稀释10倍，分别取100ul，涂布于含有50 ug/ml DAP的LB固体培养基和10% 蔗糖的无NaCl的LB固体培养基，室温静置2-3天；
7)、单菌落划线于含有50 ug/ml DAP 的LB平板，37℃培养过夜；生长的菌落为缺失asd及表达lacI的猪霍乱沙门菌C500株。
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