CN107217056A - 猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法 - Google Patents

猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，包含基因合成和引物设计、重组质粒pMG36e‑SP‑TSOL18的构建及鉴定、猪带绦虫重组pMG36e‑SP‑TSOL18/L.lactis的构建及鉴定和蛋白表达鉴定等步骤。以乳酸乳球菌MG1363为宿主***进行基因优化，合成目的基因SP‑TSOL18，双酶切连接至pMG36e载体，构建胞内型表达载体pMG36e‑SP‑TSOL18，再将其电穿孔转化至L.lactis MG1363，成功构建猪带绦虫乳酸乳球菌表达***pMG36e‑SP‑TSOL18/L.lactis MG1363。进行PCR鉴定、SDS‑PAGE和Western blot分析SP‑TSOL18在胞内与胞外均有目标蛋白表达，通过AKTA蛋白纯化鉴定及稳定性分析，pMG36e‑SP‑TSOL18质粒在L.lactis MG1363中连续传代20代，有较好的遗传稳定性，为猪囊尾蚴病疫苗的开发与利用提供了有力的参考依据。

Description

猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法
技术领域
本发明涉及猪带绦虫重组活疫苗研究领域，具体为猪带绦虫TSOL18基因重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法。
背景技术
猪囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)俗称猪囊虫病(bladder disease)，是由猪带绦虫(Taenia solium,Ts)的中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercus cellulosae)引起的一种严重危害畜牧业生产和人类健康的***共患寄生虫病，是国家***规划防治的重点寄生虫病之一。本病呈世界性分布，主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等经济、卫生条件差的国家及地区。我国主要流行于黑龙江、吉林、云南、河南、河北、山东和广西等31个省市自治区。据近年普查，我国猪带绦虫的感染率为0.112％，局部地区高达0.66％～6.00％，感染人数126万，囊虫的感染率为0.14％～3.20％，感染人数300万。其中2.3％～25.0％的猪带绦虫病患者由于自身感染而伴有囊虫的寄生。因此研发安全高效的疫苗防治该病意义重大。
TSOL18基因相对保守，存在于激活的TSO中，具有良好的免疫原性和抗原性，被认为是最具发展前途的侯选疫苗基因。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是LAB中最重要的模式菌，应用范围于食品、医药领域密切相关。随着基因工程技术的发展，选择具有高效、无毒副作用的L.lactis作为载体，已在细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等领域构建了一系列基因工程疫苗。
就上述背景技术领域而言，尚未见猪带绦虫重组L.lactis的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法。
为达到上述目的，采用的技术方案为：
猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，包含以下步骤：
1)、TSOL18基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSOL18基因序列，采用基于PAS的方法，在引物的两端各设计了Sac I和Hind III酶切位点和保护性碱基，合成749bp的SP-TSOL18基因；
2)、重组质粒pMG36e-SP-TSOL18的构建及鉴定：合成的目的基因与表达载体pMG36e用Sac I/Hind III双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e-SP-TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定；
3)、猪带绦虫重组pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建及鉴定：
3.1)、乳球菌的活化及感受态制备：取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，然后收集菌体，用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体；
3.2)、重组质粒pMG36e-SP-TSOL18电转化MG1363：将获得的pMG36e-SP-TSOL18质粒与感受态MG1363混合，进行冰浴和电击，加入蔗糖MRS培养基，然后进行涂布红霉素GM17平板培养，选取阳性菌落再进行红霉素液体培养基培养；
3.3)、阳性克隆鉴定：取上述3.2)步骤的培养菌液，离心弃上清，依次进行洗涤、重悬、沸水浴、冰浴、离心，取上清作为PCR模板待用；使用基因特异性的引物进行PCR鉴定，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
4)、蛋白表达鉴定：
4.1)、SDS-PAGE鉴定：选取未转化的乳酸球菌培养于GM17液体培养基中，挑取步骤3.3)鉴定为阳性的菌液，离心收集沉淀和上清；将沉淀在冰浴中进行超声破碎，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴4-8min，冷却后取上样，通过SDS-PAGE检测上清和胞内的表达情况；
4.2)、通过AKTA纯化TSOL18蛋白，使用Anti-TSOL18抗体检测纯化后的蛋白在15D左右有无目的条带；
4.3)、Western blot鉴定：取AKTA纯化TSOL18蛋白进行Western blot鉴定分析。
进一步，所述步骤3.1)中，菌液接种后保持不通风，30℃培养过夜，至OD值为0.2-0.8，然后将培养物冰浴10min，离心收集菌体，并用冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体，再进行重悬菌体。
进一步，所述步骤3.2)中电击电转参数如下：电压2000V，电容25UF，电阻200Ω。
进一步，所述步骤3.3)中，使用基因特异性的引物为：正向引物F(5'ATGGTTTGTCGTTTTGCTT 3')和反向引物R(5'TTATGAACGACGAACCTTTTTA3')；反应体系为：以正向和反向引物各1.0ul，1ul基因组为模板，DNA聚合酶0.5ul，dNTP2.5ul，10×PCRbuffer5.0ul，UP to ddw 50ul；PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30min，循环扩增30次，最后72℃复性10min。
进一步，所述步骤4.1)中，2×SDS上样缓冲液为：0.1mol/L Tris-HCl、pH6.8、10％二硫苏糖、4％SDS、0.2％溴酚蓝和20％甘油。
进一步，所述步骤4.3)具体为：取步骤4.2)纯化后蛋白，加loading buffer煮沸冷却后取20ul上样，电泳条件：5％浓缩胶：90V30min；10％分离胶：120V，20min；转膜：分别叠放好三层滤纸、SDS-PAGE胶和PVDF膜，PVDF膜事先需要甲醇活化15s左右，使用转膜仪进行湿法转膜，恒压100V，60min；封闭：5％脱脂奶粉PBST溶液封闭膜，摇床37℃，2h，PBS漂洗5min；一抗孵育及染色，一抗孵育：4℃过夜；PBST在37℃漂洗5min×3，二抗孵育：抗体1:1500稀释，37℃1h；PBST在37℃漂洗5min×4；曝光2min，进行Western blot鉴定分析。
本发明以GenBank中登陆的猪带绦虫TSOL18基因序列为模板，以乳酸乳球菌MG1363为宿主***进行基因优化，合成目的基因SP-TSOL18，双酶切连接至pMG36e载体，构建胞内型表达载体pMG36e-SP-TSOL18，再将其电穿孔转化至L.lactis MG1363，成功构建猪带绦虫乳酸乳球菌表达***pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis MG1363。进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Western blot分析SP-TSOL18在胞内与胞外均有目标蛋白表达，通过AKTA蛋白纯化鉴定及稳定性分析，pMG36e-SP-TSOL18质粒在L.lactis MG1363中连续传代20代，有较好的遗传稳定性，为猪囊尾蚴病疫苗的开发与利用提供了有力的参考依据。
附图说明
图1为猪带绦虫TSOL18基因序列的原始序列码；
图2为猪带绦虫TSOL18基因序列的优化后序列码；
图3为猪带绦虫TSOL18基因序列的原始GC含量图；
图4为猪带绦虫TSOL18基因序列的优化后GC含量图；
图5为TSOL18基因部分序列比对结果图；
图6为SP-TSOL18基因部分序列比对结果图；
图7为重组质粒pMG36e-TSOL18双酶切鉴定图；
图8为重组质粒pMG36e-SP-TSOL18双酶切鉴定图；
图9为乳球菌MG1363阳性克隆子提取基因组DNA测定图；
图10为PCR鉴定TSOL18阳性克隆子图；
图11为PCR鉴定SP-TSOL18阳性克隆子图；
图12为TSOL18菌株表达鉴定分析结果图；
图13为SP-TSOL18菌株表达鉴定分析结果图；
图14为TSOL18蛋白纯化鉴定图；
图15为SP-TSOL18蛋白纯化鉴定图；
图16为纯化后TSOL18蛋白的Western blot鉴定图；
图17为纯化后SP-TSOL18蛋白的Western blot鉴定图；
图18为TSOL18质粒鉴定结果图；
图19为SP-TSOL18质粒鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
1目的基因分析
根据猪带绦虫TSOL18基因序列(登录号：AF017788.1)，对目的基因进行分析和优化。
2TSOL18基因合成和引物设计
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，在引物的两端各设计了Sac I和Hind III酶切位点和保护性碱基，由南京钟鼎生物实验室分别合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因。
3重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18的构建及鉴定
合成的目的基因与表达载体pMG36e用Sac I/Hind III双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定。
4猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建及鉴定
4.1乳球菌的活化及感受态制备
取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，在不通风的条件下，30度培养过夜，培养至OD值为0.2-0.8，培养结束后将培养物冰浴10min，离心收集菌体，用冰冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体，然后用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体，可见细小的圆形白色不透明菌落出现，菌落边缘呈明显的不光滑形状，从形态上与乳酸杆菌培养吻合。
4.2重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18电转化MG1363
分别将获得的pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18质粒与感受态MG1363混合，冰浴10min，电击。电转参数如下：电压2000V，电容25UF，电阻200Ω，进行第一次脉冲，然后立即加入900ul低温的蔗糖MRS培养基，冰上放置10min，期间不要振动，30℃复苏培养2-3h，将菌液3000g离心弃去上清后浓缩于100ul蔗糖MRS培养基中，将其涂布在10ug/ml的红霉素GM17平板上，培养2-3d。期间保持相对密闭环境，观察菌落生长情况，一周左右，陆续形成细小的圆形白色不透明菌落。选取不同的阳性菌落，分别在每个阳性菌落上使用灭菌牙签挑取2～3个单菌落，置于1ml的G/L-SGM17+5ug/ml红霉素液体培养基中，30℃下静置培养72h，待溶液出现明显的浑浊后待用。
4.3阳性克隆鉴定
取上述培养的菌液，10000rpm离心10min，弃上清，ddH2O洗涤3次，10000rpm离心弃上清；加入30ul的dd H2O，重悬后沸水浴10min；冰浴2min，10000rpm离心10min，吸取上清作为PCR模板待用。使用基因特异性的引物进行PCR鉴定，引物为：正向引物F(5'ATGGTTTGTCGTTTTGCTT 3')和反向引物R(5'TTATGAACGACGAACCTTTTTA3')，引物由南京钟鼎生物公司合成。反应体系为：以正向和反向引物各1.0ul，1ul基因组为模板，DNA聚合酶0.5ul，dNTP2.5ul，10×PCR buffer5.0ul，UP to ddw 50ul；PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30min，循环扩增30次，最后72℃复性10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5蛋白表达鉴定
5.1蛋白分析
蛋白跨膜及亲疏水分析，蛋白信号肽分析。
5.2SDS-PAGE鉴定
选取未转化的乳酸球菌命名为CK培养于GM17液体培养基中，分别挑取鉴定为阳性的#1，接种于含有红霉素的GM17液体培养基中；30℃静置培养72h后，6000rpm，4℃离心15min心收集沉淀和上清备用，将沉淀重悬于预冷的PBS中，超声破碎，冰浴中进行超声破碎，每次4s(300w)，间隔8s，超声约20min，加入等体积的2×SDS上样缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，pH6.8，10％二硫苏糖，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，沸水浴4-8min。冷却后取20ul上样；分别通过SDS-PAGE检测上清和胞内的表达情况。
5.3蛋白纯化鉴定
通过AKTA纯化蛋白。
5.4Western blot鉴定
使用Anti-TSOL18抗体检测纯化后的蛋白后，取纯化后蛋白，加loading buffer煮沸冷却后取20ul上样。电泳条件：5％浓缩胶：90V30min；10％分离胶：120V，20min。转膜：分别叠放好三层滤纸、SDS-PAGE胶和PVDF膜(PVDF膜事先需要甲醇活化15s左右)，使用转膜仪进行湿法转膜，恒压100V，60min。封闭：5％脱脂奶粉PBST溶液封闭膜，摇床37℃，2h，PBS漂洗5min。一抗孵育及染色，一抗孵育：4℃过夜；PBST在37℃漂洗5min×3，二抗孵育：抗体1:1500稀释，37℃1h；PBST在37℃漂洗5min×4。曝光2min，进行Western blot分析。
6重组TSOL18和SP-TSOL18蛋白的稳定性分析
利用pMG36e质粒中含有的红霉素抗性基因的特性，将获得的含有目的基因的质粒在不含红霉素与含红霉素的液体培养基中分别进行连续传代，每隔5代做一次质粒稳定率测定，连续传至20代，质粒稳定率＝从不含红霉素的平板上选取100个单菌落接种于含红霉素的平板上最后长出的菌落数。
具体过程如下：挑取MG1363平板上单菌落，分别接种于GM17+(含红霉素)液体培养基和GM17(不含红霉素)液体培养基中，30℃培养24h后，4℃放置过夜并保种，分别取培养物进行划线接种于GM17平板，30℃培养24h后，在划线平板上分别挑取100个单菌落接种于相应含红霉素的培养基与不含红霉素的培养基中，30度培养24h后计数生长菌落，重复以上操作传至20代，则停止传代。根据100个单菌落接种于红霉素平板的菌落生长数，计算其质粒的其遗传稳定性。
7结果
7.1目的基因序列分析与优化：
野生型基因序列：
ATGGTGTGTCGGTTTGCTCTCATCTTCTTGGTGGCCGTCGTTTTGGCGAGCGGTGACCGAACATTCGGCGACGATATTTTCGTGCCATACCTTCGCTGCTTCGCCCTTAGCGCTACCGAAATTGGGGTGTTTTGGGATGCTGGAGAGATGGTTGGCCATGGCGTAGAGGAGATCAAAGTGAAAGTAGAAAAAGCAATACACCCATACAAGATCTGGAATGCAACAGTCAGCGCGAACAATGGAAAAGTCATCATCAGAGACTTGAAGGCGAAGACAATTTACAGAGTGGACGTAGACGGTTATCGAAACGAAATCATGGTGTTTGGTTCGCAGCGTTTCGCGACAACACTTCCGAAAAAGCAGATCAAGCACAAGAAGGTCCGAAGATCGTAG
优化后基因序列：
ATGGTTTGTCGTTTTGCTTTAATTTTTTTAGTTGCTGTTGTTTTAGCTTCAGGTGATCGTACTTTTGGTGATGATATTTTTGTTCCATATTTACGTTGTTTTGCTTTATCAGCTACTGAAATTGGTGTTTTTTGGGATGCTGGTGAAATGGTTGGTCATGGTGTTGAAGAAATTAAAGTTAAAGTTGAAAAGGCTATTCATCCATATAAAATTTGGAATGCTACTGTTTCAGCTAATAATGGTAAGGTTATTATTCGTGATTTAAAAGCTAAAACTATTTATCGTGTTGATGTTGATGGTTATCGTAATGAAATTATGGTTTTTGGTTCACAACGTTTTGCTACTACTTTACCAAAAAAGCAAATTAAGCATAAAAAGGTTCGTCGTTCATAA
其原始序列码如图1所示，优化后序列码如图2所示，原始GC含量如图3所示，优化后GC含量如图4所示。
7.2目的基因的合成：采用基于PAS的方法合成576bp的TSOL18基因和749bp的SP-TSOL18基因，与预期结果相符。
TSOL18基因：
SP-TSOL18基因：
7.3重组质粒的测序鉴定：合成的TSOL18基因和SP-TSOL18基因，双酶切至pMG36e载体的Sac I和Hind III位点，测序结果与预期序列相符，见图5、6。
7.4重组质粒的酶切鉴定：重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18经Sac I和Hind III双酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳，证实获得的TSOL18基因和SP-TSOL18基因正确的***到pMG36e载体的Sac I和Hind III之间，与预期结果相符，见图7、8，图中M:DNAMarker；1:酶切前质粒；2:酶切后质粒。
7.5乳球菌MG1363中重组质粒的阳性克隆鉴定：从乳球菌MG1363中抽提重组质粒，挑选阳性克隆子，进行基因组DNA测定，确认为阳性克隆，见图9，图中M:DNAMarker:1-6:TSOL18阳性克隆子基因组DNA,7-12:SP-TSOL18阳性克隆子基因组DNA,13:MG1363空菌株。
7.6乳球菌中重组质粒的PCR鉴定：以乳球菌MG1363中抽提的重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18为模板，使用基因特异性引物进行PCR扩增，结果显示1-6泳道为TSOL18阳性克隆子的PCR产物，见图10、11；图10中M:DNA Marker；1-6:阳性克隆子TSOL18PCR鉴定,7:CK(阴性-MG1363)；图11中M:DNA Marker；1-6:阳性克隆子SP-TSOL18PCR鉴定,7：CK(阴性-MG1363)；其中1、2、4、5、6泳道为SP-TSOL18阳性克隆子的PCR产物，可得到393bp的TSOL18基因片段，与预期结果相符。
7.7重组pMG36e-TSOL18/L.lactis和pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis表达产物的SDS-PAGE分析：分别挑取鉴定为阳性的克隆菌接种与含有红霉素的GM17液体培养基中，与未转化的MG1363(CK)培养于GM17液体培养基中，30℃静置培养72h后，进行SDS-PAGE电泳，CK(MG1363菌株)胞内上清与沉淀中都未检测到目标的蛋白；TSOL18在胞外上清未检测到目标蛋白，但在胞内有检测到目标蛋白的表达，SP-TSOL18在胞外上清与胞内沉淀都有检测到目标蛋白的表达，见图12、13。图12中M:Protein Marker,1:CK培养72小时上清,2:CK培养72小时沉淀,3:pMG36e-TSOL18转化MG1363菌株培养72小时上清,4:pMG36e-TSOL18转化MG1363菌株培养72小时沉淀；图13中，M:Protein Marker,1：CK培养72小时上清,2:CK培养72小时沉淀,3:pMG36e-SP-TSOL18转化MG1363菌株培养72小时上清,4:pMG36e-SP-TSOL18转化MG1363菌株培养72小时沉淀。
7.8TSOL18和SP-TSOL18蛋白的表达模式分析与产物纯化：通过AKTA纯化TSOL18和SP-TSOL18蛋白，使用Anti-TSOL18抗体检测纯化后的蛋白，两种蛋白在15D左右有目的条带，SP-TSOL18蛋白在胞内和胞外均出现特异性显色带，表明SP-TSOL18蛋白抗原性优于TSOL18蛋白，见图14、15、16、17。图14中M:Protein Marker,1:purified；图15中M:ProteinMarker,1:purified；图16中M:Protein Marker,1:CK,2:TSOL18上清,3:TSOL18沉淀；图17中M:Protein Marker,1:CK,2:SP-TSOL18上清,3:SP-TSOL18沉淀。
7.9稳定性实验：由表1、2、3、4可以看出含有目的基因的质粒pMG36e-TOSL18，pMG36e-SP-TOSL18在MG1363乳酸球菌中连续传代20代时，在无红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为100％，在含红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为99％。将各代次的质粒采用限制性内切酶Sac I/HindIII进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示大小正确，连续传至20代时，与原代质粒相符。提示pMG36E-TSOL18、pMG36E-SP-TSOL18质粒在乳酸球菌MG1363中连续传代20代时，均有较好的遗传稳定性，见图18、19。图18中，M:DNA Marker,1:TSOL18原代质粒,2:TSOL18原代质粒酶切后,3:TSOL18 5代质粒,4:TSOL18 5代质粒酶切后,5:TSOL1810代质粒,6:TSOL18 10代质粒酶切后,7:TSOL18 15代质粒,8:TSOL18 15代质粒酶切后,9:TSOL18 20代质粒,10:TSOL18 20代质粒酶切后；图19中，M:DNA Marker,1:SP-TSOL18原代质粒,2:SP-TSOL18原代质粒酶切后,3:SP-TSOL18 5代质粒,4:SP-TSOL18 5代质粒酶切后,5:SP-TSOL18 10代质粒,6:SP-TSOL18 10代质粒酶切后,7:SP-TSOL18 15代质粒,8:SP-TSOL18 15代质粒酶切后,9:SP-TSOL18 20代质粒,10:SP-TSOL18 20代质粒酶切后。
表1：MG1363中pMG36e-TOSL18质粒在无红霉素选择压力下的遗传稳定率。
表2：MG1363中pMG36e-TOSL18质粒在有红霉素选择压力下的遗传稳定率。
表3：MG1363中pMG36e-SP-TOSL18质粒在无红霉素选择压力下的遗传稳定率。
表4：MG1363中pMG36e-SP-TOSL18质粒在有红霉素选择压力下的遗传稳定率。
TSOL18基因是由Gauci等克隆的一个cDNA片段，其长度为579bp，其中开放阅读框为390bp，可编码130个氨基酸的蛋白质，理论相对分子质量(Mr)为14.7kD。该基因存在于激活的TSO中，具有良好的免疫原性和抗原性，被认为是最具发展前途的侯选疫苗基因，受到了国内外学者的广泛关注，是当前猪带绦虫疫苗研究的热点。近年来，先后开展了TSOL18基因的重组蛋白疫苗、DNA疫苗、重组酵母疫苗、重组鼠伤寒沙门氏杆菌疫苗、重组双歧杆菌疫苗及重组BCG疫苗，上述疫苗已在动物模型中取得较好的免疫效果。随着疫苗研究的深入，人们发现重组蛋白疫苗需要经过基因克隆、表达和蛋白纯化等复杂过程，技术难度大，成本较高，同时它只能诱导体液免疫和Th细胞应答，不能诱导细胞毒性T淋巴细胞应答；DNA疫苗操作简单，能同时诱导体液免疫、Th细胞和CTL应答，但DNA可整合到宿主细胞的基因组中，有引起原癌基因活化和抑制基因失活的危险；重组毕赤酵母中表达蛋白存在过度糖基化，可能影响重组蛋白的合成与分泌，且糖基化后的蛋白具有高度异质性，会使重组蛋白发生功能改变；鼠伤寒沙门氏杆菌属于革兰阴性菌，其在体内表达产生的脂多糖毒素可能对宿主细胞有毒性，可能会干扰编码基因在宿主细胞中的正确表达和合成，并且存在细菌毒力返强的危险性；双歧杆菌属专性厌氧革兰氏阳性杆菌，不利于操作，目前仍不能像大肠杆菌一样广泛和常用，表达***不成熟，就其遗传背景和分子生物学特性等研究还不是很透彻，而且，经本课题组研究发现其保护效果不太令人满意(74.85％)；BCG作为一种减毒牛型分支杆菌，仍存在毒力作用，有返毒力的可能，可能会对宿主产生毒副作用，甚至导致感染结核病，作为疫苗表达效果不满意，且实验周期长，操作存在风险，推广困难。因此，有必要研究新型的猪带绦虫疫苗。
活载体疫苗是利用基因工程技术将保护性抗原的编码基因***病毒或细菌载体中，使其成为表达外源性抗原的重组病毒或细菌。其免疫动物后在机体内以天然的方式感染和加工抗原，诱导机体产生全面的免疫反应，从而起到免疫保护作用。目前用于这类疫苗的载体有沙门氏菌、牛痘病毒、BCG等，而相对于这些病毒和细菌载体，乳酸菌(Lactic acidbacteria,LAB)对于人体则更加安全。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是LAB中最重要的模式菌，应用范围于食品、医药领域密切相关。其生理生化特性简单，遗传背景清楚，作为疫苗递呈载体有独特优势：(1)为食品级微生物，乳制品发酵的主要成份，安全性高；(2)本身分泌蛋白较少，减少了载体微生物自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰，且不产生任何细胞外蛋白酶，不会引起分泌蛋白发生细胞外降解；(3)具有粘膜佐剂特性；(4)与乳酸杆菌不同之处，L.lactis基本不在胃肠道定植，不会危害肠道内正常菌群和造成潜在的基因污染及避免长期定植带来的耐受。基因工程重组L.lactis是将L.lactis作为工程菌，利用DNA重组技术将外源基因导入L.lactis中，依靠L.lactis在宿主的复制，分泌表达外源抗原，以诱导对疾病的特异性体液和细胞免疫，提高L.lactis激发的免疫效应。
1989年van de Guchte等以L.lactis乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础，构建质粒载体pMG36e，其大小约3.6kb，便于宿主菌携带，广泛应用于多种蛋白的表达。近年来，国内外学者将其进行改造，成功构建了食品级表达载体，对于食品、药品生产和食品级疫苗研制奠定了基础。因此，食品级表达载体pMG36e可能是构建重组L.lactis疫苗的理想载体。而就寄生虫领域，尚未见猪带绦虫重组L.lactis疫苗的报道。本研究采用全基因合成方法构建TSOL18和SP-TSOL18抗原编码基因，将其定向克隆入食品级表达载体pMG36e中，构建猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18和SP-TSOL18，经双酶切、PCR和测序鉴定，证实TSOL18和SP-TSOL18基因成功***pMG36e中，再将构建成功的重组质粒电穿孔转入L.lactis MG1363，构建猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis，从含红霉素抗性的GM17液体培养基中挑选阳性菌液为模板进行PCR鉴定，证实猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis构建成功。并通过SDS-PAGE分析显示TSOL18在胞外上清未检测到目标蛋白，但在胞内有检测到目标蛋白的表达，而SP-TSOL18在胞外上清与胞内沉淀都有检测到目标蛋白的表达，Western blot显示使用Anti-TSOL18抗体检测通过AKTA纯化后的TSOL18和SP-TSOL18蛋白，两种蛋白均在15D左右有目的条带，SP-TSOL18蛋白在胞内和胞外均出现特异性显色带，表明TSOL18基因可在L.lactis中表达，且表达的蛋白具有特异的抗原性，SP-TSOL18蛋白抗原性优于TSOL18蛋白。含有目的基因的质粒pMG36e-TOSL18，pMG36e-SP-TOSL18在MG1363乳酸球菌中连续传代20代时，在无红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为100％，在含红霉素抗性条件下，质粒稳定率均为99％。将各代次的质粒采用限制性内切酶Sac I/HindIII进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示大小正确，连续传至20代时，与原代质粒相符，pMG36E-TSOL18、pMG36e-SP-TOSL18质粒在乳酸球菌MG1363中连续传代20代时，均有较好的遗传稳定性。为猪囊尾蚴病疫苗的开发与利用提供了有力的参考依据。

Claims (6)

1.猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是，包含以下步骤：
1)、TSOL18基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSOL18基因序列，采用基于PAS的方法，在引物的两端各设计了Sac I和Hind III酶切位点和保护性碱基，合成749bp的SP-TSOL18基因；
2)、重组质粒pMG36e-SP-TSOL18的构建及鉴定：合成的目的基因与表达载体pMG36e用SacI/Hind III双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e-SP-TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定；
3)、猪带绦虫重组pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建及鉴定：
3.1)、乳球菌的活化及感受态制备：取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，然后收集菌体，用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体；
3.2)、重组质粒pMG36e-SP-TSOL18电转化MG1363：将获得的pMG36e-SP-TSOL18质粒与感受态MG1363混合，进行冰浴和电击，加入蔗糖MRS培养基，然后进行涂布红霉素GM17平板培养，选取阳性菌落再进行红霉素液体培养基培养；
3.3)、阳性克隆鉴定：取上述3.2)步骤的培养菌液，离心弃上清，再依次进行洗涤、重悬、沸水浴、冰浴、离心，取上清作为PCR模板待用；使用基因特异性的引物进行PCR鉴定，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
4)、蛋白表达鉴定：
4.1)、SDS-PAGE鉴定：选取未转化的乳酸球菌培养于GM17液体培养基中，挑取步骤3.3)鉴定为阳性的菌液，离心收集沉淀和上清；将沉淀在冰浴中进行超声破碎，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴4-8min，冷却后上样，通过SDS-PAGE检测上清和胞内的蛋白表达情况；
4.2)、通过AKTA纯化TSOL18蛋白，使用Anti-TSOL18抗体检测纯化后的蛋白在15D左右有无目的条带；
4.3)、Western blot鉴定：取AKTA纯化TSOL18蛋白进行Western blot鉴定分析。
2.根据权利要求1所述的猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是：所述步骤3.1)中，菌液接种后保持不通风，30℃培养过夜，至OD值为0.2-0.8，然后将培养物冰浴10min，离心收集菌体，并用冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体，再进行重悬菌体。
3.根据权利要求1所述的猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是：所述步骤3.2)中电击电转参数如下：电压2000V，电容25UF，电阻200Ω。
4.根据权利要求1所述的猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是：所述步骤3.3)中，使用基因特异性的引物为：正向引物F(5'ATGGTTTGTCGTTTTGCTT3')和反向引物R(5'TTATGAACGACGAACCTTTTTA 3')；反应体系为：以正向和反向引物各1.0ul，1ul基因组为模板，DNA聚合酶0.5ul，dNTP2.5ul，10×PCRbuffer5.0ul，UP to ddw50ul；PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30min，循环扩增30次，最后72℃复性10min。
5.根据权利要求1所述的猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是：所述步骤4.1)中，2×SDS上样缓冲液为：0.1mol/L Tris-HCl、pH6.8、10％二硫苏糖、4％SDS、0.2％溴酚蓝和20％甘油。
6.根据权利要求1所述的猪带绦虫重组乳酸乳球菌分泌型表达***的构建和鉴定方法，其特征是：所述步骤4.3)具体为：取步骤4.2)纯化后蛋白，加loading buffer煮沸冷却后取20ul上样，电泳条件：5％浓缩胶：90V30min；10％分离胶：120V，20min；转膜：分别叠放好三层滤纸、SDS-PAGE胶和PVDF膜，PVDF膜事先需要甲醇活化15s左右，使用转膜仪进行湿法转膜，恒压100V，60min；封闭：5％脱脂奶粉PBST溶液封闭膜，摇床37℃，2h，PBS漂洗5min；一抗孵育及染色，一抗孵育：4℃过夜；PBST在37℃漂洗5min×3，二抗孵育：抗体1:1500稀释，37℃1h；PBST在37℃漂洗5min×4；曝光2min，进行Westernblot鉴定分析。
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