CN110055204B - 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用 - Google Patents

一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用，本发明通过敲除spoⅡQ、pcf基因，获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL‑1ΔspoⅡQΔpcf，芽孢形成率降低至0.16％，摇瓶发酵培养重组菌α‑淀粉酶酶活提高了10.9％，5L发酵培养时重组菌α‑淀粉酶酶活提高了19.3％。本发明在一定程度上提高了地衣芽孢杆菌目标酶的发酵活力，改善了菌株发酵生产性能，可以为工业微生物的基因工程育种提供思路和方法借鉴。

Description

一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方 法及应用
技术领域
本发明涉及一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用，属 于基因工程技术领域。
背景技术
芽孢杆菌是酶制剂行业重要的发酵生产菌株，其中地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 代谢旺盛，酶系丰富，能规模化发酵生产α-淀粉酶等，在纺织、食品、饲料、医药等行业有 广泛应用。
芽孢杆菌发酵产酶过程中，尤其在菌体生长到达稳定期后，由于营养条件及环境条件的 改变，菌体开始形成芽孢。芽孢的生成不利于高密度连续发酵，且会影响发酵过程控制，如 发酵液粘度增加、泡沫增多等，影响气质交换，容易造成逃液等，增加染菌机会，增加发酵 成本；此外，芽孢杆菌在生长过程中常伴有菌体自溶现象，不利于生物量的积累，缩短有效 的发酵周期，降低发酵生产效率。
中国专利文件CN108929883A(申请号201810886538.5)公开了芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，该发明通过***式失活的方式，将spoⅡE部分基因 片段与Cmr基因融合，融合基因spoⅡE-Cmr***克劳氏芽孢杆菌spoⅡE基因序列中，使spoⅡE基因无法正常表达而失活，spoⅡE基因失活菌株不仅可以使芽孢生成率显著降低至0.3％，并且使工程菌株生长速度比原始菌株明显加快，实现了在更短时间内细胞数量的积累和更高活力的淀粉酶的发酵生产。
中国专利文件CN108949785A(申请号201810886539.X)公开了芽孢形成相关基因spo0A 在产酶方面的作用，通过***式失活的方式，将spo0A部分基因片段与Cmr基因融合，融合 基因spo0A-Cmr***克劳氏芽孢杆菌spo0A基因序列中，使spo0A基因无法正常表达而失活， 细胞代谢发生变化，在菌株芽孢生成率降低和蛋白酶削弱表达的同时，使淀粉酶酶活较之出 发菌株提高85.8％，果胶酶酶活提高235％，脂肪酶酶活提高70.0％。
上述技术方案均发现芽孢形成相关基因spo家族通过敲除后，可以提高淀粉酶的酶活， 因此，寻找更多的具有相关功能的基因，对于后续研究和制备淀粉酶具有非常显著的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵 产酶的方法及应用，所得到的基因工程菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf 较之出发菌株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1在发酵生产性能方面有显著提高。
本发明技术方案如下：
一种高产α-淀粉酶的重组菌，将产α-淀粉酶微生物中的芽孢形成相关基因spoⅡQ和溶 菌相关基因pcf敲除后获得，所述的芽孢形成相关基因spoⅡQ核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示，溶菌相关基因pcf核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述产α-淀粉酶微生物为地衣芽孢杆菌；进一步优选的，所述地衣 芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1。
上述高产α-淀粉酶的重组菌的制备方法，步骤如下：
(1)敲除产α-淀粉酶微生物的芽孢形成基因spoⅡQ，获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ；
(2)敲除步骤(1)制得的重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ中菌 体自溶基因pcf，获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf；
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，敲除产α-淀粉酶微生物的芽孢形成基因spoⅡQ 的具体步骤如下：
步骤1：以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计上、下游同源臂引物spoⅡQF1、spoⅡQR1以及spoⅡQF2、spoⅡQR2，进行PCR扩增，获得spoⅡQ上、下游同源臂片段， 然后通过重叠PCR将同源臂连接获得融合片段spoⅡQF-spoⅡQR；
所述上、下游同源臂引物spoⅡQF1、spoⅡQR1以及spoⅡQF2、spoⅡQR2的核苷酸序列如下所示：
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT
spoⅡQR1:TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
spoⅡQF2:AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA
spoⅡQR2:CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT
步骤2：利用BamHⅠ与NotⅠ对敲除体pTOPO-Cmr进行双酶切、纯化，利用无缝克隆 技术将步骤1获得的融合片段与载体连接，获得重组载体pTOPO-Cmr-spoⅡQ；
步骤3：制备地衣芽孢杆菌感受态细胞，将步骤2获得的重组载体电转化入地衣芽孢杆 菌菌体中，涂布含氯霉素LB固体培养基上进行初筛，初筛菌株转接至含5％木糖的LB液体 培养基复筛，制得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，敲除重组菌ΔspoⅡQ中菌体自溶基因pcf的具 体步骤如下：
步骤I：以地衣芽孢杆菌基因组DNA以及pHT01质粒为模板，设计上下游引物pcfF、pcf R以及CmrF、CmrR，PCR扩增获得获得pcf基因片段以及氯霉素抗性Cmr基因片段，通 过重叠PCR将pcf、Cmr基因片段连接获得融合片段pcf-Cmr；
所述引物pcfF、pcf R以及CmrF、CmrR核苷酸序列如下：
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
CmrF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
CmrR_CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
步骤II：对步骤I获得的pcf-Cmr利用BamHⅠ进行单酶切、纯化后电转化至重组菌地衣 芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ菌体中；
步骤III：将步骤II获得的转化菌涂布含氯霉素的LB固体培养基上，筛选具有氯霉素 抗性的阳性基因缺失重组菌，即得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf；
一种利用上述高产α-淀粉酶的重组菌制备α-淀粉酶的方法，步骤如下：
(i)将高产α-淀粉酶的重组菌进行活化，制得活化菌体；
(ii)将步骤(i)制得的活化菌体经扩大培养，制得发酵菌体；
(iii)将步骤(ii)制得的发酵菌体接种至发酵培养基，经37℃，300rpm条件下发酵84h，经固液分离，取液体，纯化，制得α-淀粉酶；
所述发酵培养基组份如下：
胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、可溶性淀粉20g/L氯化钠10g/L、葡萄糖1g/L、甘油2.5％(体积分数)，pH 7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，甘油管取菌液在LB平板划线，37℃培养24h，挑取单菌落转接至50mL的液体LB培养基，37℃、200rpm培养20h传代两次制得活化菌 体。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，将步骤(i)获得的活化菌体按2％接种量，转接至100mL LBPG培养基37℃、200rpm进行扩培。
所述LBPG培养基组份如下：
胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖1g/L、甘油2.5％(体积分数)，pH 7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，利用高速冷冻离心机将发酵液在4℃、12000rpm 条件下离心10min获得粗酶液，用于后续酶活测定。
有益效果
1、发明人通过研究发现芽孢形成相关基因spoⅡQ不同于现有技术中已知的spo族基因 的特性，敲除spoⅡQ后并不能直接提高α-淀粉酶的产量，但当其同时与具有促进菌体自溶 基因pcf敲除后，可以显著提升α-淀粉酶的产量；
2、本发明通过基因敲除的方式获得重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf，在LB培养基培养，重组菌芽孢生成率降低至出发菌菌株的0.16％，菌 体生长更加稳定，摇瓶发酵显示重组菌较出发菌α-淀粉酶酶活提高了10.9％；5L发酵罐发 酵显示，重组菌较出发菌α-淀粉酶酶活提高了19.3％，较摇瓶发酵时α-淀粉酶酶活提高了3.4倍。在发酵中后期，重组菌较出发菌发酵液中的溶氧高，泡沫产量少，发酵性能较出发菌有一定提高。
附图说明
图1、本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果图片；
其中，(a)、spoⅡQ上游同源臂片段电泳结果图片；图中：泳道1、2为600bp的上游同源臂片段，泳道M为Marker；
(b)、spoⅡQ下游同源臂片段电泳结果图片；图中：泳道1、2为600bp的下游同源臂片段，泳道M为Marker；
(c)、融合片段spoⅡQF-spoⅡQR的电泳结果图片；图中：泳道1、2为1200bp的目 的片段，泳道M为Marker；
图2、本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果图片；
其中，(a)、pcf基因片段电泳结果图片；图中：泳道1、2、3为418bp的pcf部分基因片段，泳道M为Marker；
(b)、Cmr基因片段电泳结果图片；图中：泳道1、2、3为1245bp的Cmr基因片段， 泳道M为Marker；
(c)、融合片段pcf-Cmr的电泳结果图片；图中：泳道1、2、3为1663bp的目的片段，泳道M为Marker；
图3为本发明实施例3中摇瓶培养出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1与重组 菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ芽孢形成率测定结果柱状图；
图4为本发明实施例4中摇瓶发酵出发菌与重组菌菌体生长周期测定结果；
图5为本发明实施例5中出发菌与重组菌α-淀粉酶活力平板初测结果照片；
其中，(a)、出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1结果图片，(b)、重组菌地衣 芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1spoⅡQ结果图片，(c)重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1Δpcf结果图片，(d)、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1spoⅡQΔpcf结果图 片；
图6为本发明实施例5中出发菌与重组菌摇瓶发酵α-淀粉酶酶活测定结果柱状图；
图7为本发明实施例6中5L发酵罐发酵出发菌与重组菌生长测定结果曲线图其中(a) 为生长曲线(b)为溶氧曲线；
图8为本发明实施例6中5L发酵罐发酵出发菌与重组菌α-淀粉酶酶活测定结果柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
实施例中的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1购自美国模式培养物集存库，菌种编 号ATCC NO.27811。
实施例1重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ的构建
以地衣芽孢杆菌基因组为模板，进行spoⅡQ基因上、下游同源臂spoⅡQF、spoⅡQR以及融合片段spoⅡQF-spoⅡQR PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT
spoⅡQR1:TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
spoⅡQF2:AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA
spoⅡQR2:CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，600bp及1200bp左右出现特异性条带，结果见 图1(a)、(b)、(c)。
利用BamHⅠ与NotⅠ对敲除体pTOPO-Cmr进行双酶切，按照纯化试剂盒提供的步骤进行纯化，利用无缝克隆将融合片段与载体连接，连接体系如下表所示:
Figure BDA0002056083700000051
利用电转化将重组载体转入地衣芽孢杆菌菌体，37℃、180rpm复苏1h，涂布含氯霉素抗性平板筛选发生一次同源单交换菌株，将成功发生一次同源交换菌株转接至含5％木糖 的LB液体培养基37℃、200rpm传代3次，每代24h筛选发生第二次同源单交换菌株，最 终成功构建重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ。
实施例2重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf、地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1Δpcf的构建
由于重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf与重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf构建过程与方法相同因此只以重组菌地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf为例进行说明；
以地衣芽孢杆菌基因组DNA以及pHT01质粒为模板，PCR扩增pcf、Cmr以及重组片段pcf-Cmr，使用引物核苷酸序列如下：
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
CmrF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
CmrR CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别在600bp、1200bp、1600bp左右出现特异性条带，结果见图2(a)、(b)、(c)。成功获得pcf-Cmr重组片段。
利用BamHⅠ对重组片段pcf-Cmr单酶切，之后进行纯化，利用电转化将重组片段转入 spoⅡQ基因缺失菌，37℃、180rpm复苏1h，涂布含氯霉素抗性平板，筛选阳性重组菌， 最终成功构建地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf重组菌。
实施例3出发菌与重组菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ芽孢形成率和酶活测定
接种环甘油管取出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1与重组菌地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ菌液一环划线于LB平板，37℃培养24h，挑取平板上的 单菌落接种于50mL的液体LB培养基，37℃、200rpm培养20h传代两次；取第2代活化 的菌液按2％的接种量将出发菌株与重组菌转接至100mL液体LB培养基，37℃，200rpm 摇瓶培养36h，取出发菌及重组菌菌液各2mL，于80℃水浴中热处理15min，梯度稀释 后涂布LB固体培养基，37℃培养20h，平板菌落计数，根据公式芽孢生成率＝芽孢量/总菌 量×100％，计算出发菌及重组菌芽孢生成率。结果见图3，出发菌株地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1芽孢数为4.62×108CFU/mL，菌体总数为5.79×108CFU/mL，芽孢生 成率约为79.82％；重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡ芽孢数为0.51×106 CFU/mL，菌体总数为3.19×108CFU/mL，芽孢生成率约为0.16％。
敲除基因spoⅡQ可以获得芽孢缺失菌株，但芽孢缺失工程菌菌体易自溶，生物量较出 发菌株降低。在地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ基础上构建重组菌株地衣芽 孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf降低芽孢缺失菌的菌体自溶。
出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1与重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ分别发酵60h与48h达到最大酶活，分别为391U/mL、340U/mL；重组菌 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ与出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1 相比较，α-淀粉酶发酵活力有所下降。
实施例4摇瓶培养出发菌与重组菌生长周期的测定
出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1及重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf、重组菌地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf按实施例1的方法进行活化，取活化的菌液2mL接种 于100mL LBPG液体培养基37℃、200rpm摇瓶培养，期间每隔4-6h取样测定菌体浓度 OD600，并绘制生长曲线，结果见图4。所述涉及到的培养基，其组分如下：
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，(均为质量分数)pH7.0。
LBPG培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，葡萄糖0.1％，(均为质量分数)甘油2.5％(体积分数)pH7.0。
实施例5出发菌与重组菌摇瓶发酵菌体发酵产酶的测定
出发菌株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQ、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf和重组菌株地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf接种于固体培养基，37℃培养48h，平板滴加碘液并 观察透明圈大小；结果见图5(a)、(b)、(c)、(d)，淀粉水解透明圈直径大小分别为2.7cm、 2.2cm、3.1cm、3.4cm，初步鉴定重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf和重组 菌株地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf发酵产α-淀粉酶的能力高于出发菌。 出发菌株与重组菌株分别以2％的接种量接种于100mL液体发酵培养基，37℃、200rpm培 养，期间每隔12h取样按照国标GB/T24401-2009方法测定α-淀粉酶酶活，结果见图6。出 发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf 与地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf都是在发酵60h达到最大酶活，分别 为391U/mL、407U/mL和434U/mL，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQ在发 酵48h达到最大酶活340U/mL，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf较地衣 芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1酶活提高了10.9％；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1ΔspoⅡQΔpcf较重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf酶活提高了6.6％；进 一步确定构建的的重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf能有效提高α- 淀粉酶发酵活力。
α-淀粉酶活力定义：1ml液体酶，于70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。
所述发酵培养基组分如下：
可溶性淀粉2％、胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.1％、甘油2.5％ (均为质量分数)pH 7.0。
实施例6出发菌与重组菌5L罐菌体发酵性能的测定
按实施例1中的方法对出发菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1、重组菌地衣芽孢 杆菌(B.licheniformis)DL-1Δpcf及重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf 进行活化，按5％接种至5L发酵罐中，发酵液初始总量为3L，pH7.5，37℃，350rpm条 件下进行发酵，发酵周期84h，期间每隔6-8h取样测定菌体浓度OD600，每隔12h取样进 行α-淀粉酶酶活测定，菌体生长曲线见图7。与摇瓶发酵相比，5L罐发酵时菌体浓度更高， 且菌体生长更加稳定；α-淀粉酶酶活测定结果见图8，重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) DL-1Δpcf、重组菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1ΔspoⅡQΔpcf酶活达到1397U/mL、 1488U/mL，较出发菌α-淀粉酶酶活分别提高12.1％、19.3％。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 696
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
atgaaagagg aagaaaagaa tcgtacttcc aaaatcacaa agctgcaaca attttttcgt 60
aaacgctggg tatttccggc catctatttg acaagtgccg tcgttgtatt aaccgccgtt 120
ctatggtatc aatcggcttc taacaacgat gtaaaagacc agcttgcaga cgatggcaag 180
aaatcagcct atgataaccg ggatgatgcg gtagaagtag gcaaaccagt cgaaaatgtc 240
gcaatgccgg ttgctgattc tgaaaatgtt tccgtcgtta aaaagttttt tgaaactgac 300
gcaactaaag aagagaaaga agcagcactt gtaaactata ataacacgta cagcatgagc 360
aaaggtatcg acttggctga gaaagacgga aaaacatttg atgtttccgc atctctaagc 420
ggtacggtca tcaaagctgc aaaagaccct gtactgggct acgttgttga agttgaacat 480
gaagatggtt tatcaactgt gtatcagtct ctttctgaag taagcgtcaa acaaggtgac 540
aagattgaac aaaatcaagt catcggaaaa gcaggcaaaa acctttacaa tgaagaaggc 600
ggaaaccatg tgcattttga aatccgcaaa gacggtgttg cgctaaaccc gctgaacttc 660
atggacaagc cggtctccag cattgaaaaa gcgtaa 696
<210> 2
<211> 504
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 2
atggaagatt tgcttttcga atataaaaga gcgctgaaaa acacgaaaaa attgtataag 60
ccctatcaag atgaacaagg gctgacggct gaacagctga atgataaaaa actgatcaga 120
aacatgatga ccgatttgga atatgtgatc gactggcttg aaaacggaag agaacctgga 180
atcagacggg cgattgacag gcgcgactct tataagcgga tgctcctgaa agatccgcgg 240
atcatcgaca cgttttcaga acagagtgca tttgaaccgg ctcaggaagt gtcagcatac 300
gataaagccc ggattgaatc agcgctgtct gcccttacgg cacgcgaaaa agaaatcttc 360
attttacata aggtcgaaca gttttcctat gagcggattg ccgccatgct cggcatcaaa 420
aagtctactg ttcaaaccaa tgtgaaacgg gcgcagctga aaatcgcgaa acagatcgaa 480
aagcctctcg attgtatggc ataa 504

Claims (9)

1.一种高产α-淀粉酶的重组菌，将产α-淀粉酶微生物中的基因spoⅡQ和基因pcf敲除后获得，所述的基因spoⅡQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因pcf核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述产α-淀粉酶微生物为地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1，来源于美国模式培养物集存库，菌种编号ATCC NO.27811。
2.权利要求1所述高产α-淀粉酶的重组菌的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）敲除产α-淀粉酶微生物的基因spoⅡQ，获得重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQ；
（2）敲除步骤（1）制得的重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQ中基因pcf，获得重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQΔpcf。
3.权利要求2所述高产α-淀粉酶的重组菌的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，敲除产α-淀粉酶微生物的芽孢形成基因spoⅡQ的具体步骤如下：
步骤1：以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，设计上、下游同源臂引物spoⅡQF1、spoⅡ QR1以及spoⅡQF2、spoⅡQR2，进行PCR扩增，获得spoⅡQ上、下游同源臂片段，然后通过重叠PCR将同源臂连接获得融合片段spoⅡQF-spoⅡQR；
所述上、下游同源臂引物spoⅡQF1、spoⅡQR1以及spoⅡQF2、spoⅡQR2的核苷酸序列如下所示：
spoⅡQF1：CATCGCCAGTCACTAGGATCCACGCCGAGGACGTAGCCT；
spoⅡQR1: TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT；
spoⅡQF2: AAAGCGGGACATGTTCAGCGAGGGATAATGCCAAGCACGGTAA；
spoⅡQR2: CAGTATTGACTGCAGGCGGCCGCAAGCTTGAACGGCTGCCTATT；
步骤2：利用BamHⅠ与NotⅠ对敲除体pTOPO-Cmr进行双酶切、纯化，利用无缝克隆技术将步骤1获得的融合片段与载体连接，获得重组载体pTOPO-Cmr-spoⅡQ；
步骤3：制备地衣芽孢杆菌感受态细胞，将步骤2获得的重组载体电转化入地衣芽孢杆菌菌体中，涂布含氯霉素LB固体培养基上进行初筛，初筛菌株转接至含5%木糖的LB液体培养基复筛，制得重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQ。
4.权利要求2所述高产α-淀粉酶的重组菌的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，敲除重组菌ΔspoⅡQ中菌体自溶基因pcf的具体步骤如下：
步骤I：以地衣芽孢杆菌基因组DNA以及pHT01质粒为模板，设计上下游引物pcfF、pcfR以及Cm rF、Cm rR，PCR扩增获得获得pcf基因片段以及氯霉素抗性Cm r基因片段，通过重叠PCR将pcf、Cm r 基因片段连接获得融合片段pcf-Cm r；
所述引物pcfF、pcfR以及Cm rF、Cm rR核苷酸序列如下：
pcfF CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG
pcfR TTACCGTGCTTGGCATTATCCCTCGCTGAACATGTCCCGCTTT
Cm rF CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC
Cm rRCGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG
步骤II：对步骤I获得的pcf-Cm r利用BamHⅠ进行单酶切、纯化后电转化至重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQ菌体中；
步骤III：将步骤II获得的转化菌涂布含氯霉素的LB固体培养基上，筛选具有氯霉素抗性的阳性基因缺失重组菌，即得重组菌地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）DL-1ΔspoⅡQΔpcf。
5.一种利用权利要求1所述高产α-淀粉酶的重组菌制备α-淀粉酶的方法，其特征在于，步骤如下：
（i）将高产α-淀粉酶的重组菌进行活化，制得活化菌体；
（ii）将步骤（i）制得的活化菌体经扩大培养，制得发酵菌体；
（iii）将步骤（ii）制得的发酵菌体接种至发酵培养基，经37 ℃，300 rpm条件下发酵84h，经固液分离，取液体，纯化，制得α-淀粉酶；
所述发酵培养基组份如下：
胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、可溶性淀粉20 g/L氯化钠10 g/L、葡萄糖1 g/L、甘油2.5%（体积分数）， pH 7.0。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（i）中，甘油管取菌液在LB平板划线，37 ℃培养24 h，挑取单菌落转接至50 mL的液体LB培养基，37 ℃、200 rpm培养20 h传代两次制得活化菌体。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，将步骤（i）获得的活化菌体按2%接种量，转接至100 mL LBPG培养基37 ℃、200 rpm进行扩培。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LBPG培养基组份如下：
胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖1 g/L、甘油2.5% （体积分数），pH 7.0。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（iii）中，利用高速冷冻离心机将发酵液在4 ℃、12000 rpm条件下离心10 min获得粗酶液，用于后续酶活测定。
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