CN108148116A - 一种鲜味肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲜味肽及其制备方法和应用，该鲜味肽包括氨基酸序列为Ser‑Ser‑Arg‑Asp‑Glu‑Gln‑Ser‑Arg的多肽，以及该多肽的多拷贝串联多肽。制备方法为：鲜味肽编码基因设计及合成；然后将基因片段与载体质粒进行酶切、连接，得重组表达载体；再将重组表达载体转化至宿主菌感受态细胞中，并进行培养与筛选，得阳性表达工程菌；最后对阳性表达工程菌进行发酵培养，并将发酵液经超声波破碎、亲和柱纯化、过夜透析后，得鲜味肽纯化液。本发明不仅提供了一种鲜味肽，而且解决了鲜味肽制备周期较长、产率低以及纯度低的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种鲜味肽及其制备方法与应用。
背景技术
鲜味肽是一类能够弥补或强化食品原有风味的多肽，它可以改善食品鲜度、提高味觉感知度、增进进食者的食欲，因其较高的滋味特性、生理活性及营养价值，被逐渐运用在高档复合调味品中，是极具市场潜力的营养、健康、安全的绿色产品。
目前鲜味肽研究处于起步阶段，制备工艺较传统，现有的鲜味肽制备方法主要有两种：酶解提取法和化学合成法。酶解提取法主要步骤包括酶解制备-分离纯化，但存在分离纯化步骤复杂，制备周期较长、产率低、纯度低等问题。而化学合成存在副产物多、成本较高、产量低等问题，限制了鲜味肽在食品调味品中的工业化应用。因此，急需寻找一种大量、快速及高纯度的生物制备方法，促进鲜味肽在调味品领域的发展与应用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种鲜味肽及其制备方法和应用，以解决鲜味肽制备周期长、产率低以及纯度低的技术问题。
为了达到上述目的，本发明首先先提供一种鲜味肽，该鲜味肽从大豆酶解物中获得，其包括氨基酸序列为Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg的多肽，以及该多肽的多拷贝串联多肽，而且多拷贝串联多肽由多肽单体首尾相连获得，不含氨基酸间隔序列。
为了能够在短时间内获得大量高纯度的上述鲜味肽，本发明提供了一种鲜味肽生物制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)设计并合成能编码上述鲜味肽的基因片段；
(2)将步骤(1)所得基因片段和载体质粒进行酶切、连接，得重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化至宿主菌感受态细胞内，并对其进行培养、筛选，得阳性表达工程菌；
(4)对阳性表达工程菌进行发酵培养，将产生的发酵液经超声破碎、亲和柱纯化以及透析处理后，得鲜味肽纯化液。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做以下改进。
进一步，步骤(1)合成的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，载体质粒为pMA09质粒。
进一步，步骤(2)中酶切体系为：鲜味肽目的基因或载体质粒80μL，10×K缓冲液10μL，Nde I 5μL，EcoR I 5μL，；酶切温度为37℃，酶切时间为3～6h。
进一步，步骤(2)中连接体系为：酶切后的鲜味肽目的基因6μL，酶切后的载体质粒2μL，T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA高效连接酶1μL；连接温度为16℃，连接反应时间为0.5～2h。
进一步，宿主菌为具有食品安全性的枯草芽孢杆菌。
进一步，步骤(4)中发酵时间为25～48h。
本发明的有益效果是：本发明的鲜味肽生物制备方法中，利用枯草芽孢杆菌作为宿主菌，由于枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白质分泌能力、非致病性及良好的发酵基础及生产能力，能够在短时间内生产获得大量目的鲜味肽，制备周期大大缩短；而且制备方法为生物制备法，最终所制得的鲜味肽纯度高，操作简单，环境污染小，易扩大至工业化生产，所制备出的鲜味肽在调味品或保健品的生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为单倍鲜味肽蛋白电泳结果图；M代表标准蛋白，1代表单倍鲜味肽；
图2为串联鲜味肽蛋白电泳结果图；M代表标准蛋白，1代表串联鲜味肽；
图3为单倍鲜味肽感官评价雷达图；
图4为10×鲜味肽感官评价雷达图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明作进一步描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
1.鲜味肽高效表达载体的构建
(1)鲜味肽基因合成
以具有Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg(SSRDEQSR)氨基酸序列的鲜味肽为目标产物，选用枯草芽孢杆菌B.subtilis 168作为表达宿主，对目标鲜味肽进行编码基因密码子优化，获得表达基因，该基因序列如SEQ ID NO.1，最后合成5'端及3'端分别带有NdeI、EcoR I酶切位点的鲜味肽基因序列。
(2)双酶切构建重组表达载体
以枯草大肠商业穿梭载体pMA09为载体质粒，载体核心操作序列如SEQ ID NO.2。将合成后的鲜味肽基因和pMA09载体质粒进行Nde I/EcoR I双酶切，然后利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收目标酶切片段，得到带有粘性末端的鲜味肽目的基因和带有粘性末端的线性载体质粒pMA09，再将两者通过T4高效连接酶进行连接，获得鲜味肽重组载体pMA09-SSRDEQSR，其序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，酶切反应体系(共100μL)和反应程序分别为：鲜味肽目的基因或表达质粒pMA09 80μL、10×K缓冲液10μL、Nde I 5μL、EcoR I 5μL；酶切温度为37℃，酶切时间为3h。
连接体系(10μL)和反应程序分别为：酶切后的鲜味肽目的基因6μL、酶切后的表达质粒pMA09 2μL、T4DNA连接缓冲液1μL、T4DNA高效连接酶1μL；连接温度为16℃，连接反应时间为0.5h。
2.鲜味肽高效表达***的构建
通过饥饿化学法制备B.subtilis 168感受态细胞，每0.5mL感受态细胞加入10μL串联鲜味肽重组表达质粒pMA09-10SSRDEQSR，于37℃、100rpm/min培养90min，涂布kana抗性平板筛选阳性转化子，获得鲜味肽高效表达工程菌B.subtilis 168/pMA09-SSRDEQSR。
3.鲜味肽高效表达
挑取上述抗性筛选获得的工程菌B.subtilis 168/pMA09-SSRDEQSR单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，在200rpm、37℃条件下过夜培养。之后按2％接种量转入含有30mL LB培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，发酵培养在200rpm、37℃条件下进行，发酵时间30h。
4.Tris-tricine-SDS-PAGE检测鲜味肽
取25μL鲜味肽发酵液，加入6×SDS上样缓冲液煮沸5min，12000rpm离心2min，取上清蛋白液，于4％浓缩胶、10％积层胶、16％分离胶的Tris-tricine-SDS-PAGE进行蛋白电泳，电泳结果如图1。
5.鲜味肽亲和层析纯化及透析
(1)取发酵液于12000rpm离心10min，收集菌体，然后用磷酸缓冲液(含20mmol/L咪唑，pH 7.4)重悬，超声破碎约30min(300W，工作3s，间隔2s)；
(2)将细胞破碎液于12000rpm条件下离心10min；取上清液以1mL/min的流速进行亲和层析纯化，设五个梯度水平洗脱(4.2％5mL，8.3％5mL，22％5mL，58.3％5mL，100％5mL)，收集咪唑浓度约为250～350mmol/L对应峰的蛋白部分，获得鲜味肽纯化液。
(3)将收集的鲜味肽纯化液置于透析袋(MW:1500)中于1000mL超纯水中透析24h后获得高纯度的单倍鲜味肽透析液。
实施例二
1.串联鲜味肽高效表达载体的构建
(1)串联鲜味肽基因设计及合成
将鲜味肽SSRDEQSR无间隔地串联10倍，选用枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800作为表达宿主，对串联鲜味肽进行编码基因密码子优化，获得表达基因，该基因序列如SEQ IDNO.4，最后合成5'端及3'端分别带有Nde I、EcoR I酶切位点的鲜味肽基因序列。
(2)双酶切构建表达载体
以枯草大肠穿梭载体pMA09为表达载体。将合成后的鲜味肽基因和pMA09载体质粒进行Nde I/EcoR I双酶切，然后利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收目标酶切片段，得到带有粘性末端的鲜味肽目的基因和带有粘性末端的线性载体质粒pMA09，再将两者通过T4高效连接酶进行连接，获得鲜味肽重组载体pMA09-10SSRDEQSR。
其中，酶切反应体系(共100μL)和反应程序分别为：鲜味肽目的基因或表达质粒pMA09 80μL、10×K缓冲液10μL、Nde I 5μL、EcoR I 5μL；酶切温度为37℃，酶切时间为6h。
连接体系(10μL)和反应程序分别为：酶切后的鲜味肽目的基因6μL、酶切后的表达质粒pMA09 2μL、T4DNA连接缓冲液1μL、T4DNA高效连接酶1μL；连接温度为16℃，连接反应时间为1h。
2.串联鲜味肽高效表达***的构建
通过饥饿化学法制备B.subtilis WB800感受态细胞，每0.5mL感受态细胞加入10μL串联鲜味肽重组表达质粒pMA09-10SSRDEQSR，于37℃、100rpm/min培养90min，涂布kana抗性平板筛选阳性转化子，获得10倍串联的鲜味肽高效表达工程菌B.subtilis WB800/pMA09-10SSRDEQSR。
3.串联鲜味肽高效表达
取上述抗性筛选获得的工程菌B.subtilis WB800/pMA09-10SSRDEQSR，接种至含有kana抗生素的5mL LB培养基中，在200rpm、37℃条件下培养至OD600＝0.6。之后按2％接种量转入含有30mL LB培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，发酵培养在200rpm、37℃条件下进行，发酵时间25h。
4.Tris-tricine-SDS-PAGE检测串联鲜味肽
取25uL串联鲜味肽发酵液，加入6×SDS上样缓冲液煮沸5min，12000rpm离心2min，取上清蛋白液，于4％浓缩胶、10％积层胶、16％分离胶的Tris-tricine-SDS-PAGE进行蛋白电泳，电泳结果如图2。
5.串联鲜味肽的纯化及透析
(1)取发酵液于10000rpm离心15min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(含20mmol/L咪唑，pH 7.4)重悬菌体，并于冰浴中超声破碎细胞30min(300W，工作3s，间隔2s)；
(2)取胞破碎液，于12000rpm离心10min；取上清液以1mL/min的流速进行亲和层析纯化，设五个梯度水平洗脱(4.2％5mL，8.3％5mL，22％5mL，58.3％5mL，100％5mL)，收集咪唑浓度约为250～350mmol/L对应峰的蛋白部分，获得串联鲜味肽纯化液。
(3)将收集的串联鲜味肽纯化液置于透析袋(MW:5000)中于1000mL超纯水中透析24h后获得高纯度的串联鲜味肽透析液。
结果分析
1.单倍鲜味肽感官验证
以实施例一中获得的单倍鲜味肽纯化透析液作为感官评价的样品溶液。以0.35％的食盐溶液，1％的蔗糖溶液，0.08％的柠檬酸溶液，0.35％的味精溶液，0.08％的奎宁溶液分别作为咸、甜、酸、鲜、苦五种味觉的呈味基础溶液，以基础溶液为5分，采用10分制对目标呈味溶液进行感官评价打分，从而评定酶解纯化产物的呈味强度。感官评价由经训练有素的专业感官评价小组(男女对半)进行，每个评价样品都随机编号后，打乱顺序交给评价员进行滋味评定，同种样品每名评价员评价3次，取3次测定平均值为最终评价分数。每份样品均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。感官评分数据利用SPSS21.0进行分析，最终感官评价结果如图3。
从图3中可以看出，单倍鲜味肽的鲜、咸、甜味较为明显，苦、酸味较弱。而大众较为喜欢鲜、咸、甜味，对苦、酸味的接受度较低，表明该单倍鲜味肽能够明显改善食物味道，在食物提鲜方面具有广阔应用前景。
(2)串联鲜味肽美拉德反应及感官验证
以实施例2中获得的串联鲜味肽纯化透析液作为感官评价的样品溶液，取含量为10％的串联鲜味肽溶液，添加木糖至终浓度为11.5％，调节pH值至7.2，于50mL螺旋密封的反应瓶中110℃油浴搅拌加热反应120min，反应结束后冷却，用于后续分析及感官评定，每一反应重复3次。分别设清水和鸡汤为本底，加入串联鲜味肽美拉德反应产物于80℃恒温水浴加热20min后进行感官评价，风味感官评价由经训练有素的专业感官评价小组(男女对半)进行，每个评价样品都随机编号后，打乱顺序交给评价员进行滋味评定，同种样品每名评价员评价3次，取3次测定平均值为最终评价分数。每份样品均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。感官评分数据利用SPSS 21.0进行分析，最终感官评价结果如图4。
从图4中可以看出，串联鲜味肽在清水和鸡汤中的鲜、咸、甜味均较为明显，苦、酸味均较弱。而大众较为喜欢鲜、咸、甜味，对苦、酸味的接受度较低，表明该单倍鲜味肽能够明显改善食物味道，在食物提鲜方面具有广阔应用前景。
序列表
<110> 西华大学
<120> 一种鲜味肽及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaattccat atgtcttctc gtgatgaaca atctcgtcat catcatcatc atcattgaat 60
tcc 63
<210> 2
<211> 389
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa 60
cccccctttg ctgaggtggc agagggcagg tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa 120
agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca 180
cactttatga atataaagta tagtgtgtta tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga 240
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tgcagccgtc agcaaaagcc gctgaattc 389
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa 60
cccccctttg ctgaggtggc agagggcagg tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa 120
agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca 180
cactttatga atataaagta tagtgtgtta tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga 240
gcgaaaatgc ctcacatttg tgccacctaa aaaggagcga tttacatatg tcttctcgtg 300
atgaacaatc tcgtcatcat catcatcatc attgaattc 339
<210> 4
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatcttctca aaaaatacta cctgtccctt gctgattttt aaacgagcac gagagcaaaa 60
cccccctttg ctgaggtggc agagggcagg tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa 120
agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactgc cgacagcctc gcagagcaca 180
cactttatga atataaagta tagtgtgtta tactttactt ggaagtggtt gccggaaaga 240
gcgaaaatgc ctcacatttg tgccacctaa aaaggagcga tttacatatg tcttctcgtg 300
atgaacaatc tcgttcttct cgtgatgaac aatctcgttc ttctcgtgat gaacaatctc 360
gttcttctcg tgatgaacaa tctcgttctt ctcgtgatga acaatctcgt tcttctcgtg 420
atgaacaatc tcgttcttct cgtgatgaac aatctcgttc ttctcgtgat gaacaatctc 480
gttcttctcg tgatgaacaa tctcgttctt ctcgtgatga acaatctcgt catcatcatc 540
atcatcattg aattc 555
Claims (10)
1.一种鲜味肽，其特征在于：包括氨基酸序列为Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg的多肽，以及该多肽的多拷贝串联多肽。
2.根据权利要求1所述的鲜味肽，其特征在于：所述多拷贝串联多肽由多肽单体首尾相连获得，不含氨基酸间隔序列。
3.如权利要求1或2所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计并合成能编码权利要求1或2所述鲜味肽的基因片段；
(2)将步骤(1)所得基因片段和载体质粒进行酶切、连接，得重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化至宿主菌感受态细胞内，并对其进行培养、筛选，得阳性表达工程菌；
(4)对阳性表达工程菌进行发酵培养，将培养的发酵液经超声破碎、亲和柱纯化以及透析处理后，得鲜味肽纯化液。
4.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)合成的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于：所述载体质粒为pMA09质粒。
6.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中酶切体系为：鲜味肽目的基因或载体质粒80μL，10×K缓冲液10μL，Nde I 5μL，EcoR I 5μL；酶切温度为37℃，酶切时间为3～6h。
7.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中连接体系为：酶切后的鲜味肽目的基因6μL，酶切后的载体质粒2μL，T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA高效连接酶1μL；连接温度为16℃，连接反应时间为0.5～2h。
8.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于：所述宿主菌为具有食品安全性的枯草芽孢杆菌。
9.根据权利要求3所述的鲜味肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中发酵时间为25～48h。
10.权利要求1或2所述的鲜味肽在制备调味品或保健品中的应用。
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