CN108660191A - 一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法,包括样本核酸提取、引物设计、引物标记、杂交捕获、微滴生成、扩增反应以及扫描检测等步骤;本发明中所涉及的核酸检测方法结合了杂交技术的多重基因检测优势和数字PCR的高灵敏度定量检测优势,填充了多重基因定量检测技术领域的空白,具有深远的影响。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域,具体涉及一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法。
背景技术
多重聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的原理是在反应体系内同时加入多对特异性引物,同时扩增出多条目的DNA片段,由于各引物的扩增片段的大小存在明显差异,根据产物的片段大小或利用分子杂交实现多个微生物的同时检测。自1988年首次提出多重PCR概念以来,经过多年的发展,多重PCR技术逐渐成熟,目前多重PCR检测的手段主要有毛细管电泳(或凝胶电泳)、液相芯片、质谱等方式。毛细管电泳是根据PCR产物不同的扩增片段大小对其进行分离检测,该技术也是分子生物学最常用的技术之一。
随着液相芯片技术的出现,多重PCR实现了高通量检测。液相芯片技术以聚苯乙烯微球为载体,液相芯片的特殊之处在于体系由许多不同的微球体(Beads)构成,微球体上固定有不同的探针分子,并形成特殊的微球编码识别体系,每种小球都相当于固相芯片上的一个位点。将这些小球体悬浮于一个多重PCR产物中进行杂交,然后通过液相芯片分析***读取每个编码微球的荧光信号,利用这个***,可以对同一个样品中的种扩增产物同时进行检测。
PCR技术是目前应用最广泛的核酸检测技术,其主要优势在于简便、稳定、应用基础好。但PCR技术的主要局限在于多重基因检测可涵盖的靶基因数量有限,要实现多重检测往往需要多管来实现。虽然目前有些方法能够实现多重检测,但仍然存在一些问题,现有的多重检测技术都是先经过多重PCR扩增,这种多靶标的扩增有以下问题:特异性和灵敏度不理想;某一特定片段有限扩增;由于多重PCR反应体系中同时存在几对甚至几十对引物,使得形成引物二聚体的几率增大;如果非特异性产物优先扩增,将会大量消耗反应底物,降低特异性扩增效率。针对上述问题,研究者们开发了多种新型的多重PCR技术,如双启动寡核苷酸引物、多重连接依赖式探针扩增、特异性目标延伸、靶序列富集多重PCR、巢式PCR等。这些技术在某些方面改善了多重扩增存在的问题,但是在检测时需要与其他技术手段如液相芯片杂交技术结合才能实现多重检测;此外,现有的多重检测无法进行定量分析。
近年快速发展的数字PCR(Digital PCR,dPCR)技术是一种新的核酸定量检测方法,与传统定量PCR(qPCR)技术不同,数字PCR采用绝对定量的方式,不依赖于标准曲线和参照样本,直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方法具有比传统qPCR技术更加出色的灵敏度、特异性和精确性,dPCR迅速得到广泛的应用。数字PCR检测体系绝大多数采用经典的TaqMan双探针设计思路,dPCR的多重检测无论是通过荧光通道的扩展,还是采用RainDance公司改变探针的方法都无法可靠实现单管(或单芯片)超过5重基因检测。
杂交技术和dPCR技术所针对的应用目标是完全不同的:杂交技术突出多重基因检测分析能力,多重扩增是依靠传统方式实现的,尽管会借助PCR扩增来提高灵敏度,但都是定性或者半定量检测;dPCR在多重检测方面是短板,但其绝对定量能力和检测灵敏度使得杂交技术望其项背。对于在多重基因的定量检测方面所存在的技术空白,同时结合杂交技术和dPCR技术的优势是填充这一技术空白的研究方向。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处,本发明的目的在于提供一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法,以改善传统多重PCR相互干扰的问题,提高数字PCR的单次检测重数,实现多重数字核酸定量检测。
本发明提供了一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法,包括下述步骤:
1)样本核酸提取:对待测生物样本进行预处理后,通过裂解、结合、洗涤和洗脱过程提取其中核酸;
2)引物设计:根据不同待检的特定基因片段设计出各自的特异性引物;
3)引物标记:将同一待检基因的特异性引物标记在同种编码微球上,得到分别被不同待检基因的引物标记的编码微球;
4)杂交捕获:将步骤1)中提取的待测生物样本核酸与编码微球上的特异性引物进行变性杂交,使待测生物样本的DNA模板分子被特异性地结合在编码微球上,得到捕获DNA模板分子的编码微球,并建立起每个待测生物样本与编码微球的对应关系;
5)微滴生成:将步骤4)中得到的编码微球和聚合酶链反应试剂均匀混合形成水相,利用微滴生成器生成大小一致的微滴;其中,每个微滴中最多含有一个步骤4)中得到的编码微球;
6)扩增反应:在每个微滴中独立进行聚合酶链扩增反应,各微滴互不融合反应产物;
7)扫描检测:用分析仪器对微滴或者其中的编码微球进行逐个扫描,读取每个编码微球的信号,以编码微球为计数单元,基于数字多重聚合酶链反应原理,实现待测生物样本中核酸的定量和多重检测。
优选的是,步骤1)中所述待测生物样本包括多种生物样本,尤其是多种不同的微生物样本。
优选的是,步骤3)中所述编码微球为荧光编码微球、拉曼编码微球或荧光与粒径混合编码微球,材质选自聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丙烯酸微球或聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球中的一种。
优选的是,步骤4)中所述进行变性杂交的待测生物样本核酸为DNA或RNA;其中,所述DNA直接作为模板分子进行杂交捕获;所述RNA在进行反转录后作为模板分子进行杂交捕获。
优选的是,步骤5)中所述聚合酶链反应试剂包括DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子、缓冲液和非特异性荧光标记染料。
优选的是,步骤5)中生成的微滴置于油包水体系中。
优选的是,步骤5)中生成了三种微滴:所含编码微球捕获了DNA模板分子的微滴、所含编码微球仅标记了引物的微滴、不含编码微球的微滴。
本发明的有益效果是:本发明中所涉及的核酸检测方法结合了杂交技术的多重基因检测优势和数字PCR的高灵敏度定量检测优势,填充了多重基因定量检测技术领域的空白,具有开创性意义和深远的影响。本案中将包含微球的油水界面化微滴作为PCR反应器,每个微滴中包含一个荧光编码微球,该PCR反应器因百万量级微球的并行处理可高效实现反应器规模化,同时微滴中包含足量的DNA聚合酶,PCR反应所需原料,每个微滴相当于独立PCR反应体系,可有效降低多重PCR反应中多种探针的非特异性杂交反应,还可避免竞争反应导致底物不足的问题。
基于不同荧光染料种类与浓度组合构建的荧光编码微球与特异性引物形成映射关系,每种荧光编码微球针对一种待检测基因,因此每个微滴中只含有针对特定基因的一对引物。由于每个微滴中只含有一对引物,在PCR过程中,不会产生引物非特异性扩增等问题;同时,每个微滴中有足够的底物和酶,不会发生竞争性扩增导致底物不足的问题。总结来讲,每个微滴类似于单重PCR的一个管,每个微滴的扩增反应是相对独立的。
采用该技术方案后,既可以改善传统多重PCR相互干扰的问题,也能提高数字PCR的单次检测重数,是一种非常有效的多重数字核酸检测方法。
附图说明
图1为本发明中核酸检测方法的整体技术流程图;
图2为PCR扩增示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明,不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
本实施例提供一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法,包括下述步骤:
1)样本核酸提取:获取各种来源的微生物作为样本,将其分散在水相中,制成悬浮液,对待测微生物样本进行预处理后,通过磁珠提取获得其中核酸,具体提取分为裂解、结合、洗涤和洗脱四个过程;
2)引物设计:根据不同待检的特定基因片段设计出各自的特异性引物;
3)引物标记:将同一待检基因的特异性引物标记在同一种编码微球上,得到分别被不同待检基因的引物标记的编码微球,其中,编码微球使用荧光聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球;
4)杂交捕获:将步骤1)中提取的待测生物样本核酸与编码微球上的特异性引物进行变性杂交,使待测生物样本的DNA模板分子被特异性地结合在编码微球上,得到捕获DNA模板分子链的编码微球,并建立起待测生物样本与编码微球的对应关系;其中,待测生物样本核酸为DNA时可直接作为模板分子进行杂交捕获,为RNA时需要先反转录为DNA后再作为模板分子进行杂交捕获;
5)微滴生成:将步骤4)中得到的编码微球与DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子、缓冲液和非特异性荧光标记染料等聚合酶链反应试剂均匀混合形成水相,利用微滴生成器在油包水体系中生成大小一致的微滴;其中,每个微滴中最多含有一个步骤4)中得到的编码微球;
6)扩增反应:在每个微滴中独立进行聚合酶链扩增反应,各微滴互不融合;其中,所含编码微球捕获了DNA模板分子的微滴经过PCR扩增后,模板分子大量增加,同时非特异性标记染料嵌入双链DNA;所含编码微球仅标记了特异性引物的微滴和不含编码微球的微滴经过PCR后没有发生变化;
7)扫描检测:用液相芯片分析仪对微滴进行逐个扫描,读取每个微滴的信号,实现待测生物样本中核酸的定量和多重检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Claims (7)
1.一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)样本核酸提取:对待测生物样本进行预处理后,通过裂解、结合、洗涤和洗脱过程提取其中核酸;
2)引物设计:根据不同待检的特定基因片段设计出各自的特异性引物;
3)引物标记:将同一待检基因的特异性引物标记在同种编码微球上,得到分别被不同待检基因的引物标记的编码微球;
4)杂交捕获:将步骤1)中提取的待测生物样本核酸与编码微球上的特异性引物进行变性杂交,使待测生物样本的DNA模板分子被特异性地结合在编码微球上,得到捕获DNA模板分子的编码微球,并建立起每个待测生物样本与编码微球的对应关系;
5)微滴生成:将步骤4)中得到的编码微球和聚合酶链反应试剂均匀混合形成水相,利用微滴生成器生成大小一致的微滴;其中,每个微滴中最多含有一个步骤4)中得到的编码微球;
6)扩增反应:在每个微滴中独立进行聚合酶链扩增反应,各微滴互不融合反应产物;
7)扫描检测:用分析仪器对微滴或者其中的编码微球进行逐个扫描,读取每个编码微球的信号,以编码微球为计数单元,基于数字多重聚合酶链反应原理,实现待测生物样本中核酸的定量和多重检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤1)中所述待测生物样本包括多种生物样本。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤3)中所述编码微球为荧光编码微球、拉曼编码微球或荧光与粒径混合编码微球,材质选自聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丙烯酸微球或聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球中的一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤4)中所述进行变性杂交的待测生物样本核酸为DNA或RNA;其中,所述DNA直接作为模板分子进行杂交捕获;所述RNA在进行反转录后作为模板分子进行杂交捕获。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤5)中所述聚合酶链反应试剂包括DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子、缓冲液和非特异性荧光标记染料。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤5)中生成的微滴置于油包水体系中。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤5)中生成了三种微滴:所含编码微球捕获了DNA模板分子的微滴、所含编码微球仅标记了引物的微滴、不含编码微球的微滴。
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