CN110373469A - 一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法 - Google Patents
一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法。本发明所述检测子宫内膜癌的探针的基因组合涵盖了与子宫内膜癌相关15个基因的507个外显子的1859个序列,178个热点突变位点,6个MSI位点和1种融合基因,其具有性能稳定,肿瘤样品覆盖深度广,突变频率检出灵敏等优点,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法。
背景技术
子宫内膜癌是女性生殖道常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于***,约占女性生殖道肿瘤的20~30%。子宫内膜癌通常在女性出现不规则出血等明显症状后才开始检查诊断,其诊断分期较晚,检出时患者通常都已失去了最佳的治疗时间,严重影响了子宫内膜癌的治疗效果。因此,在无症状人群中进行筛查以发现子宫内膜癌癌前病变和早期癌症具有重要意义。
现有子宫内膜癌的诊断检测方法主要为B超检查、分段刮诊、宫腔镜检查、细胞学检查、磁共振成像和肿瘤标志物CA125等方法,这些检测方法不仅麻烦,而且检出率不高,不能广泛应用于无症状人群的子宫内膜癌筛查。近年的研究表明,子宫内膜癌是一类多基因病,其发展过程复杂,临床表现多样,涉及到多个基因的变化,其发生与某些原癌基因的激活及抗癌基因的失活有关。因此,开发一种性能稳定,肿瘤样品覆盖深度广,突变频率检出灵敏等优点的探针用于子宫内膜癌个体化用药具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针及其制备方法,所述探针具有性能稳定,肿瘤样品覆盖深度广,突变频率检出灵敏等优点。
为了实现上述目的,本发明提供了一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针,所述探针的基因组合涵盖了与子宫内膜癌相关15个基因的507个外显子的1859个序列,178个热点突变位点,6个MSI位点和1种融合基因。
其中,所述外显子序列信息如下表所示:
其中,所述热点突变位点信息如下表所示:
其中,所述MSI位点信息如下表所示:
序号 | 微卫星位点 | 染色体编号 | 起始位置 | 终止位置 |
1 | BAT-25 | 4 | 55598079 | 55598309 |
2 | BAT-26 | 2 | 47641482 | 47641727 |
3 | NR-24 | 2 | 95849293 | 95849501 |
4 | NR-27 | 11 | 102193452 | 102193653 |
5 | NR-21 | 14 | 23652294 | 23652506 |
6 | MONO-27 | 2 | 39564859 | 39564957 |
其中,所述融合基因信息如下表所示:
序号 | 基因 | 染色体编号 | 起始位置 | 终止位置 |
1 | FGFR3 | 3 | 1808555 | 1808661 |
2 | TACC3 | 4 | 1737457 | 1737561 |
作为优选,上述探针的基因组合包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.1558所示的序列。其中,SEQ ID No.1-SEQ ID No.1558所示的序列如下表所示:
本发明还提供了一种子宫内膜癌个体化用药的检测试剂盒,所述试剂盒包含上述的探针。
本发明还提供了上述探针、试剂盒在制备检测子宫内膜癌的检测试剂中的应用。
本发明还提供了上述探针的制备方法,所述方法采用原位合成基因芯片技术合成制备上述探针引物库。
作为优选,所述探针由微流体30K芯片大规模并行合成制备而成。
作为优选,本发明在合成制备探针时,在全部探针序列的5’末端和3’末端分别加上了如下序列:5’-ATCGCACCAGCGTGT-3’和5’-CACTGCGGCTCCTCA-3’。
作为优选,本发明在合成制备探针时,探针引物拷贝数的优化方法为:计算全部探针的GC含量,统计不同GC含量区段的探针的数目;将GC含量为40%-60%的探针合成拷贝数定为基准数,GC含量为30%-40%和60%-70%的探针合成拷贝数为基准数的2-3倍,GC含量为20%-30%和70-80%的探针合成拷贝数为基准数的3-4倍,GC含量为10%-20%和80-90%的探针合成拷贝数为基准数的4-5倍,GC含量小于10%和大于90%的探针合成拷贝数为基准数的5倍以上。
本发明还提供了上述探针的使用方法,包括如下步骤:
S1:构建基因组文库;从待筛查人员的血液、组织、细胞、唾液等提取基因组DNA,将提取的基因组DNA片段化后纯化,然后使用VariantBaitsTM Target Enrichment LibraryPrep Kit(VariantBaitsTM相关技术为联川生物已授权的专利技术)将纯化后的DNA片段构建成Illumina基因组文库。
S2:使用VariantBaitsTM Target Enrichment System将S1构建的基因组文库与上述探针进行杂交;
S3:用链霉亲和素磁珠捕获S2杂交产物;
S4:将链霉亲和素磁珠捕获的S2杂交产物进行PCR扩增;
S5:使用Illumina Hiseq X10 2×150PE进行测序,将测序下机后的数据进行数据质量分析,去除无效数据,有效数据与人类基因组(hg19)进行比对,并标记比对数据中的重复序列,在目标区域同一位置都展示相同突变类型时,认为此突变是真实的,计算该突变的频率。
作为优选,S1中提取的基因组DNA的质量要求为:总量为200ng-1μg,浓度不低于10ng/μL,OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.5,电泳主带完整,无明显降解;片段化的DNA的平均片段大小要求为150-200bp;构建的基因组文库要求为:文库总质量大于1μg,质量浓度大于35ng/μL;文库片段大小为200-500bp,150bp以下无尖锐峰污染(引物二聚体),无大片段污染。
作为优选,S2中杂交的温度为65℃孵育杂交,杂交时间为16-24h。
作为优选,S4中扩增清洗的标准为Qubit定量浓度不低于1ng/μL;文库片段大小在200-500bp之间;荧光定量PCR定量浓度不低于5nM,熔解曲线峰型单一,无Dimer污染。
本发明所达到的有益效果为:本发明所述子宫内膜癌的检测探针的基因组合涵盖了与子宫内膜癌相关15个基因的507个外显子,178个热点突变位点,6个MSI位点和1种融合基因,具有性能稳定,肿瘤样品覆盖深度广,突变频率检出灵敏等优点,具有广泛的应用前景;本发明所述探针使用简便,一次筛查只需要2-3天即可完成,较常规检测的一周时间大大缩短。
附图说明
图1基因组文库的质检谱图;
图2探针捕获基因组文库的质检谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本实用发明的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1探针的制备
S1.制备探针引物库
采用原位合成基因芯片技术合成制备探针引物库,将全部探针引物序列的5’末端和3’末端分别加上如下序列:5’-ATCGCACCAGCGTGT-3’和3’-CACTGCGGCTCCTCA-5’,使用微流体30K芯片进行大规模并行合成寡核苷酸,侧翼序列的全部探针引物的反向互补序列另外使用微流体30K芯片进行大规模并行合成寡核苷酸,将所有30K芯片上的全部寡核苷酸一同转入一个离心管作为OligoMix即探针引物库。
其中,所述探针的基因组合(panel)涵盖了与子宫内膜癌相关15个基因的507个外显子,178个热点突变位点,6个MSI位点和1种融合基因;包括如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.1558所示的基因序列。
合成制备探针时,探针引物拷贝数的优化方法为:计算全部探针的GC含量,统计不同GC含量区段的探针的数目。将GC含量为40%-60%的探针合成拷贝数定为基准数,GC含量为30%-40%和60%-70%的探针合成拷贝数为基准数的2-3倍,GC含量为20%-30%和70-80%的探针合成拷贝数为基准数的3-4倍,GC含量为10%-20%和80-90%的探针合成拷贝数为基准数的4-5倍,GC含量小于10%和大于90%的探针合成拷贝数为基准数的5倍以上。其中,探针不同GC含量的数量及对应的增加拷贝数后的数量如下表所示:
S2:PCR扩增
将完成合成的OligoMix使用25uL的10mM Tris-HCl溶解重悬,使用微型离心机将溶液离心后进行两次PCR扩增。
第一轮PCR反应体系如下:
其中,PCR引物序列和浓度如下:
引物 | 浓度 | 序列(5’-3’) |
PCR引物A | 10uM | CTGGGAATCGCACCAGCGTGT |
PCR引物B | 10uM | CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG |
第一轮PCR反应程序如下:
第一轮PCR反应结束后,PCR产物使用3倍体积的LC纯化磁珠纯化后进行第二轮PCR扩增。
第二轮PCR反应体系如下:
试剂 | 体积 |
2×PCR酶混合液 | 12.5微升 |
10uM PCR T7引物A | 1.5微升 |
10uM PCR引物B | 1.5微升 |
二甲亚砜 | 0.75微升 |
第一轮PCR纯化产物 | 8.75微升 |
总体积 | 25微升 |
其中,PCR引物序列和浓度如下:
引物 | 浓度 | 序列(5’-3’) |
PCR引物B | 10uM | CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG |
PCR T7引物A | 10uM | GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGATCGCACCAGCGTGT |
第二轮PCR反应程序如下:
第二轮PCR反应结束后,PCR产物使用3倍体积的LC纯化磁珠纯化,使用Qubit测定第二轮PCR产物浓度,使用Agilent Bioanalyzer 2100Expert进行产物峰型质检。
S3:T7体外转录
加入50ng第二轮PCR产物,充分混匀,于PCR仪中70℃孵育15min,孵育结束后将反应管立即置于冰上,静置2min,加入下表所示的体外转录试剂充分混匀后于40℃孵育4h。
试剂 | 体积 |
无核酸酶水 | 0.5微升 |
5×转录缓冲液 | 3.2微升 |
100mM腺苷三磷酸 | 0.25微升 |
100mM胞苷三磷酸 | 0.25微升 |
100mM鸟苷三磷酸 | 0.25微升 |
100mM尿苷三磷酸 | 0.2微升 |
10mM生物素标记的尿苷三磷酸 | 0.5微升 |
0.1M二硫苏糖醇 | 0.6微升 |
T7 RNA聚合酶 | 0.25微升 |
总体积 | 6微升 |
S4:RNA探针纯化
使用Zymo Research的RNA Clean&ConcentratorTM-5纯化试剂盒纯化T7体外转录产物,具体步骤如下:
A.加入无核酸酶水将转录产物体积补至100uL;
B.加入200uL RNA Binding Buffer,充分混匀;
C.加入300uL无水乙醇,充分混匀;
D.将上述溶液转移至纯化柱(Zymo-SpinTM IC Column),10000g,30s高速离心,弃去下层废液;
E.向纯化柱中加入400uL RNA Prep Buffer,10000g,30s高速离心,弃去下层废液;
F.向纯化柱中加入700uL RNA Wash Buffer,10000g,30s高速离心,弃去下层废液;
G.向纯化柱中加入400uL RNA Wash Buffer,10000g,2min高速离心,弃去下层废液;
H.将纯化柱转移至新的无核酸酶1.5mL离心管中,加入20uL无核酸酶水,10000g,2min高速离心;
I.加入0.5uL RNA酶抑制剂(40U/uL),充分混匀,置于冰上待用。
S5:RNA探针质控、贮藏
使用Nanodrop检测纯化后探针的浓度,使用Agilent Bioanalyzer 2100Expert进行探针峰型质检,将探针置于-80℃贮藏。
实施例2探针的使用
1.实验试剂
(1)VariantBaitsTM Target Enrichment Library Prep Kit(96反应)
使用注意事项:注意避免试剂的反复冻融,建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(2)VariantBaitsTM Target Enrichment Hyb&Amp KiT(96反应)
使用注意事项:2×Hyb Buffer使用前置于室温下解冻,2×Hyb Buffer在室温下通常会出现沉淀,使用前可放入37℃水浴锅中孵育5-10min,直至沉淀完全溶解。注意避免试剂的反复冻融,建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(3)VariantBaitsTM Target Enrichment Adapter&BLock Oligo(96反应)
(4)VariantBaitsTM Target Enrichment Wash KiT(96反应)
使用注意事项:建议保藏温度保持在20-25℃
(5)VariantBaitsTM Target Enrichment Purification Beads(96反应)
使用注意事项:LC Beads注意避免-20℃低温冷冻,建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(6)自备试剂
2.仪器设备及耗材
(1)仪器:真空旋转蒸发仪、涡旋振荡器、微型离心机、PCR仪、恒温金属振荡仪、恒温水浴锅、1.5mL磁力架、Qubit荧光定量仪、Agilent 2100Bioanalyzer。
(2)耗材:建议使用低吸附无核酸酶0.2mL PCR管、0.6mL离心管、1.5mL离心管,高质量无核酸酶带滤芯吸头。
3.探针的使用
S1:构建基因组文库
(1)样品准备
样本要求:
A.样品类型:血液、组织、细胞、唾液等。
B.DNA类型:基因组DNA。
C.DNA浓度测定:使用Qubit荧光定量仪测定DNA浓度。
D.DNA质量要求:DNA总量200ng-1μg,浓度不低于10ng/μL,OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.5,电泳主带完整,无明显降解。
(2)基因组DNA片段化
使用超声波物理打断的方法进行DNA片段化,具体操作步骤如下:
A.DNA打断仪器运行前须提前预冷至4℃。
B.通常情况下进行片段化的样品总体积为100μL,取500ng质量合格的基因组DNA,加入10mM Tris-HCl(pH8.0-8.5)将总体积补足为100μL。
C.待片段化的样品经漩涡振荡充分混匀,离心将液体保留在离心管底部。样品须经4℃充分预冷(可置于冰上10-15min),然后对称放入片段化仪器样品孔中,空置孔位放入配平管。确保样品管内液体完全浸没于仪器水槽内的蒸馏水中。
D.设置运行参数,On:30”,OFF:30”,CyCles:10,运行。
E.将样品从仪器中取出,使用漩涡振荡器轻轻混匀样品,用微型离心机离心将液体保留在离心管底部,重新放入片段化仪器中。
F.重复步骤(5)-(6)2次,即共运行3次打断程序,共运行30个CyCles。
G.完成打断后DNA的平均片段大小为150-200bp。
(3)片段化产物纯化
A.准备LC Beads,室温静置平衡30min,磁珠使用前应充分混匀,注意避免产生大量气泡。
B.取100μL片段化产物至1.5mL离心管中,加入200μL混合均匀的LC Beads,用移液枪轻轻吹打混匀,室温静置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min,直至溶液澄清,小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上,向管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30s,小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上,室温干燥2~5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下,加入51μL Nuclease-free Water,用移液枪轻轻吹打混匀,室温静置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上,室温放置5min至溶液澄清,小心吸取51μL上清液转移到新的PCR管中,即得纯化的片段化DNA。
I.取1μL纯化产物使用Qubit荧光定量仪测定浓度,计算DNA总量(ng),取用200ng纯化的片段化DNA进入下游建库。
(4)基因组文库构建
(4.1)End RepAir And A-Tailing
A.按照下表配制End RepAir And A-Tailing体系:
B.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀),短暂离心后将所有组分收集到管底。
C.将反应管置于PCR仪中,按如下参数进行反应。
(4.2)Indexing Adapter Ligation
A.按照下表配制Ligation体系:
B.充分混匀Ligation反应Mix,直接加入上一步End RepAir And A-Tailing反应管中。
C.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀),短暂离心,将所有组分收集到管底,此时反应体系总体积为110μL。
D.将反应管置于PCR仪中(不要开启热盖),进行下述反应:
(4.3)Post-Ligation Cleanup
A.准备LC Beads,室温静置平衡30min,磁珠使用前应充分混匀,注意避免产生大量气泡。
B.将接头连接反应产物全部转移至1.5mL离心管中,加入154μL混合均匀的LCBeads,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min,直至溶液澄清,小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上,向管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30s,小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上,室温干燥2~5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下,加入20μL Nuclease-free Water,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上,室温放置5min至溶液澄清,小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中,即得纯化的连接产物。
(5)扩增基因组文库
(5.1)Library Amplification
A.在PCR管中加入以下试剂并混匀:
B.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀),短暂离心,将所有组分收集到管底。
C.将反应管置于PCR仪中,按下述参数进行反应。
(5.2)Post-Amplification Size Selection
A.准备LC Beads,室温静置平衡30min,磁珠使用前应充分混匀,注意避免产生大量气泡。
B.将PCR产物全部转移至1.5mL离心管中,加入50μL Nuclease-free Water将总体积补至100μL,加入80μL混合均匀的LC Beads,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min,直至溶液澄清,小心吸取并将全部上清转移至另一新的1.5mL离心管中。
注意:吸取上清时注意避免吸到磁珠,切勿弃除上清!
D.向上述新的1.5mL离心管中加入40μL混合均匀的LC Beads,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
E.将离心管置于磁力架上5min,直至溶液澄清,小心吸取并弃除上清。
F.保持上述离心管固定在磁力架上,向管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30s,小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
G.重复步骤F一次。
H.保持离心管固定在磁力架上,室温干燥2~5min。
I.将离心管从磁力架上取下,加入20μL Nuclease-free Water,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
J.将离心管置于磁力架上,室温放置5min至溶液澄清,小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中,即得纯化的基因组文库。
K.1μL基因组文库使用Qubit测定浓度,计算其总量(ng),使用Agilent2100Bioanalyzer对基因组文库峰型进行质检,检验结果如图1所示,质检标准如下:
(1)文库总质量大于1μg,质量浓度一般大于35ng/μL;
(2)文库片段大小为200-500bp,150bp以下无尖锐峰污染(引物二聚体),无大片段污染。
说明:基因组文库的保存介质建议为Nuclease-free Water,请勿使用TE Buffer或Tris-HCl等,因该类Buffer中的盐分可能影响杂交步骤中的蒸干浓缩。
S2:杂交
(1)准备基因组文库及封闭试剂
VariantBaitsTM Target Enrichment System支持单个基因组文库进行杂交,同时支持最多8个基因组文库混合杂交,混库杂交时应避免选择Index序列相同的文库进行混合,同时需要考虑混合基因组文库Index序列的碱基复杂度和平衡性,以使各文库在测序时获得比较一致的测序质量。
A.将S1构建的基因组文库置于冰上融化,取用前漩涡振荡充分混匀,短暂离心后将所有溶液收集到管底,使用低吸附无核酸酶0.6mL离心管,按下表取用1μg基因组文库及相应的封闭试剂:
B.漩涡振荡充分混匀上述封闭反应混合,短暂离心后将所有组分收集到管底。将0.6mL离心管置于真空旋转蒸发仪中,40℃真空旋转将反应液蒸干。
(2)杂交反应
A.向完成蒸干的0.6mL离心管中加入以下杂交反应液,漩涡振荡充分混匀,短暂离心后将所有组分收集到管底,室温下静置10min。
B.准备无核酸酶0.2mL PCR管,将上述杂交反应液全部转移至新的0.2mL PCR管中,将PCR管置于PCR仪中,运行以下程序。
(3)探针准备
将杂交探针从-80℃中取出,置于冰上融化,漩涡混匀后将探针溶液离心至管底,置于冰上待用。
(4)每个杂交反应取用4.5μL的探针,置于无核酸酶0.2mL PCR管中,待步骤(2)中PCR反应的STep2开始后,将装有杂交探针的0.2mL PCR管放入PCR仪中,预热5min。
(5)待STep2结束后,将杂交探针全部转移至杂交反应管中,用移液器迅速吹打混匀,盖紧管盖,65℃孵育杂交16-24h。
S3:链霉亲和素磁珠捕获
(1)链霉亲和素磁珠的平衡
A.准备DynaBeads MyOne Streptavidin T1Magnetic Beads,室温静置平衡30min,磁珠使用前应充分混匀,注意避免产生大量气泡。
B.每个反应取25μL于无核酸酶1.5mL离心管中。
C.向离心管中加入200μL Beads Wash Buffer,用移液枪轻轻吹打混匀。
D.将离心管置于磁力架上,静置1-5min至溶液澄清,小心移除上清。
E.重复步骤C-D两次,即总共需要清洗三次。
(2)杂交产物与链霉亲和素磁珠结合
A.向上述离心管中加入70μL Beads Wash Buffer,用移液枪轻轻吹打混匀重悬Beads,置于65℃恒温水浴锅中预热至少2min。
B.将完成杂交的产物全部转移至步骤A的离心管中,用移液枪轻轻吹打混匀,置于65℃恒温水浴锅中孵育30min。
C.每隔10min使用漩涡振荡器轻轻混匀样品,保持样品管内溶液均匀,避免磁珠沉降到管底。
(3)清洗捕获磁珠
A.将LS Buffer,HS Buffer置于65℃恒温水浴锅中预热。
B.将离心管置于磁力架上,室温静置1-5min,直至溶液澄清。
C.小心移除上清,加入200μL 65℃预热的LS Buffer,轻轻吹打重悬Beads,于65℃恒温水浴锅中孵育15min。
D.将离心管取出置于磁力架上,室温静置1-5min,直至溶液澄清。
E.小心移除上清,加入200μL 65℃预热的HS Buffer,轻轻吹打重悬Beads,快速放入65℃水浴锅中孵育10min。
F.将离心管从水浴锅中取出,快速置于磁力架上至溶液澄清。
G.重复步骤E-F2次,即总共需要清洗三次。
H.小心移除上清,加入200μL RS Buffer,轻轻吹打重悬Beads,将离心管置于恒温金属振荡仪中室温1400-1800rpm振荡孵育1min。
I.将离心管取出置于磁力架上,室温静置1-5min,直至溶液澄清。
J.小心移除上清,加入40μL Nuclease-free Water,轻轻吹打混匀,即得捕获后产物,将离心管置于冰上待用。
S3:捕获产物的扩增
(1)PCR扩增
A.使用低吸附无核酸酶0.2mL PCR管按下表配制PCR反应液,用移液器轻轻吹打充分混匀:
B.将上述PCR管置于PCR仪中,进行下述反应:
(2)清洗
A.准备LC Beads,室温静置平衡30min,磁珠使用前应充分混匀,注意避免产生大量气泡。
B.将Post-CApTure PCR反应产物全部转移至1.5mL离心管中,加入50μL混合均匀的LCBeads,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min,直至溶液澄清,小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上,向管中加入200μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30s,小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上,室温干燥2~5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下,加入20μL Elution Buffer,用移液枪轻轻吹打混匀,室温放置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上,室温放置5min至溶液澄清,小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中,即得最终的捕获文库。
I.最终的捕获文库使用Qubit荧光定量仪进行定量,记录浓度(ng/μL),计算总量(ng);建议使用Agilent 2100Bioanalyzer对文库峰型进行质检,质检图谱如图2所示,通过荧光定量PCR对捕获文库进行定量,计算摩尔浓度(nM)。文库质控参考标准为:文库Qubit定量浓度不低于1ng/μL;文库片段大小在200-500bp之间;荧光定量PCR定量浓度不低于5nM,熔解曲线峰型单一,无Dimer污染。
S4:测序分析
质检合格的文库使用Illumina Hiseq X10 2×150PE进行测序,将测序下机后的数据进行数据质量分析,去除无效数据,有效数据与人类基因组(hg19)进行比对,并标记比对数据中的重复序列。在目标区域同一位置都展示相同突变类型时,认为此突变是真实的,计算该突变的频率。
采用本发明所述子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针对2对子宫内膜癌配对样品进行检测验证,样品信息如下:
检测验证结果表明,本发明所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针的性能稳定,肿瘤样本平均覆盖深度大于500X,覆盖深度≥100X的碱基比例大于98%,最低突变频率检出限为5%,具体检测验证数据如下表所示:
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所有的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针,其特在于,所述探针的基因组合涵盖了与子宫内膜癌相关15个基因的507个外显子的1859个序列,178个热点突变位点,6个MSI位点和1种融合基因。
2.如权利要求1所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针,其特征在于,所述探针的基因组合包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.1558所示的序列。
3.一种子宫内膜癌个体化用药的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1至2任一项所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针。
4.权利要求1至2任一项所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针在制备子宫内膜癌检测试剂上的应用。
5.权利要求3所述的子宫内膜癌个体化用药的检测试剂盒在制备子宫内膜癌检测试剂上的应用。
6.权利要求1至2任一项所述探针的制备方法,其特征在于,所述探针采用原位合成基因芯片技术合成制备而成。
7.如权利要求6所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针的制备方法,其特征在于,所述探针由μParaflo微流体30K芯片大规模并行合成制备而成。
8.如权利要求7所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针的制备方法,其特征在于,所述探针合成制备时,在全部探针序列的5’末端和3’末端分别加上了如下序列:5’-ATCGCACCAGCGTGT-3’和5’-CACTGCGGCTCCTCA-3’。
9.如权利要求7所述的子宫内膜癌个体化用药的捕获测序探针的制备方法,其特征在于,所述探针合成制备时,探针引物拷贝数的优化方法如下:计算全部探针的GC含量,统计不同GC含量区段的探针的数目;将GC含量为40%-60%的探针合成拷贝数定为基准数,GC含量为30%-40%和60%-70%的探针合成拷贝数为基准数的2-3倍,GC含量为20%-30%和70-80%的探针合成拷贝数为基准数的3-4倍,GC含量为10%-20%和80-90%的探针合成拷贝数为基准数的4-5倍,GC含量小于10%和大于90%的探针合成拷贝数为基准数的5倍以上。
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