CN107475449A

CN107475449A - 一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法

Info

Publication number: CN107475449A
Application number: CN201710818934.XA
Authority: CN
Inventors: 余乃通; 刘志昕; 熊忠国; 张雨良; 周朋
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明提供了一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法。该方法包括感染DNA病毒样品的转录组测序，病毒序列的比对和拼接，病毒基因组序列空白区域填补等三个步骤。本发明的方法不仅可以获得香蕉束顶病毒的全基因组序列，还可以通过该方法拼接其他矮缩病毒或双生病毒全基因组，从而获得病毒全基因组序列。本发明在国内外首次报道了利用转录组高通量测序拼接DNA病毒基因组的方法，填补了国内外该领域的空白。本发明还可以应用于DNA病毒鉴定和检测。

Description

一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法

技术领域

本申请属于基因组测序及生物信息学技术领域，具体涉及一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法。

背景技术

DNA病毒是指一类含有脱氧核糖核酸遗传物质的生物病毒，广泛存在于人、脊椎动物、昆虫、植物以及微生物中。根据最新ICTV国际病毒分类标准，DNA病毒按寄主类型可分为脊椎动物DNA病毒、植物DNA病毒、无脊椎动物DNA病毒、原核微生物(细菌和古细菌)DNA病毒和真核微生物DNA(藻类、真菌和原生动物)病毒。基因在结构上，分为编码区和非编码区。编码区是指能够转录信使RNA(mRNA)的部分，它能够指导合成有一定功能作用的蛋白质，而非编码区是不能够转录mRNA的DNA序列(部分非编码可以产生RNA，如mRNA的5’UTR和3’UTR)，对基因的表达主要起调控作用，如启动子等位于该区。

自从1977年以Sanger法对目标基因进行测序以来，随着测序技术的不断发展，出现了以第二代测序技术为代表的高通量方法，它使得核酸序列数据高通量化和单碱基测序费用的急剧下降，给基因组学、转录组学和小RNA深度测序等研究带来了更多的新思路和新发现。转录组测序，又称RNA-seq或mRNA-seq，即从生物总RNA中富集出mRNA，经反转录得到双链cDNA，而后对其进行高通量测序分析。Illumina HiSeqTM 2000深度测序是第二代测序技术，可以同时对数十万乃至数百万条DNA进行大规模同时测序。目前，该测序平台在国内被广泛使用，在病毒鉴定、检测和RNA病毒全基因组序列拼接等方面也普遍应用。

矮缩病毒科病毒基因组是由多个环状单链DNA组分所组成，每个组分大小为1100nt，其病毒基因组的获得主要通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法。近年来滚环PCR(rolling circle amplification,RCA)也逐渐用来扩增环状病毒DNA，从而得到病毒全基因组序列。双生病毒科病毒基因组是由单分子或两分子闭环状ssDNA组成，每分子DNA长2.5～3.0nt,总基因长约2.5～5.2nt，也可以通过PCR或RCA的方法获得双生病毒全基因组序列。然而，由于矮缩病毒科不同种病毒之间和双生病毒科不同属病毒之间的同源性差异较大，通过设计简并引物的方式并不能很好的获得新病毒的全基因组序列；且传统病毒鉴定方法，如病毒提纯、电镜观察和病毒基因组测序耗时费力。本发明通过对感染疑似DNA病毒样品进行转录组高通量测序，揭示了DNA病毒所有非编码区序列也能进行转录，从而利用转录组高通量测序可以拼接DNA病毒全基因组，填补了国内外该领域的空白。另外，利用本发明还可以应用于DNA病毒鉴定和检测。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法，方法简单。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明思路：申请人首次发现，矮缩病毒科和双生病毒科DNA病毒的所有非编码区也可以产生RNA，因此通过拼接病毒的编码区和非编码区的的高通量转录组，即可获得该病毒的全基因组序列。

一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法，将感染病毒样品的叶片总RNA反转录成cDNA，构建cDNA文库并进行高通量测序；通过与所有已知所有病毒种的核苷酸序列进行比对，筛选出高度匹配的转录组测序片段，然后按本领域的常规方式进行比对和拼接；所述的病毒为矮缩病毒科或双生病毒科病毒。

具体包括下述步骤：

(1)提取感染病毒样品的叶片总RNA；

(2)将RNA反转录成cDNA，构建cDNA文库并进行高通量测序

(3)运行Bowtie软件(默认参数)，将步骤(2)中的转录组测序片段与GenBank中所有已知所有病毒种的核苷酸序列进行比对，筛选出高度匹配(优选的，同源性95％及以上)的转录组测序片段；

(4)运行Velvet软件，参数设置为k-mer＝17和minimum coverage＝5，以步骤(3)筛选获得的RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列(contig)；

(5)运行Blast软件(默认参数)，将步骤(4)获得的短的重叠群序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比较，同源性在95％及以上的，以此推测序列的来源物种；

(6)从Genbank数据库下载所有可疑来源病毒的全长基因组序列并以此数据为基础，建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；

(7)运行Bowtie软件(默认参数)，将步骤(2)种转录组测序的片段与步骤(6)所建立的病毒数据库进行比对(即与特定病毒物种的基因组序列进行比对)，筛选出高度匹配(本发明优选同源性在95％及以上)的转录组测序的片段；

(8)根据步骤(7)的比对结果，将能够匹配到最多转录组测序的片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；

(9)将最有可能的候选病毒命名进行简单标记，对转录组测序的片段也进行标记；

(10)运行Velvet软件，参数设置为k-mer＝17和minimum coverage＝5，以步骤(9)中标记后的转录组测序的片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；

(11)运行Velvet软件，参数设置为k-mer＝17和minimum coverage＝5，以步骤(10)中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；

(12)从未能拼接好的空白区域(gap)两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的核苷酸序列，填充gap区域；

最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的核苷酸序列，即待测DNA病毒基因组中某一组分的全长核苷酸序列，其它组分也通过该方法获取，所有组分即为该病毒的基因组序列。同时依据该基因组序列对病毒进行确定鉴定和分类。

所述病毒属于矮缩病毒科或双生病毒科。

以上所述的方法还能用于病毒的鉴定和检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次证实高通量转录组测序可以用来对DNA病毒进行基因组序列拼接，进而获得病毒全基因组序列，同时还能对疑似病毒样品进行病毒病原鉴定和检测；且RNA-Seq技术在鉴定DNA病毒和克隆病毒基因组中具有诸多独特优势，具体而言：

(1)高通量：可一次获得几十万个乃至数百万个的转录组序列，能够快速准确地鉴定被测样品中含有的全部转录组mRNA序列；

(2)快速、自动化：只要数据量足够，无需预先设计特异性引物，即可通过生物信息学软件拼接病毒全基因组序列；

(3)重复性好：无需技术重复，而且起始样品比芯片技术要少得多，尤其适用于来源极为有限的生物样品分析。

(4)适用范围广，矮缩病毒科或双生病毒科的病毒都可用本发明的技术方案进行测序。

(5)本发明提供的DNA病毒基因组拼接的高通量转录组测序方法，该方法适用于在GenBank中登陆的已知或未知的DNA病毒甚至其他未知病毒。应用时，理论而言，只要有足够的转录组数据，不但可以获得一个与Genbank中有匹配的病毒全基因组序列，还可以根据重叠群序列通过基因克隆技术获得未知的新病毒全基因组序列。

(6)申请人首次发现DNA病毒的所有非编码区也可以产生RNA，因此利用转录组高通量测序拼接可得到DNA病毒基因组，填补了国内外该领域的空白。同时以引起香蕉严重病害的香蕉束顶病毒为例，通过利用转录组高通量测序拼接DNA病毒基因组的方法，获得了香蕉束顶病毒的全基因组序列，证实该方法的可靠性，从而为相关DNA病毒基因组的获得和病毒病原的鉴定提供技术支撑。

附图说明

图1为RT-PCR法鉴定香蕉束顶病毒和木尔坦棉花曲叶病毒非编码区转录示意图；

其中，M：2000bp DNA marker；1，扩增香蕉束顶病毒DNA-R非编码区；2，扩增木尔坦棉花曲叶病毒DNA-A非编码区；3，水对照。

图2为利用Bowtie软件筛选出与Genbank中高度匹配的转录组测序的片段匹配统计结果。

图3为利用Velvet软件拼接成更长的重叠群序列，以DNA-M组分全长示意图为例。

图4为PCR法扩增香蕉束顶病毒基因组DNA-N组分两个gap区的凝胶电泳图；其中，M：2000bp DNA marker；1，B2香蕉样品；2，空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。

生物材料样品：

感染BBTV香蕉叶片(B2)和感染木尔坦棉花曲叶病毒的大红花叶片采自海南省；pMD18-T载体，DNase I，Reverse Transcriptase M-MLV反转录试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；上下游引物合成及测序，由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；IlluminaHiSeqTM 2000高通量测序技术平台，诺禾致源公司；

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。

实施例1：

矮缩病毒科和双生病毒科DNA病毒的非编码区均能产生RNA：

矮缩病毒科：

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)作为香蕉束顶病(Bananabunchy top virus,BBTD)的病原物，基因组至少由6个大小在1.0～1.1kb的环状ssDNA组分所组成。2015年国际病毒分类委员会把它归属到矮缩病毒科(Nanaviridae)的香蕉束顶病毒属(Babuvirus)中，成为该属的代表成员。本实施例以香蕉束顶病毒为例，证实矮缩病毒科成员的非编码区能产生RNA，步骤如下：

(1)以提取的B2样品总RNA为模板，经DNase I处理后，利用ReverseTranscriptase M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA；

(2)然后根据DNA-R非编码区(SEQ ID NO.1)设计如下引物序列：

正向引物DNA-R 967F：5’-CACGCTATGCCAATCGTACAC-3’；

反向引物DNA-R 102R：5’-CTGTCGACGATGATGATCTTG-3’。

(3)利用DNA-R 967F/DNA-R 102R进行PCR鉴定，电泳分析结果如图1所示。从图中可以看出，扩增片段大小约250bp，与实际大小相符，证实香蕉束顶病毒非编码区产生RNA。

双生病毒科：

木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV)是引起棉花、大红花等植物严重病害的病原物，基因组是由单分子或两分子闭环状ssDNA所组成，每分子DNA长2.5～3.0nt，总基因长约2.5～5.2nt。2015年国际病毒分类委员会把它归属到双生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中，成为该属的重要成员。本实施例以木尔坦棉花曲叶病毒为例，证实双生病毒科成员的非编码区能产生RNA，步骤如下：

(1)提取感染木尔坦棉花曲叶病毒的大红花叶片总RNA为模板，经DNase I处理后，利用Reverse Transcriptase M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA；

(2)然后根据DNA-A非编码区(JQ424826.1)设计如下引物序列：

正向引物DNA-A 2430F：5’-CTTCGTGTAACTCTCTGCAGAC-3’；

反向引物DNA-A 2730R：5’-ACGGATGGCCGCTTTTTGG-3’。

(3)利用DNA-A 2430F/DNA-A 2730R进行PCR鉴定，电泳分析结果如图1所示。从图中可以看出，扩增片段大小约300bp，与实际大小相符，证实感染大红花的木尔坦棉花曲叶病毒非编码区产生RNA。

实施例2：

一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组的测序方法，包括下述步骤(本实施例以BBTV感染的香蕉样品为例对该方法进行说明)：

(1)采用商品化TRIzol Reagent试剂盒，从感染BBTV香蕉叶片(B2)中提取总RNA；

(2)采用商品化Ultra^TM RNA Library Prep Kit for(NEB,USA)试剂盒：首先通过带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，将mRNA打断成短片段；然后以短片段mRNA为模板，反转录成第一链cDNA；再通过试剂盒进一步合成双链cDNA，即cDNA文库，可用于上机进行高通量测序(Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术平台)。

(3)运行Bowtie软件(默认参数)，将步骤(2)中的转录组测序片段与GenBank中所有已知病毒序列的核苷酸序列进行比对，筛选出高度匹配(本实施例同源性选择在95以上％)的转录组测序片段；

(4)运行Velvet软件，参数设置为k-mer＝17和minimum coverage＝5，以步骤(3)筛选获得的RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列；

(5)运行Blast软件(默认参数)，将步骤(4)获得的短的重叠群序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比较，同源性在95％以上的，以此推测序列的来源物种；

(6)从Genbank数据库下载所有可疑来源物种的全长基因组序列并以此数据为基础，建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；

(7)运行Bowtie软件(默认参数)，将步骤(2)种转录组测序的片段与步骤(6)所建立的病毒数据库进行比对(即与特定病毒物种的基因组序列进行比对，在本实施例中，认为属于香蕉束顶病毒，因此集中于GenBank中香蕉束顶病毒的对比分析)，筛选出高度匹配(本实施例同源性选择在95以上％)的转录组测序的片段。

结果如图2所示。匹配到的均是香蕉束顶病毒序列，其中DNA-R组分reads为1022条，DNA-U3组分reads为4164条，DNA-S组分reads为8956条，DNA-M组分reads为1085条，DNA-C组分reads为44条，DNA-N组分reads为10953条，S2卫星组分reads为398条，Sat4卫星组分reads为1007条。

结果如表1所示，DNA-R，DNA-U3，DNA-S，DNA-M，DNA-C，DNA-N这6个必须组分均与BBTV HK株系高度匹配(97％以上)。而非必须组分S2和Sat4分别与来自台湾株系(88％)和越南株系(97％)的卫星组分高度匹配。

表1.与B2样品高度匹配的香蕉束顶病毒

(9)将上述步骤(8)最有可能的候选病毒命名进行简单标记，对转录组测序的片段也进行标记；

结果如图3所示。B2样品中BBTV病毒各组分序列拼接后的结果。

(12)根据步骤(11)中拼接的香蕉束顶病毒转录组重叠群序列(共有8个组分)，利用BioEdit进行检查，找到DNA-N组分未能拼接好的两个gap区域。

最终获得感染B2样品香蕉束顶病毒的7个全长组分，分别为DNA-R(SEQ ID NO.1)，DNA-U3(SEQ ID NO.2)，DNA-S(SEQ ID NO.3)，DNA-M(SEQ ID NO.4)，DNA-C(SEQ ID NO.5)，DNA-S2(SEQ ID NO.7)，DNA-Sat4(SEQ ID NO.8)；而DNA-N组分有两个未能拼接好的gap区域，大小分别为74nt和27nt。

实施例3：

gap区域的补充：

本实施例对DNA-N组分的两个空白区域进行PCR补充，步骤如下：

(1)以提取的B2样品总RNA为模板，利用Reverse Transcriptase M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，然后设计如下引物序列进行PCR扩增：

正向引物DNA-N 23F：5’-CCAGCGCTCGGGACGGG-3’；

反向引物DNA-N 878R：5’-GCCCAATCAACCCCCGATTCTTC-3’。

(2)利用DNA-N 23F/DNA-N 878R进行PCR扩增，电泳分析结果如图4所示。从图中可以看出，扩增片段大小约850bp，与实际大小相符；

(3)将PCR扩增产物回收后，与pMD18T载体进行连接；

(4)连接产物转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定；

(5)将初步鉴定为阳性的克隆菌送往广州Invitrogen公司进行测序分析；

(6)所得序列包含了上述两个gap区域序列，进而即可拼接到DNA-N组分(SEQ IDNO.6)获得全长序列。

进一步分析表明，该样品中香蕉束顶病毒(BBTV)的基因组包括8个组分，具体碱基序列如SEQ ID NO.1～8所示。目前，该病毒的基因组获取主要通过PCR扩增获得，但是对同源性较差的非必须组分，不能很好的扩增得到。本发明利用转录组高通量测序后全基因组拼接的方法，可获得所有香蕉束顶病毒的必须组分和非必须组分。利用PCR扩增的方式，对上述B2样品中的病毒进行扩增，与本发明的结果完全一致。

综上所述，发明人揭示了香蕉束顶病毒转录本可全长覆盖病毒基因组，同时转录组测序结果显示存在几个高覆盖率的峰值，都位于香蕉束顶病毒各组分的编码区。另外，香蕉束顶病毒RNA转录本相互重叠，使重叠区域能够组装成香蕉束顶病毒全基因组序列。

本申请的方法一次分析可获得几十万个乃至数百万个的转录组序列，能够快速准确地鉴定被测样品中含有的全部转录组mRNA序列。同时，结合生物信息学软件分析和数据处理，可对感染植物样品中的病毒转录组序列进行组装拼接，最后成功获得该样品中病毒的全基因组序列，本申请对感染病毒的香蕉叶片进行高通量转录组测序为香蕉束顶病毒或其他DNA病毒基因组克隆或新病毒鉴定等方面研究具有重要的科学依据。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgctgggg cttattatta cccccagcgc tcgggacggg acatttgcat ctataaatag 60

acctcccccc ccctccacta caagatcatc atcgtcgaca gaaatggcgc gatatgtggt 120

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<210> 2

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<400> 4

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<211> 1013

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttgggaagat cggattaaac ttctgttttg tcagaagttg aagtgctgtg tcagaaggat 360

tcttgtatat ggagatcaag atgatgctct agctgcagtg aaggatatga agacttctat 420

cattcgttat agcgaatatc tgaagaaacc atgtgtggta atatgttgtt tgactaataa 480

gtctattgtt cataggttaa acacaatggt gttcttttat catgaatata tggaagacct 540

aggtggtgac tactcggtat atcaagagtt gtattgtgat gaggaacttc ctgcttcctt 600

gacagaggaa gaagatgaag aagtaatata caggaatgtt attatgtcat cgacagaaga 660

gaagatctct tggagtgaat gtcagaagat agtcatatcg gattatgatg taacattact 720

gtaatgtaat atccattatc ataaataaaa taatggtatg atgattatgt atttaaacta 780

aatacataat ggtgtacgta tagcataaaa tacattaaca tacatacaac acactatgac 840

aaaaagggaa aaaagaagaa tcgggggttg attgggctat cttaacgatt aagggccgaa 900

ggcccgttta aatatgtgtt ggacgaagtc caaaacacat aaaagtcatc agaacagtgg 960

aatataatga gctggcagtg gcgggtccat gtcccgagtt agtgcgccac gtg 1013

<210> 6

<211> 1082

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcacggggg actattatta ccccccgtgc tcgggacggg acatgacgta agcatagatt 60

ataatgggct ttttaaagcc catataaggg aagtgggccg ggtttgagac atatttcgaa 120

agcccggctt ggaaaaggat aaagtcacgt tccgaataat aggttgcttc gccgcgaagc 180

aacctaataa attgttgcgt attcaatacg caactaaaag tctattaata tgcctgtctc 240

tgccgaataa atcagagcgt atgcgaagca gaagcgatgg attgggcaga atcacaattc 300

aagacatgta cccatggctg tgattggaag acgatatcat cggattcatc ggaaaatcgg 360

caatatgtac cttgcgtcga ctctggtgtt ggaagaaaga cgcctcgcaa ggtacttctt 420

cgatctatcg aagttgtatt caatggaagt tttaaaggga ataatcggaa tgttcgtggc 480

ttcttatacg tatcaatccg agacgatgat ggaacaatgc gtccagtact tatagtacca 540

tttggaggat atggatatca taatgatttt tattatttcg aagggaaggg gaaagttgaa 600

tgtgatatat catcagatta tgttgcgcca gaagtagatt ggagcagaga catggaagtt 660

agtattagta acagcaacaa ctgtaatgaa tcatgtgatc tgaagtgtta tgttatttgt 720

tcgttaagaa taaaggaata acagatgtgc tgtaatgaat attaataaat cttattttta 780

atgtaagtga aagttgtata aaacatacaa cacgctatga caaaagggga aaaatgaaaa 840

ataaggggtt gattgttcta tagtatcgct taagggccgc aggcccgttg aaaaataata 900

atcgaattat atacgattga taataatcag agatagatga tcaaggatat ataaacatag 960

acgaagtata tggctgtata atataaaaga agcatataat ataaaatatg tatactattc 1020

tctgattggt gcagaaagta gacccactaa ctttaagtta gtggaaatgt cccgatgacg 1080

tg 1082

<210> 7

<211> 1091

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatataaagg cagagggcat agtattaccc ctctgcctta cacctctgcc ttacacctga 60

cgtcatcata tggcgtcctc taaatggtgc ttcactctga attattcctc cgcagccgag 120

agagaagact ttctctcgcg tctgaaggag gaggatgttc actacgcggt ggtcggcgac 180

gaagtcgctc cgagctccgg ccagaagcac ctacagggat atctatccct gaaaaaagga 240

atccgtttag gcggattgaa gaagaggtac tcttcgaagg ctcactggga gatcgcgaga 300

ggaacagacg aacagaatcg tggatactgt tcgaaggaaa ccctagttct tgaactgggt 360

acgcctgtag ttcctaggtc taataagcgt aagctaatgg agcgttatag agaagaccct 420

gaagaattga agatggatga tccttccaag tatcgcagat gcttggcagc ggattcaatc 480

gagaaagcca gaaataattc taaatgggtt cacgaactaa gagaatggca gaatcaatta 540

attcaacaca tcgaaggtgt tcctgatgat cgaagtatca tctgggtcta cggtccagcc 600

ggaggcgaag gtaagtcaac cttcgcgaga tatttatcat taaaacccgg atggggatat 660

atcaatgggg gaaagacctc ggatatgatg cacatcataa cgatggatgc ggataatcat 720

tggattatag atattcccag aagtaattca gagtatctga attacggcgt tatagaacag 780

attaagaata gagttttaat aaatacgaag tatgaaccat gtgtgattag aaaagacgga 840

cagaatgtcc atgtaattgt gatggcaaat gtgttgcctg attattgtaa aatatcagaa 900

gatagaataa aaataattaa ttgttgaaat acattacttc ttcgccaagc aaccgcgtga 960

agaaaccgcg tggaccccac cactacaata acacgctatg ccgtacaacg aagtcatcaa 1020

tatatttatt attaaaatat tgggccgaag gcccaataag gatgtcggtg gcactgttgc 1080

ctgccacaca c 1091

<210> 8

<211> 1102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgggctagta ttacccacct ccgcgcacta cctccgcgca cctataaaat gtctgcctct 60

cgatggacat ttacgcttca ctattccgac gcaacggagc gaggcaaatt cctcgcgact 120

ttgaaggagg aagatgtgca ctacgccgtc gtcggcgacg aaactgctcc gaatactggt 180

cggaaacatc ttcaaggata tctttccttg aagaaacgtt ttcgtattag cggaataaag 240

aagaaatatt cgtcgagagc gcattgggag aaagctcgag gatcagatta cgacaacaag 300

gcgtactgtt ctaaagaagc cctaattctt gaattagggg ttccttgcca aacaggttcg 360

aataagcgta aattagcaga tatggttaca agatcgccgg aacgaatgaa aatcgaacag 420

ccggagatat ttcaccgata cgaatcggtg aagaagatga aagaattcaa agaaaggtat 480

gtctatccta tcctcgatag gccatggcag gtacaattaa cggagttaat tgaagcagaa 540

cctgatgatc gaacgatcat ctgggtattc ggaccaaaag ggaatgaagg caaatcaacg 600

tatgcgaagt cattaatcca aaaggattgg ttctacacaa ggggaggaaa gaaggagaac 660

atattgttcg cctacgtaga tgaaggttcg acaaaaaacg ttgtatttga tcttccgcgt 720

acagtacaag aatttattaa ttatgatgtt atcgaggcac tgaaagatag agtaatcgag 780

agtacaaaat acaagcctgt gaagtattta gagttgaatt ctgtacatgt aatagttatg 840

gctaattttc tgcctgatat gtgtaaaata tctgaagatc gaataaagat agttgcttgc 900

tgaacacgct atgacaatcg tacgctatga caaaagggga aaaatgaaga atcgggggtt 960

gattgggcta tcctaacgaa taagggccgc aggcccgtta agatggatcc ttataacccg 1020

ttaagaagct aaacgggtct aaaacgattg cttcgcccgc aagcaacacc tttaacctct 1080

gcgcacctat atatagcgga gg 1102

Claims

1.一种适用于矮缩病毒科和双生病毒科病毒基因组拼接的转录组测序方法，包括下述步骤：

将感染病毒样品的叶片总RNA反转录成cDNA，构建cDNA文库并进行高通量测序；通过与所有已知所有病毒种的核苷酸序列进行比对，筛选出高度匹配的转录组测序片段，然后按本领域的常规方式进行筛选和拼接；所述的病毒为矮缩病毒科或双生病毒科病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

（1）提取感染病毒样品的叶片总RNA；

（2）将RNA反转录成cDNA，构建cDNA文库并进行高通量测序；

（3）运行Bowtie软件，将步骤（2）中的转录组测序片段与GenBank中所有已知所有病毒种的核苷酸序列进行比对，筛选出高度匹配的转录组测序片段；

（4）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤（3）筛选获得的RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列；

（5）运行Blast软件，将步骤（4）获得的短的重叠群序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比较，同源性在95%及以上的，以此推测序列的来源物种；

（6）从Genbank数据库下载所有可疑来源病毒的全长基因组序列并以此数据为基础，建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；

（7）运行Bowtie软件，将步骤（2）种转录组测序的片段与步骤（6）所建立的病毒数据库进行比对，筛选出高度匹配的转录组测序的片段；

（8）根据步骤（7）的比对结果，将能够匹配到最多转录组测序的片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；

（9）将最有可能的候选病毒命名进行简单标记，对转录组测序的片段也进行标记；

（10）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤（9）中标记后的转录组测序的片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；

（11）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤（10）中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；

（12）从未能拼接好的空白区域两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的核苷酸序列，填充gap区域；

最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的核苷酸序列，即待测DNA病毒基因组中某一组分的全长核苷酸序列，其它组分也通过该方法获取，所有组分即为该病毒的基因组序列；所述病毒属于矮缩病毒科或双生病毒科。

3.权利要求1所述的方法在病毒鉴定中的应用。

4.权利要求1所述的方法在病毒检测中的应用。