CN101855973B

CN101855973B - 一种漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN101855973B
Application number: CN2010101246903A
Authority: CN
Inventors: 黄峰; 张海波; 张应龙; 李夏
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: CN101855973A

Abstract

本发明涉及一种新的生长迅速的高效漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用，属于生物工程技术领域。该白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3548；该菌株能够在液体培养基添加诱导剂或者固体发酵不添加任何诱导剂的情况下经济高效的产漆酶。

Description

一种漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新的生长迅速的高效漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

漆酶是一种被人类最早应用的蛋白质。漆酶是一种糖蛋白，单体的分子量从50kD到110kD大小不等，含糖量大概占分子量的10％～45％不等。目前发现的漆酶主要为四聚体，此外还有二聚体和单体漆酶，并且在序列同源性上也相差较大。生物界蛋白质的趋同进化且漆酶具有广泛的底物专一性，使得漆酶的分类并不是很明确，存在着大量的具有漆酶类似活性的蛋白。漆酶具有典型的四个铜离子的结构使得人们可以通过漆酶的光谱学吸收来界定漆酶以及测定漆酶的纯度。漆酶的四个铜离子组成了两个活性中心T₁铜离子与漆酶的底物的氧化能力有关，T₂以及两个T₃铜原子组成还原中心，能够接收从T₁位点得到的电子将氧气还原成为水，其中三铜簇也是漆酶与酪氨酸氧化酶(酪氨酸氧化酶的还原中心为两个铜离子)的本质区别。我们的祖先于6000年前就能够利用漆酶生产漆器。漆酶广泛分布于动物、植物、真菌、细菌当中。目前人们对漆酶的研究主要集中在真菌和细菌当中。漆酶能够利用氧气作为电子供体直接氧化芳香族化合物和一些氧化还原电势较低的非酚型化合物；同时漆酶在介体的介导下能够氧化氧化还原电势较高的底物和木素等大分子物质。介体的发现极大地扩大了漆酶的底物范围同时也扩大了漆酶的应用范围。漆酶在纸浆造纸、染料脱色、食品加工、饮料加工、有机合成、服装制造、传感器制造等行业中有着重要的应用前景。

新型漆酶的寻找一直都是一个研究热点，真菌漆酶的产量远远高于细菌漆酶，但真菌特别是木腐真菌的生长比细菌要慢，漆酶是一种次生代谢中需要的酶类，分泌时需要菌体进入稳定期以后，因此漆酶的发酵时间比较长。寻找能够快速生长并分泌漆酶的菌株能够有效地缩短真菌的培养时间，降低发酵成本。液体发酵往往对发酵的仪器设备要求比较高，且耗能，需要诱导物等发酵成本比较高。固体发酵能够有效的缩短发酵时间，降低发酵成本，并且白腐真菌的固体发酵培养基往往都是农产品或者工业产品废料，发酵过程不需要添加诱导物等优点。固体发酵一般发酵周期较长，一般需要20天到一个月左右，因此寻找生长迅速的产漆酶能力强的菌株能够有效的降低发酵成本。

目前固态发酵产漆酶的方法在国内外都有些报道。原料来源比较广泛，包括玉米、棉花、蔗渣、麸皮、秸秆、锯末、香蕉皮、葡萄核、花生皮等，以及他们的混合物发酵。固体发酵时间集中在一个月左右，发酵周期较长，并且在发酵过程中大多数添加微量元素以及诱导剂等。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种新的具有高产漆酶快速生长的白耙齿菌及其培养方法和应用，此菌株生长迅速，能够利用工业废料木糖渣和麸皮生产漆酶。

一种白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5，该菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.3548。

本发明涉及的快速生长的产漆酶菌-白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5是从山东大学通过选择性培养基分离得到的一株担子菌。该菌株通过采集子实体后通过选择性培养基分离得到，通过与本实验室收藏以及分离得到的产漆酶菌株进行对比发现该菌株生长迅速，能够产生组成型漆酶和诱导型漆酶，在用麸皮和木糖渣进行固态发酵的时候不需要添加任何诱导剂。

本发明涉及的生长迅速，能够利用工业废弃原料木糖渣和麸皮高效产漆酶的菌株-白耙齿菌具有如下生物学特征：

菌株成熟后实层体内裂呈把齿状，而在发育初期是孔状的。上表面白色至奶油色或淡黄色、有密生的硬毛，无环带，有浅的沟纹，边缘同色。孔口面白色至奶油色，孔口有棱角，近边缘处每毫米间一个孔，孔间隔壁薄，初期就深裂成耙齿状。菌肉白色至淡色，软纤维质，无环带。担子果一年生，平展至反卷，菌盖8～15×9～20mm厚1.5～3mm表面白色，有细长毛，菌管长1～2mm孔面微黄白色，管口约2个/mm，常裂为齿状.菌丝***二体型生殖菌丝具简单隔膜，直径3～4um，囊状体显著。菌丝体能够在顶端产生锁状联合。在液体产酶培养基震荡培养条件下能够产生白色的球状菌丝体。

本发明涉及到的白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5CGMCC No.3548的转录间隔区的(internal transcribed spacer，ITS)核苷酸序列(包括18SDNA和28SDNA的一部分以及5.8SDNA和三者之间的两段间隔序列)长度为696个碱基，如序列表SEQ IDNo.1所示。

通过美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)序列同源性分析，将本发明的菌株白耙齿菌(Irepx lacteus)sdu-5CGMCC No.3548的ITS核苷酸通过Blast进行比对，比对结果表明该菌株属于白耙齿菌。结合该菌株的子实体形态分析以及菌丝体形态分析根据《真菌鉴定手册》(魏景超著)表明该菌株属于真菌担子菌属中的白耙齿菌。该菌株已经于2009年12月28日保存与中国普通微生物菌种保藏管理中心保存号为：CGMCC No.3548。

一种白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5的培养方法，其特征在于，具体步骤如下：

取菌种保藏编号为CGMCC No.3548的白耙齿菌sdu-5菌株，将该菌株接种至麸皮浸出液斜面培养基中活化3～4天，温度为28～30℃；取活化后的白耙齿菌sdu-5接种于麸皮液体培养基扩大培养，培养温度为28～30℃；培养时间为3～4天，震荡型摇床的速度为80转/分钟；将经扩大培养的菌液接种于优化产酶合成培养基中或固体发酵培养基中发酵培养。

所述麸皮浸出液体培养基的制备方法如下：麸皮195～205g加到1L水中，沸煮30min，六层纱布过滤，自然pH，121℃灭菌20～30min。

所述麸皮浸出液斜面培养基的制备方法如下：麸皮195～205g加到1L水中，沸煮30min，六层纱布过滤，添加19.5～20.5g琼脂，自然pH，121℃灭菌20～30min。

所述优化产酶合成培养基的配方为：每升液体培养基含：9.5～10.5g葡萄糖，0.4～0.5gK₂HPO₄，1.5～2.5g(NH₄)₂HPO₄，0.3～0.5g NaH₂PO₄，0.4～0.6g MgSO₄·7H₂O，1.5～2.5g酵母浸膏，0.001g ZnSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.06g CaCl₂，0.005g CuSO₄·5H₂O，0.005g MnSO₄·H₂O，

所述的优化产酶合成培养基的培养条件为：培养温度28～30℃，震荡型摇床速度80转/分钟，培养时间7～9天。

所述的固体发酵培养基的制备方法为：4重量份麸皮和6重量份木糖渣充分混匀后添加6～8倍的水于120℃灭菌30～50min后置于25～35℃隔24小时后再次于120℃灭菌30～50min，即得。

所述的固体发酵培养基的培养条件为：浅层固态发酵，培养湿度45～75％，培养温度20～28℃，培养时间10～12天。

本发明菌株白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5 CGMCC No.3548漆酶在生产中的应用：本发明的耐热性漆酶经过以麸皮和木糖渣为培养基生产的漆酶可以应用于造纸、纸浆处理、造纸污水处理、印染污水处理、以及食品、饮料及生物传感等行业。

配制上述培养基的试剂均为市售产品，木糖渣为工业废弃原料，可由木糖生产企业购得。

本发明有益效果如下：

1)白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5能够在液体或者固体培养情况下快速生长，有效的减小发酵周期，缩小制造成本。

2)培养产物易分离，培养基经5～10倍水常温浸提30到60分钟后除去培养物，浸出液经超滤浓缩冻干成粉后可用于商业用途。

3)白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5可在能够以麸皮和木糖渣作为发酵底物的情况下产生较高的漆酶，由于培养基原料便宜易得，较现有产漆酶菌培养成本低，且可以较好的解决农副产品加工的废料麸皮和木糖渣，利于资源的综合利用。

附图说明

图1是PCR产物电泳检测图谱；

图2是时间产酶曲线；

图3是核酸序列测定图谱；

具体实施方式

实施例1快速生长产漆酶菌株的分离筛选：

1.培养基：

分离培养基：向20％(200g)麸皮中加入1L水，煮沸后30min，6层纱布过滤；称取2％(20g)琼脂条加入1000ml三角瓶中；将滤得的麸皮液装入此三角瓶中，加水定容至1000ml；将麸皮汁培养基和洗净的培养皿121℃湿热灭菌20min，添加青霉素和链霉素至200mg/L，倒平板；备用。

高通量快速生长产漆酶选择性培养基：10％(100g)麸皮中加入1L水，煮沸后30min，6层纱布过滤；称取2％(20g)琼脂条加入1000ml三角瓶中；将滤得的麸皮液装入此三角瓶中，加水定容至1000ml；将麸皮汁培养基和洗净的培养皿121℃湿热灭菌20min，添加愈创木酚至200mg/L，倒平板备用。

液体产漆酶选择性培养基：10％(100g)麸皮中加入1L水，煮沸后30min，6层纱布过滤；分装到三角瓶中备用分装体积占三角瓶体积的十分之一；于121℃湿热灭菌20min 备用。

2.筛选步骤：

(1)取长有真菌的基质或者真菌子实体，用小刀劈开从内部取很少的一小块接种到分离纯化培养基平板上，培养箱中培养培养温度28到30℃。土壤中真菌的分离：制备土壤稀释液：称取土样10克，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的土壤。

涂布平板：将上述纯化培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10^-2、10^-4、10^-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10^-2、10^-4、10^-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中。将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘可改变方向再涂布几次。涂布均匀后，室温下静置5～10min，使菌液吸附进培养基。

(2)隔天观察平板上真菌的生长情况。挑取平板上长出的真菌菌落，转接到另外的平板上，直到分离的真菌只长出一种纯化的菌落为止，共取得真菌近百株。

3.快速生长产漆酶菌株的粗筛：培养皿中菌落的生长能力能够近似的反映菌体的生长能力；愈创木酚是一种酚型化合物，能够被漆酶氧化产生红色或者深红色的产物，变色的强弱能够在一定程度上反映产漆酶能力的强弱，从近百株真菌中选择生长迅速，且变色较深的菌株，进行下一步筛选。

4.快速生长产漆酶菌株的复筛：取上述菌株中生长迅速，变色能力强的菌株进行液体发酵验证。发现菌株sdu-5具有生长迅速并能够产生组成型和诱导型的漆酶，值得进一步进行研究。

液体发酵酶活性测定方法为ABTS[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐]法或者DMP(2，6-Dimethoxyphenol，2，6-二甲氧基苯酚)法其具体操作是：ABTS(2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)法的底物为ABTS(2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)，其浓度为1mM，反应体积是2ml，缓冲体系是20mM的醋酸醋酸钠缓冲液，测定波长为420nm，消光系数为ε＝36,000M^-1cm^-1；DMP(2，6-二甲氧基苯酚)法的底物为DMP(2，6-二甲氧基苯酚)，底物浓度为10mM，反应体积是2ml，缓冲体系是20mM的醋酸醋酸钠缓冲液，测定波长为470nm，消光系数为ε＝49,600M^-1 cm^-1。酶活性测定中用到的大型仪器是Shimadzu的UV-3100型紫外可见全波段分光光度计。

实施例2快速生长产漆酶菌株白耙齿菌的鉴定

1.形态学及生理生化鉴定

首先将采集到的子实体或者经培养产生的子实体以及孢子形态与真菌分类学手册《真菌鉴定手册》(魏景超著)进行对照初步鉴定该菌株成熟后实层体内裂呈把齿状，而在发育初期是孔状的。上表面白色至奶油色或淡黄色、有密生的硬毛，无环带，有浅的沟纹，边缘同色。孔口面白色至奶油色，孔口有棱角，近边缘处每毫米间一个，孔间隔壁薄，初期就深裂成耙齿状。菌肉白色至淡色，软纤维质，无环带。担子果一年生，平展至反卷，菌盖8～15×9～20mm，厚1.5～3mm表面白色，有细长毛，菌管长1～2mm孔面微黄白色，管口约2个/mm，常裂为齿状.菌丝***二体型生殖菌丝具简单隔膜，直径3～4um，囊状体显著。该菌株的应属于白耙齿菌，具体还需要分子生物学的方法进行验证鉴定。

2.ITS的序列分析

基因组DNA的提取，在麸皮液体培养基中生长的菌体(约2～3天)用两层纱布过滤，把菌体放在液氮预冷的研钵中进行研磨进行研磨。提取基因组DNA，然后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测合格的DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为ITS5：位于18sRNA序列GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG(SEQ ID NO.2)，ITS4：位于28sRNA序列为TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO.3)；经PCR扩增得到的DNA电泳检测(图1)后连接到PMD20-T质粒转化大肠杆菌，转化的菌体经过添加LA(Luria-Bertani培养基添加氨苄青霉素)培养基筛选后，提取质粒进行电泳验证；转化成功的菌种送上海英骏公司测序。测序结果如图3所示，其有效序列为SEQ ID No.1，其余序列为质粒载体的部分序列。

实施例3白耙齿菌漆酶的液体发酵测定

合成培养基缺少部分生长因子，绝大部分菌体在合成培养基上生长较慢，白耙齿菌在上述培养基上生长迅速，在第八天生长量和漆酶产量达到最大。添加藜芦醇作为诱导剂后产酶量能够提高，说明该菌株既能够产组成型漆酶，又能够产诱导型漆酶。分别对培养基的碳源和氮源进行了选择性试验。碳源有葡萄糖、麦芽糖、草酸钠、柠檬酸；氮源有硫酸氨、氯化氨、尿素、硝酸钠、磷酸氢二氨，试验发现该液体培养基的最佳碳源和最佳氮源分别是葡萄糖和硫酸氢二铵。对培养条件进行优化后得到优化产酶合成培养基，成分如下：

每升液体培养基含：9.5～10.5g葡萄糖，0.4～0.5g K₂HPO₄，1.5～2.5g(NH₄)₂HPO₄，0.3～0.5gNaH₂PO₄，0.4～0.6g MgSO₄·7H₂O，1.5～2.5g酵母浸膏，0.001g ZnSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.06g CaCl₂，0.005g CuSO₄·5H₂O，0.005g MnSO₄·H₂O，藜芦醇2～4mM，pH在5.5～6.5；

优化产酶合成培养基的最佳培养条件如下：

振荡型摇床培养，摇床转速80r/min，培养温度28～30℃，培养时间7～9天。

实施例4白耙齿菌漆酶的固体发酵

固体发酵物的选取：固体发酵物的选取采用发酵成本的工业废弃生物质和营养物质较丰富的添加物，既能有效的降低发酵成本，有能充分利用废弃物。鉴于该菌既存在组成型的漆酶又存在诱导型的漆酶，采用工业废料木糖渣(山东禹城龙力集团)和造纸废弃木质素(山东华泰纸业股份有限公司)与麦秆，玉米秸秆，杨木粉，蔗渣，麸皮等生物质混合添加6～8倍的水后发酵。发酵产物经过5倍的水浸泡30分钟提取后离心以DMP为底物测定酶活性。

经培养测定，该菌株能够以麸皮和木糖渣作为发酵底物的情况下产生较高的漆酶。经部分因子试验对主要的产酶影响因素进行筛选，麸皮和木糖渣的混合比例和培养时间对漆酶的产量影响最大。对麸皮和木糖渣的混合比例和培养时间进行优化，当混合比例为4重量份麸皮6重量份木糖渣时产酶效果最佳，其产酶最佳时间为10～12天，如图2所示。培养过程中不需要添加金属铜离子和诱导剂，培养产物经5～10倍水常温浸提30到60分钟后除去培养物，浸出液经浓缩冻干后的酶粉可用于工业造纸、纸浆改性、造纸污水处理、印染污水处理、食品工业、饮料行业、服装行业、有机合成行业中。

经过优化后的固体发酵条件是：4重量份麸皮和6重量份木糖渣充分混匀后添加6～8倍的水进行浅层固态发酵，培养湿度控制在45～75％，培养温度20～28℃，培养时间为10～12天。培养产物经5～10倍水常温浸提30到60分钟后除去培养物，浸出液经超滤浓缩冻干成粉后酶活力大于3000U/g(DMP作为底物)。培养时间较肖亚忠等人培养的栓菌AH28-2的培养时间有效缩短10天左右，冻干后酶粉活性略低。与施晓燕等人分离得到的菌株相比发酵时间大致一致但酶活性大大高于其发酵酶活性。此外国外有用香蕉皮葡萄核等固体发酵能够产高酶活性的漆酶，但原料来源相比木糖渣和麸皮比较难收集，很难大规模培养，且其发酵最佳时间在22天左右，较白耙齿菌培养时间长10天左右。

SEQUENCE LISTING

<110>山东大学

<120>一种漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>696

<212>DNA

<213>Irpex lacteus sdu-5

<400>1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatcgagt 60

tttgaacggg ttgtagctgg cctttcacga ggcatgtgca cgcctggctc atccactctt 120

aacctctgtg cactttatgt aagagaaaaa aatggtggaa gcttccagga tctcgcgaga 180

ggtcttcggt tgaacaagcc gtttttcttt cttatgtttt actacaaacg cttcagttat 240

agaatgtcaa ctgtgtataa cacatttata tacaactttc agcaacggat ctcttggctc 300

tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga 360

atcatcgaat ctttgaacgc accttgcact ccttggtatt ccgaggagta tgcctgtttg 420

agtctcatgg tattctcaac ccctaaattt ttgtaatgaa ggtttagcgg gcttggactt 480

ggaggttgtg tcggcccttg tcggtcgact cctctgaaat gcattagcgt gaatcttacg 540

gatcgccttc agtgtgataa ttatctgcgc tgtggtgttg aagtatttat ggtgttcatg 600

cttcgaccgt cttcttgccg agacaatcat ttgacaatct gagctcaaat caggtaggac 660

tacccgctga acttaagcat atcaataagc ggagga 696

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5，该菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3548。

2.一种如权利要求1所述的白耙齿菌(Irpex lacteus)sdu-5的培养方法，其特征在于，具体步骤如下：

取菌种保藏编号为CGMCC No.3548的白耙齿菌sdu-5菌株，将该菌株接种至麸皮浸出液斜面培养基中活化3～4天，温度为28～30℃；取活化后的白耙齿菌sdu-5接种于麸皮液体培养基扩大培养，培养温度为28～30℃；培养时间为3～4天，震荡型摇床的速度为80转/分钟；将经扩大培养的菌液接种于优化产酶合成培养基中或固体发酵培养基中发酵培养；

所述优化产酶合成培养基的配方为：每升液体培养基含：9.5～10.5g葡萄糖，0.4～0.5gK₂HPO₄，1.5～2.5g(NH₄)₂HPO₄，0.3～0.5g NaH₂PO₄，0.4～0.6g MgSO₄·7H₂O，1.5～2.5g酵母浸膏，0.001g ZnSO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.06g CaCl₂，0.005g CuSO₄·5H₂O，0.005g MnSO₄·H₂O，藜芦醇2～4mM，pH 5.5～6.5；

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述麸皮浸出液体培养基的制备方法如下：麸皮195～205g加到1L水中，沸煮30min，六层纱布过滤，自然pH，121℃灭菌20～30min。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述麸皮浸出液斜面培养基的制备方法如下：麸皮195～205g加到1L水中，沸煮30min，六层纱布过滤，添加19.5～20.5g琼脂，自然pH，121℃灭菌20～30min。

5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基的制备方法为：4重量份麸皮和6重量份木糖渣充分混匀后添加6～8倍的水于120℃灭菌30～50min后置于25～35℃隔24小时后再次于120℃灭菌30～50min，即得。

6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基的培养条件为：浅层固态发酵，培养湿度45～75％，培养温度20～28℃，培养时间10～12天。