CN113729110B - 一种生物质材料高效低成本预处理结合固态发酵方法及在单细胞蛋白饲料生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开高效低成本预处理结合固态发酵的生物质材料处理方法，其中，可阶段变温的连续汽爆可以实现生物质中纤维素，半纤维素，木质素的有效分离，且溶液偏中性而无需脱毒直接发酵，能耗大大降低；后续生物材料固态发酵过程中，添加选育出的可以高效利用木质纤维素的里氏木霉和黑曲霉菌株在利用生物质材料生长过程中分别向胞外分泌纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶，两种酶系相互协同，高效降解木质纤维素类的农业废弃物中纤维素转化为菌体可以利用的可发酵糖。随后酵母的加入可以高效地降低培养基质中的可发酵糖浓度，有效地降低葡萄糖对黑曲霉/里氏木霉纤维素酶的反馈抑制作用，从而有利于提升黑曲霉/里氏木霉纤维素酶的分泌量，加快秸秆的酶解效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物质的处理和饲料领域，具体涉及生物质材料高效低成本预处理方法及在单细胞蛋白饲料生产中的应用。
背景技术
据估计，每年全球产生的农业废弃物约为 22亿吨（Kishore, V., Bhandari, P.M., P. Gupta, P. (2004). Biomass energy technologies for rural infrastructureandvillage power—opportunities and challenges in the context of globalclimate change concerns. Energy Policy, 32,801-810.doi:10.1016/S0301-4215(03)00002-8）,我国是世界上最大的农业国农业秸秆总量7.8亿吨，其所含能量约4.5亿吨标准煤，占我国有机废弃物资源总量的60%，绝大部分都未能得到有效利用，造成了巨大的浪费和环境问题(Wu, Z., Zhang, M., Wang, L. (2013). Biomass digestibility ispredominantly afected bythree factors of wall polymer features distinctive inwheat accessions and rice mutants. Biotechnology for Biofuels, 6(1), 183；Qu,Y.B., Fang, X. (2018). Fungal cellulolytic enzymes: Microbial production andapplication. Springer nature.)。据我国统计数据显示，目前我国农作物秸秆除了作为饲料、工业原料外，绝大部分作为农村的初级燃料，利用效率极低，而且造成了严重的环境污染。农业废弃物高值化利用已成为我国经济、社会可持续发展的一个重要方向。
农业废弃物玉米秸秆一年就生产高达3.6亿吨，玉米芯一年产量为1亿吨以上，甘蔗渣也有近1亿吨产量。玉米秸秆蕴含着与普通粮食基本相当的总能并且还含有许多对畜禽生长发育有益的营养物质。是尚未充分开发利用的最大量的碳水化合物资源，是非常宝贵的生物资源。但随着近年来玉米和甘蔗种植的迅速发展，一南一北两大特色农业废弃物的处理却成为大的难题。另一方面, 传统农业蛋白质原料资源短缺是制约饲料业和畜牧业发展的首要问题。大豆是重要的传统蛋白质原料，每年大豆进口量均在9000万吨左右，而进口量的三分之二用于饲料部分(尹杰, 刘红南, 李铁军.(2019) 我国蛋白质饲料资源短缺现状与解决方案. 中国科学院院刊, 34(01), 97-101.)。由于我国饲用粮短缺,人畜争粮现象进一步加剧,严重威胁了粮食安全。面对粮食短缺和潜在的农业废弃物饲料资源的浪费，对秸秆资源的开发利用显得意义重大。近年来，玉米秸秆在青贮饲料、直接还田肥料领域得到广泛的应用。青贮秸秆饲料不足之处是无法改变玉米秸秆低蛋白含量的限制，单一使用无法满足动物对蛋白的需求。秸秆发酵饲料仍停留在实验室或小型生产规模，秸秆发酵饲料中粗蛋白质含量可以提升到16-25%，但氨基酸含量一般仅为12%左右。玉米芯和甘蔗渣资源开发为初级饲料，消化率很低。而农业废弃物利用生物固态发酵方法生产饲料蛋白，通过其高蛋白含量、优氨基酸配比的特性有效地提升秸秆饲料的营养品质，提升畜禽动物对农业废弃物来源的蛋白饲料消化利用率，从而提升畜禽免疫力。农业废弃物规模化生物合成饲料蛋白是低成本健康养殖的最佳出路，农业废弃物规模化生产饲料蛋白是解决农业废弃物综合利用问题的理想途径。所以现有的技术利用农业废弃物开发的单细胞产品中真蛋白含量不高，成本不低，农业废弃物发酵单细胞蛋白仍无大规模产业化生产，还无法实现传统农业蛋白的替代。
主要原因有两点，一是农业废弃物大部分为木质纤维素类材料，抗降解屏障较为顽固，抗营养因子仍在，如何开发高效低成本的预处理工艺及设备，应对规模化处理秸秆；
农业废弃物原料秸秆组分复杂、结构不均一、 组分间结合紧密、抗降解能力强。目前将秸秆转化成高值化产品，预处理是必不可少的过程。通过预处理可以部分的去除半纤维素及木素成分、降低纤维素的结晶度、增加纤维素酶与底物的接触面积、提高纤维素酶的可及性，从而提高酶的降解纤维素的效率。
一般情况下，预处理被分为生物预处理法、物理预处理法和化学预处理法， 或者是这些方法相结合。物理预处理主要是通过对生物质的破碎、研磨等机械手 段将生物质变成较小的颗粒,增加酶对纤维素的接触面积，同时还可能部分地破 坏纤维素的结晶结构。但机械粉碎处理方式存在能耗大的缺点。化学预处理就是在高温高压下利用加入的催化剂去除木质纤维原料中的半纤维素、木素，或者 是改变原料的致密结构以利于纤维素酶的酶解。
酸碱预处理往往具有较强的腐蚀性、毒性和危险性,对反应容器的耐腐蚀性要求较高,并且在使用后因经济性原因还要回收,故其实际应用较少。有机溶剂预处理是借助有机溶剂或有机溶剂的水溶液在无机酸的催化作用 下破坏半纤维素和木质素的内结点而实现纤维素和木质素、半纤维素的分离；为了经济可行和不至于抑制下一步的酶水解和发酵工艺,反应结束后必须对有机溶 剂进行蒸发、浓缩、回收，相对操作步骤较为繁琐。生物预处理法的优点是能耗小、对环境友好,但存在降解速度慢的缺点。目前，可工业应用放大的预处理技术只有蒸汽***预处理技术。蒸汽***是指植物原料在高温、高压蒸汽中蒸煮,产生一些酸性物质,使半纤维素降解成可溶性糖,同时细胞壁的复合胞间层中的木质素软化和部分降解,从而削弱了纤维间的粘结,再通过蒸汽***瞬间完成的绝热膨胀过程对外做功,使物料从胞间层解离成单个纤维细胞（Chen H, Lan W. 2017. Chapter 3 –Pretreatment Strategies for Biochemical Conversion of Biomass.Technol.Biochem. Convers. Biomass, Elsevier, 21–64.）。目前的这些商业化预处理工艺往往是通过加大预处理强度，破坏木质纤维素解构，减少酶用量。但这些预处理技术和工艺普遍存在能耗和成本过高的问题，同时还伴随大量酶解抑制物和三废的产生，绝大多数预处理工艺难以实现产业化推广应用（岳国君.2014.纤维素乙醇工程概论，化学工业出版社.）。
同时，在产业化粗放条件下混菌发酵工艺无法调控，现有国内老一代微生物菌体蛋白的生产菌种存在秸秆转化效率低、必需氨基酸积累量少，蛋白质合成能力不足等问题，农业废弃物固态发酵生产饲料品质相对较低，无法重现实验室结果，也是制约秸秆发酵饲料规模化生产的因素。建立可优化、可复制的固态发酵技术，明确菌体活力和其他因子间的动态关联模式，监控饲用菌株固态发酵秸秆时的过程特性变化，是实现秸秆饲用蛋白产业化关键。
发明内容
基于上述需求，本发明开发了一种生物质材料高效低成本预处理方法及在单细胞蛋白饲料生产中的应用。
本发明提供一种高效低成本预处理结合固态发酵的生物质材料处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）生物质材料蒸煮阶段；农业废弃物生物质材料玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣中一种或多种，于硫酸溶液浸泡，并升温增压；
2）生物质材料***阶段：降压***；
3）分别取上述方法预处理的生物质材料加水，添加里氏木霉和黑曲霉孢子液进行固态发酵；
其中，所述黑曲霉的保藏号为：CGMCC No.22465；所述里氏木霉菌的保藏号为：CGMCC No. 21470。
优选实施方式中，第1）步中升温增压是升温至140-180℃，保温时间4-10min，压力0.8-1.0Mpa。
另一优选实施方式中，第2）步中降压***将压力降至0.4-0.7Mpa，保持相同温度4-8min。
再一优选实施方式中，第3）步中固态发酵是在25-35℃下培养24-36小时。
进一步优选地，当第3）固态发酵后，再添加产朊假丝酵母种子液，继续于25-35℃下培养100-150小时。
另一些实施方式中，第1）步中，生物质材料按照1：4-10的固液比后进行升温增压。
另外一些实施方式中，第3）步中，预处理的生物质材料按照料水比1:2至3的比例加入水，作为固态发酵的培养基。
优选地，第3）步中，里氏木霉和黑曲霉孢子液优选按1：1配比，所述黑曲霉和里氏木霉的孢子浓度均为1×107个/mL至2×109个/mL。
本发明还提供所述的生物质材料处理方法在单细胞蛋白饲料生产中的应用。进一步优选地，所述第3）步发酵完成后，进一步包括分离粗蛋白的步骤。
本发明开发高效低成本预处理结合固态发酵的生物质材料处理方法，包括农业废弃物的可阶段变温汽爆预处理方法和固态发酵两个方面。其中可阶段变温的连续汽爆方法可以实现生物质中纤维素，半纤维素，木质素的有效分离，木糖脱除率达到90%以上，且木糖溶液偏中性，可以用来下游的直接发酵，无需脱毒；并且能耗降低到目前***技术的40%且抑制物降低到目前汽爆预处理技术的10%以下，预处理成本不足200元/吨原料。而在生物材料发酵过程中，添加本发明人选育出的可以高效利用秸秆的里氏木霉和黑曲霉菌株在利用生物质材料生长过程中分别向胞外分泌纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，两种酶系相互协同，高效降解玉米秸秆的纤维素转化为菌体可以利用的可发酵糖。当加入酵母种子液后，酵母可以高效利用可发酵糖转化为菌体蛋白；酵母的加入可以高效地降低培养基质中的可发酵糖浓度，有效地降低葡萄糖对黑曲霉/里氏木霉纤维素酶的反馈抑制作用，从而有利于提升黑曲霉/里氏木霉纤维素酶的分泌量，加快秸秆的酶解效率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行阐述，以期更好的理解本发明。但不构成对本发明的限制。
实施例1：工艺的建立
第一阶段，蒸煮阶段；农业废弃物生物质材料玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣通过粉碎机切割成10cm左右的小块，分别按照1：8（固液比），浸泡在0.5%稀硫酸溶液中，保温温度160℃，保温时间6min，压力0.9Mpa；
第二阶段，***阶段：蒸煮后，将压力降至0.6Mpa，仍于温度160℃保温，保温时间6min。
对比汽爆预处理前后生物质材料组分变化。
表1 各种农业废弃物生物质材料汽爆预处理后的组分变化
实施例2：单细胞蛋白的生产
应用汽爆预处理后的生物质材料（包括甘蔗渣，玉米秸秆、玉米芯）生产单细胞蛋白。
里氏木霉/黑曲霉孢子液：取黑曲霉60B-3DW和里氏木霉A2H分别划线PDA平板于30℃培养5d，之后用无菌水洗脱孢子，然后用细胞过滤器过滤掉菌丝，再用血球计数板计数，最后调整黑曲霉和里氏木霉的孢子浓度均为1.2×108个/mL。
其中，菌株黑曲霉Aspergillus niger 60B-3DW被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.22465，保藏时间为：2021年07月05日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株是以黑曲霉3.316（保藏于中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心，CGMCC NO. 3.316）为出发菌株，经ARTP诱变，液滴微流控高通量筛选技术选育出的β-葡萄糖苷酶活力大幅度提高的突变株。
里氏木霉Trichoderma reesei A2H，其被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号为：CGMCC No.21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
分别取如实施例1所述方法的汽爆预处理玉米秸秆、甘蔗渣、玉米芯，按照料水比1:2.5加入水，作为固态发酵的培养基。里氏木霉和黑曲霉孢子液均按照5%接种量(即1：1配比)添加至汽爆预处理生物质材料固态发酵的培养基表面，30℃下培养24-36小时。
当上述黑曲霉和里氏木霉水解生物质材料24小时后，按照10%添加量向其中添加产朊假丝酵母种子液，继续30℃下固态发酵120小时。
按实施例1汽爆预处理的玉米秸秆、甘蔗渣、玉米芯分别于固态发酵7天取发酵后秸秆烘干后，测定单细胞蛋白产品总氮含量和氨基酸含量。按照粗蛋白=固体总氮含量*6.25，计算发酵后秸秆粗蛋白含量。结果显示，固态发酵7天后发酵后汽爆秸秆的粗蛋白含量约28.25%；汽爆甘蔗渣的粗蛋白含量约30.25%，汽爆玉米芯的粗蛋白含量约29.88%。
粗蛋白质GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白的测定方法》。氨基酸含量测定采用A200型amino Nova氨基酸分析仪参照中华人民共和国国家标准GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》进行测定。从下表中可以看到，固态发酵7天后发酵后汽爆秸秆的氨基酸含量约21.21%；汽爆甘蔗渣的氨基酸含量约23.45%，汽爆玉米芯的氨基酸含量约22.76%。
表2 汽爆后生物质材料固态发酵生产的单细胞产品分析
| 材料 | 玉米秸秆 | 甘蔗渣 | 玉米芯 |
| 总氮含量（%） | 4.52 | 4.84 | 4.78 |
| 粗蛋白含量（%） | 28.25 | 30.25 | 29.88 |
| 氨基酸含量（%） | 21.21 | 23.45 | 22.76 |
本发明以农业废弃物出发，通过集成优化生物质炼制的关键技术，如可阶段变温汽爆预处理技术，混菌固态发酵技术等，利用生物转化方法合成新型高蛋白、全氨基酸、复合益生功能单细胞蛋白饲料。本发明中汽爆预处理方法和固态发酵方法均可复制放大，可产业化应用，具有较好的产业化前景。汽爆预处理后的甘蔗渣，玉米秸秆，玉米芯为底物，经过特定的里氏木霉、特定的黑曲霉、产朊假丝酵母混合发酵后，单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过28%，氨基酸含量均超过21%，实现农业废弃物资源变废为宝，颠覆传统农业蛋白生产模式，促进我国蛋白原料的自给自足，实现我国循环经济和农业可持续发展的重要途径。同时精准解决我国农业废弃物资源化利用率低、传统农业蛋白短缺两大难题，提升我国农业的综合生产力和竞争力，具有重要的战略意义。
Claims (10)
1.一种高效低成本预处理结合固态发酵的生物质材料处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)生物质材料蒸煮阶段；农业废弃物生物质材料玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣中一种或多种，于硫酸溶液浸泡，并升温增压，所述升温增压是升温至140-180℃，保温时间4-10min，压力0.8-1.0Mpa；
2)生物质材料***阶段：降压***，所述降压***将压力降至0.4-0.7Mpa，保持相同温度4-8min；
3)分别取上述方法预处理的生物质材料加水，添加里氏木霉和黑曲霉孢子液进行固态发酵；
其中，所述黑曲霉的保藏号为：CGMCC No.22465；所述里氏木霉菌的保藏号为：CGMCCNo.21470。
2.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第1)步中升温增压是升温至160℃，保温时间6min，压力0.9Mpa。
3.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第2)步中，降压***将压力降至0.6Mpa，保持相同温度6min。
4.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第3)步中，固态发酵是在25-35℃下培养24-36小时。
5.如权利要求1至3任一项所述的生物质材料处理方法，其特征在于，当第3)固态发酵后，再添加产朊假丝酵母种子液，继续于25-35℃下培养100-150小时。
6.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第1)步中，生物质材料按照1：4-10的固液比后进行升温增压。
7.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第3)步中，预处理的生物质材料按照料水比1:2至3的比例加入水，作为固态发酵的培养基。
8.如权利要求1所述的生物质材料处理方法，其特征在于，第3)步中，里氏木霉和黑曲霉孢子液按1：1配比，所述黑曲霉和里氏木霉的孢子浓度均为1×107个/mL至2×109个/mL。
9.如权利要求1至8任一项所述的生物质材料处理方法在单细胞蛋白饲料生产中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，第3)步发酵完成后，进一步包括分离粗蛋白的步骤。
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