CN101343420A - 一类不对称菁类荧光染料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种式I的不对称菁类荧光染料，其中X、n、R1、R2、R3、R4、R5和Y－如说明书中的定义。本发明还提供了该荧光染料的缀合物、制备方法、包含这种荧光染料的组合物和使用这种荧光染料或其组合物进行生物染色的方法。
Description
技术领域
本发明涉及适合用于核酸染色的染料，更具体地说涉及不对称菁类荧光染料。
背景技术
荧光检测技术在DNA杂交测试、基因重组测试、免疫检测、血细胞分析和肿瘤细胞早期诊断等方面的广泛应用极大地促进了荧光染料的发展。最早应用于生物分析的荧光染料为吖啶、菲啶类染料，如吖啶橙、溴乙锭等，它们通过嵌入或静电吸引与DNA小分子结合，结合后荧光大大增强。但未结合染料的自身荧光会造成高的荧光背景，从而干扰检测。同时溴乙锭等有很大的毒性和致癌性，因此它们已逐渐被其它荧光染料代替。
目前，使用比较多的有罗丹明、荧光素类、BODIPY类和菁类荧光染料。菁类荧光染料首先由Williams发现，至今已有150年的历史，如今作为生物荧光检测探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用，其中作为生物分子的荧光探针用于检测核酸、蛋白质等尤其成为关注的焦点。
菁染料甲川链两端的含氮芳香母核有很多种类，包括噻唑、噻吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等。按其相同与否可分为对称和不对称两类。其中，不对称菁染料主要应用于物理结合荧光标示，与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式取决于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁染料中最典型的一类为TOTO及其类似物和衍生物类。TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链两端的染料分子可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中无荧光，与核酸结合后荧光增强，因此降低了检测过程中的荧光背景干扰。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[J.A.Bordelon，K.J.Feierabend，S.A.Siddiqui，L.L.Wright.J.Phys.Chem.B，2002，106，4838-3843]。Fürstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动力学机理[A.Fürstenberg，M.D.Julliard，T.G.Deligeorgiec，N.I.Gadjev.J.AM.CHEM.SOC.，2006，128，7661-7669]。但是此类染料的光谱在可见光区(490-530nm)，而生物样品在这个区域有很强的吸收和荧光发射，这会造成荧光检测效率大大降低。尽管通过增加共轭链数可以使染料的吸收和发射波长产生红移达到近红外区(670-1000nm)，如TOTAB、TOTIN、TO-PRO-3、PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M.Sovenyhazy，J.A.Bordelon，J.T.Petty.Nucleic Acids Res，2003，31，2561]，但这类染料一般分子较大，结构复杂，合成步骤多，因而使其商品化受到了限制。
此外，随着甲川链的增长，菁染料的光稳定性逐渐下降，因此需要进一步提高长波长菁染料的光稳定性。
美国专利6004816描述了一种用于分类和计数白细胞的试剂，其中包含的荧光染料特异性结合RNA而增加其荧光强度。但是这种荧光染料的光稳定性仍然不足，容易造成实验误差。
美国专利公开2003/0145394公开了一种氦-氖激光器可激发的荧光染料，其用于检测和计数网织红细胞。这种荧光染料需要昂贵的氦-氖激光器，实际应用的设备成本较高。
因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料优选具有以下性质：在不存在核酸时不发荧光，而在存在核酸时具有良好的荧光量子产率；具有一定水平的水溶性，同时具有一定的穿过细胞膜的能力；光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。
发明内容
在一个方面，本发明结合现有的各类菁染料的优点，在其基础上改进，提供了一类不对称菁类荧光染料，其具有下列结构通式I：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为负离子。
优选n为1或2，更优选n为1。
优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X为S。
优选R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基或卤素；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-18烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-12烷基；再更优选R1和R2各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R1和R2均为H。
优选R3为H、C1-18烷基、OR5、COOR5或卤素；更优选R3为H、C1-12烷基、OR5、COOR5或卤素；最优选R3为H、C1-6烷基、OR5、COOR5或卤素。
优选R4为C1-18烷基、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选R4为C1-18烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；最优选R4为C1-6烷基或苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
优选R5为H或C1-12烷基，更优选R5为H或C1-6烷基。
优选Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸负离子。
在一个实施方案中，本发明还提供上述式I化合物的缀合物。
在另一个方面，本发明还提供合成上述式I化合物或其缀合物的方法。
在另一个方面，本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
在另一个方面，本发明还提供使用上述式I化合物或其缀合物或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1是化合物A、B和已知化合物M在乙醇中的光稳定性对比。横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W碘钨灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35。
图2是化合物A、B和已知化合物M在DMSO中的光稳定性对比。横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W碘钨灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35。
图3是化合物A和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35；荧光分光光度计，型号：LS 55。
图4是化合物B和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35；荧光分光光度计，型号：LS 55。
图5是化合物A在含不同浓度pET-32a(+)质粒DNA的水溶液中的荧光发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合物A的浓度为3.3μM。箭头表示DNA的浓度(ng/mL)变化从小到大依次为0、6.67、13.33、20、26.67。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代”修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
本文中使用Y表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离子，例如卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
本发明的化合物及其缀合物
在一个方面，本发明提供了具有下列结构通式I的不对称菁类荧光染料：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为负离子。
优选n为1或2，更优选n为1。
优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X为S。
优选R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基或卤素；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-18烷基；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-12烷基；更优选R1和R2各自独立选自H或C1-6烷基；最优选R1和R2均为H。
优选R3为H、C1-18烷基、OR5、COOR5或卤素；更优选R3为H、C1-12烷基、OR5、COOR5或卤素；最优选R3为H、C1-6烷基、OR5、COOR5或卤素。
优选R4为C1-18烷基、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选R4为C1-18烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为C1-12烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；最优选R4为C1-6烷基或苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
优选R5为H或C1-12烷基，更优选R5为H或C1-6烷基。
优选Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
本发明化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式I化合物的衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物温育一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。
或者，在另一个实施方案中，该荧光缀合物还可用于固相免疫测试，例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域公知的，可由标准教科书获得。本发明的荧光缀合物可用作固相免疫测试中的各种合适成分。
化合物的合成
在另一个方面，本发明还提供合成上述式I化合物的方法。
该不对称菁类荧光染料的合成一般通过以下流程进行：首先由未取代或取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并噁唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉等原料开始，使其与取代或未取代的苄基卤化物反应，两者的摩尔比为1∶1-2，在甲苯中回流12-36小时，可制得季铵盐中间体II：
其中X、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义；
然后，将制得的季铵盐中间体II与连接分子缩合，可得到式III化合物：
其中X、n、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义，连接分子可为N，N’-二苯基甲脒或其高级同系物；
通过与制备式II化合物类似的方法得到取代或未取代的4-甲基喹啉季铵盐中间体，最后将其与式III化合物在吡啶或醋酐的作用下回流，即可得到本发明的不对称菁类荧光染料。所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤进行之前或刚完成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常规的官能团修饰来产生，这包括在本发明的方法步骤方面。这种反应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取代基的还原、取代基的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件是化学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如酰卤和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入酰基，用烷基卤和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入烷基，和引入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如用镍催化剂进行催化氢化或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还原成氨基；将烷硫基氧化成烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。
包含式I化合物的本发明荧光缀合物可通过任何本领域已知的常规方法合成。
组合物
在再另一个方面，本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外，还可包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在，或者可作为临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
使用
在再另一个方面，本发明还提供使用上述式I化合物或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法，该方法包括使上述式I化合物或其缀合物或包含式I化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
特点
由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可了解本发明荧光染料的各种优点，包括但不限于以下：
(1)本发明的荧光染料化合物分子中引入了空间位阻大的苄基，提高了染料的光稳定性，减小了因甲川链增长而导致的染料光稳定性下降的问题；
(2)本发明的荧光染料化合物在一端引入了喹啉环，与甲川链相同的对称苯并噻唑和吲哚啉类菁染料相比，最大吸收波长可增加约80nm，发射波长范围宽，可达650nm-900nm的近红外区，可避免生物自身的荧光背景干扰，同时其染料摩尔消光系数大，灵敏度高，可应用于核酸标记、免疫检测、血细胞分析等各生物分析领域；
(3)本发明的荧光染料化合物没有过长的甲川链，因此结构简单，原料易得，毒副性小，成本低廉，易产业化；
(4)本发明的荧光染料化合物可应用廉价、体积小、性能稳定的红色半导体激光器作为光源，大大降低配套的仪器成本。
为了说明本发明的化合物对染料性能的优化改进，在实施例6，7中以已知化合物M作为参照。M结构如下：
M可通过以下合成路径来合成，也可参见Journal of the AmericanChemical Socitey(1945)67，18889-93。
实施例1
中间体1-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐的合成
将20mmol 2-甲基苯并噻唑和22mmol溴化苄加入到50ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应24小时后停止。混合物冷却后过滤沉淀并用***洗涤滤饼。干燥后得到淡粉色的固体粉末，粗收率58％。
实施例2
化合物A的制备
在60ml醋酸中，将10mmol 1-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐与30mmol N，N’-二苯基甲脒于90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的***析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黄色组分，收率42％。向其中加入1-苄基-4-甲基喹啉季铵盐4mmol及吡啶10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入***中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶5，收集蓝色组分，得到标题化合物，收率70％。
1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)5.49(s，2H)，5.71(s，2H)，6.44(d，1H)，6.98(d，1H)，7.18-7.80(m，18H)，8.23(t，1H)，8.31(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C33H27BrN2S m/z：483.2[M-Br]+。
实施例3
化合物B的制备
在60ml醋酸中，将10mmol 1-(4-氟)-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐与30mmol N，N’-二苯基甲脒于90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的***析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黄色组分，收率47％。向其中加入1-(4-氟)-苄基-4-甲基喹啉季铵盐5mmol及吡啶10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入***中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶5，收集蓝色组分，得到标题化合物，收率65％。1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)5.46(s，2H)，5.68(s，2H)，6.45(d，1H)，6.97(d，1H)，7.05-7.76(m，16H)，8.18(t，1H)，8.30(d，1H)，8.37(d，1H)。MS(EI)C33H25BrF2N2S m/z：519.2[M-Br]+。
实施例4
化合物C的制备
将10mmol 1-(4-甲氧基)-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐与14mmolN，N’-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌2小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的***析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3.5，收集黄色组分，收率35％。向其中加入1-乙基-4-甲基喹啉季铵盐3mmol及吡啶8ml，90℃油浴上加热搅拌1小时。将反应液倒入***中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶6，收集蓝色组分，收率75％。
1H-NMR δ(400MHz，CD3OD，TMS)1.23(t，3H)，3.76(tetra，2H)，3.69(s，3H)，5.69(s，2H)，6.44(d，1H)，6.98(d，1H)，7.18-7.90(m，12H)，8.23(t，1H)，8.31(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C29H27IN2OS m/z：451.2[M-I]+。
实施例5
化合物D的制备
将10mmol 1-(4-羧基)-苄基-2，3，3-三甲基苯-3H-吲哚啉季铵盐与15mmol N，N’-二苯基甲脒在40ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的***析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶4，收集黄色组分，收率37％。向其中加入1，4-二甲基喹啉季铵盐4mmol及醋酐8ml，90℃油浴上加热搅拌2小时。将反应液倒入***中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶20，收集紫色组分，收率68％。
1H-NMR δ(400MHz，CD3OD，TMS)1.73(s，6H)，3.80(s，3H)，5.49(s，2H)6.44(d，1H)，6.96(d，1H)7.21-7.80(m，12H)，8.22(t，1H)，8.32(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C31H29IN2O2m/z：461.2[M-I]+。
实施例6
化合物E的制备
将8mmol 1-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐与10mmol丙二醛缩苯胺盐酸在20ml溶剂(醋酸∶醋酸酐＝1∶1)中加热到120℃，反应1小时后，冷却，加入乙酸乙酯析出固体。过滤，乙酸乙酯冲洗3次，除去未反应的过量的缩合剂。干燥，得棕黄色粉末，粗收率79％。向其中加入1-(4-硝基)-苄基-4-甲基喹啉季铵盐6mmol及醋酐10ml，120℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入***中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶10，收集蓝色组分，收率43％。
1H-NMR δ(400MHz，CD3OD，TMS)5.49(s，2H)，5.72(s，2H)，6.24(d，1H)，6.37(d，1H)，6.48(t，2H)，8.29(t，1H)，7.22-7.85(m，17H)，8.38(d，1H)，8.45(d，1H)。MS(EI)C35H28BrN3O2S：m/z：554.2[M-Br]+。
实施例7
化合物A、B和M在乙醇和DMSO中的光稳定性测定：
将化合物A、B和M分别配成1×10-5M的甲醇和DMSO溶液装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。每隔1小时后，测量样品光照后的吸光度值。如图1和2所示，经过6小时光照后，已知化合物M在乙醇和DMSO中分别褪色38％和54％；化合物A分别褪色16％和45％；化合物B分别褪色21％和48％。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35。
数据显示，本发明化合物相对已知化合物，显示出明显较高的光稳定性。
实施例8
化合物A、B和M在乙醇中的荧光量子产率的测定：
配置一定浓度的化合物A、B和M的乙醇溶液，满足经紫外可见分光光度计测定最大吸收值＜0.1。分别选定激发波长测定荧光强度。平行测定三次，算出荧光量子产率，取平均值。以罗丹明B作为标准物(ΦF＝0.97，乙醇)计算，在乙醇溶液中已知化合物M的荧光量子产率ΦF＝0.44×10-2；A的荧光量子产率ΦF＝0.76×10-2；B的荧光量子产率ΦF＝0.55×10-2。如图3和4分别为化合物A和M，B和M在乙醇中的吸收和发射光谱。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda 35；荧光分光光度计，型号：LS 55。
数据显示，本发明化合物相对已知化合物，显示出较高的荧光量子产率。
实施例9
化合物A在含不同浓度DNA的水溶液中荧光强度的测定：
配制浓度为1×10-4M的化合物A的DMSO溶液，取100μL加去离子水稀释至3mL置于比色皿中，测定其荧光强度。然后，取浓度为10ng/μL的pET-32a(+)质粒DNA 2μL滴加到上述比色皿中，稳定后测定其荧光强度。如此继续滴加该DNA并测定荧光强度值，结果见图5，随着DNA浓度的增大，荧光逐渐增强。同时，染料发射光谱与加入DNA之前相比出现10nm左右的红移。测试温度为0-5℃；所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。根据图5可知，本发明荧光染料产生的荧光强度与DNA的浓度呈浓度依赖性，从而可用于细胞内核酸的染色。
Claims (13)
1.一类荧光染料，所述染料具有如下结构通式I：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5或卤素；
R3为H、C1-18烷基、OR5、-C1-6烷基-OR5、COOR5、NO2、CN或卤素；
R4为C1-18烷基、-C1-6烷基-OR5、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
R5为H或C1-18烷基；
Y-为负离子。
2.权利要求1的化合物，其中R1和R2独立选自H、C1-18烷基或卤素；优选R1和R2均为H。
3.权利要求1-2中任一项的化合物，其中R3为H、C1-18烷基、OR5、COOR5或卤素；优选R3为H、C1-6烷基、OR5、COOR5或卤素。
4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R4为C1-18烷基、苄基或卤素，所述苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；优选R4为C1-6烷基或苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中R5为H或C1-12烷基，优选R5为H或C1-6烷基。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中X为C(CH3)2、O或S；优选X为C(CH3)2或S。
7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中n为1或2。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸负离子。
9.权利要求1-8中任一项的化合物，其中所述化合物为：
10.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物中包含权利要求1-9中任一项的化合物。
11.一种合成权利要求1-9中任一项的化合物的方法，所述方法包括
1)使未取代或取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并噁唑或2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉与取代或未取代的苄基卤化物反应，得到季铵盐中间体II：
2)将1)中得到的季铵盐中间体II与N，N’-二苯基甲脒或其高级同系物缩合，可得到式III化合物：
3)通过与制备式II化合物类似的方法，得到取代或未取代的4-甲基喹啉季铵盐中间体；
4)将3)中得到的4-甲基喹啉季铵盐中间体与式III化合物回流，得到式I化合物；
其中X、n、R1、R2、R3、R4、R5和Y-如权利要求1-9中任一项的定义。
12.一种用于生物样品染色的组合物，其特征在于所述组合物包含权利要求1-9中任一项的化合物或权利要求10的缀合物。
13.一种染色生物样品的方法，所述方法包括将权利要求1-9中任一项的化合物、权利要求10的缀合物或权利要求11的组合物与生物样品接触。
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