CN104726352B - 一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用 - Google Patents

一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，从传统的黄酒酿造主液筛选得到，可耐受高达18％(vol)酒精浓度的发酵环境，在1.6mol/L的氯化钠浓度的高渗透压条件下有较好的适应性，在54g/L的乳酸浓度下仍有较好的生长状况；利用该菌株进行黄酒酿造，得到的黄酒中酒精含量高，还原糖含量低，底物利用较完全，产品具有独特风味，口感及较高的营养。

Description

一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株酿酒酵母及其在黄酒酿造中的应用。
背景技术
发酵是用来保持和提高食物风味和营养价值最古老的方法。在我国，以谷物(南方主要是糯米，北方主要是黍米、黑米和玉米)为原料，经麦曲和酒母经糖化和发酵制成的黄酒，作为我国最古老的酒种，与啤酒、葡萄酒一起并称为世界三大古酒。黄酒的发酵是利用酒药和麦曲等所含有的多种微生物，进行开放式的“双边发酵”，将原料中的淀粉糖化。酵母利用糖生成的酒精，蛋白质和脂肪等成分经微生物作用后变成了有机酸、氨基酸、酯及杂醇油，使得黄酒富含丰富的营养物质，因此，素有“液体蛋糕”的美称。
黄酒酿造过程中，酵母作为关键微生物，是发酵重要的动力源，优良的酵母菌种是酿制高产优质黄酒的前提。酵母菌不仅对发酵醪内的糖进行分解或同化淀粉和糊精，产生乙醇，同时，酵母发酵性能的优劣，代谢产物的差异直接影响到黄酒的风味、口感和出酒率。
在所有酿制酒中，要数黄酒的酒精含量(14-20％)最高，比起葡萄酒的8％-18％和啤酒的3％-6％都高，同时酿造过程中发酵液存在高渗透压、高盐、高酸等不利环境。酵母抵御不良环境的能力对于黄酒发酵过程的顺利进行和生产效率的高低密切相关。为避免发酵过程发生阻遏或迟滞现象，要求酵母菌种须具备足够的胁迫应答能力来抵御其所造成的影响。因此筛选出起酵速度快、产酒能力强、优良发酵性能，同时耐高渗透压、耐高酒精以及耐酸的抗逆性优良的酵母菌株作为理想的发酵剂用于优质黄酒的酿造生产，对于黄酒发酵工业具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决上述问题而进行的，针对现有技术中缺乏抗逆性优良、发酵效率高的黄酒酿酒酵母的不足，提供一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)及其在黄酒酿造中的应用。
本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9445。
进一步的，本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，采用浓度梯度稀释法稀释黄酒酿造主液，取稀释液100uL涂布于培养基平板上，而后进行划线分离纯化，得到分离菌株；步骤二，将步骤一中的分离菌株，采用TTC显色平板、杜氏管发酵、CO2失重法进行初步筛选，得到初步筛选菌株；步骤三，将步骤二中的初步筛选菌株通过酒精耐受性、乳酸耐受性以及高渗耐受性实验进行复筛，得到BR20菌株。
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选方法，还可以具有这样的特征：步骤一中的培养基平板为YPD培养基平板。
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株的筛选方法，还可以具有这样的特征：BR20菌株通过18SrDNA序列对比分析，确定种属。
进一步的，本发明还提供了利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将BR20菌株从斜面上转接并进行预活化，得到预定浓度的接种液；步骤二，向灭过菌的容器中投入发酵原料米饭，并向发酵原料米饭中接入5-15％(v/v)的所述接种液以及加入2％-20％(v/v)的麦曲，在20-35℃条件下静置开始进行主发酵；步骤三，步骤二中的主发酵进行10-30天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清后得到黄酒。
本发明还提供的利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，还可以具有这样的特征：步骤一中的菌株的预活化方法为：将BR20菌株接种于麦芽汁培养基上，在培养温度为30℃的条件下振荡培养16h，得到一级种子液，一级种子液以同样的条件进行二次扩大培养，得到二级种子液，二级种子液以4000rpm的条件离心8min后，收集菌体，菌体用生理盐水悬浮，得到菌体浓度为108cfu/mL的接种液。
本发明还提供的利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，还可以具有这样的特征：发酵原料米饭的制备方法为：将从市面上购得的糯米洗净后加入水进行浸米，待浸米水酸度达到2-10g/L，结束浸米，而后常压条件下蒸煮20min。
发明作用与效果
本发明提供了一株抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BR20菌株，从传统的黄酒酿造主液筛选得到，可耐受高达18％vol酒精浓度的发酵环境，在1.6mol/L的氯化钠浓度的高渗透压条件下有较好的适应性，在54g/L的乳酸浓度下仍有较好的生长状况；利用该菌株进行黄酒酿造，可以使酵液酒精含量达到30.58g/100mL，同时具有良好的风味及营养。
附图说明
图1是本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20的生长曲线。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
YPD培养基：10g酵母浸粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加水至1000mL，2％琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。
麦芽汁培养基：取200g麦芽，分别加入0.6g的1‰糖化酶与液化酶，加水至1000mL，在55-65℃条件下糖化3-4h，调整糖度为12-15°Bx，2％琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。
实施例一、酿酒酵母菌株的筛选与鉴定
1.1样品稀释液制备及菌株分离
采集来自浙江、上海地区传统方法酿造的黄酒主酵样品2g，加入15mL无菌水，剧烈震荡20min。采用浓度梯度稀释法(10-1-10-4)，取稀释液100uL涂布于YPD琼脂培养基平板上，28℃静置培养48h，挑选菌落大、生长快的菌株，进一步划线分离纯化。
1.2菌株初筛
将步骤1.1中的菌株以点植法利用TTC显色平板、杜氏管发酵、CO2失重法进行初步筛选。记录产气时间、最终产气量以及CO2总失重量，选择出四株菌株。实验结果如表1所示：
表1酵母菌的初筛结果
注：“++++”表示杜氏小管内充满气体；“+++”表示杜氏小管内有3/4气体；“++”表示杜氏小管内有1/2气体；“+”表示杜氏小管内有1/4气体；“-”表示杜氏小管内无气体。
如表1所示，杜氏管发酵中，BR20、BR25、BR26、BR29、BR30以及BR41菌株的产气时间均较短，产气量也占有杜氏小管的3/4以上。但BR29菌株的TTC显色结果明显浅于其他菌株，说明步骤1.1中，BR29的菌落总数偏少，其在黄酒主酵样品中的含量偏少；BR41菌株的CO2总失重量低于BR20、BR25、BR26以及BR30菌株。因此，选择BR20、BR25、BR26和BR30进行复筛。
1.3菌种复筛
将经过初筛后得到性能优良的BR20、BR25、BR26和BR30菌株进行抗逆性评价，分别评估菌种的酒精耐受性、乳酸耐受性、高渗耐受性。实验结果如表2所示。
表2酵母菌的抗逆性结果
注：“++++”表示杜氏小管内充满气体；“+++”表示杜氏小管内有3/4气体；“++”表示杜氏小管内有1/2气体；“+”表示杜氏小管内有1/4气体；“-”表示菌株无生长。
综合表2的结果，BR20菌株为抗逆性效果最好的菌株。
1.4菌株鉴定
BR20菌株的菌落呈椭圆形或类圆形，边缘整齐，菌落大小一般为5～7mm，乳白色。通过18SrDNA序列对比分析，结果显示该序列与NCBI数据库中酿酒酵母的同源性达99％，可以鉴定该菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。BR20菌株已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其编号为CGMCC 9445，保藏时间为2014.07.11。
酿酒酵母BR-20的18SrDNA序列如下：
AGGTGTGCTAATAATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAGACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGG
1.5菌株的生长特性
将活化好的酿酒酵母BR20菌株，按10％(v/v)接种量接入麦芽汁液体培养基中，28℃静置培养72h，每隔2-4h取样，以菌浓对时间作图得到菌株BR20的生长曲线。
图1为本实施例中的酿酒酵母BR20菌株的生长曲线图。
如图1所示，酿酒酵母BR20在0-8h内处于环境适应阶段，为生长延滞期；8-48h菌株生长迅速，为对数生长期；48-64h内菌株整体生长缓慢，为生长稳定期；64h后菌体浓度略有下降渐渐步入衰亡期。
实施例一的作用与效果
本实施例提供了从传统黄酒酿造主液中筛选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BR20菌株的筛选方法，采用梯度浓度稀释法，将稀释后的样品液涂布于YPD平板，30℃恒温培养后，划线分离得到分离菌株，而后结合发酵速率以及耐受性实验，确定BR20菌株为抗逆性优良、发酵效率高的酿酒酵母菌株。BR20菌株可耐受高达18％(vol)酒精浓度的发酵环境，在1.6mol/L的氯化钠浓度的高渗透压条件下有较好的适应性，在54g/L的乳酸浓度下仍有较好的生长状况。
实施例二、利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的方法
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的步骤如下：
步骤一，将酿酒酵母BR20接种于麦芽汁培养基中，30℃振荡培养16h，同样条件下进行二次扩大培养，4000rpm离心8min收集菌体，再用生理盐水悬浮菌体，调制菌浓为108cfu/mL的接种液；
步骤二，将从市面上购得的糯米洗净后加入水进行浸米，待浸米水酸度达到2g/L，结束浸米，常压条件下蒸煮20min；
步骤三，向灭过菌的容器中投入蒸好的米饭1kg、加入2％(v/v)的麦曲，接入5％(v/v)的酒母，将米饭、麦曲和酵母搅拌混匀，调整物料品温在20℃条件下静置开始进行主发酵；
步骤四，主发酵10天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清，即得黄酒。
本实施例所得的黄酒产品的酒精含量为12％vol，残还原糖含量为6.36g/L。结果表明，所得黄酒的酒精含量较高，还原糖含量较低，底物利用较完全，产品具有独特风味、口感及较高的营养。
实施例三、利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的方法
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的步骤如下：
步骤一，将酿酒酵母BR20接种于麦芽汁培养基中，30℃振荡培养16h，同样条件下进行二次扩大培养，4000rpm离心8min收集菌体，再用生理盐水悬浮菌体，调制菌浓为108cfu/mL的接种液；
步骤二，将从市面上购得的糯米洗净后加入水进行浸米，待浸米水酸度达到6g/L，结束浸米，常压条件下蒸煮20min；
步骤三，向灭过菌的容器中投入蒸好的米饭1kg、加入12％(v/v)的麦曲，接入10％(v/v)的酒母，将米饭、麦曲和酵母搅拌混匀，调整物料品温在28℃条件下静置开始进行主发酵；
步骤四，主发酵20天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清，即得黄酒。
本实施例所得产品的酒精含量为19％vol，残还原糖含量为1.55g/L。结果表明，所得黄酒的酒精含量高，还原糖含量低，底物利用较完全，产品具有独特风味，口感及较高的营养。
实施例四、利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的方法
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的步骤如下：
步骤一，将酿酒酵母BR20接种于麦芽汁培养基中，30℃振荡培养16h，同样条件下进行二次扩大培养，4000rpm离心8min收集菌体，再用生理盐水悬浮菌体，调制菌体浓度为108cfu/mL的接种液；
步骤二，将从市面上购得的糯米洗净后加入水进行浸米，待浸米水酸度达到10g/L，结束浸米，常压条件下蒸煮20min；
步骤三，向灭过菌的容器中投入蒸好的米饭1kg、加入20％(v/v)的麦曲，接入15％(v/v)的酒母，将米饭、麦曲和酵母搅拌混匀，调整物料品温在35℃条件下静置开始进行主发酵；
步骤四，主发酵30天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清，即得黄酒。
本实施例所得产品的酒精含量为15％(vol)，残还原糖含量为3.73g/L。结果表明，所得黄酒的酒精含量高，还原糖含量低，底物利用较完全，产品具有独特风味，口感及较高的营养。
实施例二至实施例四的作用与效果
实施例二至实施例四提供了利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株酿造黄酒的方法，BR20菌株经两次扩大培养后，进行离心，用生理盐水调制菌体浓度，得到接种液；而后将接种液以及麦曲加入到蒸好的原料饭中，发酵一定天数后，对发酵醪液进行过滤压榨，得到的滤液进行过夜澄清，即得黄酒。采用实施例二至实施例五中的方法得到的黄酒，酒精含量高，还原糖含量低，底物利用较完全，产品具有独特风味，口感及较高的营养。

Claims (4)

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9445。
2.利用权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将BR20菌株从斜面上转接并进行预活化，得到预定浓度的接种液；
步骤二，向灭过菌的容器中投入发酵原料米饭，并向所述发酵原料米饭中接入体积比为5-15％的所述接种液以及加入体积比为2％-20％的麦曲，在20-35℃条件下静置，开始进行主发酵；
步骤三，所述步骤二中的主发酵进行10-30天后，将发酵醪液进行过滤压榨，得到滤液，将所述滤液进行过夜澄清后得到所述黄酒。
3.根据权利要求2所述的利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，其特征在于：
其中，所述步骤一中的菌株的预活化方法为：将所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BR20菌株接种于麦芽汁培养基上，在培养温度为30℃的条件下振荡培养16h，得到一级种子液，所述一级种子液以同样的条件进行二次扩大培养，得到二级种子液，
所述二级种子液以4000rpm的条件离心8min后，收集菌体，将所述菌体用生理盐水制成悬浮液，得到菌体浓度为108cfu/mL的接种液。
4.根据权利要求2所述的利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BR20菌株进行黄酒酿造的方法，其特征在于：
其中，所述发酵原料米饭的制备方法为：将糯米洗净后加入水，进行浸米，待浸米水酸度达到2-10g/L，结束浸米，而后常压条件下蒸煮20min。
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