CN106092924A - 一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：磷酸盐缓冲液、氯化镁、曲拉通X‑100、脂酰辅酶A、辅酶A、腺苷‑5’‑水合三磷酸二钠、4‑氨基安替吡啉、抗坏血酸氧化酶、叠氮钠，试剂R2：磷酸盐缓冲液、曲拉通X‑100、脂酰辅酶A氧化酶、过氧化物酶、3‑甲基‑N‑乙基‑N‑苯胺、叠氮钠，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的游离脂肪酸的浓度。本发明具有准确度高、操作方便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法。
背景技术
游离脂肪酸，简称：FFA，存在于人体内的脂质，大致可以分为胆固醇、中性脂肪（三酸甘油脂）、磷脂质、游离脂肪酸等4种，游离脂肪酸是中性脂肪分解成的物质，当肌肉活动所需能源肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用，所以，游离脂肪酸可说是进行持久活动所需的物质，血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升，游离脂肪酸(FFA)刺激的后果是高活性反应分子性氧簇(ROS)和活性氮簇 (RNS)生成增多,从而启动了氧化应激机制，这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、脂类,还可作为功能性分子信号,激活细胞内多种应激敏感信号通路,这些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关。
目前，临床检测游离脂肪酸主要酶法，但酶法的试剂稳定性存在一定的缺陷，不能长期保存，检测结果容易出现偏差,因此准确度不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术稳定性差、准确度低的缺陷，而提供一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定游离脂肪酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
氯化镁 30~170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0~3.0 KU/L
辅酶A 0.5~4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 2.0~4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0~6.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5~4.0 KU/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2~5.6 KU/L
过氧化物酶 1.2~3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定游离脂肪酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 100mmol/L
曲拉通X-100 1.0mL/L
脂酰辅酶A 2.0 KU/L
辅酶A 2.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 3.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 4.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 2.0 KU/L
叠氮钠 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
曲拉通X-100 1.0 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 3 KU/L
过氧化物酶 2.4 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 20 g/L
叠氮钠 1.0g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明还公开了上述测定游离脂肪酸的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
氯化镁 30~170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0~3.0 KU/L
辅酶A 0.5~4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 2.0~4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0~6.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5~4.0 KU/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2~5.6 KU/L
过氧化物酶 1.2~3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的游离脂肪酸的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:80之间。
本发明的检测原理是：样品中游离脂肪酸在辅酶A与腺苷-5’-水合三磷酸二钠存在下，受脂酰辅酶A作用，生成的酰基-CoA在脂酰辅酶A氧化酶作用下被氧化，同时生成过氧化氢，生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与3-甲基-N-乙基-N-苯胺（MEHA）及4-氨基安替比林发生定量性氧化缩合，生成的化合物在特定波长处有最大吸收，通过测定吸光度值，求得FFA含量。
样本中游离脂肪酸（FFA）的活性（mmol/L）=CS×（mmol/L）
式中：ΔAU以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAB以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中FFA的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明所述的一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法可以应用于临床全自动生化分析仪，操作简单，另外和以往的荧光法相比，没有荧光剂造成的污染，不会污染环境和人体，也无需像化学分光光度法提取特殊的物质，该技术可以大规模应用于临床检测，在试剂R1中添加了抗坏血酸氧化酶，即在试剂R1和样本孵育的过程中，去除了维生素C类还原型物质的干扰，使得结果更准确。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 100mmol/L
曲拉通X-100 1.0mL/L
脂酰辅酶A 2.0 KU/L
辅酶A 2.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 3.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 4.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 2.0 KU/L
叠氮钠 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
曲拉通X-100 1.0 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 3 KU/L
过氧化物酶 2.4 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 20 g/L
叠氮钠 1.0g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0 KU/L
辅酶A 4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5 KU/L
叠氮钠 0.3g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40 mmol/L
曲拉通X-100 1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2 KU/L
过氧化物酶 3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10 g/L
叠氮钠 0.3 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 100mmol/L
曲拉通X-100 1.0mL/L
脂酰辅酶A 2.0 KU/L
辅酶A 2.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 3.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 4.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 2.0 KU/L
叠氮钠 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
曲拉通X-100 1.0 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 3 KU/L
过氧化物酶 2.4 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 20 g/L
叠氮钠 1.0g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm、副波长700nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正方向；
3、检测步骤
（a） 取180μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入45μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 根据样本中游离脂肪酸（FFA）的活性（mmol/L）= CS × （mmol/L）计算出样本中的游离脂肪酸的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0 KU/L
辅酶A 4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5 KU/L
叠氮钠 0.3g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40 mmol/L
曲拉通X-100 1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2 KU/L
过氧化物酶 3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10 g/L
叠氮钠 0.3 g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长546nm、副波长700nm；
（c）反应时间：8min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)反应方向：正方向；
3、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入45μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(d) 根据样本中游离脂肪酸（FFA）的活性（mmol/L）= CS × （mmol/L）计算出样本中的游离脂肪酸的浓度。
表1为实施例1所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的游离脂肪酸的浓度为0.48 mmol/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（mmol/L） | 第2次（mmol/L） | 第3次（mmol/L） | 均值（mmol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 0.47 | 0.49 | 0.49 | 0.48 | 0.00 |
| 实施例2 | 0.47 | 0.46 | 0.49 | 0.47 | 2.08 |
由表1可知，本发明所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的游离脂肪酸的浓度为 1.20mmol/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（mmol/L） | 第2次（mmol/L） | 第3次（mmol/L） | 均值（mmol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 1.17 | 1.18 | 1.18 | 1.18 | 1.67 |
| 实施例2 | 1.17 | 1.16 | 1.16 | 1.15 | 4.17 |
由表2可知，本发明所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定游离脂肪酸的试剂盒的精密度比较好，而且由表1可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种测定游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
氯化镁 30~170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0~3.0 KU/L
辅酶A 0.5~4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 2.0~4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0~6.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5~4.0 KU/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2~5.6 KU/L
过氧化物酶 1.2~3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
氯化镁 100mmol/L
曲拉通X-100 1.0mL/L
脂酰辅酶A 2.0 KU/L
辅酶A 2.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 3.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 4.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 2.0 KU/L
叠氮钠 1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 70 mmol/L
曲拉通X-100 1.0 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 3 KU/L
过氧化物酶 2.4 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 20 g/L
叠氮钠 1.0g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定游离脂肪酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
氯化镁 30~170 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A 1.0~3.0 KU/L
辅酶A 0.5~4.0 KU/L
腺苷-5’-水合三磷酸二钠 2.0~4.0 mmol/L
4-氨基安替吡啉 2.0~6.0 mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1.5~4.0 KU/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 40~100 mmol/L
曲拉通X-100 0.5~1.5 mL/L
脂酰辅酶A氧化酶 2.2~5.6 KU/L
过氧化物酶 1.2~3.6 KU/L
3-甲基-N-乙基-N-苯胺 10~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.7 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的游离脂肪酸的浓度。
4.根据权利要求3所述的一种测定游离脂肪酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
5.根据权利要求3所述的一种测定游离脂肪酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:80之间。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610376086.7A CN106092924A (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 一种测定游离脂肪酸的试剂盒及其制备方法 |
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| 罗侃等: "《临床化学方法学评价》", 31 December 1996 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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