CN104651422A - 一种从深海鱼中提取甘油三酯型dha和epa的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物制药技术领域，提供了一种深海鱼从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法,包括以下步骤：采用酶解技术制备粗鱼油、制备游离脂肪酸、采用尿素包埋法分离含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸、制备EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯。该方法能够有效地从深海鱼中提取、富集DHA和EPA；制备过程中得到的粗鱼油酸值低、粗鱼油中酯化脂肪酸水解程度高，最终得到的DHA和EPA为甘油酯型DHA和EPA，且甘油酯型EPA和DHA的含量高。

Description

一种从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法。
背景技术
深海鱼，如金枪鱼等是一种大型远洋性重要商品食用鱼。由于深海鱼必须时常保持快速游动，才能维持身体的供给，加上只在海域深处活动，因此肉质柔嫩鲜美，且不受环境污染，是现代人不可多得的健康美食。深海鱼的加工业成为一个重要的产业，但是深海鱼在加工过程中存在品质难以控制、边角料利用程度低、生产能耗高、原料损失严重等一系列重大问题，企业经济损失较大。因此对深海鱼加工过程产生的下脚料增加营业收入，实现经济价值。鱼油的应用非常广泛，可应用于保健、医药、食品、化工以及饲料等领域。通过将深海鱼的下角料用于制备鱼油是一种非常好的实现经济效益的方式。
鱼油中n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）在人体中具有重要的生物学意义，其特征脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的生理活性已经明确，EPA具有预防冠心病、降血压、消除疲劳、预防动脉粥样硬化和脑血栓、抗癌等生理活性，DHA能显著地促进婴儿的智力发育，改善大脑机能，提高记忆力，EPA和DHA是生产预防心血管疾病和婴儿益智食品的良好基料。
鱼油中的多烯脂肪酸，包括EPA和DHA，是属热及化学不稳定物质，将其分离提纯及其困难，现有常用的分离纯化的技术有精馏分离技术、分子蒸馏技术、色谱分离技术、低温冷冻技术、金属盐沉淀技术和鱼油交酯化，但都存在各自的不足：
其中，传统精制技术的主要工艺流程包括脱胶、脱酸、脱色、脱臭等，该精制工艺繁琐，产品色泽不理想，并且在此提取过程中所需要的加热容易导致油脂氧化酸败。精馏分离技术，是目前使用最广泛的工业化分离技术，其原理是利用混合脂肪酸中各组分挥发性不同，在同一温度下依不同饱和蒸汽压的性质而得到分离，但该方法操作温度较高，时间较长，致使不饱和脂肪酸发生热敏反应，影响产品质量和收率。分子蒸馏技术，在极高的真空条件下，依据液体分子受热会从页面逸出，在气相中分子运动的平均自由程不同而得以分离，该种技术操作温度低，被分离物质不易分离或者聚合，且分子蒸馏装置一次性投资较大，且维护费用较高。超临界流体技术设备投资大，抽提压力高，且传统超临界萃取装置主要是由单一高压反应釜和分离釜组成的，仅能进行单一的分离反应，此外，超临界萃取无法实现将EPA、DHA与其他分子量接近的饱和或低浓度不饱和脂肪酸分离。色谱分离技术，是一种现代分离、分析检测方法，可用于脂肪酸分离纯化和检测的色谱方法有气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱等，多数情况下用简易的硅胶色谱进行分离，该法能将极性相近，结构相似的不饱和脂肪酸分离，主要缺点是耗能大，操作成本高。低温冷冻技术，是根据脂肪酸混合物在过冷有机溶剂中溶解度的不同而达到分离的目的。饱和脂肪酸在有机溶剂中的溶解度与碳链的长度成反比，而同一不饱和度的脂肪酸，碳链越长，溶解度越低，对同样碳链数目的不饱和脂肪酸，随双键的增加，溶解度增加。该种技术主要缺点是需回收大量溶剂，分离效率不高，需要极低温的冷却设备，成本较高。金属盐沉淀技术，是利用饱和脂肪酸、低不饱和脂肪酸以及EPA、DHA的金属盐在某种有机溶剂中溶解度的不同进行分离，常用的为硝酸银络合法，该方法操作简单、条件温和、周期短、收率高，但是硝酸银昂贵、回收困难、生产成本高。鱼油交酯化技术，是指在碱性催化剂存在时，通过乙醇置换油脂中的甘油，制取乙酯化的高不饱和脂肪酸（EPA和DHA）。乙酯型ω-3PUFA在人体中消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，旨在解决现有技术从鱼油中提取的DHA和EPA纯度低、酸值高、颜色深需脱色、且得到DHA和EPA为DHA和EPA的单甘油酯、三甘油酯等混合物或乙酯类鱼油且成本高的问题。
本发明是这样实现的，一种从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，包括以下步骤：
将深海鱼绞碎成肉浆，加水后在无氧条件下进行加热处理后，使用胰蛋白酶将其进行第一酶解反应后，进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
利用脂肪酶1LVK-F100将所述粗鱼油进行第二酶解反应，得到游离脂肪酸；
在水浴条件下，将尿素的甲醇或乙醇饱和溶液与所述游离脂肪酸进行混合后得到混合物溶液，将所述混合物溶液进行降温处理至温度为4℃-10℃、保温静置处理48h-72h后，进行过滤处理得到滤液，将所述滤液进行萃取处理并收集有机层，得到浓缩的含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸；
以所述含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸为底物，将其放入含有脂肪酶Novozym435的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏，得到EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯。
本发明提供的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，能有效地从深海鱼、甚至是作为边角料的深海鱼头中提取DHA和EPA，其生产成本低。制备过程中得到的粗鱼油酸值低，可达到1.5(mg KOH)/g；粗鱼油中酯化脂肪酸水解程度高，可达到50%；最终得到的DHA和EPA为甘油三酯型DHA和EPA，且甘油三型EPA和DHA的含量高，其中，甘油三酯型EPA可高达15%，甘油三酯型DHA可高达75%。
附图说明
图1是本发明实施例提供的从深海鱼中提取甘油酯型DHA和EPA的流程示意图。
图2是本发明实施例提供的用于制备EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯亚临界酶促反应示意图。
图3是本发明实施例提供的用于制备EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的流程示意图；其中，图3中各编号分别为：1.CO2钢瓶，2.过滤器，3.冷机，4.高压计量泵，5.混合器，6.预热器，7.反应釜，8.一级分离釜，9.二级分离釜，10.精馏柱（10-1至10-4分别为以及精馏柱、二级精馏柱、三级精馏柱、四级精馏柱），11.携带剂，12.累积流量计。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种深海鱼从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，包括以下步骤，如附图1所述：
S01.采用酶解技术制备粗鱼油：将深海鱼绞碎成肉浆，加水后在无氧条件下进行加热处理后，使用胰蛋白酶将其进行第一酶解反应后，进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
S02.制备游离脂肪酸：利用脂肪酶1LVK-F100将所述粗鱼油进行第二酶解反应，得到游离脂肪酸；
S03.采用尿素包埋法分离含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸：在水浴条件下，将尿素的甲醇或乙醇饱和溶液与所述游离脂肪酸进行混合后得到混合物溶液，将所述混合物溶液进行降温处理至温度为4℃-10℃、保温静置处理48h-72h后，进行过滤处理得到滤液，将所述滤液进行萃取处理并收集有机层，得到浓缩的含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸；
S04.制备EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯：以所述含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸为底物，将其放入含有脂肪酶Novozym435的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏，得到EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯。
具体地，上述步骤S01中，将深海鱼绞碎成肉浆的方法不受限制。作为优选实施例，为了达到均匀、高效的粉碎效果，可将深海鱼经过碎骨机碾碎形成糜状，碎骨机功率可设置为4KW左右，得到的肉浆大小以5mm-80mm为宜。其中，深海鱼的种类可以选用金枪鱼、鳕鱼、沙丁鱼、三文鱼、鲨鱼等。为了降低经济成本，优选用深海鱼加工后的下脚料为原料提取。
称取上述得到的肉浆，按肉浆和水的质量比为(0.5-1):(1-1.5)的比例加水密封。由于深海鱼油、特别是金枪鱼油中的油脂在有氧环境下能分解生成具有挥发性的醛类、酮类和醇、碳氧化物、环氧化物及酸之类低分子物质，从而造成酸值的不稳定、甚至酸值明显升高，导致鱼油酸败变质。因此，为避免多不饱和脂肪酸的氧化酸败，在无氧条件下进行加热处理，所述无氧条件可以为惰性气体气氛、真空环境及其他常见的无氧条件，如氮气气氛等。作为优选实施例，为了得到均匀的混合物溶液，所述加热处理的温度为85℃～90℃，加热时间为0.5h-1h。经过上述处理，避免了所述粗鱼油发生氧化酸败，同时，省去了由于酸值增加导致的需要进行降低酸值处理的步骤。
上述步骤S01中，为了能有效地将深海鱼中的鱼油成分提取出来，且同时达到提取效率高和杂质少的目的，所述第一酶解反应采用下述方法进行：调节混合物溶液的pH值至7.0-8.5后，加入质量分数为1.5%-3.0%的胰蛋白酶，在避光条件下酶解反应15h-19h，反应温度为20℃-30℃。
经过第一酶解反应后，可将酶解物进行离心处理实现固液分离，取上层酶解液，即得到粗鱼油。其中，离心处理的条件可设置为常规条件。本实施例中，为了提高粗鱼油的纯度和离心效率，采用4500r/min-6000r/min的速度离心15min-30min。
上述步骤S02中，由于上述粗鱼油中，EPA、DHA等脂肪酸均以鱼油甘油酯的形式存在，从粗鱼油中直接分离浓缩EPA和DHA难度大、且不容易除去以杂质存在的饱和的或单不饱和的脂肪酸。因此，本发明实施例需要对粗鱼油进行第二酶解反应，使用脂肪酶催化水解鱼油中的甘油三酸酯，得到DHA和EPA的游离脂肪酸形式、饱和的或单不饱和的游离脂肪酸，鱼油甘油酯的水解如下式所示；再通过尿素包合方式除去饱和的或单不饱和的脂肪酸，从而达到浓缩EPA和DHA的目的。通过上述处理，便于得到易于纯化处理的游离脂肪酸。
作为优选实施例，为了提高粗鱼油中鱼油甘油酯的水解效率，本发明实施例在所述粗鱼油中加入质量分数为1.5%-3.0%的脂肪酶1LVK-F100作为催化剂，在45℃-55℃的温度下酶解反应20h-28h，得到游离脂肪酸。
经过上述处理后，粗鱼油中酯化脂肪酸的水解率高达30%-50%。
上述步骤S03中，由于得到的上述游离脂肪酸中的成分复杂，含有多种单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸成分，导致EPA、DHA的含量和纯度均较低，因此，需要对所述游离脂肪酸进行分离处理。对上述游离脂肪酸的分离，可采用本领域内常规的分离技术，如精馏分离技术、分子蒸馏技术、色谱分离技术等。但是精馏分离技术的操作温度较高、且时间较长，容易导致EPA、DHA发生热敏反应，从而影响其质量；分子蒸馏技术恰恰相反，因为操作温度低，被分离物质不易分离，且耗费高；色谱分离技术尽管能得到纯度高的产品，但往往产率低、耗资大，而其他常规分离技术也难以同时满足EPA和DHA对于纯度、产率、质量和成本的要求。上述游离脂肪酸中，由于EPA和DHA均为多不饱和脂肪酸，含有多个不饱和键，导致其碳链分子能形成一定的空间构型，不容易被尿素包合；而饱和度较高的脂肪酸或单不饱和脂肪酸由于其不饱和度较高，往往容易被结晶的尿素分子包合，并以稳定的晶体饱和物形式析出。有鉴于此，作为优选实施例，可采用尿素包合技术、在合适的洗脱液的洗脱下将其与其他游离脂肪酸进行分离。
本发明实施例中，为了得到混合均匀的混合液，作为优选实施例，所述水浴温度为60℃-65℃。为了不使作为载体的尿素超负荷、同时又能达到较好的分离效果，经发明人反复研究发现：所述游离脂肪酸和尿素甲醇饱和溶液或尿素乙醇饱和溶液的配置比例为1g：(5-10)ml。
上述步骤S03中，所述尿素的甲醇或乙醇饱和溶液与上述游离脂肪酸的混合可采用常规的混合方式，作为优选实施例，为了混合均匀、且不破坏各成分的结构，所述混合采用搅拌的形式，搅拌时间以直至混合物溶液均匀、透明为宜。
为了尿素分子在结晶过程中能与饱和度较高的脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物，需对上述混合物溶液进行降温处理。所谓具体实施例，所述降温处理的方法为：以5℃/10min-10℃/10min的降温速率使混合液溶液的温度降至4℃-10℃后，将其于4℃-5℃的条件下放置48-72h。
将经过降温处理后的样品进行过滤处理，所述过滤方式不受限制。作为优选实施例，为了提高过滤效率，所述过滤方式选用抽滤的方式进行。抽滤后，使用对应的甲醇、乙醇溶液洗涤结晶体，收集并合并滤液。
将上述滤液进行萃取处理，所述萃取处理采用的萃取体系为滤液、正己烷、蒸馏水体系，其中，滤液：正己烷：蒸馏水的用量比为10ml：(1-2)g：(2-3)g。将混合溶液摇匀后静置分离并收集有机层，将有机层溶液进行减压蒸馏，即得到EPA、DHA含量高的多不饱和游离脂肪酸浓缩液。
现有技术中，往往将提取的EPA、DHA加工成乙酯型鱼油，导致产品质量受到影响，且乙酯型鱼油的过程需要在酯化过程中置换定量的乙醇，造成了脂肪酸的不平衡，乙酯型鱼油在人体内的代谢吸收率低、生物利用率低、稳定性差；且乙酯型鱼油在胃肠道内容易分解出乙醇，导致对乙酯耐受性差的人群容易引起不良反应如过敏症，因此，其安全性低。鱼油中EPA、DHA的天然状态为甘油三酯型，而人体胰脏和肝脏的具有专一性水解甘油三酯的脂肪酶，天然状态下的EPA、DHA容易消化吸收，且其性质稳定，能够有效保证其营养成分，便于人体吸收利用，甘油酯型鱼油吸收率是乙酯型鱼油的三倍左右。
有鉴于此，上述步骤S04中，为了得到酯化度高的甘油三酯型EPA和DHA，需要对上述浓缩后的含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸进行酯化反应。与传统的催化剂比较，脂肪酶催化反应具有很好的专一性和高效性，但是，由于酶工业发展的局限，酶促反应难以控制，导致酯化率偏低。而亚临界流体的参与，可进行酶水解反应的逆反应，如酯化、内酯化、酯交换及肽的合成等；并同时减少底物或产物对酶的抑制、增加酶的热稳定性、减少反应副产物，能有效地解决单独使用酶促反应时存在的上述问题。为了增加底物与酶的接触面积和接触频率，进一步提高酶促反应的效率，所述亚临界酶促反应可选择在超声波的作用下进行。
具体地，上述超临界萃取反应釜中，还含有正己烷、甘油，作为优选实施例，所述正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435、含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸的用量比为正己烷：甘油：脂肪酶Novozym435：含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸为(8-12)ml:(2-6)g:(0.01-0.05)g:1g。
本发明实施例中，所述亚临界酶促反应的条件为：所述反应釜的压力为4-8MPa，超声波振动磁场为2-10Hz，反应温度为30℃-60℃，反应时间为1h-12h。
所述亚临界酶反应示意图如附图2所示：将含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸、正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435加入到超临界萃取反应釜中形成混合物料，在CO2亚临界流体和超声波磁场的共同作用下进行亚临界酶促反应。
经过上述处理的含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸，酯化度可达80%-90%。
上述步骤S04中，为了减小对甘油三酯型EPA和DHA质量的影响，且同时实现甘油三酯型EPA和DHA的高效萃取和精制，采用超临界萃取的方法对上述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯进行处理。超临界萃取过程中，由于超临界流体在临界点附近，温度和压力的微小变化会引起超临界流体密度的较大变化，由此可以调节对物质的溶解能力。因此，超临界萃取的萃取率高，萃取过程中容易实现甘油三酯型EPA和DHA与溶剂的分离，且同时存在无有机溶剂残留、对热敏性物质不易破坏等优点，能够有效去除上述亚临界酶促反应中可能残存的游离脂肪酸、脂溶性色素、挥发性和非挥发性的醛类、酮类、醇类臭味物质，从而达到脱酸、脱色、脱臭的目的。
在制备所述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的步骤中，所述超临界萃取分为萃取和分离两步。具体地，所述亚临界酶促反应结束后，将上述酯化后的反应产物作为底物，将超临界萃取反应设置条件为：萃取压力为20MPa-30（MPa，萃取温度为35℃-40℃，CO2流量为4-6L/h，在此条件下完成萃取过程。萃取结束后，将萃取物质进行分离，所述分离分为两级分离，其中，一级分离的压力为6MPa-10MPa，温度为45℃-50℃；二级分离的压力为4MPa-6MPa，温度为55℃-60℃。
本发明实施例S04步骤中，为了提高生产效率、同时增加EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的产率，进行超临界萃取处理后紧接着进行精馏处理，将萃取分离得到的液体引入精馏柱中进行再次纯化分离。具体的，经过超临界萃取后的反应产物依次四级精馏，其中，一级精馏的温度为60℃-65℃，二级精馏的温度为65℃-70℃，三级精馏的温度为70℃-75℃，四级精馏的温度为75℃-80℃。
经过上述精馏柱后收集得到的馏分即为以EPA和DHA的不饱和脂肪酸甘油三酯为主的密度接近的高纯度多不饱和脂肪酸甘油三酯，其中，甘油三酯型EPA的质量百分含量为14%-15%，甘油三酯型DHA的质量百分含量71%-75%。
具体地，如附图3所示，CO2钢瓶1中的CO2依次经过过滤器2和冷机3的处理后，与携带剂11在混合器5中混合，经预热器6的预热处理后，CO2变成超临界状态流体，在反应釜7中与经过亚临界酶促反应后的反应产物混合进行超临界萃取，萃取产物依次经一级分离釜8、二级分离釜9后进入精馏柱10进行四级精馏处理，最终得到纯化、浓缩的甘油三酯型DHA和EPA，产物经累积流量计12流出。
本发明实施例提供的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，在惰性环境下采用酶解法提取鱼油、得到的粗鱼油DHA和EPA含量高、酸值低、可达到1.5(mg KOH)/g，不易酸败质变，可直接进行酶解甘油反应，省去降低酸值的处理步骤，简化提取流程；通过亚临界状态进行酶解反应，得到甘油三酯型脂肪酸，酯化效率明显增加，酯化率可达到90%；通过超临界流体萃取浓缩EPA和DHA的脂肪酸甘油三酯，能同时达到浓缩和精制的目的，节约了处理程序，生产效率高、成本低，最终得到的多不饱和甘油三酯中，甘油三酯EPA和DHA的产率高，其中，甘油三酯型EPA可高达15%，甘油三酯型DHA可高达75%。
下面结合具体实施例进行进一步说明。
实施例1
S11.粗鱼油的制备
采用酶解技术制备深海鱼粗鱼油。深海鱼经过碎骨机碾碎形成糜状，称取600g肉浆，按肉：水=0.5:1（m：m）的比例加水密封，在暗室、通氮气的条件下，于85℃蒸煮1h。使用NaOH调节pH值至8.0。加入质量分数为2%的胰蛋白酶，在暗室、室温条件下（25℃）酶解17h。通过5000r/min离心20min后，取上层酶解液，即为粗鱼油。
S12.游离脂肪酸的制备
采用酶解技术使粗鱼油的鱼油甘油酯形式得到水解，获得游离脂肪酸。利用脂肪酶1LVK-F100为催化剂，酶用量为2%，反应温度为50℃，反应时间为24h，得到游离脂肪酸。
S13.浓缩EPA、DHA等游离多不饱和脂肪酸
采用尿素包埋法浓缩EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸。在65℃的水浴环境下，制备尿素的乙醇饱和溶液，再加入游离脂肪酸，其中，配制比例如下，游离脂肪酸：尿素乙醇饱和溶液=1:10（w：v）。搅拌均匀至透明，以5℃/10min的降温速度使混合液的温度降至4℃后，放置4℃冰箱72h，再进行抽滤，使用100%的乙醇溶液洗涤结晶体后收集滤液。将滤液加入正己烷、蒸馏水，其中，配制比例如下，滤液：正己烷：蒸馏水=10：2：2（v:m:m）。将混合溶液摇匀后静置分离有机相，最后将上层有机溶液减压蒸馏，即得到EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸浓缩液。
S14.EPA和DHA的脂肪酸甘油三酯的制备
以上述游离不饱和脂肪酸浓缩液为底物放入超临界萃取反应釜中，在超声波磁场的辅助作用下进行亚临界状态下的选择性的酶解反应。添加反应物有：正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435，按如下比例添加：正己烷：游离脂肪酸为10:1（v:m）、甘油：游离脂肪酸为4:1(w:w)、脂肪酶Novozym435：游离脂肪酸为0.02：1（w:w）。设置反应釜压力为4MPa，当压力在10min之内保持稳定时，打开超声波磁场，振荡频率2.5Hz，设定反应釜温度40℃，在此条件下反应3h，主要生成多碳的脂肪酸甘油三酯。
将上述酯化后的甘油三酯作为反应底物，超临界萃取反应设置条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为40℃，CO2流量为4L/h，分离釜I的压力为10MPa，分离釜I的温度为50℃，分离II的压力为6MPa，分离釜II的温度为60℃，精馏柱I的温度为65℃，精馏柱II的温度为70℃，精馏柱III的温度为75℃，精馏柱IV的温度为80℃。精馏柱收集得到的物质是EPA和DHA的不饱和脂肪酸甘油三酯为主的密度接近的高纯度多不饱和脂肪酸甘油三酯。
实施例2
S21.粗鱼油的制备
采用酶解技术制备深海鱼粗鱼油。深海鱼经过碎骨机碾碎形成糜状，称取600g肉浆，按肉：水=0.5:1（w：w）的比例加水密封，在暗室、通氮气的条件下，于85℃蒸煮0.5h。使用NaOH调节pH值至8.0。加入质量分数为1.5%的胰蛋白酶，在暗室、室温条件下（20℃）酶解15h。通过4500r/min离心20min后，取上层酶解液，即为粗鱼油。
S22.游离脂肪酸的制备
采用酶解技术使粗鱼油的鱼油甘油酯形式得到水解，获得游离脂肪酸。利用脂肪酶1LVK-F100为催化剂，酶用量为1.5%，反应温度为45℃，反应时间为20h，得到游离脂肪酸。
S23.浓缩EPA、DHA等游离多不饱和脂肪酸
采用尿素包埋法浓缩EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸。在60℃的水浴环境下，制备尿素的乙醇饱和溶液，再加入游离脂肪酸，其中，配制比例如下，游离脂肪酸：尿素乙醇饱和溶液=5:10（w：v）。搅拌均匀至透明，以10℃/10min的降温速度使混合液的温度降至10℃后，放置4℃冰箱48h，再进行抽滤，使用100%的乙醇溶液洗涤结晶体后收集滤液。将滤液加入正己烷、蒸馏水，其中，配制比例如下，滤液：正己烷：蒸馏水=10：1：2（v:m:m）。将混合溶液摇匀后静置分离有机相，最后将上层有机溶液减压蒸馏，即得到EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸浓缩液。
S24.EPA和DHA的脂肪酸甘油三酯的制备
以上述游离不饱和脂肪酸浓缩液为底物放入超临界萃取反应釜中，在超声波磁场的辅助作用下进行亚临界状态下的选择性的酶解反应。添加反应物有：正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435，按如下比例添加：正己烷：游离脂肪酸为8:1（v:m）、甘油：游离脂肪酸为2:1(w:w)、脂肪酶Novozym435：游离脂肪酸为0.01：1（w:w）。设置反应釜压力为6MPa，当压力在10min之内保持稳定时，打开超声波磁场，振荡频率6Hz，设定反应釜温度30℃，在此条件下反应5h，主要生成多碳的脂肪酸甘油三酯。
将上述酯化后的甘油三酯装入反应釜内作为反应底物，超临界萃取反应设置条件为：萃取压力为20MPa，萃取温度为30℃，CO2流量为4L/h，分离釜I的压力为6MPa，分离釜I的温度为45℃，分离II的压力为4MPa，分离釜II的温度为55℃，精馏柱I的温度为60℃，精馏柱II的温度为65℃，精馏柱III的温度为70℃，精馏柱IV的温度为75℃。精馏柱收集得到的物质是EPA和DHA的不饱和脂肪酸的甘油三酯。为主的密度接近的高纯度多不饱和脂肪酸甘油三酯。
实施例3
S31.粗鱼油的制备
采用酶解技术制备深海鱼粗鱼油。深海鱼经过碎骨机碾碎形成糜状，称取600g肉浆，按肉：水=0.5:1.5（m：m）的比例加水密封，在暗室、通氮气的条件下，于90℃蒸煮1h。使用NaOH调节pH值至8.0。加入质量分数为3%的胰蛋白酶，在暗室、30℃的条件下酶解15h。通过6000r/min离心20min后，取上层酶解液，即为粗鱼油。粗鱼油根据国家标准GB/T17377-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯气相色谱分析》进行检测。
S32.游离脂肪酸的制备
采用酶解技术使粗鱼油的鱼油甘油酯形式得到水解，获得游离脂肪酸。利用脂肪酶1LVK-F100为催化剂，酶用量为3.0%，反应温度为55℃，反应时间为28h，得到游离脂肪酸。
S33.浓缩EPA、DHA等游离多不饱和脂肪酸
采用尿素包埋法浓缩EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸。在65℃的水浴环境下，制备尿素的甲醇饱和溶液，再加入游离脂肪酸，其中，配制比例如下，游离脂肪酸：尿素甲醇饱和溶液=1:10（w：v）。搅拌均匀至透明，以5℃/10min的降温速度使混合液的温度降至10℃后，放置4℃冰箱72h，再进行抽滤，使用100%的甲醇溶液洗涤结晶体后收集滤液。将滤液加入正己烷、蒸馏水，其中，配制比例如下，滤液：正己烷：蒸馏水=10：2：3（v:m:m）。将混合溶液摇匀后静置分离有机相，最后将上层有机溶液减压蒸馏，即得到EPA、DHA等多不饱和游离脂肪酸浓缩液。
S34.EPA和DHA的脂肪酸甘油三酯的制备
以上述游离不饱和脂肪酸浓缩液为底物放入超临界萃取反应釜中，在超声波磁场的辅助作用下进行亚临界状态下的选择性的酶解反应。添加反应物有：正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435，按如下比例添加：正己烷：游离脂肪酸为12:1（v:m）、甘油：游离脂肪酸为6:1(w:w)、脂肪酶Novozym435：游离脂肪酸为0.05：1（w:w）。设置反应釜压力为8MPa，当压力在10min之内保持稳定时，打开超声波磁场，振荡频率10Hz，设定反应釜温度60℃，在此条件下反应12h，主要生成多碳的脂肪酸甘油三酯。
将上述酯化后的甘油三酯装入反应釜内作为反应底物，超临界萃取反应设置条件为：萃取压力为30MPa，萃取温度为40℃，CO2流量为6L/h，分离釜I的压力为10MPa，分离釜I的温度为50℃，分离II的压力为6MPa，分离釜II的温度为60℃，精馏柱I的温度为65℃，精馏柱II的温度为70℃，精馏柱III的温度为75℃，精馏柱IV的温度为80℃。精馏柱收集得到的物质是EPA和DHA的不饱和脂肪酸甘油三酯为主的密度接近的高纯度多不饱和脂肪酸甘油三酯。
对比例1
1.粗鱼油的制备
采用酶解技术制备深海鱼粗鱼油。深海鱼经过碎骨机碾碎形成糜状，称取600g肉浆，按肉：水=0.5:1（m：m）的比例加水密封，在暗室、通氮气的条件下，于85℃蒸煮1h。使用NaOH调节pH值至8.0。加入质量分数为2%的胰蛋白酶，在暗室、室温条件下（25℃）酶解17h。通过5000r/min离心20min后，取上层酶解液，即为粗鱼油。
2.超临界萃取浓缩EPA/DHA的甘油三酯
将上述的粗鱼油装入反应釜内作为反应底物，超临界萃取反应设置条件为：萃取压力为25MPa，萃取温度为40℃，CO2流量为4L/h，分离釜I的压力为10MPa，分离釜I的温度为50℃，分离II的压力为6MPa，分离釜II的温度为60℃，收集分离得到的物质。
上述实施例中，试剂来源为：
胰蛋白酶：食品级，郑州鸿程化工产品有限公司；
LVK-F100脂肪酶：深圳市绿微康生物工程有限公司；
Novozym435脂肪酶：诺维信公司。
对上述实施例1-3中粗鱼油中EPA和DHA的含量、游离脂肪酸的水解度、脂肪酸的酯化度以及最终产品中甘油酯型EPA和DHA的质量百分含量进行测试，测试方法如下：
(1)初鱼油中DHA/EPA含量检测方法:根据GB/T17377-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯气象色谱分析》检测。
(2)游离脂肪酸含量的检测方法（即酸值测定）：根据GB/T5530-2005《动植物油脂酸值和酸度的测定》检测。
(3)脂肪酸酯化率的测定：按照GB/T5530-2005方法测定反应体系的酸值，然后按照下面公司计算：酯化率（%）=[（1-反应后的酸值/反应前的酸值）]×100%。
(4)甘油酯型DHA/DHA纯度的测定：根据GB/T17377-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯气象色谱分析》检测”来测定。
测试结果如下表1所示:
表1
由上表可知，本发明实施例提供的深海鱼从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，粗鱼油中DHA/EPA的含量高，分别可达到28.94%和4.93%；游离脂肪酸的水解度高，可达到50%以上；脂肪酸酯化度高达90%；得到的最终产品中，甘油酯型DHA质量百分含量高，可分别达到15.02%和74.98%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，包括以下步骤：
将深海鱼绞碎成肉浆，加水后在无氧条件下进行加热处理后，使用胰蛋白酶将其进行第一酶解反应后，进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
利用脂肪酶1LVK-F100将所述粗鱼油进行第二酶解反应，得到游离脂肪酸；
在水浴条件下，将尿素的甲醇或乙醇饱和溶液与所述游离脂肪酸进行混合后得到混合物溶液，将所述混合物溶液进行降温处理至温度为4℃-10℃、保温静置处理48h-72h后，进行过滤处理得到滤液，将所述滤液进行萃取处理并收集有机层，得到浓缩的含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸；
以所述含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸为底物，将其放入含有脂肪酶Novozym435的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯。
2.如权利要求1任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的步骤中，所述超临界萃取分为萃取和分离两步，其中，
所述萃取的条件为：萃取压力为20MPa-30MPa，萃取温度为35℃-40℃，CO2的流量为4-6L/h；
所述分离分为两级分离，其中，一级分离的压力为6MPa-10MPa，温度为45℃-50℃；二级分离的压力为4MPa-6MPa，温度为55℃-60℃。
3.如权利要求1所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的步骤中，所述精馏处理分为四级精馏，其中，一级精馏的温度为60℃-65℃，二级精馏的温度为65℃-70℃，三级精馏的温度为70℃-75℃，四级精馏的温度为75℃-80℃。
4.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的步骤中，所述亚临界酶促反应的条件为：所述反应釜的压力为4-8MPa，超声波振动磁场为2-10Hz，反应温度为30℃-60℃，反应时间为1h-12h。
5.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述EPA、DHA的脂肪酸甘油三酯的步骤中，超临界萃取反应釜中，还含有正己烷、甘油，且所述正己烷、甘油、脂肪酶Novozym435、含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸的用量比为正己烷：甘油：脂肪酶Novozym435：含游离EPA、DHA的多不饱和脂肪酸为(8-12)ml:(2-6)g:(0.01-0.05)g:1g。
6.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸的步骤中，所述萃取处理采用的萃取体系为滤液、正己烷、蒸馏水体系，其中，滤液：正己烷：蒸馏水的用量比为10ml：(1-2)g：(2-3)g。
7.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸的步骤中，所述游离脂肪酸与尿素的甲醇或乙醇饱和溶液的用量比为1g：(5-10)ml。
8.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述含EPA、DHA的多不饱和脂肪酸的步骤中，所述降温处理的方法为以5℃/10min-10℃/10min的降温速率使混合液溶液的温度降至4℃-10℃后；和/或
静置处理的温度为4℃-5℃。
9.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述游离脂肪酸的步骤中，所述第二酶解反应的方法为：在所述粗鱼油中加入质量分数为1.5%-3.0%的脂肪酶1LVK-F100，在45℃-55℃的温度下酶解反应20h-28h。
10.如权利要求1～3任一所述的从深海鱼中提取甘油三酯型DHA和EPA的方法，其特征在于：在制备所述粗鱼油的步骤中，所述第一酶解反应的方法为：调节所述混合物溶液的pH值至7.0-8.5后，加入质量分数为1.5%-3.0%的胰蛋白酶，在避光条件下酶解反应15h-19h，反应温度为20℃-30℃。
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