CN105316368A

CN105316368A - 一种酶法富集多不饱和脂肪酸的方法

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Publication number: CN105316368A
Application number: CN201510757500.4A
Authority: CN
Inventors: 李志刚; 王永华; 杨博; 陈华; 王卫飞; 陈华勇
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: CN105316368B

Abstract

本发明公开了一种酶法富集多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：(1)配置脂肪酶浓度为5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和鱼油，配成三液相体系；(2)将配置好的三液相体系置于搅拌釜中反应，反应结束后，静置或离心至分层，收集上层产物即为脂类产品相；(3)将脂类产品相加入碱液，然后加入疏水性有机溶剂，静置后取上相，回收疏水性有机溶剂，取萃取上相为富omega-3甘油酯产物，下相用酸调pH值至2以下，然后经疏水性有机溶剂萃取，即得到水解后脂肪酸。本发明方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶水解法生产脂肪酸难于工业化的技术难题。

Description

一种酶法富集多不饱和脂肪酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程与食品技术领域，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用脂肪酶水解鱼油富集多不饱和脂肪酸的方法。

背景技术

近年来，多不饱和脂肪酸由于具有降低血脂、抗炎、促进脑部发育功能等方面的功效，已经成为一种功能性油脂中的最重量级品种，受到了国内外的广泛重视。据估算，多不饱和脂肪酸及其关联市场的市值已超过了300亿美元。其中已EPA和DHA为多不饱和型多不饱和脂肪酸主要成分的鱼油占距了相关产业78％的原料来源。而天然鱼油存在EPA和DHA含量低，质量波动大等难题很难满足产品配方要求。因此，从鱼油变成合格的多不饱和脂肪酸原料，除了要进行精炼操作，还要浓缩和调整EPA/DHA的比例和含量。目前，主要的工业生产途径是通过化学法将油脂转化成低沸点脂肪酸乙酯，然后采用分子蒸馏等方式进行浓缩和分离纯化，得到乙酯型鱼油。但是这种鱼油的生物利用度只有天然甘油酯结构的30％左右。而且，体内分解会产生乙醇，对人体不利，尤其对婴幼儿和孕妇人群。因此，近年来，浓缩富集甘油酯型多不饱和脂肪酸一直是研究的重点。然而，鱼油极易氧化，化学法生产存在副反应多、步骤复杂、资源消耗大等难题，难于大规模工业化应用。生物酶法转化不但具有条件温和、能耗低、副产物少等优点，而且对不同脂肪酸具有选择性，因而受到了广泛的重视。

最近几十年，科学家在脂肪酶选择性富集多不饱和脂肪酸作了一系列的尝试，但是，如何开发一套具有经济性和产业化上具有可操作性的方法一直是巨大的困难。例如，Lyberg等研究了不同脂肪酶醇解和分子蒸馏结合富集鱼油中的多不饱和脂肪酸，结果EPA和DHA的含量可提高42％和79％，但该方法不但存在耗时长(仅酶解一项就耗时24h)、费用高、能耗大、酶易失火等问题，而且需要高温的分子蒸馏设备处理，因此多不饱和脂肪酸容易出现反式等副反应，严重影响产品质量(Eur.J.LipidSci.Technol.2008,110,317–324)。利用脂肪酶水解能够在一定成度上克服上述难题，然而，低效的反应体系导致该法的较低总催化效率依然较低。例如，Xiao-Xing等用Geotrichumsp.脂肪酶从鱼油中水解富集多不饱和脂肪酸，但是，该方法需反应14h，而EPA和DHA的含量仅可提高21％和29％，导致整个工艺成本巨大，工业应用困难(J.Agric.FoodChem.2012，60,9673-9679)。总体而言，脂肪酶过高的价格，副反应多，能耗大，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等问题制约了该方法的大规模应用。

发明内容

本发明的目的是针对目前酶法水解鱼油富集多不饱和甘油酯过程中，存在的富集成本高，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等问题，提供了一种利用脂肪酶水解鱼油富集多不饱和甘油酯的方法。

本发明的技术方案：

一种酶法富集多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤：

(1)配置脂肪酶浓度为5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性盐、亲水性溶剂和鱼油，配成三液相体系；所述可溶性盐、亲水性溶剂和鱼油与酶液的质量比分别为0.1-1、0.05-0.9和0.05-5；

(2)将配置好的三液相体系置于搅拌釜中反应，反应结束后，静置或离心至分层(三层，上层为脂类产品相；中层为富酶相；下层为富甘油相)，收集上层脂类产品相；(3)将脂类产品相加入浓度为0.1-10mol/L的碱液，然后加入0.5-10倍体积的疏水性有机溶剂，静置后取上相，回收疏水性有机溶剂，取萃取上相为富omega-3甘油酯产物，下相用酸调pH值至2以下，然后经0.5-10倍体积疏水性有机溶剂萃取，即得到水解后脂肪酸。

优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为亲水性有机溶剂，选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上。

优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为亲水性离子液体，选自[BMIM]Br、[BMIM]BF₄、[EMIM]ETSO₄和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。

优选地，步骤(1)所述可溶性盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。

优选地，步骤(3)所述疏水性有机溶剂为正己烷、石油醚和乙酸乙酯中的一种或两种以上。

优选地，步骤(3)所述碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸钙溶液中的一种或两种以上。

优选地，步骤(2)所述搅拌的转速为100-1000转/分，反应温度为5-90℃，反应0.05-120h。

反应操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了使富集效果尽可能达到最佳，可以调节体系的pH值。所述三液相体系的pH值为3-13。

优选地，所述三液相体系的pH值为4-10。

优选地，所述脂肪酶浓度为50-2000U/mL。

优选地，步骤(3)所述脂类产品与碱液的质量体积比为0.3～10。

上述脂肪酶催化反应中，脂肪酶可以来自天然，也可以通过人工发酵产生。可以是发酵液，可以是经简单纯化后的粗酶，也可是经纯化后纯酶。

步骤(2)反应结束后，中层富酶相，可直接作为下次反应应用，也可经超滤或吸附的方法得到纯酶产品；下层为富甘油相，经溶剂析出或降温结晶等方式除盐后，可得甘油水溶液。

本发明的效果和益处：

克服了目前酶法富集鱼油中多不饱和脂肪酸过程中，存在的富集成本高，连续化生产困难，产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，提供了一种从粗酶液中分离脂肪酶以及脂肪酶水解鱼油富集生产甘油酯型多不饱和脂肪酸的方法。使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在：利用三液相体系可将富多不饱和甘油酯产物及水解脂肪酸分配在上相，脂肪酶分配在中相或下相，甘油富集于另一相的特性，然后通过碱洗和疏水溶剂萃取结合，将富多不饱和甘油酯产物和水解脂肪酸分离。该过程既有利于酶的纯化与回收，也有提高催化效率，从而大幅降低酶的损耗与纯化成本。该方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有酶水解法生产脂肪酸难于工业化的技术难题。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

本实施例中所用脂肪酶，TL-100L、PL20000L购于Novozyme公司，AYS购于Amano公司。

实施例1

取6.5g含脂肪酶AYS的粗酶液(75U/mL)，加入1.5g的硫酸钠，混匀后加入2g聚乙二醇400和2g金枪鱼油，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成三液相体系，pH为7；在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应2h。另取6.5g粗酶液(75U/mL)，加入2g金枪鱼油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，对照组分为油水两相，实验组分为上，中，下三液相，上液相产物为脂类产品相，中液相为富酶相，甘油等副产物分配至下液相。分别取实验组和对照组的脂类产品相，加入7.5ml浓度5mol/L的氢氧化钠溶液，然后加入等体积正己烷，静置后取萃取，萃取后的上相经蒸馏得到富多不饱和甘油酯产物，下相用盐酸调回pH值至2以下，然后经等体积正己烷萃取得到水解后脂肪酸相。另取三液相中相测量其酶活，可得EPA和DHA的富集率可达129％和138％，其富集率的提高值分别为对照组的3.2和4.8倍，另脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达10.8，回收率可达91.5％。

实施例2

取0.9g含脂肪酶PL20000L的粗酶液(80U/mL)，加入0.3g的硫酸铵，混匀后加入0.3g聚乙二醇600和0.3g金枪鱼油，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成三液相体系，pH为4.5；并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37℃下反应0.5h。另取0.9g粗酶液(80U/mL)，加入0.3g金枪鱼油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，对照组分为油水两相，实验组分为上，中，下三液相，上液相产物为脂类产品相，中液相为富酶相，甘油等副产物分配制下液相。分别取实验组和对照组的脂类产品相(0.3g)，加入1.125ml浓度5mol/L的氢氧化钠溶液，然后加入等体积正己烷，静置后取萃取，萃取后的上相经蒸馏得到富多不饱和甘油酯产物，下相用盐酸调回pH值至2以下，然后经等体积正己烷萃取得到水解后脂肪酸相。另取三液相中相测量其酶活，可得EPA和DHA的富集率可达160％和133％，其富集率的提高值分别为油水体系的4.3和1.9倍，另脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达35.5，回收率可达96.2％。

实施例3

取6.5g含脂肪酶TL100L的粗酶液(100U/mL)，加入1.5g的硫酸钠，混匀后加入2g聚乙二醇400和2g金枪鱼油，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成三液相体系，pH为7；并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37℃下反应2h。另取6.5g粗酶液(100U/mL)，加入2g金枪鱼油，并用水稀释至相同体积，在相同条件下反应作为对照。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，对照组分为油水两相，实验组分为上，中，下三液相，上液相产物为脂类产品相，中液相为富酶相，甘油等副产物分配制下液相。分别取实验组和对照组的脂类产品相，加入7.5ml浓度5mol/L的氢氧化钠溶液，然后加入等体积正己烷，静置后取萃取，萃取后的上相经蒸馏得到富多不饱和甘油酯产物，下相用盐酸调回pH值至2以下，然后经等体积正己烷萃取得到水解后脂肪酸相。另取三液相中相测量其酶活，可得DHA的富集率可达135％，其富集率的提高值为对照组的13.2倍，另脂肪酶主要分配于中相，分配系数可达65.3，回收率可达98.6％。

实施例4

取0.825gg含脂肪酶AYS的粗酶液(75U/mL)，加入0.225g的硫酸钠，混匀后加入0.45g[BMIM]Br和0.3g金枪鱼油，装入具塞三角瓶中混合均匀，配成三液相体系，pH为7；并置于转速为200rpm的恒温摇床上，控制在37℃下反应0.5h。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，实验组分为上，中，下三液相，上液相产物为脂类产品相，中液相为富酶相，甘油等副产物分配制下液相。取反应后实验组和对照组的脂类产品相，加入7.5ml浓度5mol/L的氢氧化钠溶液，然后加入等体积正己烷，静置后取萃取，萃取后的上相经蒸馏得到富多不饱和甘油酯产物，下相用盐酸调回pH值至2以下，然后经等体积正己烷萃取得到水解后脂肪酸相。取上层油样测定所含甘油酯和脂肪酸中EPA和DHA含量可得EPA和DHA的富集率可达129％和124％，另取三液相中相测量其酶活，可得脂肪酶主要分配于下相，分配系数可达0，回收率可达100％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酶法富集多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将配置好的三液相体系在带搅拌反应器中反应，反应结束后，静置或离心至分层，收集上层产物即为脂类产品相；

(3)将脂类产品相加入浓度为0.1-10mol/L的碱液，然后加入疏水性有机溶剂，静置后取上相，回收疏水性有机溶剂，取萃取上相为富omega-3甘油酯产物，下相用酸调pH值至2以下，然后经疏水性有机溶剂萃取，即得到水解后脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF₄、[EMIM]ETSO₄和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述可溶性盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述疏水性有机溶剂为正己烷、石油醚和乙酸乙酯中的一种或两种以上。

5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸钙溶液中的一种或两种以上。

6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述搅拌的转速为100-1000转/分，反应温度为5-90℃，反应0.05-120h。

7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述三液相体系的pH值为3-13。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述三液相体系的pH值为4-10。

9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶浓度为50-2000U/mL。

10.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述脂类产品与碱液的质量体积比为0.1～5.0g/mL。