CN110904166A - 一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域，公开一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，该方法包括如下步骤：将娃娃鱼原料进行处理得到粗鱼油；将粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；将精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸；将含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。本发明一方面解决了现有大鲵产品，特别是深层次加工产品种类单一，从而限制大鲵养殖业的长远发展的问题；另一方面同时利用尿素包埋法与超临界法，解决了现有技术从鱼油中提取DHA存在的纯度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸，即DHA，通常称为脑黄金，其是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸，鱼油中含量较多。但是它属于热和化学不稳定的物质，将其分离提纯及其困难，现有常用的分离纯化技术有精馏分离技术、分子蒸馏技术、色谱分离技术、低温冷冻技术、金属盐沉淀技术和于油交酯化，但都或多或少的存在各自的不足。
例如，精馏分离技术，操作温度较高，时间较长，致使不饱和脂肪酸发生热敏反应，影响产品质量和收率。分子蒸馏技术一次性投资较大，且维护费用较高。超临界流体技术设备投资大，抽提压力高，无法实现将EPA、DHA与其他分子量接近的饱和或低浓度不饱和脂肪酸分离。色谱分离技术耗能大，操作成本高。低温冷冻技术需回收大量溶剂，分离效率不高，需要极低温的冷却设备，成本较高。金属盐沉淀技术因为使用硝酸银，造成成本高，且回收困难。鱼油交酯化技术，是指在碱性催化剂存在时，通过乙醇置换油脂中的甘油，制取乙酯化的高不饱和脂肪酸(EPA和DHA)。乙酯型ω-3PUFA在人体中消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患。
大鲵俗称娃娃鱼，是世界上最大的两栖类动物。《本草纲目》、《本草经集注》和《本草拾遗》等药典中，对大鲵有“麟目、滋阴补肾、补血行气治痴疾”和“治痴疾、治顽疾”等药用功效的描述，被誉为“水中活人参”和“软黄金”，在东南亚有“吃一鲵肉长一甲子功力”之说，是一种高级滋补保健珍品。
目前大鲵深层次的开发利用很少，现有的大鲵深层次的开发利用大多着眼于大鲵蛋白的分解等方法类，或者直接将分解得到的大鲵蛋白肽作为保健品进行售卖，这就导致大鲵蛋白类的产品种类过于单一，不利于大鲵养殖业的长远发展。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，旨在解决现有大鲵产品，特别是深层次加工产品种类单一，从而限制大鲵养殖业的长远发展的问题，解决现有技术从鱼油中提取DHA存在的纯度低的问题。
本发明采用如下技术方案：一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼原料进行处理得到粗鱼油；
S2、将所述S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将所述S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
S4、将所述S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
优选的，所述S1的具体方法为：
将娃娃鱼绞碎成肉浆，加水和抗氧化剂，使用枯草杆菌蛋白酶进行第一次酶解处理，酶解后进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
优选的，所述枯草杆菌蛋白酶的比酶活520U/g～550U/g，用量为娃娃鱼原料重量的0.65％～0.85％。
优选的，所述抗氧化剂的加入量为娃娃鱼原料重量的0.005％～0.015％，所述抗氧化剂为TBHQ、茶多酚或Vc。
优选的，所述第一次酶解处理的酶解条件：酶解液pH为7～8，酶解温度为35℃～40℃，酶解时间为2h～3h。
优选的，所述S3中的所述尿素包埋法分离步骤为：
S31、将S2中的精制鱼油中加入脂肪酶进行第二酶解反应，得到游离的脂肪酸；
S32、将所述S31得到的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液进行混合，降温至0℃～5℃，并保温结晶处理10h～12h后升至室温，过滤得到滤液；
S33、将所述S32的所述滤液进行萃取，并对收集的有基层进行减压蒸馏，得到浓缩的含有DHA的高度不饱和脂肪酸。
优选的，所述S32中，在50℃～65℃下将所述S31中的所述脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液按照重量比为1：(1～3)混合。
优选的，所述S33中，所述萃取时采用的萃取体系为用量比为10ml:(1～2)g:(2～3)g的滤液、正己烷、蒸馏水体系；萃取压力为20MPa～30MPa，萃取温度为35℃～40℃。
优选的，所述S4中的所述亚临界酶促反应的条件为：所述超临界萃取反应釜的压力为4MPa～8MPa，超声波振动磁场为2Hz～10Hz，反应温度为30℃～60℃，反应时间为1h～12h。
优选的，所述脂肪酶为脂肪酶Novozym435。
与现有技术相比，采用上述方案本发明的有益效果为：
本发明中通过选用娃娃鱼为原料，首先将娃娃鱼制备成精制鱼油；然后通过尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸；最后，再通过亚临界酶促反应得到DHA的脂肪酸甘油三酯；即本发明一方面解决了现有大鲵产品，特别是深层次加工产品种类单一，从而限制大鲵养殖业的长远发展的问题；另一方面同时利用尿素包埋法与超临界法，解决了现有技术从鱼油中提取DHA存在的纯度低的问题。
附图说明
图1是本发明提供的一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼原料进行处理得到粗鱼油；
S2、将S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
S4、将S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
下面结合具体实施例对本发明的方法进行具体说明：
实施例1
一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼绞碎成肉浆，加水和抗氧化剂，使用枯草杆菌蛋白酶进行第一次酶解处理，酶解后进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
其中，枯草杆菌蛋白酶的比酶活520U/g，用量为娃娃鱼原料重量的0.65％；
抗氧化剂为TBHQ，加入量为娃娃鱼原料重量的0.005％。
第一次酶解处理的酶解条件：酶解液pH为7，酶解温度为35℃，酶解时间为2h；
S2、将S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸，具体包括如下步骤：
S31、将S2中的精制鱼油中加入脂肪酶进行第二酶解反应，得到游离的脂肪酸；
S32、将S31得到的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液进行混合，降温至0℃，并保温结晶处理10h后升至室温，过滤得到滤液；
S33、将S32的滤液进行萃取，并对收集的有基层进行减压蒸馏，得到浓缩的含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
其中，S32中，在50℃下将S31中的所述脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液按照重量比为1：1混合；
S33中的萃取采用的萃取体系为用量比为10ml:1g:2g的滤液、正己烷、蒸馏水体系；萃取压力为20MPa，萃取温度为35℃；
S4、将所述S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
其中，亚临界酶促反应的条件为：超临界萃取反应釜的压力为4MPa，超声波振动磁场为2Hz，反应温度为30℃，反应时间为1h。
实施例2
一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼绞碎成肉浆，加水和抗氧化剂，使用枯草杆菌蛋白酶进行第一次酶解处理，酶解后进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
其中，枯草杆菌蛋白酶的比酶活540U/g，用量为娃娃鱼原料重量的0.75％；
抗氧化剂为茶多酚，加入量为娃娃鱼原料重量的0.01％。
第一次酶解处理的酶解条件：酶解液pH为7.4，酶解温度为37℃，酶解时间为2.5h；
S2、将S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸，具体包括如下步骤：
S31、将S2中的精制鱼油中加入脂肪酶进行第二酶解反应，得到游离的脂肪酸；
S32、将S31得到的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液进行混合，降温至3℃，并保温结晶处理11h后升至室温，过滤得到滤液；
S33、将S32的滤液进行萃取，并对收集的有基层进行减压蒸馏，得到浓缩的含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
其中，S32中，在60℃下将S31中的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液按照重量比为1：2混合；
S33中的萃取采用的萃取体系为用量比为10ml:1.5g:2.5g的滤液、正己烷、蒸馏水体系；萃取压力为25MPa，萃取温度为37℃；
S4、将S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
其中，亚临界酶促反应的条件为：超临界萃取反应釜的压力为6MPa，超声波振动磁场为8Hz，反应温度为45℃，反应时间为8h。
实施例3
一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼绞碎成肉浆，加水和抗氧化剂，使用枯草杆菌蛋白酶进行第一次酶解处理，酶解后进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
其中，枯草杆菌蛋白酶的比酶活550U/g，用量为娃娃鱼原料重量的0.85％；
抗氧化剂为Vc，加入量为娃娃鱼原料重量的0.015％。
第一次酶解处理的酶解条件：酶解液pH为8，酶解温度为40℃，酶解时间为3h；
S2、将S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸，具体包括如下步骤：
S31、将S2中的精制鱼油中加入脂肪酶进行第二酶解反应，得到游离的脂肪酸；
S32、将S31得到的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液进行混合，降温至5℃，并保温结晶处理12h后升至室温，过滤得到滤液；
S33、将S32的滤液进行萃取，并对收集的有基层进行减压蒸馏，得到浓缩的含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
其中，S32中，在65℃下将S31中的所述脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液按照重量比为1：3混合；
S33中的萃取采用的萃取体系为用量比为10ml:2g:3g的滤液、正己烷、蒸馏水体系；萃取压力为30MPa，萃取温度为40℃；
S4、将所述S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
其中，亚临界酶促反应的条件为：超临界萃取反应釜的压力为8MPa，超声波振动磁场为10Hz，反应温度为60℃，反应时间为12h。
上述实施例中采用的脂肪酶均为脂肪酶Novozym435，购买自诺维信公司。
枯草杆菌蛋白酶购买自Sigma-Aldrich。
对比例1
将娃娃鱼原料在氮气气氛下水煮提法得到鱼油；
并将鱼油加入到氢氧化钠-乙醇溶液中，在氮气气氛下于70℃皂化30min，然后搅拌冷却至10℃，滤除析出的结晶，用少量的乙醇洗涤结晶，并将洗涤液与滤液合并，减压浓缩，再用正己烷萃取，分离水相，加入稀硫酸，调节pH为2，再用正己烷萃取，蒸馏出去正己烷，得到含有DHA的不饱和脂肪酸；
在含有DHA的不饱和脂肪酸总加入尿素的乙醇溶液，加热搅拌，滤除低度不饱和的脂肪酸，再经过正己烷萃取，酸性白土脱色，水蒸汽减压蒸馏，可得到含有DHA的产品。
对比例2
向娃娃鱼的精制鱼油加入脂肪酶进行酶解反应，得到游离的脂肪酸；
将游离的脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
其中，超临界萃取反应釜的压力为6MPa，超声波振动磁场为8Hz，反应温度为40℃，反应时间为8h。
对上述实施例1-3和对比例1-2中得到的最终产品中的DHA的质量百分含量进行测试，测试方法如下：
DHA的脂肪酸甘油三酯纯度的测定：根据GB/T17377-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯气象色谱分析》检测”来测定。
测试结果如表1，从表1的结果可以看出，实施例1-3的最终产品中DHA的质量百分含量明显高于对比例1-2。
表1实施例和对比例中最终产品中DHA的质量百分含量
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 最终产品的DHA含量(％) | 83.2 | 79.8 | 81.5 | 46.3 | 49.1 |
综上所述，本发明的方法一方面解决了现有大鲵产品，特别是深层次加工产品种类单一，从而限制大鲵养殖业的长远发展的问题；另一方面同时利用尿素包埋法与超临界法，解决了现有技术从鱼油中提取DHA存在的纯度低的问题。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将娃娃鱼原料进行处理得到粗鱼油；
S2、将所述S1中的粗鱼油依次经过脱酸、脱臭、脱脂处理后，得到精制鱼油；
S3、将所述S2中的精制鱼油采用尿素包埋法分离、萃取得到含有DHA的高度不饱和脂肪酸；
S4、将所述S3中的含有DHA的高度不饱和脂肪酸放入含有脂肪酶的超临界萃取反应釜中，在超声波磁场中进行亚临界酶促反应，将反应产物进行超临界萃取、精馏处理，得到DHA的脂肪酸甘油三酯。
2.如权利要求1所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述S1的具体方法为：
将娃娃鱼绞碎成肉浆，加水和抗氧化剂，使用枯草杆菌蛋白酶进行第一次酶解处理，酶解后进行固液分离，收集滤液，得到粗鱼油；
3.如权利要求2所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述枯草杆菌蛋白酶的比酶活520U/g～550U/g，用量为娃娃鱼原料重量的0.65％～0.85％。
4.如权利要求2所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述抗氧化剂的加入量为娃娃鱼原料重量的0.005％～0.015％；所述抗氧化剂为TBHQ、茶多酚或Vc中的至少一种。
5.如权利要求2所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述第一次酶解处理的酶解条件：酶解液pH为7～8，酶解温度为35℃～40℃，酶解时间为2h～3h。
6.如权利要求1所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述S3中的所述尿素包埋法分离步骤为：
S31、将S2中的精制鱼油中加入脂肪酶进行第二酶解反应，得到游离的脂肪酸；
S32、将所述S31得到的脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液进行混合，降温至0℃～5℃，并保温结晶处理10h～12h后升至室温，过滤得到滤液；
S33、将所述S32的所述滤液进行萃取，并对收集的有基层进行减压蒸馏，得到浓缩的含有DHA的高度不饱和脂肪酸。
7.如权利要求6所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述S32中，在50℃～65℃下将所述S31中的所述脂肪酸与尿素的乙醇饱和溶液按照重量比为1：(1～3)混合。
8.如权利要求6所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述S33中，所述萃取时采用的萃取体系为用量比为10ml:(1～2)g:(2～3)g的滤液、正己烷、蒸馏水体系；萃取压力为20MPa～30MPa，萃取温度为35℃～40℃。
9.如权利要求1所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述S4中，所述亚临界酶促反应的条件为：所述超临界萃取反应釜的压力为4MPa～8MPa，超声波振动磁场为2Hz～10Hz，反应温度为30℃～60℃，反应时间为1h～12h。
10.如权利要求1所述的从娃娃鱼中提取脑黄金的方法，其特征在于，所述脂肪酶为脂肪酶Novozym435。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200324 |