CN104569277A

CN104569277A - 一种快速鉴别深海鱼油的方法

Info

Publication number: CN104569277A
Application number: CN201410852773.2A
Authority: CN
Inventors: 王秀嫔; 李培武; 刘优钱; 张奇; 丁小霞; 张文; 张良晓
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104569277B

Abstract

本发明涉及一种快速鉴别深海鱼油的方法。将待鉴别深海鱼油样品经提取获得其中脂质组分后，稀释，过滤，进样到反相液相色谱-质谱联用仪中进行分析，所述反相液相色谱使用的流动相包括：a组分异丙醇和b组分乙腈，洗脱方式：梯度洗脱；质谱条件：采集模式：正离子采集模式；离子源：大气压化学电离源；扫描方式：数据依赖型二级扫描；采集范围：100～1200m/z；碰撞能量：10-50eV；导出色谱质谱图，通过对总离子流图、一级质谱图、二级质谱图进行结合分析，鉴别样品是乙酯型深海鱼油还是甘油酯型深海鱼油。其能准确区分乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油，有效地防止低价乙酯型深海鱼油冒充高价甘油酯型深海鱼油。

Description

一种快速鉴别深海鱼油的方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种快速鉴别深海鱼油的方法。

背景技术

深海鱼油因富含多元不饱和脂肪酸(DHA和EPA)而深受人们的喜爱。深海鱼油的主要作用功效包括：调节血脂，清理血栓，防止血液凝固，预防脑血栓、脑溢血及中风；预防关节炎、缓解痛风、哮喘，暂时缓解由关节炎引起的肿痛；预防老年痴呆症、营养大脑、改善记忆；改善视力、防治老花眼；维护视网膜等。《2009年膳食营养补充剂热门品类调查》显示，维生素C、鱼油、钙制剂类品种位于全国销量前列，鱼油仅次于维生素C位于第二。而目前市场上鱼油分为乙酯型和甘油酯型，两种不同深海鱼油价格差异大，功效不同。

甘油酯型鱼油由于是EPA与DHA的天然存在形式，因此食用安全，易被人体消化吸收，是被人们普遍接受的一种产品形式。甘油酯型鱼油与乙酯型鱼油相比，首先其吸收率高，其吸收率是乙酯型鱼油的三倍左右，原因是人体胰脏和肝脏的主要脂肪酶是专一性水解甘油三酯的，因此，乙酯型鱼油不能被有效水解而释放游离脂肪酸以被人体吸收。

其次，乙酯型鱼油存在着功能上的缺陷：乙酯型鱼油脂肪酸被小肠吸收进入人体后易作为供能的物质基础而被氧化，影响了鱼油的保健功效；乙酯型在胃肠道分解成形成乙醇，对乙醇耐受性差的人易引起一些不良反应，如过敏症，尤其是不适宜儿童；长期以脂肪酸、乙醇为膳食来源，易引起人体内甘油的缺失或不足，从而拉动人体糖代谢，这样易造成人体内糖代谢的不平衡而产生一定的副作用。

目前保健品市场上80％以上的鱼油为乙酯型，它存在功能上的缺陷，隐含着消费的信任危机，这种危机源于技术的滞后，我国作为保健食品及保健药品的鱼油胶丸消费大国，开发能够快速鉴别深海鱼油的方法已迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴别深海鱼油的方法，其能准确区分乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油，可有效地防止低价乙酯型深海鱼油冒充高价甘油酯型深海鱼油。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

提供一种快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：将待鉴别深海鱼油样品经提取获得其中脂质组分后，稀释，过滤，进样到反相液相色谱-质谱联用仪中进行分析，所述反相液相色谱使用的流动相包括：a组分异丙醇和b组分乙腈，洗脱方式：梯度洗脱；质谱条件：采集模式：正离子采集模式；离子源：大气压化学电离源；扫描方式：数据依赖型二级扫描；采集范围：100～1200m/z；碰撞能量：10-50eV；

导出色谱质谱图，通过对总离子流图、一级质谱图、二级质谱图进行结合分析，鉴别样品是乙酯型深海鱼油还是甘油酯型深海鱼油。

按上述方案，所述乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油的鉴别方法为：样品中只含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为乙酯型深海鱼油；样品中只含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，且不含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为甘油酯型深海鱼油。

按上述方案，所述的鱼油样品为乙酯型深海鱼油时，其总离子流图中没有甘油酯型深海鱼油的手指型特征色谱峰，且在其一级质谱图中可看到乙酯酰基EPA特征分子离子峰([CH₃CH₂O-EPA+H]⁺，m/z 331.3)和乙酯酰基DHA特征分子离子峰([CH₃CH₂O-DHA+H]⁺，m/z 357.4)，其二级质谱图中可看到碎片离子[EPA-OH]⁺(m/z 285.27)和[DHA-OH]⁺(m/z311.28)。

按上述方案，所述的鱼油样品为甘油酯型深海鱼油时，其总离子流图中有甘油酯型深海鱼油的手指型特征色谱峰，另外，各脂质组分的一级分子离子峰会任意丢失一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子，结合一级分子离子和二级碎片离子的质荷比特征信息可推测丢失的脂肪酸种类，从而判断所述的样品中是否含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，由此可判断鱼油样品是否为甘油酯型深海鱼油，且可判断甘油骨架上的脂肪酸种类。

按上述方案，所述的梯度洗脱方式为：0-5min，10％a，90％b(按体积百分比计)；5-20min，59％a，41％b(按体积百分比计)；20-25min，10％a，90％b(按体积百分比计)。

按上述方案，所述洗脱速度为150-300μL/min。

按上述方案，所述的提取用试剂为异丙醇、乙腈和正己烷的混合溶液，其中按体积百分比计，各组分的含量为；异丙醇5％-50％，乙腈5％-40％，正已烷10-90％。

按上述方案，所述稀释用溶剂为体积比为1:1的甲醇和异丙醇的混合溶液。

按上述方案，所述的离子源温度：200-350℃；毛细管温度：200-350℃；鞘气压力：30-35psi；辅助气压力：0-10psi。

按上述方案，所述的液相色谱分析中使用的色谱柱为反相色谱柱。

按上述方案，所述的进样量10-25μL。

本发明的有益效果：

本发明采用反相液相色谱-质谱联用仪分析样品，通过识别样品中EPA和DHA的脂质结合方式，可很好地实现乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油的准确鉴别；需要待测样品量少、前处理简单、分析时间短、适合推广。

附图说明

图1为乙酯型深海鱼油样品的总离子流图；

图2乙酯型深海鱼油样品中乙酯化EPA/DHA的一级质谱图；

图3乙酯型深海鱼油样品中EPA乙酯的二级质谱图；

图4乙酯型深海鱼油样品中DHA乙酯的二级质谱图；

图5甘油酯型深海鱼油样品的总离子流图；

图6甘油酯型深海鱼油样品中[PoEPADHA+H]⁺的二级质谱图。图中可以看到二级特征碎片离子[DHAEPA]⁺(m/z，671.50)，[PoDHA]⁺(m/z，621.50)，和[PoEPA]⁺(m/z，595.47)；

图7乙酯型深海鱼油验证样品的总离子流图；

图8乙酯型深海鱼油验证样品中乙酯化EPA/DHA的一级质谱图；

图9甘油酯型深海鱼油验证样品的总离子流图。

具体实施方式

为进一步阐述采用反相液相色谱-质谱联用仪分析鉴定深海鱼油的方法，下面具体结合实例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

样本来源：市售不同品牌的深海鱼油样品(样品1为乙酯型深海鱼油，样品2为甘油酯型深海鱼油)。

称取30mg待测深海鱼油样本，采用异丙醇：乙腈：正己烷(2:2:1；V/V/V)的混合溶剂提取获得其中脂质组分(包括酰基EPA和酰基DHA)后，用甲醇：异丙醇(1:1；V/V)稀释100倍，0.22μm的有机滤膜过滤，进样到液相色谱-质谱联用仪中进行分析，进样量10μl，其中：所述的反相液相色谱中使用的色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱(150*2.1mm，3μm，USA)，流动相a相为异丙醇，b相为乙腈，梯度洗脱：0-5min，10％a，90％b；5-20min，59％a，41％b；20-25min,10％a，90％b(按体积百分比计)；流速为200μL/min；进样量为10-25μL；质谱条件：离子源：大气压化学电离源；采集模式：正离子采集模式；扫描方式：数据依赖型二级扫描，采集范围：100～1200m/z；离子源温度：275℃；毛细管温度：275℃；鞘气压力：30psi；辅助气压力：5psi；碰撞能量：35eV；

导出色谱质谱图，通过对总离子流图、一级质谱图、二级质谱图进行结合分析，识别样品中EPA和DHA的脂质结合方式，即判断是乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，还是三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，由此判断样品是乙酯型深海鱼油还是甘油酯型深海鱼油。

所述样品1的总离子流图如图1，图1中2.86min处有乙酯酰基EPA分子离子峰([CH₃CH₂O-EPA+H]⁺，m/z 331.34)和乙酯酰基DHA分子离子峰([CH₃CH₂O-DHA+H]⁺，m/z 357.41)的色谱峰。同时在乙酯型鱼油一级质谱图中，可以看到乙酯酰基EPA特征分子离子峰([CH₃CH₂O-EPA+H]⁺，m/z 331.3)和乙酯酰基DHA特征分子离子峰([CH3CH2O-DHA+H]⁺，m/z 357.4)。在分子离子峰二级全扫描质谱图中分别出现了其碎片离子[EPA-OH]⁺(m/z 285.27，见图3)和[DHA-OH]⁺(m/z 311.28，见图4)。由此可判断样品1为乙酯型鱼油。

所述样品2的总离子流图见图5，图5中5.5min-18min之间的峰为甘油酯型深海鱼油中脂质组分包括三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA多组分的手指型色谱峰。同时，能够对三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA定性。

定性方法为：所述的鱼油样品为甘油酯型深海鱼油时，其三酰甘油酯组分的一级分子离子峰会任意丢失一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子，通过将一级分子离子和二级碎片离子信息与脂质数据库(http://www.lipidmaps.org/)进行比对，并结合一级分子离子和二级碎片离子的质荷比特征信息可推测丢失的脂肪酸种类，由此可判断鱼油样品是否为甘油酯型深海鱼油，且可判断甘油骨架上的脂肪酸种类。如一种甘油三酯组分PoEPADHA的分子离子峰[PoEPADHA+H]⁺(m/z 923.67)会失去任意一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子[DHAEPA]⁺(m/z，671.50)，[PoDHA]⁺(m/z，621.50)，和[PoEPA]⁺(m/z，595.47)，见图5，由此可识别该组分为PoEPADHA。使用该定性方法，可识别出样品2中全部三酰甘油酯组分包括三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，见表1。

表1甘油酯型鱼油中甘油三酯定性结果

缩写备注：M为十四碳脂肪酸；P为十六碳脂肪酸；Po为十六碳烯酸；Ma为十七碳脂肪酸；S为十八碳脂肪酸；O为十八碳烯酸；Ln为十八碳三烯酸；St为十八碳四烯酸；G为二十碳烯酸；Ar为二十碳四烯酸；EPA为二十碳五烯酸；B为二十二碳脂肪酸；DHA为二十二碳六烯酸。

实施例2

对已知为乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油各一个样本进行验证。

分别称取30mg已知为乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油样本，采用异丙醇：乙腈：正己烷(1:1:8；V/V/V)的混合溶剂提取获得其中脂质组分(包括酰基EPA和酰基DHA)后，用甲醇：异丙醇(1:1；V/V)稀释100倍，0.22μm的有机滤膜过滤，进样到液相色谱-质谱联用仪中进行分析，进样量10μl，其中：所述的反相液相色谱中使用的色谱柱为Thermo ScientificHypersil GOLD C18色谱柱(150*2.1mm，3μm，USA)，流动相a相为异丙醇，b相为乙腈，梯度洗脱：0-5min，10％a，90％b；5-20min，59％a，41％b；20-25min,10％a，90％b(按体积百分比计)；流速为180μL/min；进样量为10-25μL；质谱条件：离子源：大气压化学电离源；采集模式：正离子采集模式；扫描方式：数据依赖型二级扫描，采集范围：100～1200m/z；离子源温度：200℃；毛细管温度：200℃；鞘气压力：35psi；辅助气压力：2psi；碰撞能量：15eV。

从乙酯型深海鱼油样品的总离子流图(图7)可看到：2.86min处有乙酯酰基EPA分子离子峰([CH₃CH₂O-EPA+H]⁺，m/z 331.28)和乙酯酰基DHA分子离子峰([CH₃CH₂O-DHA+H]⁺，m/z 357.26)的色谱峰。同时在乙酯型鱼油一级质谱图(图8)中，可以看到乙酯酰基EPA特征分子离子峰([CH3CH2O-EPA+H]⁺，m/z 331.28)和乙酯酰基DHA特征分子离子峰([CH3CH2O-DHA+H]⁺，m/z 357.26)。由此可验证该样品为乙酯型鱼油。

采用与实施例1相同的方法结合总离子流图、一级质谱图、二级质谱图进行定性分析，经验证，该样品为甘油酯型深海鱼油。图9为该甘油酯型深海鱼油样品的总离子流图，从中可看到5min-18min之间的峰为甘油酯型深海鱼油中脂质组分包括三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA多组分的手指型色谱峰。

Claims

1.一种快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：将待鉴别深海鱼油样品经提取获得其中脂质组分后，稀释，过滤，进样到反相液相色谱-质谱联用仪中进行分析，所述反相液相色谱使用的流动相包括：a组分异丙醇和b组分乙腈，洗脱方式：梯度洗脱；质谱条件：采集模式：正离子采集模式；离子源：大气压化学电离源；扫描方式：数据依赖型二级扫描；采集范围：100 ～ 1200 m/z；碰撞能量：10-50eV；

2.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：样品中只含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为乙酯型深海鱼油；样品中只含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，且不含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为甘油酯型深海鱼油。

3.根据权利要求1或2所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的鱼油样品为乙酯型深海鱼油时，其总离子流图中没有甘油酯型深海鱼油的手指型特征色谱峰，且在其一级质谱图中可看到乙酯酰基EPA特征分子离子峰[CH₃CH₂O-EPA+H]⁺和乙酯酰基DHA特征分子离子峰[CH₃CH₂O-DHA+H]⁺，其二级质谱图中可看到碎片离子[EPA-OH]⁺和[DHA-OH]⁺；所述的鱼油样品为甘油酯型深海鱼油时，其总离子流图中有甘油酯型深海鱼油的手指型特征色谱峰，另外，各脂质组分的一级分子离子峰会任意丢失一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子，结合一级分子离子和二级碎片离子的质荷比特征信息可推测丢失的脂肪酸种类，从而判断所述的样品中是否含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，由此可判断鱼油样品是否为甘油酯型深海鱼油，且可判断甘油骨架上的脂肪酸种类。

4.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的梯度洗脱方式为：0-5min，10% a，90% b（按体积百分比计）；5 -20min，59% a，41% b（按体积百分比计）；20-25min，10% a，90% b（按体积百分比计）。

5.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述洗脱速度为150-300μL/min。

6.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的提取用试剂为异丙醇、乙腈和正己烷的混合溶液，其中按体积百分比计，各组分的含量为；异丙醇 5%-50%，乙腈5%-40%，正已烷 10-90%。

7.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述稀释用溶剂为体积比为1:1的甲醇和异丙醇的混合溶液。

8.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的离子源温度：200-350℃；毛细管温度：200-350℃；鞘气压力：30-35psi；辅助气压力：0-10psi 。

9.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的反相液相色谱使用的色谱柱为反相色谱柱。

10.根据权利要求1所述的快速鉴别深海鱼油的方法，其特征在于：所述的进样量10-25 μL。