CN104640880A - Kir3dl2结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用特异性地结合KIR3DL2的抗体(例如单克隆抗体)、抗体片段、及其衍生物治疗癌症和炎性疾病的方法。本发明也涉及抗体、生产这样的抗体的细胞；制备这样的抗体的方法；所述抗体的片段、变体和衍生物；包含它们的药物组合物。

Description

KIR3DL2结合剂
技术领域
本发明提供了能够结合KIR3DL2多肽的抗原结合蛋白。所述抗体在治疗以表达KIR3DL2的细胞(特别是CD4+T细胞)为特征的障碍中具有增加的活性，所述障碍包括恶性肿瘤(诸如蕈样肉芽肿病和塞扎里综合征)和表达KIR3DL2的自身免疫障碍。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月19日提交的美国临时申请号61/702,834的权益；其公开内容通过引用整体并入本文；包括任何附图。
对序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。所述序列表作为标题为“KIR-3PCT_ST25”的文件提供，该文件创建于2013年9月13日，大小为91KB。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
背景技术
杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)是一个受体家族，其与C-型凝集素受体(CD94-NKG2)一起，被人NK细胞和T-淋巴细胞子集用于特异性地识别MHCI类分子。某些抑制性KIR和活化KIR具有非常类似的细胞外结构域，并且被相同单克隆抗体识别，例如KIR2DL1和KIR2DS1都被EB6识别，2DL2和2DS2都被GL183识别。已经使用3个标准(细胞外Ig-样结构域(结构域D0、D1、D2)的数目、细胞质尾巴长度和序列类似)将KIR蛋白分类成13个组、即KIR3DL1-2、KIR3DS1、KIR2DL1-5和KIR2DS1-5。对2个结构域的命名2D或对3个结构域的命名3D给出了Ig-样结构域的数目；具有长或短细胞质结构域的受体被进一步分类为L或S.(Pascal V.等人,2007J.Immunol.179:1625-1633)。抑制性受体具有含有规范ITIM的长(L)细胞质尾巴(即，KIR2DL或KIR3DL)，所述规范ITIM在它们的HLA类别I配体的KIR啮合以后变成酪氨酸磷酸化。磷酸化的ITIM募集含有Src同源性2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶：含有Src同源性2结构域的磷酸酶1和/或含有Src同源性2结构域的磷酸酶2，它们将细胞底物去磷酸化，从而中止NK活化信号，即，节制靶细胞的适当的自身MHC I类表达。具有短(S)细胞质尾巴的受体缺少ITIM(即，KIR2DS或KIR3DS)。这些活化KIR在它们的跨膜结构域内含有带电荷的残基，从而促进与信号传递链KARAP/DAP12的相互作用。已经证实KIR2DS家族的受体的啮合会导致KARAP/DAP12介导的信号传递事件的级联，最终导致增加的NK细胞细胞裂解活性和促炎性细胞因子诸如IFN-γ的产生(Pascal等人.2007)J.Immunol.179:1625-1633)。预测成熟的NK细胞会获得至少一种对自身MHC I类分子特异性的抑制性受体，其通常在功能上胜过潜在地自体反应性的活化分子。有人提出，NK细胞的应答代表KIR和其它受体对活化和抑制性信号传递的集成结果。
已经将KIR3DL2作为恶性肿瘤的治疗靶标进行了研究，所述恶性肿瘤涉及表达KIR3DL2受体的CD4+T细胞(特别是CD4+T细胞)，包括恶性肿瘤诸如蕈样肉芽肿病和塞扎里综合征(参见，例如PCT公开WO2010/081890和WO02/50122)。
KIR3DL2的一种配体HLA-B27与脊柱关节炎(SpA)强相关，所述脊柱关节炎(SpA)是一组以强直性脊柱炎(AS)为代表的使人虚弱的炎症性关节炎障碍。基因组范围的关联研究已经强烈暗示在SpA中由Th17细胞产生的IL-17调节中涉及的基因(Reveille,等人(2011)Nat Genet 43:761-767.)。IL17已经涉入不同的自身免疫障碍，包括SpA(Shen,等人(2009)Arthritis Rheum60:1647-1656；Wendling,等人(2007)Joint Bone Spine 74:304-305)。HLA-B27(B27)在疾病中在抗原表达细胞(APC)的表面处表达为经典的β2m-相关的异源三聚体和非规范的不含β2m的二硫键合的重链二聚体(被称作B272)(Bird,等人(2003)Eur J Immunol 33:748-759；Kollnberger,等人(2002)ArthritisRheum 46:2972-2982)。B27二聚体是(但B27异源三聚体不是)杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR3DL2的配体(Kollnberger等人(2002))。KIR3DL2的3个免疫球蛋白样结构域D0、D1和D2参与结合配体。B27二聚体的KIR3DL2连接会促进Th17和NK细胞子集的存活(Bowness,等人(2011)Journal ofimmunology 186:2672-2680；Chan,等人(2005)Arthritis Rheum 52:3586-3595)。已经证实，在具有SpA的患者中，存在增加比例的表达KIR3DL2的病原性Th17和NK细胞子集。Bowness等人(2011)和Chan等人(2005)。研究强烈提示，KIR3DL2-B27相互作用在SpA中起重要作用，并且KIR3DL2是一种有前途的治疗靶标。
已经报道了对不同KIR3D多肽具有反应性的抗体的存在。已经报道了2种抗-KIR3DL2抗体的存在：Q241和Q66(Pende,等人(1996)J Exp Med184:505-518)。但是，这2种抗体都属于IgM同种型(五聚体)，并且不会容易地适合于制药应用；此外，如果将它们的可变区放在二价IgG型抗体的背景下，预期它们的亲和力较低。报道了被称作生产其它抗体的“AZ158”的细胞(Parolini,S.,等人(2002)In Leucocyte typing VII.D.Mason,编.OxfordUniversity Press,Oxford.415-417；PCT公开WO2010/081890)。抗体5.133可得自Miltenty Biotech(Auburn CA)。抗体AZ158和5.133都结合KIR3DL2以及KIR3DL1(和其它高度同源的KIR3DS1)。KIR3DL2和KIR3DL1具有相对较高的氨基酸同一性，并且结合KIR3DL2的不同HLA配体也被KIR3DL1识别。尽管免疫接种会产生AZ158、Q241和Q66，在治疗和其它应用中仍然需要改进的抗体。
发明内容
在一个方面，本发明尤其源自下述发现：KIR3DL2当结合抗体时可以内化。我们又鉴别出许多不会内化的抗-KIR3DL2mAb。经证实，KIR3DL2内化会强烈阻碍基于ADCC的方案。在这里，我们也提供了这样的抗-KIR3DL2抗体：其抑制与KIR3DL2的B27二聚体相互作用。值得注意的是，可以在不造成受体内化的情况下实现配体阻断。我们也提供了选择性地阻断KIR3DL2-HLA B27相互作用、而不阻断KIR3DL2-HLA-A3相互作用的抗体。
提供了结合主要(以在人群中的频率的方式)KIR3DL2等位基因、但不结合密切相关的KIR3DL1多肽(例如包含在SEQ ID NO:169中所示的氨基酸序列的等位基因*00101)的抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合SEQ IDNO:1和159-168的KIR3DL2多肽(例如，等位基因*002、*003、*005、*007和/或*008)中的1种、2种、3种、4种或5种或更多种。结果，提供了这样的抗体：其具有本文描述的有利功能性能，且其可以施用用于治疗在人群中大量交叉的疾病，例如无需进行诊断试验来评估在个体中表达的KIR3DL2等位基因。
通过抗体的表位研究，还提供了在KIR3DL2上(在D0结构域和D2结构域中)可以被抗体靶向以产生有利性能的区域。
在一个方面，所述抗体此外具有结合人KIR3DL2的多个等位基因、同时维持超过KIR3DL1的KIR3DL2特异性的额外优点。
提供了这样的抗体：其具有阻断KIR3DL2的天然配体的优点，且其因而非常适合用于治疗或预防炎症性障碍，无论是作为耗尽性还是非耗尽性mAb形式。此外，不同的表位会提供不同的配体阻断特异性。
还提供了不会阻断KIR3DL2配体(HLA-A3和HLA-B27)的抗体，包括非内化抗体；这些抗体在基于ADCC的方案中可能是有利的，其中它可能有助于避免与配体的竞争。
在一个实施方案中，提供了结合KIR3DL2多肽的抗体，其中所述抗体不会实际上结合KIR3DL1多肽(例如其中KIR3DL1多肽包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列)，且其中所述抗体不会内化进表达KIR3DL2的细胞中。
在一个实施方案中，提供了结合至少2种KIR3DL2多肽(等位基因)的抗体，且其中所述抗体不会实质上结合KIR3DL1多肽(例如包含在SEQ ID NO:169中所示的氨基酸序列的KIR3DL1等位基因*00101)。
在一个实施方案中，所述抗体结合SEQ ID NO:1、161、163、165和/或166的KIR3DL2多肽(等位基因*002、*003、*005、*007和/或*008)中的1种、2种、3种、4种或5种。
在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ ID NO:1、171和176(分别是等位基因_*002、*001和*007)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ ID NO:171和178(分别是等位基因_*001和*009)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ ID NO:171、1、176和178(分别是等位基因_*001、*002、*007和*009)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ IDNO:171、1、172、174和176(分别是等位基因_*001、*002、*003、*005和*007)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ ID NO:171、1、176和177(分别是等位基因_*001、*002、*007和*008)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在一个实施方案中，所述抗体结合具有在SEQ ID NO:171、1、172、174、176和177(分别是等位基因_*001、*002、*003、*005、*007和*008)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽中的每一种。在前述任一种的一个实施方案中，所述抗体进一步结合具有在SEQ ID NO:178(等位基因*09)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽。在前述任一种的一个实施方案中，所述抗体进一步结合具有在SEQ ID NO:173(等位基因*004)中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽。在前述任一种的一个实施方案中，所述抗体进一步结合KIR3DL2多肽等位基因*010(具有与*001相同的SEQ ID NO:171的细胞外结构域)。在前述任一种的一个实施方案中，所述抗体进一步结合KIR3DL2多肽等位基因*011(具有与*003相同的细胞外结构域(SEQ ID NO:179))。在前述任一种的一个实施方案中，所述抗体进一步结合KIR3DL2多肽等位基因*006。任选地，在每种情况下，所述抗体结合在细胞(例如报告细胞系，其中KIR3DL2呈天然构象)的表面上表达的所述KIR3DL2多肽。任选地，所述抗体结合构象表位。
任选地，在每种情况下，所述抗体结合在细胞表面上表达的所述KIR3DL2多肽，其对人KIR3DL2多肽的结合亲和力(KD)小于10-8M，任选地其中结合亲和力是二价的。优选地，所述抗体结合在KIR3DL2上的构象表位。
在一个实施方案中，提供了结合KIR3DL2多肽的D0或D2结构域中的氨基酸残基的抗体，且其中所述抗体不会实质上结合KIR3DL1多肽。
任选地，所述抗体对人KIR3DL2多肽的结合亲和力(KD)小于(即，比此更好的亲和力)10-8M、优选地小于10-9M或优选地小于10-10M，任选地，其中结合亲和力是二价的。
任选地，就结合被造成在它们的表面处表达特定KIR3DL2等位基因(例如等位基因_*001、*002、*003、*005、*007和/或*008)的细胞而言，所述抗体具有不超过5μg/ml、任选地不超过3μg/ml、不超过2μg/ml、不超过1μg/ml或不超过0.5μg/ml的EC50。
在一个方面，提供了在配体(HLA)结合区域(例如HLA结合槽)中或至少部分地在KIR3DL2蛋白的HLA结合面上结合KIR3DL2多肽的抗体。
优选地，在本文中的任意实施方案中，提供了结合在KIR3DL2多肽的D0结构域(SEQ ID NO:1的残基1-98)和/或D2结构域(SEQ ID NO:1的残基193-292)内的氨基酸残基的抗体。任选地，与对SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽的结合相比，所述抗体对具有在D0和/或D2结构域内的残基处的突变的KIR3DL2多肽的结合实质上减小。
在一个方面，所述抗体结合包含选自R13、P14、S15、H23、A25、Q27、I60和G62的1个、2个、3个、4个、5个或更多个残基(参考SEQ IDNO:1)的表位，和/或所述抗体具有减小的与具有在选自R13、P14、S15、H23、A25、Q27、I60和G62的残基处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。
在本文中为突变使用的速记符号是：野生型残基：在多肽中的位置，在SEQ ID NO:1中指定的残基的编号：突变体残基。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含KIR3DL2多肽的残基R13、A25和/或Q27的表位，和/或具有减小的与具有在残基R13、A25和/或Q27处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。例如，抗体可以具有减小的与具有突变R13W、A25T和/或Q27R的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位另外包含残基I60和/或G62(参考SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基I60和/或G62处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如I60N、G62S)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位额外地或可替换地包含残基P14、S15和/或H23(参考SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基P14、S15和/或H23处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如P14S、S15A、H23S)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位不包含残基R32和/或G33(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体不具有减小的与具有在残基R32和/或G33处的突变(参考SEQID NO:1，例如，R32H和/或G33R)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位不包含残基F50和/或R53(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体不具有减小的与具有在残基F50和/或R53处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，F50A、R53S)的KIR3DL2多肽的结合。所述抗体可以结合(例如阻断KIR3DL2-HLA B27和-HLA A3相互作用的抗体)或不结合(例如非内化抗体)残基Q56和/或E57、和/或残基F9和/或S11；因而，在一个实施方案中，任选地，所述表位不包含残基F9、S11、Q56和/或E57(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体不具有减小的与具有在残基F9、S11、Q56和/或E57处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，F9S和S11A、Q56S和E57A)的KIR3DL2多肽的结合；在另一个实施方案中，任选地，所述表位包含残基F9、S11、Q56和/或E57(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基F9、S11、Q56和/或E57处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，F9S和S11A、Q56S和E57A)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位不包含残基H29和/或F34(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体不具有减小的与具有在残基H29和/或F34处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，H29S、F34A)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位不包含残基F9和/或S11(参考SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体不具有减小的与具有在残基F9和/或S11处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，F9S、S11A)的KIR3DL2多肽的结合。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基I60和/或G62的表位，和/或具有减小的与具有在残基I60和/或G62处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。例如，抗体可以具有减小的与具有突变I60N和/或G62S的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位额外地或可替换地包含残基P14、S15和/或H23(参考SEQID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基P14、S15和/或H23处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如P14S、S15A、H23S)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述抗体不会结合KIR3DL2多肽的残基R13、A25和/或Q27，和/或不具有减小的与具有在残基R13、A25和/或Q27处的突变的KIR3DL2多肽(例如，具有突变R13W、A25T和/或Q27R的KIR3DL2多肽)的结合。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基P14、S15和/或H23的表位，和/或具有减小的与具有在残基P14、S15和/或H23处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如P14S、S15A、H23S)的KIR3DL2多肽的结合。
在一个方面，提供了具有减小的与以下多肽的结合的抗体：(1)具有在残基I60和/或G62处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如I60N、G62S)的KIR3DL2多肽，和(2)具有在残基P14、S15和/或H23处的突变(参考SEQ IDNO:1，例如P14S、S15A、H23S)的KIR3DL2多肽。
在一个方面，提供了结合表位的抗体，所述表位包含：(a)残基R13、A25和/或Q27中的1个、2个或3个，和(b)KIR3DL2多肽的残基I60和/或G62中的一个或两个。在一个方面，抗体具有减小的与具有以下突变的KIR3DL2多肽的结合：(a)在残基R13、A25和/或Q27中的1个、2个或3个处的突变，和(b)在残基I60和/或G62中的一个或两个处的突变。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基R78和/或L82的表位，和/或具有减小的与具有在残基R78和/或L82处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。例如，抗体可以具有减小的与具有突变R78H和L82P的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位额外地包含或排除残基K7、Y30、R31、P79、H80、S81、T83、G84、W85、S86和/或A87(参考SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体具有减小的与以下多肽的结合或不具有减小的与以下多肽的结合：具有在残基K7、Y30、R31、P79、H80、S81、T83、G84、W85、S86和/或A87处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽。在一个实施方案中，所述抗体结合这样的表位：所述表位包含在与KIR3DL2多肽(参考SEQID NO:1)的残基1-98对应的区段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7或更多个残基，任选地进一步其中所述表位包含残基K7、Y30、R31、R78、P79、H80、S81、L82、T83、G84、W85、S86和/或A87中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个)。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基W226的表位，和/或具有减小的与具有在残基W226处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位额外地包含残基I231和/或R246(参考SEQ ID NO:1)中的一个或多个，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基I231和/或R246处的突变(参考SEQ IDNO:1，例如，I231M、R246P)的KIR3DL2多肽的结合。任选地，所述表位额外地包含残基E239(参考SEQ ID NO:1)，和/或所述抗体具有减小的与具有在残基E239处的突变(参考SEQ ID NO:1，例如，E239G)的KIR3DL2多肽的结合。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基I231和/或R246的表位，和/或具有减小的与具有在残基I231和/或R246处的突变(参考SEQ ID NO:1)的KIR3DL2多肽的结合。
在一个方面，提供了这样的抗体：其结合包含KIR3DL2多肽的残基W226以及残基I231和/或R246中的一个或两个的表位。
在一个方面，抗体具有减小的与具有在残基W226处的突变以及在残基I231和/或R246中的一个或两个处的突变的KIR3DL2多肽的结合。
在本文中的任意实施方案中，所述抗体任选地不会造成KIR3DL2多肽在表达KIR3DL2的细胞中的内化，和/或不会被内化进表达KIR3DL2的细胞中。
在一个实施方案中，提供了结合KIR3DL2多肽的抗体，其中所述抗体可检测地减少(或消除)KIR3DL2与KIR3DL2的第一HLA天然配体之间的结合，但是不会可检测地减少(或消除)KIR3DL2与KIR3DL2的第二HLA天然配体之间的结合。
在一个实施方案中，所述抗体任选地可检测地减少KIR3DL2与KIR3DL2的HLA类别I配体(例如HLA-B27、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35和/或HLA-A2)之间的结合。
在一个实施方案中，所述抗体任选地可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间的结合，但是不会可检测地减少KIR3DL2与HLA-A3之间的结合。
在一个实施方案中，所述抗体任选地可检测地减少KIR3DL2与HLA-A3之间的结合，但是不会可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间的结合。
在一个实施方案中，所述抗体任选地不会可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间或KIR3DL2与HLA-A3之间的结合。
在一个实施方案中，所述抗体任选地是结合至少2种具有不同氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因)的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体任选地是不会实质上结合KIR3DL1多肽的抗体。
在本文中关于配体阻断抗体和/或关于结合包含KIR3DL2多肽的残基H32和/或G33的表位的抗体的实施方案中，所述抗体可以任选地造成KIR3DL2多肽在表达KIR3DL2的细胞中的内化和/或被内化进表达KIR3DL2的细胞中。
抗-KIR3DL2抗体可以用于治疗癌症、炎症性障碍和自身免疫障碍，例如在人受试者中。该抗体可以在与或不与毒性试剂或其它试剂偶联的情况下使用，取决于所述抗体的期望作用或用途。在一个实施方案中，所述抗-KIR3DL2抗体是“裸抗体”且未与毒性试剂偶联。在一个实施方案中，裸抗体或偶联的抗体包含重链，所述重链包含结合Fcγ受体(例如CD16)的Fc区(例如IgG1)。任选地，其中这样的抗体诱导针对表达KIR3DL2的细胞的补体依赖性的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)。
任选地，在任意实施方案中，抗体(例如IgG4、IgG1、抗体片段等)进一步包含毒性试剂(例如化学治疗剂)，其在抗体-毒素缀合物的内化后对细胞而言是毒性的。在一个实施方案中，所述抗体缀合至放射性试剂。
本公开内容进一步提供了特异性地结合人KIR3DL2的抗体、抗体片段和衍生物。本公开内容提供了这样的抗体组合物，以及它们在本文中公开的治疗、预防和诊断癌症、炎症性或自身免疫性障碍的任意方法中的用途。
在一个实施方案中，所述抗体对人KIR3DL2多肽具有小于10-8M、优选地小于10-9M或优选地小于10-10M的结合亲和力(KD)。任选地，亲和力表示二价结合。
在本文中的任意实施方案的一个方面，所述抗体可以具有重链和/或轻链，所述重链和/或轻链具有选自抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3和/或20E9的抗体的各个重链和/或轻链的一个、两个或三个CDR。
在本文中的任意实施方案的一个方面，所述抗体与单克隆抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3和/或20E9中的任意一种或任意组合竞争对KIR3DL2多肽的结合。在一个实施方案中，抗体与选自以下的抗体竞争对KIR3DL2多肽的结合：
在一个方面，本公开内容提供了特异性地结合KIR3DL2的单克隆抗体，其选自：
(a)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:4、5或6(HCDR1)、SEQ ID NO:7或8(HCDR2)和SEQ ID NO:9(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:10、11或12的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(b)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:15、16或17(HCDR1)、SEQ ID NO:18或19(HCDR2)和SEQ ID NO:20(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:10、21或22的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(c)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:25、26或27(HCDR1)、SEQ ID NO:28或29(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:31、32或33的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(d)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:36、37或38(HCDR1)、SEQ ID NO:39或40(HCDR2)和SEQ ID NO:41(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:42、43或44的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(e)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:47、48或49(HCDR1)、SEQ ID NO:50或51(HCDR2)和SEQ ID NO:52(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:53、54或55的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(f)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:58、59或60(HCDR1)、SEQ ID NO:61或62(HCDR2)和SEQ ID NO:63(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:64、65或66的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(g)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:172、173或174(HCDR1)、SEQ ID NO:175或176(HCDR2)和SEQ ID NO:177(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:178、179或180的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；和
(h)抗体，其具有：(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:183、184或185(HCDR1)、SEQ ID NO:186或187(HCDR2)和SEQ ID NO:188(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:189、190或191的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。
在一个方面，提供了特异性地结合KIR3DL2的抗体，其中所述抗体具有下述性能中的一种或多种(包括它们的任意组合，就这样的组合不会矛盾而言)：
(a)就结合KIR3DL2多肽而言，具有小于10-8M、优选地小于10-9M或优选地小于10-10M的Kd；
(b)结合与KIR3DL2多肽的残基1-98或残基193-292对应的区段中的至少一个残基；
(c)与抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3和/或20E9竞争对KIR3DL2多肽的结合；
(d)与或不与KIR3DL2的天然配体(例如HLA多肽HLA-A3、HLA-11和/或HLA-B27)竞争对KIR3DL2多肽的结合(例如在多肽相互作用测定中)；
(e)不会造成KIR3DL2多肽在表达KIR3DL2的细胞中的内化和/或不会内化进表达KIR3DL2的细胞中；
(f)会或不会抑制由KIR3DL2的天然配体(例如HLA多肽HLA-A3、HLA-11和/或HLA-B27)诱导的KIR3DL2信号传递；
(g)不会实质上结合KIR3DL1、KIR3DS1、KIR3DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DL3、KIR2DL1和/或KIR2DS4多肽；
(h)结合SEQ ID NO:160、1、161、163、165和/或166的KIR3DL2多肽(例如，等位基因*001、*002、*003、*005、*007和/或*008)中的1种、2种、3种、4种、5种或6种；
(i)结合包含KIR3DL2多肽的氨基酸残基R13、P14、S15、H23、A25、Q27、H32、G33、I60、G62、R78、L82、W226、I231和/或R246中的任意一种或多种的表位；和
(j)具有减小的与特定KIR3DL2多肽的结合，所述特定KIR3DL2多肽具有在KIR3DL2多肽的残基R13、P14、S15、H23、A25、Q27、H32、G33、I60、G62、R78、L82、W226、I231和/或R246中的一个或多个处的突变。
在本文中的任意实施方案中，抗体可以通过上面的(a)至(j)中的任意一种或多种特征来表征。
在一个实施方案中，所述抗体是人合适的。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的，例如含有非鼠的、任选地人类的恒定区。在一个实施方案中，所述抗体是人的或人源化的。在另一个实施方案中，所述抗体是小鼠抗体。
在本文中的任意实施方案的一个方面，所述抗体的同种型是IgG，任选地是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，所述抗体包含Fc结构域或属于被FcγR(例如FcγRIIIA)结合的同种型，例如IgG1或IgG3同种型的抗体。
在本文中的任意实施方案的一个方面，所述抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双体、单链抗体片段、或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体。在本文中的任意实施方案的一个方面，所述抗体不包含Fc结构域或属于基本上不被FcγR结合的同种型。在一个实施方案中，所述抗体属于IgG4或IgG2同种型。
任选地，这样的抗体此外是四聚体(2个重链和2个轻链)，且因而是二价的(例如IgG抗体)。
在某些实施方案中，所述抗体进一步包含毒性试剂。在一个实施方案中，所述包含毒性试剂的抗体能够直接地造成表达KIR3DL2的细胞的死亡。在一个实施方案中，所述抗体能够直接地诱导(例如在没有免疫效应细胞存在下)表达KIR3DL2的细胞的至少20％、30％、40％或50％的细胞死亡，例如在体外测定中。
在一个实施方案中，所述抗体能够诱导表达KIR3DL2的细胞的CDC和/或ADCC。在一个实施方案中，所述抗体能够诱导表达KIR3DL2的细胞(例如T细胞淋巴瘤细胞，得自SS患者或SS细胞系的细胞)的至少20％、30％、40％或50％的细胞裂解，在细胞毒性测定中。
在一个实施方案中，提供了试验抗-KIR3DL2抗体的方法，所述方法包括：使结合KIR3DL2多肽的抗体与表达KIR3DL2多肽的细胞接触，和评估所述抗体是否被内化进表达KIR3DL2的细胞中和/或所述抗体是否诱导和/或增加KIR3DL2多肽的细胞内内化，和如果抗体不会诱导和/或不会增加KIR3DL2多肽的细胞内内化，则选择所述抗体。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物受试者中生产结合KIR3DL2多肽的抗体的方法，任选地用于治疗癌症、炎症性或自身免疫性障碍，所述方法包括下述步骤：a)提供多个抗体，任选地用包含人KIR3DL2多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；b)确定所述多个抗体中的每一个是否能够结合1个、2个、3个、4个、5个或更多个不同KIR3DL2多肽等位基因(例如等位基因*001、*002、*003、*005、*007、*008、*009和/或*011)，任选地在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达、和(c))从所述多个抗体中选择(例如用于生产、开发、用在治疗中等)能够结合1个、2个、3个、4个、5个或更多个不同KIR3DL2多肽等位基因(例如等位基因*001、*002、*003、*005、*007、*008、*009和/或*011)的抗体，任选地在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。任选地，所述方法进一步包括：确定所述多个抗体中的每一个是否能够结合KIR3DL1多肽，和从所述多个抗体中选择能够结合所述KIR3DL1多肽的抗体。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物受试者中生产结合KIR3DL2多肽的抗体的方法，任选地用于治疗癌症、炎症性或自身免疫性障碍，所述方法包括下述步骤：a)提供多个抗体，任选地用包含人KIR3DL2多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；和b)从所述多个抗体中选择(例如用于生产、开发、用在治疗中等)这样的抗体：
(i)结合KIR3DL2多肽，但是不结合KIR3DL1多肽；和/或
(ii)(a)结合在与SEQ ID NO:1的成熟KIR3DL2多肽的残基99-192对应的区段中的至少一个残基，和/或结合残基R13、P14、S15、H23、A25、Q27、H32、G33、I60、G62、R78、L82、W226、I231和/或R246中的任意一个或多个(例如2个、3个、4个、5或更多个)，和/或具有减小的与具有在所述残基处的氨基酸置换的KIR3DL2多肽的结合，
或
(b)结合在与SEQ ID NO:1的成熟KIR3DL2多肽的残基1-98对应的区段中的至少一个残基，和/或结合残基R13、P14、S15、H23、A25、Q27、H32、G33、I60、G62、R78、L82、W226、I231和/或R246中的任意一个或多个(例如2个、3个、4个、5个或更多个)，和/或具有减小的与具有在所述残基处的氨基酸置换的KIR3DL2多肽的结合；和/或
(iii)不会内化进表达KIR3DL2的细胞中和/或不会诱导和/或增加KIR3DL2多肽的细胞内内化。
在一个方面，提供了抑制表达KIR3DL2的细胞的生物活性的方法，所述方法包括：使所述细胞在体外、离体或在体内与抗-KIR3DL2抗体接触。任选地，所述接触在有KIR3DL2的配体(例如HLA)、任选地表达KIR3DL2的配体(例如HLA)的细胞存在下进行。优选地，所述表达KIR3DL2的细胞是免疫细胞，例如T细胞或NK细胞、恶性T细胞或NK细胞、CD4 Th17细胞(例如，表达IL-23R和生产IL-17A的促炎CD4 T细胞)或表达生产IL-17A的促炎NK细胞。在一个实施方案中，提供了抑制表达KIR3DL2的生产IL-17A的T或NK细胞的生物活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与抗-KIR3DL2抗体在体外、离体或在体内接触。优选地，所述生物活性是活化、裂解活性、细胞因子(例如IL-17A)生产和/或细胞增殖。优选地，所述生物活性是配体诱导的(例如HLA诱导的)信号传递。在一个方面，提供了抑制表达KIR3DL2的细胞的生物活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与抗-KIR3DL2抗体在体外、离体或在体内接触。
在一个方面，提供了消除或减少表达KIR3DL2的细胞的方法，所述方法包括：使所述细胞与抗-KIR3DL2抗体在体外、离体或在体内接触。所述细胞可以是例如恶性T细胞或NK细胞、T细胞或NK细胞、CD4 Th17细胞(例如，表达IL-23R和生产IL-17A的促炎CD4 T细胞)或表达生产IL-17A的促炎NK细胞。
在一个方面，提供了使用本文中的抗-KIR3DL2抗体的治疗方法。所述抗体可以用作预防性或治疗性处理；在本文中的任意实施方案中，所述抗体的治疗有效量可以与抗体的预防有效量互换。在一个方面，提供了治疗具有癌症(例如T细胞淋巴瘤、CD4+或CD8+CTCL、塞扎里综合征(SS)、蕈样肉芽肿病(MF)、CD30+T细胞淋巴瘤)的患者的方法，所述方法包括：给所述患者施用药学有效量的本文描述的抗原结合化合物，其特异性地结合KIR3DL2多肽。在另一个实施方案中，提供了治疗患者的方法，所述患者具有至少部分地由表达KIR3DL2的T细胞介导的自身免疫障碍或炎症性障碍，所述方法包括：给所述患者施用药学有效量的本文描述的抗原结合化合物，其特异性地结合KIR3DL2多肽。
所述治疗方法和抗-KIR3DL2抗体可以与第二治疗剂联合地用于治疗个体，所述第二治疗剂包括免疫调节剂(例如化疗药物、抗炎药、肿瘤疫苗、结合肿瘤细胞上的肿瘤特异性抗原的抗体、诱导针对肿瘤细胞的ADCC的抗体、增强免疫应答的抗体、改善疾病的抗风湿药(DMARD)等)。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是抗-CD4抗体或抗-CD30抗体。
本公开内容进一步涉及用于选择受试者的方法，所述受试者具有对使用KIR3DL2拮抗剂(例如结合KIR3DL2多肽的抗体)的治疗做出应答的疾病，所述方法包括：确定所述受试者中的疾病相关细胞是否表达KIR3DL2受体，所述KIR3DL2受体的表达指示应答受试者。任选地，所述方法进一步包括给应答受试者施用结合KIR3DL2多肽的抗体(例如本发明的抗-KIR3DL2抗体)。在一个实施方案中，所述方法用于选择具有癌症的受试者，且所述疾病相关细胞是癌细胞。在一个实施方案中，所述方法用于选择具有炎症性或自身免疫性障碍的受试者，且所述疾病相关细胞是T细胞。
使用KIR3DL2-特异性的配体，可以确定KIR3DL2受体在所述疾病相关细胞中的表达。优选地，所述配体是抗体或片段或其衍生物。在一个方面，本发明提供了包含单克隆抗体的组合物和使用单克隆抗体的方法，所述单克隆抗体包括、但不限于特异性地结合人KIR3DL2的抗体片段和衍生物。
在另一个方面，提供了一种方法(例如，进行诊断测定、应答者测定等的方法)，所述方法包括：评估患者是否具有表达KIR3DL2多肽(例如被本文描述的抗体结合的KIR3DL2多肽(一个或多个KIR3DL2等位基因))的疾病相关细胞。所述方法可以包括，例如，从包含疾病相关细胞的患者得到生物样品，使所述疾病相关细胞与这样的抗体接触，和评估所述抗体结合疾病相关细胞。KIR3DL2是由疾病相关细胞表达的发现指示，所述患者具有以表达KIR3DL2的细胞为特征的病症，和/或适合用本文描述的抗-KIR3DL2抗体治疗。所述患者可以进一步用适合于以表达KIR3DL2的细胞为特征的特定疾病的治疗进行治疗。任选地，所述患者用抗-KIR3DL2抗体治疗。在一个实施方案中，所述方法用于选择具有癌症的受试者，且所述疾病相关细胞是癌细胞。在一个实施方案中，所述方法用于选择具有炎症性或自身免疫性障碍的受试者，且所述疾病相关细胞是T细胞。在一个实施方案中，所述与疾病相关细胞发生接触从而评估抗体是否结合疾病相关细胞的抗体是本文描述的抗体。
也提供了治疗患者的方法，所述方法包括：
a)确定所述患者是否具有表达KIR3DL2的病原性细胞，和
b)如果确定所述患者是具有表达KIR3DL2的病原性细胞的患者，则施用本公开内容的抗原结合化合物(例如，抗体)。
还提供了用于评估CTCL(分期疾病)的发展水平、从而允许评价在患者的某个身体隔室内存在的恶性CD4+CTCL细胞的比例(例如百分比)的方法。根据该方法，使从所述身体隔室收集的生物样品的细胞与本公开内容的抗-KIR3DL2抗体接触，并测量在它们的表面处表达KIR3DL2多肽的CD4+细胞的比例。在所述身体隔室中实际存在的CD4+CTCL细胞的比例可以视作与所述测量的比例基本上相等，例如，在该测量比例附近的±10％范围内。
还提供了用于CTCL诊断的方法，所述方法包括：使得自个体的生物样品的细胞与本公开内容的抗-KIR3DL2抗体接触，并测量在它们的表面处表达KIR3DL2多肽的T细胞的比例(例如百分比)，并且将这样的比例与在非-CTCL人类(优选地在健康人类中)中观察到的在它们的表面处表达KIR3DL2多肽的T细胞的平均比例(例如百分比)进行对比，其中当所述测量的比例显著高于所述平均比例时，做出CTCL-阳性的诊断。
可以在本文别处进一步描述本发明的这些和其它有利的方面和特征。
附图说明
图1显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体1”、“突变体2”、“突变体3”和“突变体6”的突变氨基酸残基，其(以不同的组合)导致抗体结合的丧失。
图2显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体1”、“突变体2”和“突变体3”的突变氨基酸残基，突变体1、2和6(以不同的组合)导致抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5和13H1的结合的丧失，在阴影中显示了邻近残基的残基(F9、S11、P14、F34和/或S140邻近突变体2，且G21、G22、H23、E57、S58、F59、P63和/或H68邻近突变体1)。
图3显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的每个面的视图，显示了被指示为“突变体6”的突变氨基酸残基，其导致抗体5H1的结合的丧失，显示了不会导致结合丧失的“突变体3”。也在阴影中显示了邻近突变体6附近的残基的残基，其也可以被抗体(K7、Y30、R31、P79、H80、S81、T83、G84、W85、S86和/或A87)结合。
图4显示了KIR3DL2多肽(包括在D2结构域(D1/D2连接部)内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体14”(抗体1C3和20E9丧失对它的结合)以及“突变体12”和“突变体17”(其没有造成抗体结合的丧失)的突变氨基酸残基；也在阴影中显示了邻近残基的残基(Q201、K202、P203、S204、S224、S225、S227、S228、N252、R253和/或T254邻近突变体14)。
图5显示了KIR3DL2多肽(包括在D2结构域(D1/D2连接部)内的部分)的视图，显示了指示为“突变体15”(抗体20E9丧失对其的结合)的突变氨基酸残基；也在阴影中显示了邻近突变体14附近的残基(D230、I231、R244、L245、R246、A247、V248、S275、R277和/或P280)的残基。
图6显示了抗体的介导CDC的能力；结合D0结构域的抗-KIR3DL2mAb以灰色显示，结合D1结构域的那些以黑色显示，表明利用亲本鼠mAb，mAb的同种型对CDC具有最突出的影响。
图7表明，KIR3DL2在结合后的内化完全废除mo19H12的用补体募集杀死B221-KIR3DL2的能力，而在限制内化的温度条件下，清楚地观察到mo19H12的CDC活性。
图8显示了嵌合的抗-KIR3DL2 mAb在体外介导针对B221-KIR3DL2的CDC的能力。
图9显示了在相同终浓度(10μg/ml)试验的一系列抗-KIR3DL2 mAb通过ADCC介导的机制杀死原型Sezary细胞系HUT78的能力。
图10显示了抗-KIR3DL2 mAb的ADCC介导的杀死KIR3DL2-转染的B221细胞的能力。以灰色显示的mAb诱导受体的内化，且有效性似乎低于不会诱导KIR3DL2内化的其它4种mAb。
图11显示了抗体在剂量范围实验中的对比，嵌合的huIgG1抗-KIR3DL2mAb的介导针对表达KIR3DL2的B221靶标的ADCC的能力。
图12显示了实验(n＝6只NOD-SCID小鼠/组)的结果，其中试验了3种IgG2b同种型鼠抗-KIR3DL2 9E10和19H12针对SC B221-KIR3DL2异种移植物的效力。与PBS和内化性的抗-D1抗体19H12相比，非内化性的抗-D0抗体9E10表现出增加的存活。
图13显示了另一个实验(n＝6只NOD-SCID小鼠/组)的结果，其中试验了鼠抗-KIR3DL2 19H12针对SC RAJI-KIR3DL2异种移植物的效力。在体外，KIR3DL2-转染的RAJI细胞在mAb结合后表现出比B221-KIR3DL2或Sezary细胞系更少的内化。在RAJI-KIR3DL2异种移植物模型中，mo19H12 mAb比在B221-KIR3DL2模型中更有效。这是由于靶标在体内的更少有效内化。
图14显示了KIR3DL2 D0结构域抗体抑制HLA-A3和B27重链二聚体(B272)结合。代表性的FACS染色显示了抗KIR3DL2 D0抗体对HLA-A3和B272四聚体与KIR3DL2转导的Baf3细胞的结合的影响(三个独立实验中的一个的代表)。
图15显示了KIR3DL2抗-D1和抗-D2(1C3抗体)结构域抗体抑制HLA-A3结合，但是不抑制B27重链二聚体(B272)结合。代表性的FACS染色显示了抗KIR3DL2 D1/D2抗体对HLA-A3和B272四聚体与KIR3DL2转导的Baf3细胞的结合的影响(三个独立实验中的一个的代表)。
图16A显示了KIR3DL2 D0结构域抗体抑制HLA-A3和B27重链二聚体四聚体结合。图16B.抗-D2(1C3)结构域mAb抑制HLA-A3四聚体结合，但是不会抑制B27重链二聚体(B272)结合。将结果表示为在有同种型对照MAb存在下的四聚体染色的百分比。
图17显示了KIR3DL2 D0结构域抗体会(但是D1/D2结构域抗体不会)抑制用表达HLA-B27的B细胞系(221B27)刺激的KIR3DL2 CD3e报告细胞的IL-2分泌。D0抗体抑制用表达对照HLA类别1的B细胞系刺激的报告细胞的IL-2生产，达到与用HLA-B27刺激的细胞相比更小的程度。得自三个独立实验之一的IL-2生产的代表性ELISA。
图18显示了KIR3DL2多肽等位基因*001的视图，包括与具有在D0结构域内的置换I60N和G62S的突变体2对应的抗体结合位点(例如，抗体2B12、10F6、18C10、10G5和13H1的结合位点)。在该图中也显示了KIR3DL2等位基因*001与等位基因*002、*004、*006/*007、*008和*009之间的氨基酸差异。
图19显示了KIR3DL2多肽等位基因*001的一个替代视图，包括与具有在D0结构域内的置换I60N和G62S的突变体2对应的抗体结合位点。在该图中也显示了KIR3DL2等位基因*001与等位基因*005和*003/*011之间的氨基酸差异。
图20显示了KIR3DL2多肽等位基因*001的两个替代(前和后)视图，包括与具有在D0结构域内的置换I60N和G62S的突变体2对应的抗体结合位点。在该图中也显示了KIR3DL2等位基因*001与等位基因*004之间的氨基酸差异。
具体实施方式
前言
本公开内容的抗体能够直接地和特异性地靶向表达KIR3DL2的细胞，特别是CD4+、KIR3DL2+T细胞，而不靶向其它细胞诸如KIR3DL1+细胞(或KIR3DL2+KIR3DL1+细胞、KIR3DS1+细胞；或KIR3DS1KIR3DL2+细胞)，并且不会内化进KIR3DL2+细胞中。还提供了抑制或不抑制KIR3DL2的天然配体的结合(或配体诱导的KIR3DL2信号传递)的抗体。本公开内容提供了许多具有这样的性能的抗体，并且所述抗体彼此竞争对KIR3DL2+的特定区域的结合，所述特定区域包括分别由SEQ ID NO:1的成熟KIR3DL2多肽的氨基酸残基1-98和残基193-292限定的结构域0和2。
KIR3DL2(CD158k)是3个约140kD的Ig结构域分子的二硫键连接的同源二聚体，描述于Pende等人(1996)J.Exp.Med.184:505-518中，其公开内容通过引用并入本文。KIR3DL1(CD158e1)是约70kD的单体分子，描述于Colonna和Samaridis(1995)Science 268(5209),405-408中；HLA结合槽已经描述于Vivian等人(2011)Nature 479:401-405中。KIR3DL2的天然配体尤其包括HLA-A和HLA-B多肽，特别是HLA-A3和HLA-A11(参见Hansasuta等人(2004)Eur.J.Immunol.34:1673-1679和HLA-B27.HLA-B27(关于HLA-B27基因的组构、序列和表达，参见，例如，Weiss等人(1985)Immunobiology 170(5):367-380，且关于HLA-B27多聚体和HLA-B272同源二聚体，参见Allen等人(1999)J.Immunol.162:5045-5048和Kollnberger等人(2007)Eur.J.Immunol.37:1313-1322。所有以上参考文献的公开内容通过引用并入本文。本文中使用的“KIR3D”个别地或共同地表示任何KIR3D受体(例如KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DS1)，且术语“KIR3D”可以被术语“KIR3DL1、KIR3DL2和/或KIR3DS1”替换。类似地，“KIR3DL”个别地或共同地表示任意KIR3DL受体(例如KIR3DL1、KIR3DL2)，且术语“KIR3DL”可以被术语“KIR3DL1和/或KIR3DL2”替换。此外，术语“KIR3D”、“KIR3DL”、“KIR3DL1”、“KIR3DL2”、“KIR3DS1”各自包括它们表示的KIR3D基因或编码的蛋白的任意变体、衍生物或异形体。已经报道了KIR3D多肽(例如KIR3DL2)的几种等位基因变体，这些中的每一种被各个术语包括。成熟的人KIR3DL2(等位基因*002)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1中，其对应于Genbank登记号AAB52520(其中21个氨基酸残基前导序列已经被省略)且对应于IPD KIR数据库(由EMBL-EBI出版，欧洲生物信息学研究所,英国)登记号KIR00066。KIR3DL2(等位基因*002)的cDNA显示在Genbank登记号U30272中。人KIR3DL2等位基因*002的前体氨基酸序列(包括前导序列)显示在SEQ ID NO:159中，其对应于Genbank登记号AAB52520。人KIR3DL2等位基因*001的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:160中，其对应于IPD KIR数据库登记号KIR00065。人KIR3DL2等位基因*003的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:161中，其对应于Genbank登记号AAB36593和IPD KIR数据库登记号KIR00067。人KIR3DL2等位基因*004的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:162中，其对应于IPD KIR数据库登记号KIR00068。人KIR3DL2等位基因*005的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:163中，其对应于IPD KIR数据库登记号KIR00069。人KIR3DL2等位基因*006(成熟的)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:164中，其对应于Genbank登记号AAK30053和IPD KIR数据库登记号KIR00070。人KIR3DL2等位基因*007(成熟的)的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:165中，其对应于Genbank登记号AAK30052和IPD KIR数据库登记号KIR00071。人KIR3DL2等位基因*008的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:166中，其对应于Genbank登记号AAK30054和IPD KIR数据库登记号KIR00072。人KIR3DL2等位基因*009的氨基酸序列显示在SEQ IDNO:167中，其对应于IPD KIR数据库登记号KIR00457。人KIR3DL2等位基因*011的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:168中，其对应于IPD KIR数据库登记号KIR00544。编码KIR3DL1(CD158e2)多肽(等位基因*00101)的cDNA显示在Genbank登记号L41269中；编码的氨基酸序列显示在SEQ IDNO:169中，其对应于Genbank登记号AAA69870。在前导序列存在于描述KIR3DL2多肽序列的特定SEQ ID NO(例如SEQ ID NO:1和159-168)中的情况下，在本文中对氨基酸残基位置的任何提及是指成熟的KIR3DL多肽。
提供了使用抗原结合化合物的方法；例如，用于抑制细胞增殖或活性的方法，用于将分子(例如毒性分子、可检测的标志物等)递送进细胞中的方法，用于靶向、鉴别或纯化细胞的方法，用于减少、杀死或消除细胞的方法，用于减少细胞增殖的方法，所述方法包括：将细胞(诸如表达KIR3DL多肽的T细胞)暴露于本公开内容的结合KIR3DL2多肽的抗原结合化合物。应当理解，为了本公开内容的目的，“细胞增殖”可以表示细胞的生长或增殖的任何方面，例如，细胞生长、细胞***，或细胞周期的任何方面。所述细胞可以是在细胞培养物中(在体外)或在哺乳动物中(体内)，例如遭受表达KIR3DL2的病理学的哺乳动物。也提供了用于诱导细胞的死亡或抑制表达KIR3DL2多肽的细胞的增殖或活性的方法，所述方法包括：以有效地诱导细胞的死亡和/或抑制细胞的增殖的量，将细胞暴露于抗原结合化合物，所述化合物结合与毒性试剂连接的KIR3DL2多肽。因而，提供了用于治疗遭受增生性疾病和以表达KIR3DL2多肽的细胞的病原性繁殖或活化为特征的任何病症的哺乳动物的方法，所述方法包括：将药学有效量的本文中公开的抗原结合化合物施用给哺乳动物。这样的病症的例子包括塞扎里综合征、蕈样肉芽肿病、CTCL和自身免疫或炎性病症，例如关节炎、心血管疾病。优选地，这样的病原性地膨胀的细胞表达KIR3DL2，但是不会显著地表达KIR3DL1(例如不超过20％、40％、50％或60％的病原性细胞表达KIR3DL1，这些病症特别地受益于选择性的抗体。
使用本公开内容的方法和组合物，可以治疗或诊断几种表达KIR3DL2的障碍，特别是T和NK细胞介导的障碍。所述障碍可以是例如CD4+T细胞恶性肿瘤诸如CTCL、MF或SS，或自身免疫障碍或炎症性障碍，其中消除或抑制T和/或NK细胞的活性和/或增殖将是有用的。CD4+T细胞包括例如活化的CD4+T细胞、Th17T细胞、表达或不表达一种或多种其它标志物(例如CD2+、CD3+、CD5+、CD8-、CD28+、CD28-、CD45RO+和TCRαβ+)的CD4+T细胞。例如，已知CD4+CD28-T细胞能够表达KIR3DL2且在某些自身免疫障碍和炎症性障碍中以高频率存在于克隆繁殖的细胞中，但是在健康的个体中是罕见的。这些T细胞可以是细胞毒性的，分泌大量IFN-γ，并且在用自体固有的单核细胞刺激后繁殖。
本公开内容的抗体具有以下优点：结合不同的KIR3DL2等位基因，从而允许广泛地用于治疗、表征和诊断疾病。已经报道皮肤和循环MF/SS细胞不表达试验的9个KIR3DL2等位基因中的优先等位基因。迄今为止还已经描述了13个等位基因。而p140-KIR3DL2受体在NK细胞的微小子集上和在健康人的罕见CD8+T细胞上表达，它似乎限于MF/SS患者中的CTCL肿瘤CD4+T细胞。在NK细胞的表面处经常观察到的其它受体(诸如p58.1、p58.2、p70KIRs、CD94/NKG2A)未在恶性CD4+T细胞的表面处发现(BahlerD.W.等人,(2008)Cytometry B Clin Cytom.74(3):156-62)。除了CD4+以外，通常还通过具有成熟的T淋巴细胞表型、CD2+、CD3+、CD5+、CD8-、CD28+、CD45RO+和TCRαβ+来表征SS细胞。
通过消除表达KIR3DL2的细胞和/或通过抑制表达生物活性KIR3DL2的细胞(即通过阻断由它的天然配体诱导的KIR3DL2信号传递)，本公开内容的方法和组合物可以用于治疗以KIR3DL2表达为特征的自身免疫病症和炎性病症。抑制表达生物活性KIR3DL2的细胞可以包括：例如，减少表达KIR3DL2的细胞的增殖，降低表达KIR3DL2的细胞对靶细胞的反应性或细胞毒性，减少表达KIR3DL2的细胞的活化、活化标志物(例如CD107表达)和/或细胞因子产生(例如，IFNγ产生)，和/或降低这样的活化的、反应性的、细胞毒性的和/或活化的表达KIR3DL2的细胞的体内频率。
例如，已经证实，几种这样的障碍至少部分地由CD4+T细胞(包括特定CD4+CD28null T细胞)介导。通常认为CD4+T细胞的活化由刺激性受体和抑制性受体之间的相互作用控制，其中刺激信号的优势有利于自身免疫反应。Chan等人((2005)Arthrit.Rheumatism 52(11):3586-3595报道称，增加数目的外周血和滑液CD4+T细胞和NK细胞会在椎关节炎中表达KIR3DL2。在具有类风湿性关节炎的患者中，关键性共刺激分子CD28的表达经常丧失。相反，缺少CD28的CD4+T细胞群体(CD4+CD28-T细胞)会表达杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)。尤其已经报道，CD4+CD28nullT细胞表达KIR3D多肽。与它们的CD28+相应物相比，CD4+CD28-细胞产生显著更高水平的IFN-γ，从而给它们赋予充当促炎症细胞的能力。CD4+CD28nullT细胞克隆在循环中存续数年。已知这些T细胞与CD28+T细胞的不同之处在于，在CD3交联后耐受Fas介导的细胞凋亡。CD28nullT细胞进展穿过细胞周期，并且处于细胞周期的所有阶段的细胞耐受细胞凋亡，这不像它们的CD28+相应物。已经证实，CD4+CD28nullT细胞中的细胞凋亡途径的调节异常有利于它们的克隆生长晕和体内维持。Namekawa等人((2000)J.Immunol.165:1138-1145报告称，KIR(包括KIR3DL2)存在于在类风湿性关节炎中繁殖的CD4+CD28null T细胞上。类风湿性关节炎涉及淋巴细胞浸润、炎症介质以及由成纤维细胞样滑膜细胞和巨噬细胞的侵袭性增殖引起的滑液增生。关节侵蚀的预后和疾病严重程度与克隆繁殖的CD4+CD28-T细胞的高频率有关。Lamprecht等人(2001)Thorax 56:751-757报道了CD4+CD28-T细胞在韦格纳氏肉芽肿病中的募集。Markovic-Plese等人(2001)J Clin Invest.108:1185-1194报道了CD4+CD28-共刺激非依赖性的T细胞在CNS中的存在和它们与多发性硬化的关联。因此，所述方法和组合物可以用于治疗或预防韦格纳氏肉芽肿病、多发性硬化或其它中枢神经***炎症性或自身免疫性障碍、关节炎或其它以炎症为特征的风湿病。
还已经将CD4+CD28-T细胞与心血管病症关联。Betjes等人(2008)Kidney International 74,760-767报道称，动脉粥样硬化性疾病在具有巨细胞病毒(CMV)血清阳性的患者中的高风险与年龄依赖性的CD4+CD28-T细胞增加有关，所述T细胞可以包含个体中超过半数的循环CD4 T细胞。据报道，超过50岁的患者具有与CMV血清阴性的患者相比高50倍的CD4+CD28-T细胞百分比和与血清阳性的健康对照相比高5倍的百分比。Nakajima等人((2003)Circ.Res.93:106-113)报道了KIR在急性冠状动脉综合征中的从头表达，其中得自具有急性冠状动脉综合征(ACS)的患者的CD4+T细胞表达多种KIR，而得自健康供体的正常CD4+CD28null T细胞不表达KIR。Yen等人.Journal of Experimental Medicine,第193卷,第10期,2001年5月21日，1159-1168通过RT-PCR研究了从具有风湿样血管炎的患者建立的CD4+CD28nullT细胞克隆对抑制性的和刺激性的KIR的表达。在具有类风湿性关节炎的患者和具有ACS的患者中，表达谱有利于抑制性的KIR，包括KIR3DL2，而刺激性受体的表达高度限于KIR2DS2。因此，所述方法和组合物可以用于治疗或预防特征在于炎症的心血管病症，例如ACS、动脉粥样硬化性疾病、风湿样血管炎。
Bowness等人(2011)J.Immunol.186:2672-2680报道称，KIR3DL2+CD4T细胞占外周血CD4 T细胞的IL-23R表达的大多数，并且这样的Th17型的KIR3DL2+细胞在有IL-23存在下产生更多的IL-17。尽管KIR3DL2+细胞构成SpA患者的外周血中的仅15％的CD4 T的平均值，与对照受试者相比，该子集占在SpA患者中观察到的Th17数目的增加的70％。与得自对照的KIR3DL2+系或KIR3DL2-CD4 T细胞相比，得自SpA患者的TCR-刺激的外周血KIR3DL2+CD4 T细胞系分泌多4倍的IL-17。
提供了生产和使用抗体和其它化合物的方法，所述抗体和其它化合物适合用于治疗障碍(例如癌症、炎症性和自身免疫性障碍)，其中消除表达KIR3DL2的细胞将是有用的。包括抗体、抗体衍生物、抗体片段和生产它们的细胞，也包括生产它们的方法以及使用所述抗体和化合物治疗患者的方法。
因为本发明的抗体对于KIR3DL2是特异性的，它们可以用于多种目的，包括纯化KIR3DL2或表达KIR3DL2的细胞，在体外、离体或在体内调节(例如，活化或抑制)KIR3DL2受体，靶向表达KIR3DL2的细胞以进行体内破坏，或在体内、离体或在体外地特异性地标记/结合KIR3DL2，包括用于多种方法诸如免疫印迹法、IHC分析(即在冰冻活组织检查上)、FACS分析和免疫沉淀。
定义
在本说明书中使用的“一个”或“一种”可以是指一个/种或多个/种。如在权利要求书中使用的，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”可以是指一个/种或超过一个/种。本文中使用的“另一个/种”可以至少是指第二个/种或更多个/种。
在使用“包含”的情况下，这可以优选地被“基本上由......组成”替代，更优选地被“由......组成”替代。
关于抗-KIR3DL2结合剂(例如抗体)，“增生性疾病的治疗”或“肿瘤的治疗”或“癌症的治疗”等包括、但不限于：(a)治疗增生性疾病的方法，所述方法包括下述步骤：以允许治疗所述疾病的剂量(治疗有效量)，例如，以在上文中和在下文中规定的剂量(量)，给需要这种治疗的温血动物(特别是人)施用(对于至少一次治疗)抗-KIR3DL2结合剂(例如，在药学上可接受的载体材料中)；(b)抗-KIR3DL2结合剂用于治疗增生性疾病的用途，或用于所述治疗(特别是在人类中)的抗-KIR3DL2结合剂；(c)抗-KIR3DL2结合剂用于制备治疗增生性疾病的药物制剂的用途，使用抗-KIR3DL2结合剂制备治疗增生性疾病的药物制剂的方法，所述方法包括将抗-KIR3DL2结合剂与药学上可接受的载体混合，或适合用于治疗增生性疾病的包含有效剂量的抗-KIR3DL2结合剂的药物制剂；或(d)a)、b)和c)的任意组合，其根据提交本申请的国家可允许专利保护的主题。在提及特定疾病(例如，炎症性疾病或自身免疫性疾病)或特定肿瘤(例如CTCL)来替代“增生性疾病”的情况下，也包括类别a)至e)，这意味着，可以将各种疾病填在上面的a)至e)下面来替代“增生性疾病”，根据可专利保护的主题。
本文中使用的术语“癌症”和“肿瘤”被定义为构成失控的和进行性的繁殖的细胞或组织的新生长。在一个具体实施方案中，在天然进程后，癌症是致命的。在具体实施方案中，癌症是侵袭性的、转移性的和/或间变性的(丧失分化和丧失向另一种和向它们的轴框架的取向)。
“自身免疫”障碍包括这样的任意障碍、病症或疾病：其中免疫***引起针对自身细胞或组织的反应，这归因于将自身与非自身区分开或相反的能力的破坏。自身免疫障碍的例子包括类风湿性关节炎、风湿样血管炎、***性红斑狼疮、多发性硬化、韦格纳坏死性肉芽肿病、椎关节炎和其它。“炎症性障碍”包括以不希望的免疫应答为特征的任何障碍。自身免疫障碍和炎症性障碍可以涉及免疫***的任何组分，并且可以靶向体内的任何细胞或组织类型。
本文中使用的术语“活组织检查”被定义为，为了检查的目的，诸如为了建立诊断，从器官(例如，关节)取出组织。活组织检查的类型的例子包括：通过施加抽吸，诸如通过连接至注射器的针头；通过器械取出一块组织；通过穿过内窥镜用适当的器械取出；通过外科手术切除，诸如整个病灶；等。
本文中使用的术语“抗体”表示多克隆抗体和单克隆抗体。取决于重链中恒定结构域的类型，可以将抗体指定为以下五个大类之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的几个被进一步分成亚类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。一种示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端限定约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别表示这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。IgG和/或IgM是本文中采用的优选的抗体类别，其中IgG是特别优选的，因为它们是在生理状况下最常见的抗体，并且因为它们在实验室条件下最易于制备。优选地，所述抗体是单克隆抗体。特别优选地是人源化的、嵌合的、人类的、或在其它方面人类合适的抗体。“抗体”还包括本文中描述的任何抗体的任何片段或衍生物。
术语“特异地结合”是指，抗体在竞争性结合测定中可以优选地与结合配偶体(例如KIR3DL2)结合，如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其它方法在下面进一步描述，并且是本领域众所周知的。
当抗体被描述成与特定单克隆抗体(例如10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9)“竞争”时，是指在使用重组KIR3DL2分子或表面表达的KIR3DL2分子的结合测定中，所述抗体与所述单克隆抗体竞争。例如，如果试验抗体在结合测定中减少了10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9与KIR3DL2多肽或表达KIR3DL2的细胞的结合，则所述抗体被描述成分别与10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9“竞争”。
本文中使用的术语“亲和力”是指抗体与表位的结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，所述解离常数Kd被定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为1/Kd。用于确定mAb的亲和力的方法的例子可以在以下参考文献中找到：Harlow,等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988),Coligan等人,编,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993),和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，所述参考文献通过引用整体并入本文。本领域众所周知的用于确定mAb的亲和力的一种标准方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(诸如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)。
本文中使用的“决定簇”表示多肽上的相互作用或结合的位点。
术语“表位”表示抗原决定簇，并且是抗原上的抗体所结合的地方或区域。蛋白表位可以包含直接涉入结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效地阻断的氨基酸残基(即在抗体“足迹”内的氨基酸残基)。复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域可以与例如抗体或受体结合。表位可以是直链的或构象性的/结构性的。术语“直链表位”被定义为由多个氨基酸残基组成的表位，所述氨基酸残基在氨基酸的直链序列(一级结构)上是邻接的。术语“构象表位或结构表位”被定义为由氨基酸残基构成的表位，所述氨基酸残基不全是邻接的，并且因此代表通过分子折叠(二级、三级和/或四级结构)而彼此邻近的氨基酸的线性序列的分离的部分。构象表位依赖于三维结构。因此，术语“构象性的”经常与“结构性的”互换使用。
当提及KIR3DL2多肽和/或与其结合的抗体时，术语“细胞内内化”或“内化”表示与分子从细胞的细胞外表面向细胞的细胞内表面转移的过程有关的分子、生化和细胞事件。负责分子的细胞内内化的过程是众所周知的，且可以尤其涉及以下物质的内化：细胞外分子(诸如激素、抗体和小有机分子)；膜相关的分子(诸如细胞表面受体)；和与细胞外分子结合的膜相关的分子的复合物(例如，与跨膜受体结合的配体或与膜相关的分子结合的抗体)。因而，“诱导和/或增加细胞内内化”包括这样的事件：其中细胞内内化被开启和/或细胞内内化的速率和/或程度增加。
关于表达KIR3DL2的细胞，术语“减少”是指这样的过程、方法或化合物：其可以杀死、消除、裂解或诱导这样的杀死、消除或裂解，从而负面地影响存在于样品中或受试者中的表达KIR3DL2的细胞的数目。
术语“试剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或从生物学材料制备的提取物。术语“治疗剂”表示具有生物活性的试剂。
术语“毒性试剂”和“细胞毒性试剂”包括这样的任意化合物：其可以减慢、停止或逆转细胞的增殖，以任何可检测的方式降低它们的活性，或直接地或间接地杀死它们。优选地，细胞毒性试剂主要通过直接地干扰细胞的功能而造成细胞死亡，且包括、但不限于：烷化剂、肿瘤坏死因子抑制剂、嵌入剂、微管抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。本文中使用的“毒性净荷”表示足够量的细胞毒性试剂，其当递送至细胞时导致细胞死亡。毒性净荷的递送可以如下实现：施用足够量的包含抗体或抗原结合片段和细胞毒性试剂的免疫缀合物。毒性净荷的递送还可以如下实现：施用足够量的包含细胞毒性试剂的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含识别和结合抗体或抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段。
为了本文中的目的，“人源化”或“人”抗体表示这样的抗体：其中将一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)融合。这样的抗体被设计成保持衍生出所述结合区的非人抗体的结合特异性，但是却避免针对非人抗体的免疫反应。这样的抗体可以从转基因小鼠或其它动物得到，所述转基因小鼠或其它动物已经被“工程化”以产生响应于抗原激发的特异性人抗体(参见，例如，Green等人(1994)Nature Genet 7:13；Lonberg等人(1994)Nature 368:856；Taylor等人(1994)Int Immun 6:579，其全部教导通过引用并入本文)。还可以通过遗传学方法或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建全人抗体，所有这些技术是本领域已知的(参见，例如，McCafferty等人(1990)Nature 348:552-553)。还可以通过体外活化的B细胞来产生人抗体(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，它们通过引用整体并入)。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子：其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变类别的效应子功能和/或物质的恒定区、或给嵌合抗体提供新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区来改变、替换或交换。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”表示抗体重链的C-端片段，例如，人γ(γ)重链或它在其它类型的抗体重链中的相应物序列(例如，对于人抗体而言，α、δ、ε和μ)的约氨基酸(aa)230至约氨基酸450，或它的天然存在的同种异型。除非另外指出，否则贯穿本公开内容使用通常接受的针对免疫球蛋白的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991)Sequences of Protein ofImmunological Interest,第5版,United States Public Health Service,NationalInstitute of Health,Bethesda,MD)。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域中充分理解的术语，且表示这样的细胞介导的反应：其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒性的细胞识别靶细胞上的结合的抗体，并随后造成所述靶细胞的裂解。介导ADCC的非特异性的细胞毒性的细胞包括天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”表示实质上或基本上不含有如在其天然状态中所发现的通常伴随它的组分的物质。通常使用分析化学技术(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定纯度和同质性。作为在制剂中存在的优势物质的蛋白是基本上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语“重组体”指示，所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白，或改变天然核酸或蛋白而进行了修饰，或所述细胞从这样修饰的细胞衍生出。因而，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达否则异常地表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。
术语“修饰”当表示氨基酸的序列时(例如，“氨基酸修饰”)，是指多肽序列中的氨基酸置换、***和/或缺失。“修饰”或“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸置换、***和/或缺失。“氨基酸置换”或“置换”在本文中是指用另一个氨基酸替换蛋白序列中的给定位置处的氨基酸。例如，置换P14S表示亲本多肽的变体，其中用丝氨酸替换在位置14处的脯氨酸。多肽的“变体”表示具有与参照多肽(通常是天然或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可以具有在天然氨基酸序列内的某些位置处的一个或多个氨基酸置换、缺失和/或***。
本文中使用的“T细胞”表示在胸腺中成熟的淋巴细胞亚群，且其在它们的表面上展示其它分子T细胞受体。借助于某些特征和生物学特性，诸如特定表面抗原(包括TCR、CD4或CD8，任选CD4和IL-23R)的表达，某些T细胞的杀死肿瘤或受感染的细胞的能力，某些T细胞的活化免疫***的其它细胞的能力，和释放刺激或抑制免疫应答的蛋白分子(被称作细胞因子)的能力，可以鉴别T细胞。使用本领域众所周知的方法，这些特征和活性中的任一种可以用于鉴别T细胞。本文中使用的“有活性的”或“活化的”T细胞是指生物活性的T细胞，更具体地是具有细胞裂解或刺激免疫应答的能力的T细胞(例如，通过分泌细胞因子)。可以在许多众所周知的方法中的任一种中检测有活性的细胞，所述方法包括功能测定和基于表达的测定，诸如细胞因子诸如TNF-α或IL-17A的表达。
本文中使用的术语“结合”多肽或表位的抗体是指以特异性和/或亲和力结合所述决定簇的抗体。
抗体和表位
公开的抗体是结合人KIR3DL2的抗体。在一个实施方案中，所述抗体选择性地结合KIR3DL2(例如1个、2个、3个、4个或更多个最优势的KIR3DL2等位基因)且不结合KIR3DL1(例如1个、2个、3个、4个或更多个最优势的KIR3DL1等位基因)。在一个实施方案中，所述抗体结合KIR3DL2的D0结构域，该结构域对应于SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的氨基酸残基1-98。在一个实施方案中，所述抗体结合KIR3DL2的D2结构域或跨SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的D1和D2结构域(在D1和D2结构域的边界处)的区域。在一个实施方案中，所述抗体对人KIR3DL2具有以小于10-9M、优选地小于10-10M的KD为特征的亲和力。
在另一个实施方案中，所述抗体结合与抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9基本上相同的表位。在另一个实施方案中，所述抗体至少部分地重叠或包括在与SEQ ID NO:1(或其子序列)的KIR3DL2多肽的残基1-98或残基193-292对应的区段中的至少一个残基。在一个实施方案中，所述表位的所有关键残基是在与残基1-98对应的区段中。在一个实施方案中，所述抗体结合存在于D1结构域中的残基以及存在于D2结构域中的残基；任选地一个或多个关键残基是在D1(残基99-192)和D2结构域(残基193-292)的边界处。在一个实施方案中，所述抗体结合这样的表位：其包含在与SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽的残基1-98、99-292、99-192或193-292对应的区段中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基。优选地，所述抗体结合的残基存在于KIR3DL2多肽的表面上。
在一个实施方案中，所述抗体结合包含残基R13、A25和/或Q27的表位。任选地，所述抗体结合包含残基R13、A25和/或Q27、以及残基I60和/或G62的表位。任选地，所述抗体不结合残基H32和/或H33。任选地，所述抗体进一步结合残基Q56和/或E57。
在一个实施方案中，所述抗体结合包含残基I60和/或G62的表位。任选地，所述抗体结合包含残基I60和/或G62中的一个或多个、但是不包含残基R13、A25和/或Q27的表位。
在一个实施方案中，所述抗体结合包含残基I60和/或G62中的一个或多个以及残基P14、S15和/或H23中的一个或多个的表位。任选地，所述抗体结合包含残基G21、G22、H23、E57、S58、F59、P63和/或H68中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个的表位。
任选地，所述抗体结合包含残基R78和/或L82中的一个或多个的表位。任选地，所述抗体结合包含残基K7、Y30、R31、P79、H80、S81、T83、G84、W85、S86和/或A87中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个的表位。
任选地，所述抗体结合包含残基W226的表位。任选地，所述抗体结合包含残基Q201、K202、P203、S204、S224、S225、S227、S228、N252、R253和/或T254中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个的表位。
任选地，所述抗体结合包含残基I231和/或R246中的一个或多个的表位。任选地，所述抗体结合包含残基I231和/或R246的表位以及结合包含残基W226的表位。任选地，所述抗体结合包含残基D230、I231、R244、L245、R246、A247、V248、S275、R277和/或P280中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个的表位。
任选地，所述抗体结合包含残基E239的表位。任选地，所述抗体进一步结合残基I231和/或R246中的一个或多个。任选地，所述抗体进一步结合残基W226。
本文中的实施例部分描述了一系列突变体人KIR3DL2多肽的构建。测量了抗-KIR3DL2抗体与用KIR3DL2突变体转染的细胞的结合，并与抗-KIR3DL2抗体的结合野生型KIR3DL2多肽(SEQ ID NO:1)的能力进行了对比。本文中使用的抗-KIR3DL2抗体和突变体KIR3DL2多肽之间的结合的减小是指，存在结合亲和力的减小(例如，通过已知方法测量，诸如表达特定突变体的细胞的FACS试验，或通过与突变体多肽的结合的Biacore试验)，和/或抗-KIR3DL2抗体的总结合能力的减小(例如，通过抗-KIR3DL2抗体浓度相对于多肽浓度的图中的Bmax的下降来证实)。结合的显著减小指示，突变的残基直接涉入与抗-KIR3DL2抗体的结合，或当抗-KIR3DL2抗体与KIR3DL2结合时，突变的残基与结合蛋白紧密靠近。抗体表位因而优选地包括这样的残基，并且可以包括邻近这样的残基的额外残基。
在某些实施方案中，结合的显著减小是指，与抗体和野生型KIR3DL2多肽(例如，SEQ ID NO:1中所示的多肽)之间的结合相比，抗-KIR3DL2抗体和突变体KIR3DL2多肽之间的结合亲和力和/或能力减小了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合减小至检出限度以下。在某些实施方案中，当抗-KIR3DL2抗体与突变体KIR3DL2多肽的结合小于在抗-KIR3DL2抗体和野生型KIR3DL2多肽(例如，SEQ ID NO:1所示的细胞外结构域)之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证实结合的显著减小。这样的结合测量可以使用本领域已知的多种结合测定来进行。在实施例部分中描述了一种这样的测定的具体例子。
在某些实施方案中，提供了表现出对突变体KIR3DL2多肽显著更低的结合的抗-KIR3DL2抗体，其中野生型KIR3DL2多肽(例如，SEQ ID NO:1)中的残基被置换。在这里使用的速记符号中，格式是：野生型残基:在多肽中的位置:突变体残基，具有如在SEQ ID NO:1中指示的残基的编号。
在某些实施方案中，抗-KIR3DL2抗体结合野生型KIR3DL2多肽，但是具有减小的与突变体KIR3DL2多肽的结合，所述突变体KIR3DL2多肽具有下述突变中的任意一种或多种(参考SEQ ID NO:1)：
R13W、A25T和/或G25R；
I60N和/或G62S；
P14S、S15A和/或H23S；
R13W、A25T和/或G25R中的一个或多个，和I60N和/或G62S中的一个或多个；
P14S,S15A和/或H23S中的一个或多个，和I60N和/或G62S中的一个或多个；
R13W、A25T和/或G25R中的一个或多个，I60N和/或G62S中的一个或多个；和P14S、S15A和/或H23S中的一个或多个；
P14S、S15A和/或H23S中的一个或多个，和I60N和/或G62S中的一个或多个；
R78H和/或L82P；
W226A；
I231M和/或R246P；
I231M和/或R246P中的一个或多个，和额外地W226A；或者
I231M和/或R246P中的一个或多个，但是其中所述抗体不具有减小的与具有在W226A中的突变的突变体的结合。
优选地，与对野生型KIR3DL2的结合相比，对KIR3DL2的特定突变体的结合显著减小。
生产抗-KIR3DL2抗体
可以通过本领域已知的多种技术来生产抗体。通常如下生产它们：用包含KIR3DL2多肽(优选人KIR3DL2多肽)的免疫原，免疫接种非人动物，优选小鼠。所述KIR3DL2多肽可以包含人KIR3DL2多肽的全长序列，或其片段或衍生物，通常是免疫原性片段，即包含暴露于表达KIR3DL2多肽的细胞的表面上的表位(优选被10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9抗体识别的表位)的多肽的一部分。这样的片段通常含有成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上从受体的细胞外结构域衍生出。在一个实施方案中，所述免疫原包含在脂质膜中(通常在细胞表面处)的野生型人KIR3DL2多肽。在一个具体实施方案中，所述免疫原包含完整的细胞，特别是完整的人细胞(任选经过处理或裂解)。在另一个实施方案中，所述多肽是重组KIR3DL2多肽。在一个具体实施方案中，所述免疫原包含完整的SS或MF细胞，特别是完整的人恶性CD4+T细胞、或CD4+CD28-T细胞(任选经过处理或裂解)。在另一个实施方案中，所述多肽是重组二聚体的KIR3DL2多肽。
用抗原来免疫非人哺乳动物的步骤可以以本领域众所周知的、用于在小鼠中刺激抗体产生的任何方式来实现(参见，例如，E.Harlow和D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1988)，其整个公开内容通过引用并入本文)。将所述免疫原悬浮或溶解于缓冲液中，所述缓冲液任选地含有佐剂，诸如完全或不完全弗氏佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型以及佐剂量的方法是本领域技术人员众所周知的。这些参数对于不同的免疫原而言可能是不同的，但是易于阐明。
类似地，足以刺激抗体产生的免疫接种的位置和频率也是本领域众所周知的。在一个典型的免疫接种方案中，在第1天用抗原腹膜内注射非人动物，并且在约1周之后再次注射。随后在约第20天进行所述抗原的记忆注射，任选地与佐剂诸如不完全弗氏佐剂一起。记忆注射静脉内地进行，并且可以重复连续几天。随后在第40天静脉内地或腹膜内地进行加强注射，通常不使用佐剂。该方案会导致在约40天后产生抗原特异性抗体的B细胞的产生。还可以使用其它方案，只要它们会导致生成表达抗体的B细胞的产生即可，所述抗体针对在免疫接种中使用的抗原。
对于多克隆抗体制备而言，从经免疫的非人动物得到血清，并且通过众所周知的技术分离存在于其中的抗体。使用与固体支持物连接的上述免疫原中的任一种，可以亲和纯化血清，从而得到与KIR3DL2多肽反应的抗体。
在一个替代实施方案中，从未免疫的非人哺乳动物分离出淋巴细胞，在体外培养，然后暴露于细胞培养物中的免疫原。然后收获所述淋巴细胞，并且执行以下描述的融合步骤。
对于单克隆抗体而言，下一步是从经免疫的非人哺乳动物分离脾细胞，并且随后将那些脾细胞与永生化细胞融合，从而形成产生抗体的杂交瘤。从非人哺乳动物分离脾细胞是本领域众所周知的，并且通常包括：从经麻醉的非人哺乳动物取出脾，将它切成小块，并将脾被膜中的脾细胞挤压穿过细胞过滤网的尼龙孔挤入适当的缓冲液中，从而产生单细胞悬浮液。将这些细胞洗涤、离心并且再悬浮于裂解任何红细胞的缓冲液中。将所述溶液再次离心，并且将沉淀物中的剩余淋巴细胞最终再悬浮于新鲜的缓冲液中。
一旦分离并且存在于单细胞悬浮液中，所述淋巴细胞可以与永生细胞系融合。这通常是小鼠骨髓瘤细胞系，尽管可用于制备杂交瘤的许多其它永生细胞系是本领域已知的。鼠骨髓瘤系包括、但不限于：从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,U.S.A.)、X63 Ag8653和SP-2细胞(可得自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland U.S.A.)衍生出的那些。使用聚乙二醇等进行所述融合。然后将得到的杂交瘤在选择性培养基中培养，所述选择性培养基含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质会阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
通常在巨噬细胞的饲养层上培养杂交瘤。所述巨噬细胞优选地得自用于分离脾细胞的非人哺乳动物的同胞仔，并且通常在将杂交瘤铺板之前用不完全弗氏佐剂等预处理数天。在Goding,“Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,”第59-103页(Academic Press,1986)中描述了融合方法，其公开内容通过引用并入本文。
允许所述细胞在选择性培养基中生长足以形成集落和产生抗体的时间。这通常是在约7天至约14天之间。
然后针对抗体的产生来测定杂交瘤集落，所述抗体特异性地结合KIR3DL2多肽基因产物，任选被抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9特异性地识别的表位。所述测定通常是比色测量ELISA-型测定，尽管可以使用可适用于杂交瘤在其中生长的孔的任何测定。其它测定包括放射免疫测定或荧光活化细胞分选。检查期望的抗体产生为阳性的孔，以确定是否存在一个或多个独特集落。如果存在超过一个集落，可以将所述细胞再克隆并且培养，以确保仅单个细胞产生生成期望抗体的集落。
被证实产生合适的单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基中(诸如DMEM或RPMI-1640)较大量地生长。可替换地，所述杂交瘤细胞可以作为动物中的腹水肿瘤在体内生长。
在充分生长以产生期望的单克隆抗体之后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水液)与细胞分开，并且对其中存在的单克隆抗体进行纯化。通常通过凝胶电泳、透析、使用蛋白A或蛋白G-Sepharose的色谱法、或连接到固体支持物(诸如琼脂糖或Sepharose珠子)上的抗-小鼠Ig(都描述在例如Antibody Purification Handbook,Biosciences,公开号18-1037-46,Edition AC，其公开内容特此通过引用并入)，进行纯化。通常通过使用低pH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱洗脱结合的抗体，其中含抗体的级分被立即中和。根据需要将这些级分收集、透析和浓缩。
通常将具有单个清楚集落的阳性孔再克隆并且再测定，以确保仅检测并且产生一个单克隆抗体。
如例如在Ward等人.Nature,341(1989)第544页(其整个公开内容通过引用并入本文)中公开的，还可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体。
使用多种可以在其中评估抗体竞争的免疫筛选测定中的任一种，可以容易地确定结合KIR3DL2、特别是与单克隆抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9实质上或基本上相同的表位的一种或多种抗体的身份。许多这样的测定被常规地实践，并且是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利号5,660,827，其特别地通过引用并入本文)。应该理解，实际上不再以任何方式要求确定本文中描述的抗体所结合的表位，即可鉴别结合与本文中描述的单克隆抗体相同的或基本上相同的表位的抗体。
例如，在待检查的试验抗体得自不同来源动物或甚至具有不同Ig同种型的情况下，可以采用简单竞争测定，其中将对照(10F6，例如出于例证的目的，或任意其它抗体诸如2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9)和试验抗体混合(或预吸附)，并且施加于含有KIR3DL2多肽的样品。基于蛋白质印迹法和使用BIACORE分析的方案适合用在这样的竞争研究中。
在某些实施方案中，在施加于KIR3DL2抗原样品之前，将对照抗体(例如10F6，尽管任意其它抗体也行)与不同量的试验抗体预混合(例如，约1:10或约1:100)一段时间。在其它实施方案中，可以在暴露于KIR3DL2抗原样品过程中将对照与不同量的试验抗体简单地混合。只要可以将结合的抗体与游离的抗体区别开(例如，通过使用分离技术或洗涤技术来消除未结合的抗体)，并且将10F6与试验抗体区别开(例如，通过使用物种-特异性的或同种型-特异性的第二抗体，或通过用可检测标记物来特异性地标记10F6)，可以确定所述试验抗体是否减小了10F6与抗原的结合，从而指示所述试验抗体识别与10F6基本上相同的表位。在没有完全不相关的抗体存在下(标记的)对照抗体的结合可以充当对照高值。通过将标记的(10F6)抗体与完全相同类型(10F6)的未标记的抗体一起温育，可以得到对照低值，其中竞争会发生并且减小经标记的抗体的结合。在一个试验测定中，在有试验抗体存在下经标记的抗体反应性的显著减小指示识别基本上相同的表位的试验抗体，即所述抗体与(10F6)抗体“交叉反应”或与其竞争。在约1:10至约1:100之间的10F6:试验抗体的任何比率，使10F6与KIR3DL2抗原的结合减小至少约50％、诸如至少约60％或更优选地至少约80％或90％(例如、约65-100％)的任何试验抗体，被认为是结合与10F6基本上相同的表位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体将10F6与KIR3DL2抗原的结合减小了至少约90％(例如，约95％)。
还可以通过例如流式细胞计量术试验来评估竞争。在这样的试验中，例如，可以将带有给定KIR3DL2多肽的细胞首先与10F6一起温育，然后与用荧光染料或生物素标记的试验抗体一起温育。如果在与饱和量的10F6预温育以后得到的结合是不与10F6一起预温育抗体所得到的结合(如通过荧光所测量的值)的约80％、优选约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，则说所述抗体与10F6竞争。可替换地，如果用经标记的10F6抗体(通过荧光染料或生物素)在与饱和量的试验抗体预温育的细胞上得到的结合是未与所述试验抗体预温育所得到的结合的约80％、优选约50％、约40％或less(例如，约30％、20％或10％)，则说所述抗体与10F6竞争。
还可以采用简单竞争测定，其中将试验抗体预吸附并且以饱和浓度施用到固定有KIR3DL2抗原的表面上。在所述简单竞争测定中，所述表面优选地是BIACORE芯片(或适合用于表面等离子体共振分析的其它介质)。然后在KIR3DL2饱和浓度下使对照抗体(例如，10F6)与所述表面接触，并且测量对照抗体的KIR3DL2和表面结合。将对照抗体的这种结合与在没有试验抗体存在下对照抗体与含有KIR3DL2的表面的结合进行对比。在一个试验测定中，在有试验抗体存在下对照抗体与含有KIR3DL2的表面的结合的显著减小指示所述试验抗体识别与对照抗体基本上相同的表位，使得所述试验抗体与所述对照抗体“交叉反应”。将对照(诸如10F6)抗体与KIR3DL2抗原的结合减小了至少约30％或更多、优选约40％的任何试验抗体可以被认为是结合与对照(例如，10F6)基本上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体会将对照抗体(例如，10F6)与KIR3DL2抗原的结合减小至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％或或更多)。应当理解，对照和试验抗体的顺序可以颠倒：也就是说，在一个竞争测定中，可以首先使对照抗体与表面结合，并且此后使试验抗体与所述表面接触。优选地，首先使对KIR3DL2抗原具有较高亲和力的抗体与表面结合，正如所预期的，观察到的第二抗体(假设所述抗体是交叉反应的)的结合的减小将具有较大量级。这样的测定的其它例子提供在例如Saunal(1995)J.Immunol.Methods 183:33-41(其公开内容通过引用并入本文)中。
优选地，识别KIR3DL2表位的单克隆抗体将与存在于高百分比的或甚至所有有关的细胞(例如，恶性CD4+T细胞，得自SS或MF患者的细胞)上的表位反应，但是不会与其它细胞(即，不表达KIR3DL2的细胞)显著地反应。在一个方面，抗-KIR3DL2抗体结合KIR3DL2，但是不结合KIR3DL1和/或KIR3DS1。
在某些实施方案中，所述抗体将结合这样的表达KIR3DL2的细胞：其得自具有以KIR3DL2-阳性细胞的表达为特征的疾病的一个或多个个体，即作为使用抗-KIR3DL2抗体用本文描述的方法之一进行治疗的候选人的个体。因此，一旦得到特异性地识别细胞上的KIR3DL2的抗体，就可以试验它的结合KIR3DL2-阳性细胞(例如恶性CD4+T细胞)的能力，所述KIR3DL2-阳性细胞取自具有障碍(诸如SS或MF)的患者。具体地，在用本发明的抗体之一治疗患者之前，有益的是，试验所述抗体的结合取自患者的恶性细胞的能力(例如在血液样品中)，以使该治疗将在患者中有益的可能性最大化。
在一个实施方案中，在免疫测定中验证所述抗体，以试验它们的结合表达KIR3DL2的细胞(例如恶性CD4+T细胞、促炎症性的CD4+细胞)的能力。例如，从多个患者采集外周血淋巴细胞(PBL)，并从PBL富集CD4+T细胞，例如，通过流式细胞计量术使用有关的抗体(关于恶性CD4+细胞，参见，例如，Bagot等人(2001)Blood 97:1388-1391，其公开内容通过引用并入本文)，或通过在MACS柱(Miltenyi Biotec)上的磁性分离来分离CD4+CD28-细胞级分。然后使用本领域技术人员众所周知的标准方法，评估给定抗体的结合细胞的能力。被发现结合高比例(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的已知表达KIR3DL2的细胞(例如T细胞，其得自高百分比的个体或患者(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多))的抗体适合用于本文中的用途，用于诊断目的来确定恶性T细胞在患者中的存在或水平，或用在本文描述的治疗方法中，例如，用于增加或减少恶性T细胞数目或活性。为了评估抗体与细胞的结合，可以直接地或间接地标记抗体。当间接地标记时，通常添加第二种经标记的抗体。然后可以检测抗体与细胞的结合，例如，使用细胞荧光测量分析(例如FACScan)。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。
以本领域技术人员已知的方式，可以确定抗体是否结合在表位区域内。作为这样的作图/表征方法的一个例子，使用KIR3DL2蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰，通过表位“足迹法”，可以确定抗-KIR3DL2抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体例子是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及反向交换，其中保护参与蛋白结合的主链酰胺基团免于反向交换并且因此将保持被氘化。在此时可以通过胃蛋白酶解、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷射电离质谱法来鉴别相关区域。参见，例如，Ehring H,Analytical Biochemistry,第267卷(2)第252-259页(1999)Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73,256A-265A。合适的表位鉴别技术的另一个例子是核磁共振表位作图(NMR)，其中通常将游离抗原和与抗原结合肽(诸如抗体)形成复合物的抗原的二维NMR谱图中信号的位置进行对比。通常用15N对所述抗原进行选择性同位素标记，使得在NMR谱图中仅可以看到与抗原对应的信号，且没有来自所述抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比较，在复合物谱图中由涉入与抗原结合肽相互作用的氨基酸所产生的抗原信号通常会移动位置，并且以此方式可以鉴别涉入所述结合的氨基酸。参见，例如，Ernst Schering Res FoundWorkshop.2004；(44):149-67；Huang等人,Journal of Molecular Biology,第281(1)卷第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,Methods.1996年6月；9(3):516-24。
还可以使用质谱法进行表位作图/表征。参见，例如，Downward,JMass Spectrom.2000年4月；35(4):493-503和Kiselar和Downard,Anal Chem.1999年5月1日；71(9):1792-801。在表位作图和鉴别的上下文中，蛋白酶消化技术也可以是有用的。通过蛋白酶消化(例如通过以相对于KIR3DL2为约1:50的比率使用胰蛋白酶或在pH 7-8消化过夜)，随后进行质谱法(MS)分析以鉴别肽，可以确定抗原决定簇相关的区域/序列。随后可以如下被抗-KIR3DL2结合剂保护而免于胰蛋白酶切割的肽：将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体温育的、并且然后经历例如胰蛋白酶消化的样品进行对比(由此揭示结合剂的足迹)。在类似的表位表征方法中也可以或可替换地使用其它酶如糜蛋白酶、胃蛋白酶等。此外，酶消化可以提供快速方法，其用于分析潜在抗原决定簇序列是否在KIR3DL2多肽的特定区域内，所述区域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能的是不相关的。关于类似技术的讨论，参见，例如，Manca,Ann Ist Super Sanita.1991；27:15-9。
定位诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白片段内的每个残基都用丙氨酸残基替换，并且测量结合亲和力的后果。如果所述突变导致结合亲和力的显著降低，它最可能涉入结合。可以使用对结构表位具有特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来证实所述丙氨酸替换没有影响蛋白的整体折叠。参见，例如，Clackson和Wells,Science 1995；267:383-386；和Wells,Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:1-6。
还可以将电子显微术用于表位“足迹法”。例如，Wang等人,Nature 1992；355:275-278使用冷冻电子显微镜术、三维图像重建、以及X-射线晶体学的协同应用来确定天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。
用于表位评价的其它形式的“无标记”测定包括表面等离子体共振(SPR、BIACORE)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，等人,Journal Of Molecular Recognition 1990；3:208-14；Nice等人,J.Chroma-togr.1993；646:159-168；Leipert等人,Angew.Chem.Int.Ed.1998；37:3308-3311；等人,Biosensors and Bioelectronics 2002；17:937-944。
还应当指出，可以在本文中描述的一个或多个示例性竞争测定中鉴别出结合与本文描述的抗体相同或基本上相同的表位的抗体。
任选地，评估细胞摄入或定位，以便选择易于摄入细胞中和/或细胞隔室(在其中存在KIR3DL2)中的抗体。通常在细胞中测量细胞摄入或定位，在所述细胞中寻找抗体或认为抗体发挥其活性。通过标准方法(诸如通过使用用可检测部分(例如荧光部分)标记的抗体进行共聚焦染色)，可以评估细胞摄入或定位。
在给脊椎动物或细胞免疫接种并在其中生产抗体以后，可以执行特定选择步骤来分离所要求保护的抗体。在这点上，在一个具体实施方案中，提供了生产这样的抗体的方法，所述方法包括：(a)用包含KIR3DL2多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；和(b)从所述经免疫的动物制备抗体；和(c)选择得自步骤(b)的能够结合KIR3DL2的抗体。
通常，本文中的抗-KIR3DL2抗体对KIR3DL2多肽具有在约104至约1011M-1(例如，约108至约1010M-1)范围内的亲和力。例如，抗体可以对KIR3DL2具有小于1x 10-9M的平均解离常数(Kd)，如通过例如表面等离子体共振(SPR)筛选(诸如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)来确定的。在一个更具体的示例性方面，抗体可以对KIR3DL2具有约1x 10-8M至约1x 10-10M、或约1x 10-9M至约1x 10-11M的Kd。
通过例如不超过约100、60、10、5或1纳摩尔、优选地亚纳摩尔或任选地不超过约500、200、100或10皮摩尔的平均Kd(即更好亲和力)，可以表征抗体。例如，通过将重组生产的人KIR3DL2蛋白固定在芯片表面上，随后施加在溶液中的待试验的抗体，可以确定Kd。在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤(d)，选择得自(b)的这样的抗体：其能够与抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9竞争对KIR3DL2的结合。
在任意实施方案的一个方面，根据本发明的方法制备的抗体是单克隆抗体。在另一个方面，根据本发明的方法用于生产抗体的非人动物是哺乳动物，诸如啮齿动物、牛、猪、家禽、马、兔、山羊或绵羊。抗体包括10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9。另外，可以任选地将抗体指定为除了以下任一种以外的抗体：抗体Q241和Q66(Pende,等人(1996)J Exp Med 184:505-518)、克隆5.133(Miltenyi Biotec)、“AZ158”(Parolini,S.,等人(2002)In Leucocyte typing VII.D.Mason,编.Oxford University Press,Oxford.415-417和WO2010/081890(例如具有WO2010/081890的SEQ ID NO:8和10的重链和轻链可变区的抗体)，或前述抗体的衍生物，例如完全地或部分地包含抗原结合区的衍生物。
根据一个替代实施方案，从杂交瘤中分离出编码结合KIR3DL2多肽上存在的表位的抗体的DNA，并且将其置于适当的表达载体中用于转染进适当的宿主中。然后将所述宿主用于重组生产所述抗体或其变体，诸如该单克隆抗体的人源化形式、所述抗体的活性片段，包含所述抗体的抗原识别部分的嵌合抗体、或包含可检测部分的形式。
使用使用常规规程(例如，通过使用寡核苷酸探针，所述探针能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因)，可以容易地将编码单克隆抗体(例如，抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9)的DNA进行分离和测序。分离后，可以将所述DNA置于表达载体中，然后将所述载体转染进否则会产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。如在本说明书的其它地方所描述的，可以出于多个目的中任何一个(例如，用于人源化抗体、生产片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列)而修饰这样的DNA序列(例如在抗原结合位点中)，以便优化所述抗体的结合特异性。
在细菌中重组表达编码所述抗体的DNA，是本领域众所周知的(参见，例如，Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5,第256页(1993)；和Pluckthun,Immunol.130,第151页(1992)。
评估活性
一旦得到抗原结合化合物，通常评估它的以下能力：内化进表达KIR3DL2的靶细胞中或造成KIR3DL2内化进表达KIR3DL2的靶细胞中以诱导ADCC或CDC朝向，抑制表达KIR3DL2的靶细胞的促炎活性和/或增殖和/或造成所述靶细胞的消除。评估抗原结合化合物的内化或诱导ADCC、CDC或通常导致表达KIR3DL2的靶细胞的活性的消除或抑制的能力，可以在所述方法的任意合适阶段进行，例如如在本文中提供的实施例中。该评估可以在用于治疗用途的抗体(或其它化合物)的鉴别、生产和/或开发所涉及的不同步骤中的一个或多个步骤是有用的。例如，可以在鉴别候选抗原结合化合物的筛选方法的背景下或在特定方法中评估活性，在所述特定方法中，选择抗原结合化合物并使其成为人合适的(例如在抗体的情况下，制成嵌合的或人源化的)，在所述特定方法中，已经得到表达抗原结合化合物的细胞(例如表达重组抗原结合化合物的宿主细胞)并评估它的产生功能性抗体(或其它化合物)的能力，和/或在所述特定方法中，已经产生一定量的抗原结合化合物并评估活性(例如以试验产品批次或批量)。通常，已知抗原结合化合物特异性地结合KIR3DL2多肽。所述步骤可能包括试验多个(例如，使用高通量筛选方法的非常大数目，或较小数目)抗原结合化合物。
本文中使用的没有“内化”或不会“内化”的抗-KIR3DL2抗体是这样的抗体：其在结合哺乳动物细胞上的KIR3DL2(即细胞表面KIR3DL2)后，基本上没有被细胞摄入(即，进入)。非内化抗体当然包括抗体片段、人或人源化抗体和抗体缀合物。
抗-KIR3DL2抗体在结合哺乳动物细胞上的KIR3DL2后是否内化，或KIR3DL2多肽是否经历细胞内内化(例如在被抗体结合以后)，可以通过多种测定来确定，所述测定包括在本文中的实验实施例中描述的那些。例如，为了在体内试验内化，将试验抗体标记并引入已知在某些细胞的表面上表达KIR3DL2的动物中。可以放射性地标记或用例如荧光颗粒或金颗粒标记抗体。适合用于该测定的动物包括哺乳动物，诸如含有表达人KIR3DL2的肿瘤移植物或异种移植物的裸鼠，或在其中已经引入用人KIR3DL2转染的细胞的小鼠，或表达人KIR3DL2转基因的转基因小鼠。适当的对照包括没有接受试验抗体的动物或接受无关抗体的动物，和接受针对目标细胞上的另一种抗原的抗体的动物，所述抗体已知在结合抗原后内化。可以将所述抗体施用给动物，例如，通过静脉内注射。在合适的时间间隔，使用已知方法或如在下面的实验实施例中所述，可以制备动物的组织切片，并通过光学显微术或电子显微术分析内化以及内化的抗体在细胞中定位。对于体外内化，可以在有或没有加入培养基中的有关抗体存在下在组织培养皿中温育细胞，并在期望的时间点处理用于显微分析。如果使用放射性地标记的抗体，通过显微术或通过放射自显影术可以直接地观察内化的标记的抗体在细胞中的存在。任选地，在显微术中，可以评估与已知的多肽或其它细胞组分的共定位；例如与胞内体/溶酶体标志物LAMP-1(CD107a)的共定位可以提供关于内化的抗体的亚细胞定位的信息。可替换地，在定量生化测定中，在体外或在体内使包含表达KIR3DL2的细胞的细胞群体与放射性地标记的试验抗体接触，并将细胞(如果在体内接触，则在合适量的时间以后分离细胞)用蛋白酶处理或进行酸洗涤以除去细胞表面上的未内化的抗体。将细胞磨碎，并通过使匀浆物穿过闪烁计数器来测量与每批细胞有关的每分钟的蛋白酶抗性的放射性计数的量(cpm)。基于放射性地标记的抗体的已知比活性，可以从磨碎的细胞的闪烁计数推导出每个细胞内化的抗体分子的数目。优选地以溶液形式在体外使细胞与抗体“接触”，诸如通过将细胞加入培养皿或烧瓶内的细胞培养基中，并使抗体与培养基充分混合以确保细胞向抗体的均匀暴露。
试验CDC和ADCC，可以通过不同测定来进行，所述测定包括在本文的实验实施例中描述的那些(参见实施例4和5)。试验ADCC通常包括：评估细胞介导的细胞毒性，其中具有结合的抗-KIR3DL2抗体的、表达KIR3DL2的靶细胞(例如Cou-L细胞,塞扎里综合征细胞或其它表达KIR3DL2的细胞)被带有Fc受体的效应细胞识别，不涉及补体。不表达KIR3DL2抗原的细胞可以任选地用作对照。通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标志物(例如CD107动员)的增加，评估NK细胞细胞毒性的活化。优选地，与对照抗体(例如不结合KIR3DL2的抗体，具有鼠恒定区的KIR3DL2抗体)相比，所述抗体在有靶细胞存在下将诱导细胞因子产生的增加、细胞毒性标志物的表达、或至少20％、50％、80％、100％、200％或500％的靶细胞裂解。在另一个实施例中，在例如铬释放测定中检测靶细胞的裂解，优选地所述抗体将诱导至少10％、20％、30％、40％或50％的靶细胞的裂解。在针对它的(a)诱导ADCC和(b)内化进表达KIR3DL2的细胞中和/或诱导KIR3DL2内化的能力来试验抗原结合化合物的情况下，(a)和(b)的测定可以以任意次序进行。但是，较大的内化程度和速度通常预期与CDC和ADCC活性的程度的下降有关。
抗体10F6
抗体10F6的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:3。在一个具体实施方案中，提供了结合与单克隆抗体10F6基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体10F6的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体10F6可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含10F6的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含10F6的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含10F6的重链可变区的三个CDR。还提供了单克隆抗体，其进一步包含10F6的可变轻链可变区或10F6的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体10F6的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选人恒定区，任选人IgG1或IgG3同种型)融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列GYTFTIAGMQ，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如IAGMQ(SEQ ID NO:4)、GYTFTI(SEQ ID NO:5))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列WINTHSGVPKYAEDFKG，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如WINTHSGVPK(SEQ ID NO:8))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列GGDEGVMDY，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQID NO:10中所示的氨基酸序列KASQDVSTAVA，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列WASTRHT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列QQHYNTPWT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:2的重链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:3的轻链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:2的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:3的轻链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)分别如在SEQ ID NO:4-6、7-8和9中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)如在SEQ ID NO:10、11和12中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)分别如在SEQ ID NO:4、7和9中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:10、11和12中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面(a)至(f)的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
抗体2B12
抗体2B12的重链可变区的氨基酸序列列出为SEQ ID NO:13，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，提供了结合与单克隆抗体2B12基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体2B12的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体2B12可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含2B12的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含2B12的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含2B12的重链可变区的三个CDR。还提供了这样的单克隆抗体，其进一步包含2B12的可变轻链可变区或2B12的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体2B12的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型(任选人恒定区，任选IgG1或IgG4同种型)的免疫球蛋白恒定区融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列GYTFTTAGMQ，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如，TAGMQ(SEQ ID NO:15)、GYTFTT(SEQ ID NO:16))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列WINSHSGVPKYAEDFK，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如WINSHSGVP(SEQ ID NO:19))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列GGDEGVMDYW，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQID NO:10中所示的氨基酸序列KASQDVSTAVA，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列WTSTRHT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；和/或LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列QQHYSTPWT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换，或其中所述序列可以包含一个或多个氨基酸的***。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:13的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:14的轻链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:13的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:14的轻链可变区，任选地其中所述氨基酸残基中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)分别如在SEQ ID NO:15-17、18-19和20中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)分别如在SEQ ID NO:10、21和22中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)分别如在SEQ ID NO:15、18和20中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:10、21和22中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面(a)至(f)的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
抗体10G5
抗体10G5的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:23，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:24。在一个具体实施方案中，提供了结合与单克隆抗体10G5基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体10G5的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体10G5可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含10G5的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含10G5的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含10G5的重链可变区的三个CDR。还提供了单克隆抗体，其进一步包含10G5的可变轻链可变区或10G5的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体10G5的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选人恒定区，任选人IgG1或IgG3同种型)融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列GYTFTSYTMH，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如SYTMH(SEQ ID NO:25)、GYTFTS(SEQ ID NO:26))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列YINPSSGYTENNRKF，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如YINPSSGY(SEQ ID NO:29))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列RLGKGLLPPFDY，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列RASENIYSNLA，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列AATNLAD，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列QHFWGTPYT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:23的重链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:24的轻链可变区，任选地其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:23的重链可变区，任选地其中一个或多个残基可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:24的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)分别如在SEQ ID NO:25-27、28-29和30中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)如在SEQ ID NO:31、32和33中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)分别如在SEQ ID NO:25、28和30中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个或多个残基可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:31、32和33中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面(a)至(f)的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
抗体13H1
抗体13H1的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:34，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:35。在一个具体实施方案中，提供了结合与单克隆抗体13H1基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体13H1的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体13H1可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含13H1的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含13H1的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含13H1的重链可变区的三个CDR。还提供了单克隆抗体，其进一步包含13H1的可变轻链可变区或13H1的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体13H1的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选人恒定区，任选人IgG1或IgG3同种型)融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列HYSFIGYTM，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如GYTMN(SEQ ID NO:36)、HYSFIG(SEQ ID NO:37))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列LINPYNGDTTYNQKFKG，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如LINPYNGDTT(SEQ ID NO:40))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列ENWGYPYAMDY，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列RASESVDNFGISFMN，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列AASNQGS，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列QQSKEVPYT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:34的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:35的轻链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:34的重链可变区，任选地其中一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:35的轻链可变区，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或更多个可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)分别如在SEQ ID NO:36-38、39-40和41中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)如在SEQ ID NO:42、43和44中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)分别如在SEQ ID NO:36、39和41中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:42、43和44中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面(a)至(f)的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
抗体1E2
抗体1E2的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:45，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:46。在一个具体实施方案中，提供了结合与单克隆抗体1E2基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体1E2的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体1E2可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含1E2的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含1E2的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含1E2的重链可变区的三个CDR。还提供了单克隆抗体，其进一步包含1E2的可变轻链可变区或1E2的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体1E2的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与人IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选人恒定区，任选人IgG1或IgG3同种型)融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列GYTFTDYAMN，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如DYAMN(SEQ ID NO:47)、GYTFTD(SEQ ID NO:48))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列VISTYYGDANYNQKFKG，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如VISTYYGDAN(SEQ ID NO:51))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列IYYDYDGSY，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQID NO:53中所示的氨基酸序列RSSQSLVHSNGNTYLH，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQID NO:54中所示的氨基酸序列KVSNRFS，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列SQSTHVPPYT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:42的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:43的轻链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:42的重链可变区，任选地其中一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:43的轻链可变区，任选地其中这些氨基酸中的1个、2个、3个或更多个可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)分别如在SEQ ID NO:47-49、50-51和52中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)如在SEQ ID NO:53、54和55中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)如在SEQ ID NO:47、50和52中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:53、54和55中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面(a)至(f)的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
抗体9E10
9E10的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:56，9E10的轻链可变区(可得到两个替代轻链)的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:57和67。在一个具体实施方案中，提供了结合与单克隆抗体9E10基本上相同的表位或决定簇的抗体；任选地，所述抗体包含抗体9E10的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中，抗体9E10可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个实施方案中，所述单克隆抗体包含9E10的Fab或F(ab')2部分。还提供了包含9E10的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含9E10的重链可变区的三个CDR。还提供了单克隆抗体，其进一步包含9E10的可变轻链可变区或9E10的轻链可变区的一个、两个或三个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、***或缺失)。任选地，提供了这样的抗体：其中构成抗体9E10的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选人恒定区，任选人IgG1或IgG4同种型)融合。
在另一个方面，提供了纯化的编码抗体的多肽，其中所述抗体包含：HCDR1区域，该区域包含如在SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列GYTFTSYTMH，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如，SYTMH(SEQ ID NO:58)、GYTFTS(SEQ ID NO:59))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR2区域，该区域包含如在SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列YINPSSGYTDYNQKFKD，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列(例如YINPSSGYTD(SEQ ID NO:62))，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；HCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列LGKGLLPPFDY，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR1区域，该区域包含如在SEQID NO:64中所示的氨基酸序列KSNQNLLWSGNQRYCLV，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR2区域，该区域包含如在SEQID NO:65中所示的氨基酸序列WTSDRYS，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被不同的氨基酸置换；LCDR3区域，该区域包含如在SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列QQHLHIPYT，或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被删除或被不同的氨基酸置换，或其中所述序列可以包含一个或多个氨基酸的***。
在另一个方面，提供了结合人KIR3DL2的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:56的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(b)SEQ ID NO:57或67的轻链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(c)SEQ ID NO:56的重链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:57或67的轻链可变区，任选地其中1个、2个、3个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(d)如在SEQ ID NO:58、59或60、61-62和63中所示的重链CDR 1和2(HCDR1,HCDR2)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(e)如在SEQ ID NO:64、65和66中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换；和/或
(f)如在SEQ ID NO:58、61和63中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，任选地其中1个、2个、3个残基of任意CDR可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ ID NO:64、65和66中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，任选地其中任意CDR的一个、两个、三个或更多个残基可以被不同的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，提供了抗体1C3(抗-D2结构域)、它的可变区和CDR。在一个实施方案中，提供了这样的抗体：其分别具有SEQ ID NO:170和171(1C3)的VH和VL区域。在一个实施方案中，提供了具有重链的抗体，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:172、173或174(HCDR1)、SEQ ID NO:175或176(HCDR2)和SEQ ID NO:177(HCDR3)的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。在一个实施方案中，提供了这样的抗体：其具有(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:172、173或174(HCDR1)、SEQ ID NO:175或176(HCDR2)和SEQ ID NO:177(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ ID NO:178、179或180的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。
在另一个实施方案中，提供了抗体20E9(抗-D2结构域)、它的可变区和CDR。在一个实施方案中，提供了这样的抗体：其分别具有SEQ ID NO:181和182(20E9)的VH和VL区域。在一个实施方案中，提供了具有重链的抗体，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:183、184或185(HCDR1)、SEQ IDNO:186或187(HCDR2)和SEQ ID NO:188(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。在一个实施方案中，提供了这样的抗体：其具有(i)重链，其包含分别含有SEQ ID NO:183、184或185(HCDR1)、SEQ ID NO:186或187(HCDR2)和SEQ ID NO:188(HCDR3)的序列的CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，其包含分别含有SEQ IDNO:189、190或191的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。
在本文中的任意实施方案的另一个方面，所述重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以通过其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列来表征，和/或表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，提供了与上面的单克隆抗体竞争KIR3DL2结合的抗体。
在任意抗体中，所指定的可变区和CDR序列可以包含1个、2个、3个、4个、5个或更多个保守的序列修饰。保守的序列修饰表示不会显著地影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。通过本领域已知的标准技术(诸如定位诱变和PCR介导的诱变)，可以将修饰引入抗体中。保守氨基酸置换通常是这样的置换：其中用一个含有具有类似物理化学性能的侧链的氨基酸残基来替换某个氨基酸残基。所指定的可变区和CDR序列可以包含1个、2个、3个、4个或更多个氨基酸***、缺失或置换。在进行置换的情况下，置换可以任选地是保守修饰。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文中描述的测定来试验经改变的抗体所保留的功能(即，本文中阐述的性能)。
术语“同一性”或“相同”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系中时，表示多肽之间的序列关联性程度，正如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数量所确定的。“同一性”量度具有间隙比对(如果存在的话)的2个或多个序列中较小者之间相同匹配的百分比，所述间隙比对通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。通过已知的方法，可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括、但不限于在以下文献中描述的那些方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。
用于确定同一性的优选方法被设计成给出所试验的序列之间的最大匹配。在公众可得到的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual,Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人,出处同上)得到。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。
根据AbM(Oxford Molecular的AbM抗体建模软件定义)、Kabat和Chothia定义***，已经将抗体的CDR的序列总结在下面的表1(对于重链CDR)和表2(对于轻链CDR)(对于AbM、Kabat和Chothia定义中的每一种，轻链CDR是相同的)中。根据Abm、Kabat和Chothia编号***，将本文中描述的氨基酸序列编号。尽管可以将任意合适的编号***用于指定的CDR区域，但是在没有任意其它指示存在下，可以使用Abm编号。已经使用以下指示建立了这样的编号：CDR-L1：起始：大约残基24，残基之前：总是Cys，残基之后：总是Trp(通常是Trp-Tyr-Gln，但也可以是Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)，长度：10至17个残基；CDR-L2：起始：在L1的末端之后总是16个残基，残基之前：通常是Ile-Tyr(但也可以是Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe)，长度：总是7个残基；CDR-L3，起始：在L2末端之后总是33个残基，残基之前：总是Cys，残基之后：总是Phe-Gly-Xaa-Gly，长度：7至11个残基；CDR-H1，起始：大约残基26(在Cys之后总是4个)(Chothia/AbM定义，Kabat定义在5个残基之后起始)，残基之前：总是Cys-Xaa-Xaa-Xaa，残基之后：总是Trp(通常是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile、Trp-Ala)，长度：10至12个残基(AbM定义，Chothia定义排除了最后4个残基)；CDR-H2，起始：在CDR-H1的Kabat/AbM定义的末端之后总是15个残基，残基之前：通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但有很多变化，残基之后：Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala)，长度：Kabat定义16至19个残基；AbM(和Chothia)定义在7个残基之前结束；CDR-H3，起始：在CDR-H2末端之后总是33个残基(在Cys之后总是2个)，残基之前：总是Cys-Xaa-Xaa(通常Cys-Ala-Arg)，残基之后：总是Trp-Gly-Xaa-Gly，长度：3-25个残基。
在一个实施方案中，所述抗体是人或小鼠IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗体是人IgG1同种型。在一个实施方案中，所述抗体是保留它们的结合和/或功能性能的抗体片段。
表1
表2
所述抗体的可变链的序列列出在下面的表3中，其中CDR标有下划线。在本文中的任意实施方案中，可以将VL或VH序列指定或编号，从而含有或缺少信号肽或其任意部分。
表3
片段和衍生物
通过本领域已知的技术，可以生产抗体的片段和衍生物(它们被在本申请中使用的术语“抗体”包括，除非另有说明或与上下文明显矛盾)，优选10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9-样抗体。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双体；任何抗体片段，其为具有由一个邻接氨基酸残基的连续序列组成的一级结构的多肽(在本文中被称作“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括、但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、或其片段，所述片段含有所述轻链可变结构域的3个CDR，而没有相关的重链部分，和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽、或其片段，所述片段含有重链可变区的3个CDR，而没有相关的轻链部分；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。尤其包括纳米体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。
可以使用标准方法得到本发明的抗体的片段。例如，根据常规技术，通过分离抗体的蛋白酶消化，可以产生Fab或F(ab′)2片段。应当理解，可以使用已知的方法来修饰免疫反应片段，例如为了减慢体内清除率和得到更合乎需要的药代动力学分布，可以用聚乙二醇(PEG)来修饰所述片段。在例如Leong等人,16(3):106-119(2001)和Delgado等人,Br.J.Cancer 73(2):175-182(1996)(它们的公开内容通过引用并入本文)中，描述了用于将PEG偶联至Fab'片段并且位点特异性地缀合至Fab'片段的方法。
可替换地，可以修饰生产抗体(优选10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9-样抗体)的杂交瘤的DNA，从而编码片段。然后将经修饰的DNA***表达载体中，并且用于转化或转染适当的细胞，所述细胞然后表达期望的片段。
在某些实施方案中，在***表达载体中之前，可以修饰生产抗体(优选10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9-样抗体)的杂交瘤的DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源非人序列(例如，Morrison等人,PNAS第6851页(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。以此方式，制备“嵌合的”或“杂交的”抗体，所述抗体具有原始抗体的结合特异性。通常，这样的非免疫球蛋白多肽替换了抗体的恒定结构域。
因而，根据另一个实施方案，抗体，优选10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9-样抗体，是人源化的。抗体的“人源化”形式是特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有从鼠免疫球蛋白衍生出的最小序列。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替换，同时保持期望的原始抗体的特异性、亲和力和能力。
在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有的或基本上所有的CDR区对应于原始抗体的那些CDR区，并且所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关于其它细节，参见Jones等人,Nature,321,第522页(1986)；Reichmann等人,Nature,332,第323页(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2,第593页(1992)；Verhoeyen et Science,239,第1534页；和美国专利号4,816,567，它们的整个公开内容通过引用并入本文)。
要用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择，对于降低抗原性而言是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个库，筛选抗体的可变结构域的序列。然后，将最接近小鼠序列的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.151,第2296页(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.196,1987,第901页)。另一种方法使用来自所有人抗体的轻链或重链的特定亚组的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,PNAS 89,第4285页(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151,第2623页(1993))。
进一步重要的是，在保留对KIR3DL2受体的高亲和力和其它有利的生物学特性的情况下，将抗体人源化。为了实现该目的，根据一种示例性的方法，使用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和不同概念的人源化产物的方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的，并且是本领域技术人员熟知的。可以得到阐明并且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维结构的计算机程序。对这些显示的检查，允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白的结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并且组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接地并且最显著地涉入影响抗原结合。
另一种制备“人源化的”单克隆抗体的方法是使用鼠宿主，其免疫球蛋白基因被功能性的人免疫球蛋白基因替换(参见，例如，美国专利号6,162,963，它通过引用整体并入本文中)。
还可以根据多种其它技术来生产人抗体，诸如通过使用其它转基因动物进行免疫接种，所述转基因动物已经经过工程改造以表达人抗体所有组成成分(Jakobovitz等人,Nature 362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法选择抗体所有组成成分。这样的技术是技术人员已知的，并且可以从本文中公开的单克隆抗体开始实施。
抗体，任选10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、5H1、1E2、1C3或20E9-样抗体，还可以被衍生成“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链/轻链的一部分与原始抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与从另一个物种衍生出抗体或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列、以及这样的抗体的片段相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性和结合特异性(Cabilly等人,出处同上；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第6851页(1984))。
预见到多种形式的人源化抗体或亲和力成熟的抗体。例如，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，诸如Fab。可替换地，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是全长或完整抗体，诸如全长或完整的IgG1或IgG4抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是全长IgG4抗体或其片段。为了生产这样的抗体，可以根据标准重组方法(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)将人源化的VH和VL区域或其变体形式克隆进编码得自人抗体的全长或截短恒定区的表达载体中。结果是转染的细胞系，该细胞系表达和分泌目标人源化抗体分子，其包含选择的VH和VL区域和恒定区。编码人抗体的恒定区的cDNA序列是已知的。
根据已知方法，可以进一步修饰恒定区。例如，在IgG4恒定区中，可以将残基S241突变成脯氨酸(P)残基以允许在铰链处形成完整的二硫桥(参见，例如，Angal等人,Mol Immunol.1993；30:105-8)。
经修饰的恒定区
考虑到抗-KIR3DL2抗体(特别是非内化抗体)的诱导ADCC和CDC的能力，还可以对所述抗体做出增加它们的结合Fc受体的能力的修饰，其可以影响效应子功能诸如抗体依赖性的细胞毒性、肥大细胞去粒和吞噬作用，以及免疫调节性信号诸如淋巴细胞增殖和抗体分泌的调节。典型修饰包括经修饰的人IgG1恒定区，其包含至少一个氨基酸修饰(例如置换、缺失、***)和/或改变的糖基化类型，例如，低岩藻糖基化。这样的修饰可以影响与以下Fc受体的相互作用：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD 16)是活化(即，免疫***增强)受体，而FcγRIIB(CD32B)是抑制(即，免疫***减弱)受体。修饰可以例如增加Fc结构域与效应(例如NK)细胞上的FcγRIIIa的结合。
抗-KIR3DL2抗体优选地包含人IgG1或IgG3同种型的Fc结构域(或其部分)，任选地经过修饰。残基230-341(Kabat EU)是Fc CH2区域。残基342-447(Kabat EU)是Fc CH3区域。抗-KIR3DL2抗体可以包含变体Fc区，其具有在一个或多个部分中的一个或多个氨基酸修饰(例如，置换、缺失、***)，所述修饰会增加变体Fc区对FcγR(包括活化性的和抑制性的FcγR)的亲和力和亲合力。在某些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰会增加变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力。在另一个实施方案中，所述变体Fc区进一步特异性地结合FcγRIIB，其亲和力低于可比较的亲本抗体(例如，除了Fc区中的一个或多个氨基酸修饰以外，具有与所述抗体相同的氨基酸序列的抗体)的Fc区。例如，可以用例如赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸置换在氨基酸位置310和435处的组氨酸残基中的一个或两个(参见，例如PCT公开号WO 2007/080277)；这样的被置换的恒定区会提供减小的与抑制性FcγRIIB的结合，而不减小与活化性的FcγRIIIA的结合。在某些实施方案中，这样的修饰会增加变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，并且也增强变体Fc区对FcγyRIIB的亲和力(相对于亲本抗体)。在其它实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰会增加变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，但是不会改变变体Fc区对FcγRIIB的亲和力(相对于亲本抗体的Fc区)。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰会增强变体Fc区对FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力，但是减小对FcγRIIB的亲和力(相对于亲本抗体)。当母体分子(没有经修饰的Fc区)的结合活性不可在表达低水平的FcγR的细胞中检测出时，增加的亲和力和/或亲合力会在所述细胞中导致可检测的与FcγR的结合或FcγR-相关活性。
使用本领域已知的用于确定抗体-抗原或Fc-FcγR相互作用(即，分别是抗原与抗体的特异性结合，或Fc区与FcγR的特异性结合)的体外测定(基于生化或免疫学的测定)，包括、但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定，可以确定抗体对FcγR的亲和力和结合性能。
在某些实施方案中，包含变体Fc区的抗体包含在Fc区的CH3结构域中的至少一个氨基酸修饰(例如，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)。在其它实施方案中，包含变体Fc区的抗体包含在Fc区的CH2结构域中的至少一个氨基酸修饰(例如，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，其被定义为从氨基酸231-341延伸。在某些实施方案中，抗体包含至少2个氨基酸修饰(例如，具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，其中至少一个这样的修饰是在CH3区域中，且至少一个这样的修饰是在CH2区域中。还包括在铰链区中的氨基酸修饰。在一个实施方案中，包括在Fc区的CH1结构域中的氨基酸修饰，其被定义为从氨基酸216-230延伸。
可以做出Fc修饰的任意组合，例如在以下文献中公开的不同修饰的任意组合：美国专利号US,7,632,497、7,521,542、7,425,619、7,416,727、7,371,826、7,355,008、7,335,742、7,332,581、7,183,387、7,122,637、6,821,505和6,737,056；PCT公开号WO2011/109400、WO 2008/105886、WO 2008/002933、WO 2007/021841、WO 2007/106707、WO 06/088494、WO 05/115452、WO 05/110474、WO 04/1032269、WO 00/42072、WO06/088494、WO 07/024249、WO 05/047327、WO 04/099249和WO04/063351；和Presta,L.G.等人(2002)Biochem.Soc.Trans.30(4):487-490；Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.26；277(30):26733-26740和Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276(9):6591-6604)。
抗-KIR3DL2抗体可以包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰(例如，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，使得所述分子与包含野生型Fc区的分子相比具有增强的效应子功能，任选地其中变体Fc区包含在位置221、239、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、332、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439中的任意一个或多个处的置换。在一个实施方案中，抗-KIR3DL2抗体可以包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰(例如，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸修饰)，使得所述分子与包含野生型Fc区的分子相比具有增强的效应子功能，任选地其中变体Fc区包含在位置329、298、330、332、333和/或334中的任意一个或多个处的置换(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A置换)。
在一个实施方案中，具有变体或野生型Fc区的抗体可以具有改变的糖基化模式，该模式增加抗体的Fc受体结合能力。这样的碳水化合物修饰可以例如通过在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达所述抗体来实现。在本领域中已经描述了具有改变的糖基化机构的细胞，并且可以用作在其中表达重组抗体以由此生产具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。参见，例如，Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-1,以及,欧洲专利号:EP 1,176,195；PCT公开WO06/133148、WO 03/035835、WO 99/54342，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。
通常，这样的具有改变的糖基化的抗体是“糖优化的”，使得所述抗体具有产生某些合乎需要的性能的特定N-聚糖结构，包括、但不限于，与以下抗体相比，增强的ADCC和效应细胞受体结合活性：由鼠骨髓瘤NSO和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的、未修饰的抗体或具有天然存在的恒定区的抗体(Chu和Robinson,Current Opinion Biotechnol.2001,12:180-7)，如在本文实施例部分中生产的表达HEK293T的抗体，或常用于生产重组治疗性抗体的其它哺乳动物宿主细胞系。
在哺乳动物宿主细胞中生产的单克隆抗体含有在每个重链的Asn297处的N-连接的糖基化位点。在抗体上的聚糖通常是复杂的二天线结构，其具有非常低的或不具有对分N-乙酰基葡糖胺(对分GlcNAc)和高水平的核心岩藻糖基化。聚糖末端含有非常低的或不含有末端唾液酸和可变量的半乳糖。关于糖基化对抗体功能的影响的综述，参见，例如，Wright&Morrison,TrendBiotechnol.15:26-31(1997)。大量工作表明，抗体聚糖结构的糖组成的变化可以改变Fc效应子功能。认为促成抗体活性的重要碳水化合物结构是通过α-l,6连接附着于Fc区N-连接的寡糖的最里面的N-乙酰基葡糖胺(GlacNAc)残基的岩藻糖残基(Shields等人,2002)。因此可以生产在N-连接的聚糖(低岩藻糖基化的N-连接的聚糖)上具有降低的岩藻糖含量的抗体。
FcγR结合要求共价连接在人IgGl、IgG2或IgG3型的Fc区中的保守Asn297的寡糖的存在。最近已经将未岩藻糖基化的寡糖结构与惊人地增加的体外ADCC活性相关联。“Asn 297”表示位于Fc区中的位置297附近的氨基酸天冬酰胺；基于抗体的微小序列变异，Asn297还可以位于上游或下游一些氨基酸(经常不超过+3个氨基酸)。
在历史上，在CHO细胞中产生的抗体含有约2-6％的未岩藻糖基化的群体。已经报道YB2/0(大鼠骨髓瘤)和Lecl3细胞系(CHO系的凝集素突变体，其具有有缺陷的GDP-甘露糖4,6-脱水酶，从而导致GDP-岩藻糖或GDP糖中间体的缺乏，所述中间体是α6-岩藻糖基转移酶的底物)会产生具有78-98％未岩藻糖基化的物质的抗体。在其它实施例中，可以采用RNA干扰(RNAi)或敲除技术来工程改造细胞以降低FUT8mRNA转录物水平或完全敲除基因表达，并且已经报道这样的抗体含有多达70％的未岩藻糖基化的聚糖。
与KIR3DL2结合的抗体可以在Asn297处被糖链糖基化，所述抗体通过它的Fc部分表现出对FcγRIII的增加的结合亲和力。在本发明的一个实施方案中，抗体将包含恒定区，所述恒定区包含在Fc区中的至少一个氨基酸改变，所述改变会改善抗体与FcyRIIIa的结合和/或ADCC。
在一个方面，所述抗体在它们的恒定区中被低岩藻糖基化。这样的抗体可以包含氨基酸改变，或可以不包含氨基酸改变，但是在产生这样的低岩藻糖基化的条件下生产或处理。在一个方面，抗体组合物包含本文描述的嵌合抗体、人或人源化抗体，其中所述组合物中的至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或基本上所有的抗体物质具有恒定区，所述恒定区包含缺少岩藻糖的核心碳水化合物结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)。在一个实施方案中，提供了抗体组合物，其不含有包含具有岩藻糖的核心碳水化合物结构的抗体。核心碳水化合物优选地是在Asn297处的糖链。
在一个实施方案中，提供了抗体组合物，例如包含结合KIR3DL2的抗体(其在Asn297处被糖链糖基化)的组合物，其中所述抗体被部分地岩藻糖基化。部分地岩藻糖基化的抗体的特征在于，所述组合物中的抗-KIR3DL2抗体(其缺少在Asn297处的糖链内的岩藻糖)的比例为20％至90％，优选20％至80％，优选20％至50％、55％、60％、70％或75％，35％至50％、55％、60％、70％或75％，或45％至50％、55％、60％、70％或75％。优选地，所述抗体是人IgGl或IgG3类型。
所述糖链可以进一步表现出任何特征(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构的存在和比例)，包括与得自人细胞的抗体的Asn297连接的N-连接的聚糖的特征，或在啮齿动物细胞、鼠细胞(例如CHO细胞)或禽细胞中重组地表达的抗体的特征。
在一个实施方案中，在缺少岩藻糖基转移酶的细胞中表达抗体，使得所述细胞系生产在它们的核心碳水化合物中缺少岩藻糖的蛋白。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的核心碳水化合物上缺少岩藻糖。这些细胞系通过使用2种替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而建立(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704；和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22,其公开内容通过引用并入本文)。其它例子已经包括使用反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰在功能上破坏FUT8基因。在一个实施方案中，在具有功能上被破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系中表达抗体，使得通过减少或消除α-1,6键相关的酶，在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。
在一个实施方案中，在经工程改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(l,4)-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶III(GnTHI))的细胞系中表达抗体，使得在经工程改造的细胞系中表达的抗体表现出增加的对分GlcNac结构，该结构导致抗体的增加的ADCC活性(Umana等人的PCT公开WO 99/54342；和Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180,其公开内容通过引用并入本文)。
在另一个实施方案中，表达抗体，并使用岩藻糖苷酶切割岩藻糖基残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶会从抗体除去岩藻糖基残基(Tarentino,等人(1975)Biochem.14:5516-5523)。在其它实施例中，可以用糖基化抑制剂处理生产抗体的细胞系；Zhou等人.Biotech.和Bioengin.99:652-665(2008)描述了用α-甘露糖苷酶I抑制剂几夫碱处理CHO细胞，从而导致具有未岩藻糖基化的寡甘露糖-型N-葡聚糖的抗体的生产。
在一个实施方案中，在天然地具有低酶活性(就将岩藻糖基添加至结合抗体的Fc区的N-乙酰基葡糖胺而言)或不具有酶活性的细胞系中表达抗体，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。细胞系的其它例子包括变体CHO细胞系、Led 3细胞(其具有减小的将岩藻糖基连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力)，也导致在宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(WO 03/035835(Presta等人)；和Shields,RX.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740,其公开内容通过引用并入本文)。在另一个实施方案中，在禽细胞、优选天然地产生具有低岩藻糖含量的抗体的细胞(Vivalis,法国)中表达抗体，例如WO2008/142124。还可以在植物起源的细胞系中生产低岩藻糖基化的聚糖，例如WO 07/084926A2(Biolex Inc.)、WO 08/006554(Greenovation Biotech GMBH),其公开内容通过引用并入本文。
在诊断和治疗中的应用
在某些实施方案中，使用本发明的抗体从生物样品中纯化或鉴别KIR3DL2阳性细胞。生物样品可以得自患者(例如为了诊断或离体治疗目的)，或得自个体或非人灵长类动物，以得到这样的细胞的来源(为了研究目的)。
使用本发明的抗体，利用许多标准方法中的任一种，可以纯化或鉴别KIR3DL2阳性细胞。例如，使用FACS扫描仪，使用经标记的对KIR3DL2且任选地对通常存在于细胞上的其它细胞表面分子特异性的抗体，可以筛分周围血细胞，所述其它细胞表面分子是例如CD4、CD8或CD30(对于T细胞)；CD4 CD2+、CD3+、CD5+、CD8-、CD28+、CD45RO+和/或TCRαβ+(对于塞扎里综合征中的恶性细胞)；在炎症性疾病、自身免疫性疾病或心血管疾病中的CD4+(任选地CD4+和CD28-)。
另外，可以将抗体缀合至或共价地连接至固体支持物并用于从生物样品(例如，从得自患者或其它个体的血液样品或粘膜组织活组织检查)纯化或鉴别KIR3DL2阳性细胞或表达KIR3DL2的任何细胞。具体地，在允许样品内的细胞结合抗体的条件下，将生物样品放置成与抗体接触，然后从固体支持物结合的抗体洗脱细胞。
不论用于分离、纯化或鉴别KIR3DL2阳性细胞的方法如何，用于该目的的能力可用于众多目的，例如诊断以表达KIR3DL2的细胞的病原性繁殖为特征的障碍(通过评估得自患者的KIR3DL2阳性细胞的数目或活性或其它特征)，或评价抗体或其片段或衍生物的调节患者的细胞的活性或行为的能力(例如，在本文描述的使用抗体的处理之一之前)。进一步，纯化的KIR3DL2阳性细胞可用于研究背景中，例如，以更好地表征细胞和它们的不同性能和行为，以及鉴别可以用于调节它们的行为、活性或增殖的化合物或方法。所述抗体还可以用在诊断方法中，例如在检测细胞(例如得自患者的疾病细胞)上的KIR多肽的方法中。
本公开内容也提供了药物组合物，其包含特异性地结合细胞表面上的KIR3DL2多肽的抗体。所述抗体优选地抑制细胞的生长或活性(例如细胞因子产生)和/或导致KIR3DL2阳性细胞的消除，优选地通过诱导CDC和/或ADCC。所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
本公开内容进一步提供了在有此需要的患者中抑制KIR3DL2-阳性细胞的生长或活性和/或减少KIR3DL2-阳性细胞的方法，所述方法包括给所述患者施用本文描述的组合物的步骤。这样的处理方法可以用于许多障碍，包括、但不限于CTCL、SS和MF、炎症性病症、自身免疫性病症和心血管病症。
不论CD4+CTCL的形式如何，存在在它们的表面处表达KIR3DL2的恶性CD4+T细胞。KIR3DL2因而覆盖CD4+CTCL的范围，特别是塞扎里综合征(“SS”)、转化的蕈样肉芽肿病(“转化的MF”)、淋巴瘤样丘疹病(“LP”)和CD30+淋巴瘤。
诊断(例如CTCL诊断)可以是基于KIR3DL2在从被怀疑的身体区域收集的CD4+细胞的表面处的存在的分析(例如，当怀疑转化的MF时，皮肤红皮病样品；或当怀疑更侵袭性的CTCL形式诸如SS时，外周血样品)。一旦在这些CD4+T细胞的表面处检测到KIR3DL2多肽，就通常可以得出结论：CD4+T细胞是肿瘤性的。可以在从疑似SS患者收集的外周血样品中测量CD4+KIR3DL2+T细胞的百分比，并且这样的百分比基本上对应于在该患者的外周血中实际存在的恶性SS细胞的百分比(对于KIR3DL2+、CD4+细胞，通常在±10％范围或甚至±5％范围内)。因此，本文描述的KIR3DL2和抗-KIR3DL2抗体可以用在疾病、特别是SS的分期中。
就KIR3DL2是CTCL的通用标志物而言，可以将抗体与CTCL的其它治疗或诊断标志物联合使用。例如，存在于恶性CD4+T细胞的表面处的CD30指示，患者具有特定形式的CD4+CTCL，其在本领域中被称作CD30+淋巴瘤。因此，CD30是特定形式的CTCL(CD30+淋巴瘤)的CTCL标志物，但是CD30不会覆盖CD4+CTCL的每种形式，因为就CD4+CTCL诸如SS、转化的MF或LP而言，不一定存在在它的表面处表达CD30的恶性CD4+T细胞。因此，除了KIR3DL2以外，可以使用CD30作为CTCL诊断和治疗中的标志物。此外，患者具有表达CD30的CD4+CTCL的发现可以指示，该患者适合于用抗-KIR3DL2抗体和抗-CD30抗体治疗；任选地，所述患者然后可以用抗-KIR3DL2抗体和抗-CD30抗体治疗。
在某些实施方案中，在施用抗-KIR3DL2抗体或组合物之前，评估CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD30、CD45RO和/或TCRαβ在得自患者的细胞(例如病原性细胞)上的存在。然后可以用抗-KIR3DL2抗体或组合物处理其细胞表达(或不表达，根据力图靶向的特定障碍和细胞)标志物的患者。在某些实施方案中，在施用抗-KIR3DL2抗体或组合物之前，评估KIR3DL2在患者的细胞上的存在，例如，以确定KIR3DL2-阳性细胞在患者中的相对水平和活性以及以证实抗体与患者细胞的结合效力。然后可以用抗-KIR3DL2抗体或组合物处理其细胞表达KIR3DL2的患者。这可以如下完成：从障碍部位得到PBL或细胞的样品，并试验(例如，使用免疫测定)以确定标志物(诸如CD4、CD8、CD30或KIR3DL2)在细胞上的相对优势(prominence)。
在一个实施方案中，在力图抑制患者的KIR3DL2-阳性细胞的活性或生长、或减少所述细胞的情况下，评估抗-KIR3DL2抗体的抑制患者的KIR3DL2-阳性细胞的增殖或减少所述细胞的能力。如果抗-KIR3DL2抗体或组合物减少KIR3DL2-阳性细胞，确定所述患者对使用抗-KIR3DL2抗体或组合物的治疗有应答，且任选地用抗-KIR3DL2抗体或组合物治疗所述患者。
在某些实施方案中，所述方法可以包括以下额外步骤：给所述患者施用适当的其它(第二种)治疗剂，其选自免疫调节剂、免疫抑制剂、激素剂、化学治疗剂、结合在表达KIR3DL2的细胞上存在的多肽的第二抗体(例如减少抗体)。这样的其它试剂可以与所述抗体一起作为单一剂型或作为单独剂型施用给所述患者。
抗体的剂量(或抗体和其它治疗剂共同地的剂量)足以可检测地诱导、促进和/或增强在患者中的治疗应答。在单独施用的情况下，理想地在导致对患者的可检测的组合治疗益处的条件(例如，关于时机、剂量的数目等)下施用抗体、片段或衍生物和其它治疗剂。
蕈样肉芽肿病和更侵袭性的塞扎里综合征代表CTCL的最常见形式。MF/SS的临床进程通常是无痛的，具有在长时间段内缓慢地发展的瘙痒红斑状区域。但是，最终，红斑状斑块变得逐渐浸润，发展成斑块，并最后发展成溃疡性肿瘤。MF/SS的预后是基于目前的疾病程度。患有I期疾病的患者具有20年或更久的中间存活期，与此相比，患有III/IV期疾病的患者的生存中值为大约3-4年。
本文描述的组合物可以与可用于治疗特定T细胞恶性肿瘤的任何药剂联合用于治疗。CTCL的不同治疗剂正在使用中，包括皮质类固醇、氮芥、卡莫司汀、局部他克莫司咪喹莫特(3M Inc.)、局部维A酸类和rexinoids(贝沙罗汀；Ligand Pharmaceuticals,San Diego,CA))、以及紫外光疗法(补骨脂素+UVA(PUVA)、窄带UVB和UVB)、光动力学疗法(PDT)和身体辐照。治疗剂也包括组蛋白脱乙酰基酶抑制剂诸如伏林司他(辛二酰苯胺异羟肟酸,)和罗米地新(缩酚酸肽,FK-228,)，选择性地抑制组蛋白脱乙酰基酶同种型1、2、4和6的环肽。也使用化学疗法或联合化学疗法。例子包括吉西他滨、抗叶酸剂类似物诸如普拉曲沙其它疗法包括IMiD(免疫调节药物)，从沙利度胺衍生出的类似物，其具有宽范围的作用，包括免疫和非免疫相关的作用。IMiD种类的代表包括CC-5013(来那度胺；)、CC-4047(Actimid)和ENMD-0995。其它治疗剂包括蛋白体抑制剂诸如硼替佐米一种可逆的26S蛋白酶体抑制剂。也使用干细胞移植。
尽管关于MF/SS不存在现有的护理标准，但是在广泛征状发展之前，存在依赖于对早期延迟疾病的全身性和更有毒的疗法的局部干预的一般趋势。补骨脂素和紫外A辐射(PUVA)(与或不与低剂量的干扰素-α组合)在早期阶段MF/SS中是有效的，从而在大多数患者中诱导完全减轻(CR)。已经成功地使用局部放射疗法或完全皮肤电子束辐照(TSEB)来控制晚期皮肤病。其它身体体外光化学疗法也可能成功地使用，但是通常不可得到。一旦疾病变成外用治疗难治的，就可以施用干扰素-α、rexinoid贝沙罗汀(Ligand Pharmaceuticals,San Diego,CA)、靶向类视色素X受体的合成类视色素类似物、单药剂化学疗法或联合化学疗法。治疗(具体地是皮肤指导的疗法)包括，例如，皮质类固醇、氮芥、卡莫司汀、局部他克莫司和咪喹莫特(3M Inc.)。但是，应答的持续时间经常小于1年，并且最终所有患者具有复发且所述疾病变成难治的。重组IL2-白喉毒素地尼白介素2(DAB389IL-2,Ligand Pharmaceuticals,San Diego,CA)在具有以前的治疗难治(在71位患者中的总客观应答为30％，具有7个月的中间持续时间应答)的Ib期至IV期CTCL的患者中是有效的，且似乎在征状缓解和生活质量中具有有益效果。近年来，已经在I期试验中与贝沙罗汀联合地试验了地尼白介素2，因为它在体外诱导CD25上调。所述组合被良好地耐受，并且在14位患者中的67％中诱导客观应答。最显著的不利事件是用单独的贝沙罗汀已经报道的那些(高甘油三酯血症和由于降低的TSH产生对甲状腺功能的抑制)和3或4级淋巴细胞减少，但是在治疗停止的一个月内消退。
在该研究中没有报告治疗失败的时间。在其它研究中，已经开发了减少表达CD4的细胞的抗-CD4抗体。例子包括全人IgG1抗-CD4抗体扎木单抗(HuMax-CD4；Genmab A/S和TenX BioPharma Inc.)，并且将嵌合的单克隆抗-CD4(cM-T412,Centocor,Malvern,PA)施用给8位具有MF的患者，并在其中的7位中诱导客观应答，但是具有仅5个月的中间应答持续时间。(甲氧沙林,Therakos Inc.Exton,PA)在其它身体体外光化学疗法中也已经表现出效力的征象。人源化的单克隆抗体阿仑珠单抗(hu-IgG1抗-CD52 mAb,Millennium Pharmaceuticals,Inc.和ILEX Oncology,Inc.，在美国由Berlex Laboratories,Inc.,Montville,NJ销售和分配)被指示用于治疗患者中的B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，所述患者已经用烷化剂治疗且具有失败的氟达拉滨治疗。已经在具有晚期MF/SS(III或IV期疾病)的患者中进行了试验，并在至少半数病例(22位患者中的55％)中导致客观应答。它的副作用谱主要由免疫抑制和输液反应组成。独立的回顾研究也描述了在8位患者中的4位中的显著心脏毒性。由于观察到的持久减轻(达到治疗失败的中间时间为12个月，范围为5-32+个月)，与迄今为止报道的所有治疗相比，阿仑珠单抗疗法似乎是具有更有利的中间应答持续时间的治疗。可以使用的其它药剂包括抗-CCR4(C-C趋化因子受体4；CD194)抗体。一个例子是mogamulizumab(KW-0761；AMG-761；商业名称Poteligeo,Kyowa Hakko Kirin Ltd.,Japan和Amgen,USA)，和人源化的抗-CCR4抗体。可以使用的其它药剂包括抗-CD30抗体。一个例子是SGN-35，它是含有与抗-CD30单克隆抗体cAC10(Okeley等人(2010)Clin.Cancer Res.16(3):888-897)连接的有效抗有丝***药物单甲基耳他汀E(MMAE)的抗体-药物缀合物(ADC)；另一个例子是人抗-CD30免疫球蛋白(Ig)G1κ单克隆抗体MDX-060(Medarex Inc.和Bristol Myers Squibb；Ansell等人(2007)J.Clin.Oncol.25:2767-2769)。这些治疗剂中的每一种可以与本公开内容的抗体联合使用。
使用本发明的方法生产的抗体在治疗以下病症中是特别有效的：自身免疫障碍和炎症性障碍，以及心血管病症，最特别是急性冠状动脉综合征、关节炎、类风湿性关节炎、风湿样血管炎、***性红斑狼疮、多发性硬化和韦格纳坏死性肉芽肿病、椎关节炎。一般而言，本发明的方法可以用于治疗至少部分地由表达KIR3DL的细胞(例如，NK细胞或T细胞、产生IL-17A的促炎T或NK细胞、表达KIR3DL2的T细胞诸如Th17细胞或CD4+CD28-细胞)的存在或活性造成的任意障碍，且其因此可以通过选择性地杀死或抑制表达KIR3DL2的细胞的增殖或活化而有效地治疗。
在某些实施方案中，在施用抗-KIR3DL2抗体之前，评估作为特定障碍的基础的细胞上的KIR3DL2的表达。这可以如下完成：从障碍部位(例如，从RA患者中的滑膜)得到PBL或细胞的样品，并试验(例如使用免疫测定)以确定标志物(诸如CD4、CD28等、以及KIR3DL2)在细胞上的相对优势(prominence)。还可以使用其它方法来检测KIR3DL2和其它基因的表达，诸如基于RNA的方法，例如，RT-PCR或RNA印迹法。
所述治疗可以包括多轮抗体或化合物施用。例如，在第一轮施用之后，通常重新测量患者中表达KIR3DL的T或NK细胞(例如，CD4+CD28-T细胞、恶性CD4+T细胞)的水平和/或活性，并且，如果仍然升高，可以进行另一轮施用。以此方式，可以进行多轮受体检测和抗体或化合物施用，例如，直到所述障碍处于控制之下。
当用于治疗自身免疫障碍或炎症性障碍时，本公开内容的抗-KIR3DL2抗体可以与已知可用于治疗特定炎症性障碍、自身免疫障碍或心血管病症的任何药剂联合用于治疗。可以将抗-KIR3DL2抗体与例如甾体类抗炎剂、非甾体类抗炎剂、抗代谢药和用于治疗心血管疾病、炎症性疾病或自身免疫疾病的其它药剂组合。在某些实施方案中，抗炎剂包括甾体类抗炎剂，其包括糖皮质类固醇和盐皮质类固醇。这些可以通过适合用于治疗炎症性障碍的任意方法来施用，所述方法具体地包括口服途径、静脉内途径、肌肉内途径、真皮途径或鼻途径。在某些实施方案中，所述抗炎剂包括非甾体类抗炎剂。这些药剂通常通过抑制环加氧酶和脂氧合酶的作用、或这些酶产生的介质的受体而起作用。非甾体类抗炎化合物包括非选择性的COX抑制剂、选择性的COX抑制剂、以及FLAP拮抗剂和5-脂氧合酶拮抗剂。在某些实施方案中，所述抗炎剂可以包括影响在免疫应答中涉及的细胞增殖的抗代谢药。合适的抗代谢药包括：叶酸盐类似物，诸如甲氨蝶呤；肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，诸如吗替麦考酚酯；和硫唑嘌呤。该组的化合物通常影响DNA复制必需的底物的产生，由此抑制响应于炎症反应而涉及或活化的细胞的增殖。在某些实施方案中，所述抗炎剂是阻断TNF-α(在炎症性障碍中涉及的主要细胞因子)的作用的药剂。在某些实施方案中，所述抗-TNF是阻断TNFα的作用的抗体。一种示例性的抗-TNF抗体是英夫利昔单抗 在其它实施方案中，所述抗-TNFα剂是结合TNFα并阻止它与存在于细胞上的TNF受体的相互作用的受体构建体，例如依那西普在其它实施方案中，所述抗炎剂是具有免疫抑制特性且可用于治疗用本文描述的KIR3DL2抗体治疗的障碍的任意其它药剂(例如抗体药剂)。
药物制剂
可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括、但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，诸如人血清白蛋白，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮,基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡类，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。本文描述的抗体可以用在调节(例如抑制)患者中表达KIR3DL2的细胞的活性的方法中。该方法包括使所述组合物与所述患者接触的步骤。这样的方法可用于预防和治疗目的。
就用于施用给患者而言，配制用于施用给患者的组合物。本文描述的组合物可以通过口服、胃肠外、吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、含服、经***或通过植入药库施用。本文使用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。所述抗体可以以例如约25mg至500mg之间的量存在于单次剂量中。
本文描述的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可以按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介质和溶剂是水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油常用作溶剂或悬浮介质。
为此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸和它的甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻油)也是如此，特别是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬液)中的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂(诸如吐温类、司盘类和其它乳化剂或生物利用度促进剂)也可以用于实现制剂的目的。
本文描述的组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括、但不限于胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液剂。在用于口服应用的片剂的情形下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，可用的稀释剂包括例如乳糖。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和助悬剂组合。如果需要的话，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可替换地，本文描述的组合物可以以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些可以通过将所述试剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋型剂在室温为固体、但是在直肠温度为液体，且因此将在直肠中熔化以释放出药物。这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本文描述的组合物还可以局部地施用，特别是当治疗靶标包括通过局部施用可容易地达到的区域或器官时，包括眼部、皮肤或下肠道的疾病。针对这些区域或器官中的每一种，容易地制备合适的局部制剂。对于局部应用，可以将组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏剂。用于局部施用本文所述化合物的载体包括、但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替换地，还可以将组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳膏剂。合适的载体包括、但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸腊硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
可以将本发明的抗体包含在试剂盒中。所述试剂盒可以任选地进一步含有任何数目的抗体和/或其它化合物，例如，1种、2种、3种、4种或任意其它数目的治疗性抗体和/或化合物。应当理解，试剂盒的内容物的该描述不是以任何方式进行限制。例如，所述试剂盒可以含有其它类型的治疗性化合物。优选地，所述试剂盒也包括关于使用抗体的说明书，例如，其详述了本文中描述的方法。
剂型
通过以低压冻干制剂或水溶液的形式将具有期望的纯度程度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备抗体的治疗制剂进行贮存。关于制剂的一般信息，参见，例如，Gilman等人(编),ThePharmacological Bases of Therapeutics,第8版(Pergamon Press,1990)；Gennaro(编),Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版(Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1990)；Avis等人(编),Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications(Dekker,New York,1993)；Lieberman等人(编),PharmaceuticalDosage Forms:Tablets(Dekker,New York,1990)；Lieberman等人(编)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems(Dekker,New York,1990)；和Walters(编),Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and thePharmaceutical Sciences),第119卷(Dekker,New York,2002)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度是对受体无毒的，且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
示例性抗体制剂描述在例如WO 1998/56418中，其描述了在pH 5.0的抗-CD20抗体的液体多剂量制剂，该制剂包含40mg/mL利妥昔单抗、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇和0.02％聚山梨酯20TM，其具有在2-8℃贮存最少2年的贮存期限。另一种感兴趣的抗-CD20制剂包含在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80TM和无菌注射用水中的10mg/mL利妥昔单抗，pH 6.5。
适合用于皮下施用的低压冻干制剂描述在例如美国专利号6,267,958(Andya等人)中。这样的低压冻干制剂可以用合适的稀释剂重构至高蛋白浓度，并且可以将重构的制剂皮下地施用给本文中要治疗的哺乳动物。
本文中的制剂还可以含有超过一种活性化合物(如上指出的第二种药物)，优选具有互补活性的那些，其不会不利地彼此影响。这样的药物的类型和有效量取决于例如在制剂中存在的B-细胞拮抗剂的量和类型以及受试者的临床参数。上面指出了示例性的第二种药物。
还可以将活性成分封装在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)中或在大乳剂中。这样的技术公开在例如Remington’sPharmaceutical Sciences,出处同上。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是呈成形物的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如醋酸亮丙瑞林DepotTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过穿过无菌过滤膜过滤容易地实现。可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括、但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白(诸如人血清白蛋白)，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡类，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
将在下述实验部分中公开其它方面和优点，其应当视作示例性的，且不是限制本申请的范围。
实施例
实施例1-Generation of抗-KIR3DL2抗体
材料和方法
第一和第二流式细胞计量术筛选
针对与表达KIR3DL2的Sézary细胞系(HUT78和COU-L)和KIR3DL2-转染的肿瘤细胞系(HEK-293T)的结合，在流式细胞计量术中首先筛选抗-KIR3DL2mAb。流式细胞计量术装置包括：FACSarray(BD Biosciences,第一筛选)，FACSCanto II n°1 et n°2(BD Biosciences)(第二筛选)和FC500(Beckman Coulter)(第二筛选)。使用的KIR3DL2+和其它肿瘤细胞系包括：
-在完全IMDM中培养HUT-78(KIR3DL2阳性的Sézary细胞系)；
-HEK-293T(人肾癌)/KIR3DL2和HEK-293T/KIR3DL2结构域0-eGFP细胞系(在完全DMEM中培养)；
-COU-L(KIR3DL2阳性的Sézary细胞系)(在补充了10％人血清AB的完全RPMI中培养)；
-HEK-293T/KIR3DL1和HEK-293T/KIR3DL1-eGFP细胞系(在完全DMEM中培养)；
-B221(B-类淋巴母细胞,CD20阳性的人细胞系)/KIR3DL2细胞系(在含有FCS血清的完全RPMI中培养)；和
-RAJI(伯基特淋巴瘤CD20阳性的人细胞系)/KIR3DL2细胞系(在含有FCS血清的完全RPMI中培养)。
尽管使用的Sezary细胞系在IV或SC转移至免疫受损的小鼠以后都没有生长，KIR3DL2-转染的B221或RAJI细胞在注射至小鼠以后生长成为弥散性(IV)肿瘤或实体(SC)肿瘤。
基于在Gardiner等人,Journal of Immunology 2001(第166卷,第2992-3001页)中可得到的信息，确定在使用的肿瘤细胞系中存在的KIR3DL2基因等位基因。我们确定Sezary细胞系COU-L是等位基因3DL2*003和3DL2*008杂合的，且HUT-78是等位基因3DL2*002和3DL2*007杂合的。所有4个等位基因3DL2*003、3DL2*008、3DL2*002和3DL2*007编码在它们的细胞外结构域中具有差异的KIR3DL2蛋白变体。值得指出的是，用于免疫小鼠的重组KIR3DL2-Fc融合蛋白由不同的KIR3DL2基因等位基因3DL2*006和3DL2*007(克隆1.1，两个等位基因编码相同的细胞外结构域蛋白序列)编码。
KIR3DL2结构域0、1和2细胞系
在补充了丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和10％热灭活的FCS(PAN biotech)的DMEM(Gibco)中培养HEK293T/17细胞。Lipofectamine 2000试剂、Trizol、SuperScript II逆转录酶、pcDNA3.1载体和抗-V5-FITC抗体购自Invitrogen。山羊抗-小鼠(H+L)-PE购自BeckmanCoulter。将得自智人的PBMC(5x106细胞)再悬浮于1ml Trizol试剂中。通过加入200μl氯仿，进行RNA提取。离心(15min,13,000rpm)以后，用500μl异丙醇从水相中沉淀RNA。温育(10min,RT)和离心(10min,13,000)以后，将RNA用70％乙醇洗涤并重新离心(5min,13,000rpm)。将RNA再悬浮于无核糖核酸酶的水中。使用2μg特异性的RNA并按照生产商的说明书，使用SuperScript II逆转录酶得到cDNA。人KIR3DL2(登录号U30272,KIR3DL2等位基因*002)结构域0、结构域1和结构域2序列显示在表4中。
表4
分别使用5’AA GCT AGC GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTCCTC GGT CTC GAT TCT ACG CTC ATG GGT GGT CAG GAC AAA C(SEQID NO:71)(正向)和3’AA GGA TCC CTC TCC TGA TTT CAG CAG GGT(SEQ ID NO:72)(反向)；5’AA GCT AGC GGT AAG CCT ATC CCT AACCCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG ACA GTC ATC CTG CAA TGTTGG(SEQ ID NO:73)(正向)和3’AA GGA TCC CTC TCC TGC CTG AACCGT GGG(SEQ ID NO:74)(反向)；5’AA GCT AGC GGT AAG CCT ATCCCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG AAC GTG ACC TTGTCC TGT AGC(SEQ ID NO:75)(正向)和3’AA GGA TCC ATG CAG GTGTCT GCA GAT ACC(SEQ ID NO:76)(反向)寡核苷酸，通过PCR反应，从cDNA扩增智人KIR3DL2(登录号U30272)结构域0、结构域1和结构域2序列。TA-克隆和测序以后，将序列克隆进pcDNA3.1载体中在NheI和BamHI限制位点之间。将这些构建体***在由MWG Biotech合成的CD33肽前导序列和CD24GPI锚点(CD24GPI锚点DNA和氨基酸序列分别显示在SEQID NO:77和78中)之间(***在BamHI和HindIII限制位点之间)。
在转染进6孔板(5.105个细胞/孔)内的不含抗生素的DMEM中之前24小时，接种HEK-293T/17细胞。根据生产商的说明书使用Lipofectamine 2000，使用5μg不同的pcDNA3.1/KIR3DL2结构域0、pcDNA3.1/KIR3DL2结构域1或pcDNA3.1/KIR3DL2结构域2构建体进行转染。为了确保用于转染的DNA纯度，使用得自Qiagen的Maxi-prep无内毒素的试剂盒。以2/1固定使用的Lipofectamine/DNA比率。在用于流式细胞计量术实验的转染之后48小时，收获细胞。
免疫接种
用重组KIR3DL2-Fc融合蛋白(等位基因*006)免疫小鼠。通过流式细胞计量术，在HUT78、COU-L和HEK-293T/KIR3DL2结构域0–eGFP上试验生长中的杂交瘤的上清液(SN)。通过在96-孔板中的有限稀释技术克隆选自初期筛选的潜在感兴趣的杂交瘤。二次筛选包括通过流式细胞计量术在HUT78、COU-L、HEK-293T/KIR3DL1结构域0-eGFP和HEK-293T/KIR3DL2结构域0–eGFP上试验亚克隆的上清液来选择目标杂交瘤。将阳性的亚克隆注射进小鼠中以产生腹水，并在使用rec KIR3DL2芯片的Biacore测定中试验之前纯化目标抗体，随后进行基于与表达人KIR3DL2的细胞的结合的不同测定形式。在选择的克隆中，包括抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、4B5、5H1、1E2、1C3和20E9的上清液。基于允许在D0或D1/2结构域结合中的选择的筛选，抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、4B5、5H1和1E2结合存在于细胞外结构域0(D0)上的KIR3DL2，而1C3和20E9结合存在于结构域1/2(D2)上的表位。
通过PCR从每种抗体的cDNA扩增选择的抗体的重(VH)和轻(VL)链的可变结构域的序列。将扩增的序列在琼脂糖凝胶上泳动，然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。然后根据生产商的说明书使用InFusion***(Clontech)将VH和VL序列亚克隆进Lonza表达载体(Double-Gene载体)中。测序以后，使用Promega PureYieldTMPlasmid Maxiprep System，将含有VH和VL序列的载体制备为Maxiprep。然后根据生产商的说明书使用Invitrogen的Lipofectamine 2000，将载体用于HEK-293T细胞转染。
实施例2–不会诱导KIR3DL2内化的抗体
简而言之，没有抗体或将20μg/mL的抗-KIR3DL2结构域0抗体、或抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、4B5、5H1、1E2、1C3或20E9与得自5个不同人供体的新鲜塞扎里综合征细胞在37℃一起温育24h。然后将细胞洗涤、固定并使用得自Beckman Coulter的IntraPrep透化试剂进行渗透化处理。用山羊抗-小鼠Ab(经过GAM-PE标记)揭示KIR3DL2-结合的10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、4B5、5H1、1E2、1C3或20E9 Ab的存在。表6分别显示了温育24h以后抗-KIR3DL2结构域0抗体13H1的例子。表5显示了每种不同供体中的13H1的荧光的强下降，从而证实该抗体的结合下调SS细胞上的KIR3DL2的表达。关于抗-D0抗体4B5以及一定范围的抗-D1抗体，得到了类似的结果。相反，抗-KIR3DL2结构域0或结构域2抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、5H1、1E2、1C3和20E9没有导致荧光的下降，从而指示该抗体没有下调SS细胞上的KIR3DL2的表达。表6显示了抗体10G5的代表性实施例。
表5
表6
实施例3–没有内化进塞扎里综合征细胞系中的抗体
使用HUT78 SS细胞系，通过荧光显微术，评估抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、13H1、4B5、5H1、1E2、1C3和20E9、以及抗体AZ158(抗-结构域0mAb)和其它抗-D1抗体的内化。
材料和方法：
将Hut-78细胞与10μg/ml的不同抗体一起在4℃温育1H。在该温育以后，将细胞在37℃固定(t＝0H)或温育2H。然后将温育了2H的细胞固定并染色。使用与Alexa594(Invitrogen,A11032)偶联的山羊抗-小鼠抗体，将抗体染色。使用兔抗-LAMP-1抗体(Abcam,ab24170)将LAMP-1隔室染色，所述抗体用与FITC(Abcam ab6717)偶联的山羊抗-兔多克隆抗体显影。使用Apotome装置(Zeiss)获取图像，并使用Axiovision软件进行分析。
结果：
抗-KIR3DL2mAb显示为红色，而LAMP-1隔室显示为绿色。在加入抗体时，被染成红色的KIR3DL2显示在细胞表面处，而绿色的LAMP-1在细胞内显示为绿色。但是，在加入抗体以后2小时，抗体AZ158、13H1和4B5和抗-D1抗体中的每一种造成红色染色与绿色染色共定位，以及在细胞表面处红色染色的减少，从而指示AZ158、13H1和4B5和抗-D1抗体被快速内化。但是，抗体10F6、2B12、18C6、9E10、10G5、5H1、1E2、1C3和20E9没有被内化，且在加入抗体以后2小时，红色染色完全保留在细胞表面上。
实施例4-抗体能够通过补体依赖性的机制(CDC)杀死表达KIR3DL2的靶标
简而言之，在White透明底P96孔(Ref 655098-Greiner)中在标准培养基中提供50μl经稀释的20μg/ml抗体(2x浓缩)，向其中加入50μl在标准培养基中的200万/ml的细胞混悬液(100,000个细胞/孔)，并在4℃温育30min。加入5μl/孔的新鲜重构的补体(Ref CL3441-Cedarlan)，随后在37℃温育1H。加入100μl/孔的Cell Titer Glo(Ref G7572-Promega)，随后在室温避光温育10min。使用光度计(VICTOR)读出结果。
使用从兔血纯化的补体，在体外评估(address)我们的抗-KIR3DL2mAb的募集补体和裂解KIR3DL2-转染的B221细胞的能力。
图6显示了抗体的介导CDC的能力；结合D0结构域的抗-KIR3DL2mAb为灰色，结合D1结构域的抗体为黑色。对于亲本鼠mAb，mAb的同种型对该测定的结果具有最突出的影响，因为IgG2b鼠mAb比任意其它同种型(小鼠IgG1根本不会结合补体)更有效地结合补体。
为了评估在与抗-KIR3DL2 mAb结合以后KIR3DL2内化对补体介导的靶细胞死亡的影响，我们使用了mo19H12，即诱导KIR3DL2向HUT78 Sezary细胞系和B221-KIR3DL2中的快速内化的抗-KIR3DL2抗体。在与补体温育之前，我们将靶标B221-KIR3DL2靶标与mo19H12一起在4℃(阻断内化)或37℃(允许最佳内化)预温育。然后，加入补体，并如上温育和测量CDC。
在该实验中，KIR3DL2在结合以后的内化完全废除了mo19H12的用补体募集杀死B221-KIR3DL2的能力，而在限制内化的温度条件下，明显观察到mo19H12的CDC活性(图7)。使用抗-CD20利妥昔单抗作为对照，其介导针对CD20+靶标的CDC，但是不会诱导CD20内化。
将选择的mAb嵌合进人IgG1中，以使它们能够介导效应子功能(ADCC和CDC)。图8显示了嵌合的抗-KIR3DL2mAb在体外介导针对B221-KIR3DL2的CDC的能力。
某些mAb克隆如1E2和10G5在嵌合以后已经获得通过CDC机制杀死KIR3DL2阳性靶标的能力。在该实验中，对于抗-D0mAb，有效的内化(诸如由13H1诱导，呈黑色)可能阻止如具体地关于1E2和10G5所观察到的最佳效力。
实施例5-抗体能够通过抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)杀死表达KIR3DL2的靶标
在基于放射性的51Cr释放实验(从预负载的靶细胞释放的放射性水平与它们的死亡成比例)中，监测通过ADCC机制实现的细胞裂解。给100万个靶细胞在37℃加载51Cr持续1小时，并洗涤3次。每孔接种3,000个细胞(U形底96-孔平板)，并以10或20μg/ml终浓度(或如果研究剂量-响应关联的话，递增浓度)加入试验mAb。以确定的效应物:靶标比率(通常10:1)加入效应细胞，并将混合物在37℃温育4h。在Lumaplate设备上分析上清液。当使用嵌合的huIgG1 mAb时，效应细胞是从PBMC纯化的同种异体人NK细胞，所述PBMC取自健康的志愿者供体。
对于最佳评估，通常使用从不同的亲本鼠抗-KIR3DL2 mAb制备的嵌合huIgG1 mAb进行ADCC实验。图9显示了在相同终浓度(10μg/ml)试验的一系列抗-KIR3DL2 mAb的通过ADCC介导的机制杀死原型Sezary细胞系HUT78的能力。
图10显示了一个类似的实验，其中使用的靶细胞是KIR3DL2-转染的B221，其对ADCC介导的抗-KIR3DL2mAb的杀死总体上更敏感。用灰色显示的mAb诱导受体的内化，且似乎具有比其它4种没有诱导KIR3DL2内化的mAb更低的有效性。
图11显示了在剂量范围实验中抗体的对比，嵌合的huIgG1抗-KIR3DL2mAb介导针对表达KIR3DL2的B221靶标的ADCC的能力，没有诱导靶标(10F6、2B12和10G5)的内化的mAb的效力特性优于诱导KIR3DL2内化的mAb(13H1和抗-D0mAb 15C11和18B10)的效力特性。
实施例6–在表达KIR3DL2的人肿瘤的小鼠异种移植物模型中的活性
材料和方法
用于B221-KIR3DL2和RAJI-KIR3DL2模型的免疫受损的小鼠是购自Charles River Laboratories的NOD-SCID。在下述模型中，在第0天(D0)，即治疗起始前1天(D1)，静脉内植入500万人肿瘤细胞(在100μl作为媒介物的PBS中)。从D1开始，用在PBS中稀释的不同剂量的mAb(剂量适合于小鼠体重)静脉内治疗小鼠，在整个实验持续期间每周注射2次。
取决于实验，对照组包括：
-PBS/安慰剂治疗的小鼠，作为正常的/未受影响的肿瘤生长的对照；
-注射了相同剂量的针对无关抗原的同种型对照-匹配的mAb的小鼠。
将小鼠称重，并每2-5天(取决于模型)观察临床征象。将体重变化百分比计算为与在肿瘤移植物植入之前D0时的体重之比或与在实验过程中达到的最高体重之比。记录小鼠死亡或重要的重量减轻，并用于绘制Kaplan-Meier存活曲线，并相对于对照小鼠组计算存活的改善。
结果
图12显示了一个实验的结果(n＝6只NOD-SCID小鼠/组)，其中针对皮下(SC)B221-KIR3DL2异种移植物试验了3种IgG2b同种型鼠抗-KIR3DL29E10和19H12(二者都以300μg/小鼠提供，每周2次)的效力。与PBS和内化性的抗-D1/D2抗体19H12相比，非内化性的抗-D0抗体9E10表现出增加的存活。
图13显示了另一个实验的结果(n＝6只NOD-SCID小鼠/组)，其中针对皮下(SC)RAJI-KIR3DL2异种移植物试验了鼠抗-KIR3DL219H12的效力(以300μg/小鼠提供，每周2次)。在体外，KIR3DL2-转染的RAJI细胞在mAb结合以后表现出与B221-KIR3DL2或Sezary细胞系相比更少的内化。mo19H12mAb在RAJI-KIR3DL2异种移植物模型中比在B221-KIR3DL2模型中更有效。这是由于靶标在体内的更少有效内化。
实施例7-配体阻断
材料和方法
四聚体染色的抗体抑制
以前已经描述了B27二聚体和HLA-A3四聚体制备和FACS染色(Kollnberger,等人(2007)Eur J Immunol 37:1313-1322)。制备HLA-A3四聚体。对于抗体抑制实验，将用KIR3DL2转导的Baf3细胞用5μg抗体或IgG1/IgG2a同种型对照(Biolegend UK Ltd)在4℃染色20分钟，然后用四聚体在室温染色20分钟。然后在BD Fortessa FACS机器上进行FACS分析之前，如前所述将染色的细胞洗涤和固定。使用Flowjo软件(Tree star Inc US)进行FACS分析。
Jurkat KIR3DL2 CD3ε报告细胞的抗体抑制
以前已经描述了被转导成表达KIR3DL2CD3ε融合蛋白的Jurkat报告细胞(Payeli,等人(2012)Arthritis Rheum.)。对于抗体抑制实验，将100,000/孔的报告细胞在RPM1640(Sigma，补充了10％FCS和青霉素和链霉素)中与10μg抗体或同种型对照抗体一起在4℃染色20分钟。随后，以200μl的终体积，用200,000个亲本LCL.LBL.721.221细胞(以后被称作221细胞)或经HLA-B27或对照HLA类别1转染的221细胞刺激报告细胞。通过根据生产商的说明书进行的ELISA(Ebiosciences UK Ltd)，在过夜刺激后收获上清液用于IL-2测定。
结果
D0结构域-特异性抗体抑制KIR3DL2转导的细胞的HLA-A3和B27二聚体(B272)四聚体染色
首先，我们研究了D0和D1/D2结构域-特异性的抗-KIR3DL2抗体的抑制KIR3DL2的HLA-A3和B27二聚体四聚体染色的能力。D0-结构域特异性的抗-KIR3DL2抗体1E2和13H1一致地抑制KIR3DL2转导的Baf3细胞的HLA-A3和B27重链(B272)染色(图14和16A)。2B12抑制B272，同时表现出对KIR3DL2的HLA-A3四聚体染色的可忽略的作用。相反，10G5没有抑制HLA-A3或B272四聚体对KIR3DL2的染色。
D2结构域特异性抗体1C3抑制KIR3DL2的HLA-A3染色，但是没有抑制B27二聚体(B272)四聚体染色
D2特异性抗体1C3一致地抑制KIR3DL2转导的细胞的HLA-A3四聚体染色(图15和16B)。相反，1C3MAb没有影响KIR3DL2Baf3细胞的B272染色，且D1特异性抗体没有显著影响KIR3DL2的HLA-A3或B272四聚体染色(图15和16B)。
D0结构域(但是D1/D2没有)特异性的抗-KIR3DL2 MAb抑制KIR3DL2报告细胞与HLA类别1的相互作用。
我们接下来通过研究抗体对用221转染子刺激的、KIR3DL2CD3ε转导的Jurkat报告细胞的IL-2产生的影响，确定了KIR3DL2特异性抗体对HLA-B27和其它HLA-类别1的KIR3DL2识别的影响。与我们的先前发现一致，与用表达对照HLA类别1的细胞刺激相比，表达HLA-B27的221细胞一致地刺激大6倍的KIR3DL2报告细胞的IL-2产生(图17)。
D0结构域-特异性抗体2B12、1E2、10G5和13H1都在一定程度上抑制用HLA-B27转染的细胞刺激的KIR3DL2报告细胞的IL-2产生(图4)，其中2B12和1E2表现出最大抑制作用。相反，D2特异性抗体1C3对HLA-B27的报告细胞识别没有显著影响。
D0结构域-特异性抗体也抑制用221细胞(其经过HLA-B7、HLA-B35和HLA-A2和HLA-A3转染)刺激的KIR3DL2报告细胞的IL-2产生，尽管作用与用HLA-B27刺激细胞时观察到的作用相比不太显著。相反，D2特异性抗体1C3对用221细胞(其经过HLA-B7、HLA-B35和HLA-A2和HLA-A3转染)刺激的KIR3DL2报告细胞的IL-2产生没有显著影响。
总结
在这里我们证实了针对KIR3DL2的D0结构域的单克隆抗体(2B12、1E2、13H1)抑制与不含β2m的B27重链二聚体(B272)和β2m-相关的配体诸如HLA-A3的结合。相反，针对KIR3DL2的D2结构域的抗体(1C3)仅抑制与HLA-A3的相互作用，且对B272四聚体结合几乎没有影响。
尽管当用HLA-B27刺激时KIR3DL2报告T细胞产生IL-2，但是HLA-B7、HLA-B35、HLA-A2和HLA-A3转染的LBL.721.221B细胞报告细胞一致地响应于HLA-B27而产生高6倍的IL-2。KIR3DL2与表达HLA-B27和其它HLA-类别1的B细胞相互作用被D0结构域特异性抗体2B12和1E2一致地抑制，且在更低的程度上被13H1抑制。这提示，KIR3DL2的D0结构域可能对于不同HLA-类别1的共同共有特征具有某种亲和力。KIR3DL2 D0结构域可能至少部分地结合在不同HLA类别1之间共有的HLA-B27中的区域。增加的KIR3DL2对HLA-B27的亲合力可能源自B27重链的二聚化。
已经报道，KIR3DL2的3个免疫球蛋白样结构域D0、D1和D2参与结合配体。得自抗体抑制研究的结果提示，KIR3DL2与HLA类别1的优势接触是通过D0结构域。值得注意的是，D2抗体1C3仅抑制HLA-A3与KIR3DL2的结合，不抑制与B27二聚体的结合。因此，我们提出，D0结构域接触残基在不同的HLA-类别1之间是保守的，并且D1和D2结构域接触肽MHC复合物中的多晶型区域和肽。鉴别的抗体可以用于治疗、诊断和其它研究应用(取决于特定应用)，以选择性地阻断不同的配体，或阻断多种配体，或不与配体竞争对KIR3DL2的结合。
实施例8-表位作图
开发了KIR3DL2突变体以鉴别具有期望的结合性能的KIR3DL2-特异性抗体。抗体有利地结合群体中的大多数或所有主要KIR3DL2等位基因(以等位基因频率的方式)，而不结合主要KIR3DL1等位基因(例如等位基因*00101)。
制备了与在KIR3DL1和KIR3DL2之间不同的残基对应的突变。制备第一组突变，其中在KIR3DL1中的氨基酸被置换进KIR3DL2中。但是，这些突变的蛋白中的许多没有在细胞表面处表达，从而提示，掺入KIR3DL1会深度影响整个KIR3DL2分子的折叠。具体地，在下面表7A中所示的簇D21、D22、D23、D26和D27中的突变体没有在细胞表面处表达。
表7A
簇 在KIR3DL1中的残基 在KIR3DL2中的残基
D21 V196；P199；D285；P286 I196；L199；N285；S286
D22 K212；S218 T212；N218
D23 R226 W226
D26 R249 P249
D27 H278；S279；E282；Y281 A278；L279；V282；C281
将其它突变体重新设计和试验，最终的突变集合显示在下面的表7B中。试验了抗体与KIR3DL2的结合以及与不同KIR3DL2突变体的结合。通过PCR制备KIR3DL2突变体(参见下面的表7B)。与下述5’引物ACCCAAGCTGGCTAGCATGTCGCTCACGGTCGTCAGCATG(SEQ ID NO:79)一起使用所有Mx-R引物。与下述3’引物AGCACAGTGGCGGCCGCCTAGAAAA CCCCCTCAAGACC(SEQ ID NO:80)一起使用所有Mx-F引物。将扩增的序列在琼脂糖凝胶上泳动，然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。
为了制备突变体12和21，必须进行第三个PCR。用于这些PCR的引物是：M12a-F引物(5’-GCCACAGGTGCATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCC-3’)(SEQ ID NO:81)和M12b-R引物(5’-TGGGTCACTTGCGGCTGACCACACGCAGGGCAGGG-3’)(SEQ ID NO:82)以及M21a-F引物(5’-CGTGCCCTGCCCTACGTGTGGTCAAACTCAAGTGAC-3’)(SEQ IDNO:83)和M21b-R引物(5’-ATGCAGGTGTCTGGGGATACCAGATTTGGAGCTTGGTTC-3’)(SEQ ID NO:84)。
然后根据生产商的说明书，用InFusion***(Clontech)，将为每种突变体制备的2种或3种PCR产物连接进用限制性酶NheI和NotI消化的pcDNA3.1载体中。
测序以后，使用Promega PureYieldTMPlasmid Maxiprep System，将含有突变序列的载体制备为Maxiprep。然后根据生产商的说明书，使用Invitrogen的Lipofectamine 2000，将载体用于HEK-293T细胞转染。
表7B
试验了每种抗体与野生型KIR3DL2的结合，以及与D0、D1和D2结构域突变体中的每一种的结合。抗体没有显示出与未突变的野生型KIR3DL2(WTaKIR3DL2)的结合的任何损失，但是丧失与一个或多个突变体的结合，由此鉴别出几个表位。
总结显示在表7C和7D中(“+”指示结合没有显著损失，“±”指示结合的下降(或结合的部分损失)，且“-”指示结合的基本上完全损失)。大多数非内化性的D0抗体丧失与突变体2的基本上所有的结合(4种抗体：10F6、2B12、18C6、10G5)。所有这些抗体也具有与突变体2A3的至少部分损失。一种非内化性的D0抗体(9E10)显示出仅与突变体1的结合的丧失。一种非内化性的D0抗体(1E2)仅丧失与突变体2A3的结合。一种抗体(5H1)丧失与突变体6的结合。
除了突变体1和2以外，天然配体阻断性和内化性抗体13H1另外显示出降低的与突变体2A2和MD0/HLA1的结合。
关于结合KIR3DL2的结构域D2的抗体，(都为非内化性的)抗体1C3和20E9丧失与突变体14的结合，以及部分丧失与突变体15和突变体16的结合。
抗体10F6、2B12、18C6和10G5丧失与具有I60N和G62S置换的突变体2的结合，并且与具有P14S、S15A和H23S置换的突变体2A3的结合减小，但是没有丧失与任意其它突变体的结合。因此，这些抗体的主要表位包括残基I60和/或G62(且所述表位任选地进一步包括P14、S15和H23中的一个或多个)。残基60和62是在KIR3DL2的D0结构域内。
抗体13H1丧失与具有R13W、A25T和Q27R置换的突变体1以及具有I60N和G62S置换的突变体2的结合。13H1也具有减小的与突变体2A2(Q56S、E57A)和突变体MD0/HLA1(F9S、S11A)的结合。因此，13H1的表位包括残基F9、S11、Q56和/或E57。这些残基是在D0结构域内。
抗体9E10具有减小的与具有R13W、A25T和Q27R置换的突变体1的结合，但是不结合任意其它突变体。因此，9E10和10G5的表位包括残基R13、A25和/或Q27。
图1显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体1”,“突变体2”,“突变体3”和“突变体6”的突变氨基酸残基，其(以不同的组合)导致抗体结合的丧失。图2显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体1”、“突变体2”和“突变体3”(其(以不同的组合)导致抗体结合的丧失)的突变氨基酸残基，在阴影中显示了邻近残基的残基(F9、S11、P14、F34和/或S140邻近突变体2，且G21、G22、H23、E57、S58、F59、P63和/或H68邻近突变体1)。
抗体5H1丧失与具有R78H和L82P置换的突变体6的结合，但是没有丧失与任意其它突变体的结合。因此，5H1的主要表位包括残基R78和/或L82。残基R78和L82是在KIR3DL2的D0结构域内。邻近这些突变残基的表面暴露的残基还可以为抗体的表位做出贡献。图3显示了KIR3DL2多肽(包括在D0结构域内的部分)的每个面的视图，显示了被指示为“突变体6”(其(以不同的组合)导致抗体结合的丧失)的突变氨基酸残基，显示了不会导致结合丧失的“突变体3”。也在阴影中显示了邻近突变体6附近的残基的残基，其也可以被抗体(K7、Y30、R31、P79、H80、S81、T83、G84、W85、S86和/或A87)结合。
抗体1C3和20E9丧失与具有W226A置换的突变体14的结合。所述抗体另外具有减小的与具有I231M和R246P置换的突变体15以及与具有E239G置换的突变体16的结合。因此，1C3的主要表位包括残基W226。20E9的主要表位可以包括残基I231M和/或R246P，和/或可以另外包括E239。残基W226、I231和R246是在KIR3DL2的D1和D2结构域的连接部的区域中。邻近这些突变残基的表面暴露的残基还可以为抗体的表位做出贡献，包括例如位于KIR3DL2表面的W226表位区域中的残基Q201、K202、P203、S204、S224、S225、S227、S228、N252、R253和/或T254(参考SEQ ID NO:1)，但是它们在KIR3DL2突变的不会导致抗体结合丧失的区域之外(例如突变体12和17)。邻近突变残基I231和R246的表面暴露的残基还可以为抗体的表位做出贡献，包括例如位于KIR3DL2表面的I231/R246表位区域中的残基D230、I231、R244、L245、R246、A247、V248、S275、R277和/或P280(参考SEQ ID NO:1)，但是它们在KIR3DL2突变的不会导致抗体结合丧失的区域之外(例如突变体12和17)。
图4显示了KIR3DL2多肽(包括在D2结构域(D1/D2连接部)内的部分)的视图，显示了被指示为“突变体14”(抗体丧失对它的结合)以及“突变体12”和“突变体17”(其没有造成抗体结合的丧失)的突变氨基酸残基；也在阴影中显示了邻近也可以被结合的残基的残基(Q201、K202、P203、S204、S224、S225、S227、S228、N252、R253和/或T254邻近突变体14)。
图5显示了KIR3DL2多肽(包括在D2结构域(D1/D2连接部)内的部分)的视图，显示了指示为“突变体15”(抗体丧失对其的结合)的突变氨基酸残基；也在阴影中显示了邻近也可以被结合的突变体14附近的残基(D230、I231、R244、L245、R246、A247、V248、S275、R277和/或P280)的残基。
图18、19和20显示了KIR3DL2多肽等位基因*001的视图，显示了突变体2的结合位点，并显示了在具有最高频率的不同KIR3DL2等位基因中观察到的氨基酸差异(在美国的群体研究)。可以看出，抗体结合位点是在KIR3DL2等位基因之间保守的位点，这与抗体的结合来自所有试验个体的细胞的能力相一致。
表7C:结构域0突变体
表7D:结构域2突变体
所有标题和小标题都在本文中仅仅为了方便而使用，不应当解释为以任何方式限制本发明。在其所有可能的变体中上述要素的任意组合被包括在本发明中，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。除非另有说明，本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，关于特定因子或测量结果所提供的所有确切示例性数值可以被认为还提供对应的近似测量结果，在适当时用“约”来修饰)。
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Claims (68)

1.一种单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KIR3DL2多肽，其中所述抗体不实质上结合包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的KIR3DL1多肽，且其中所述抗体不内化到表达KIR3DL2的细胞中。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQ IDNO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、和(c)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
3.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中所述抗体可检测地减少(或消除)KIR3DL2与KIR3DL2的第一HLA天然配体之间的结合，但是不会可检测地减少(或消除)KIR3DL2与KIR3DL2的第二HLA天然配体之间的结合。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQ IDNO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、和(c)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
5.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、和(c)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
6.根据权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQID NO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、(c)包含在SEQ ID NO:161中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*003)、(d)包含在SEQ ID NO:163中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*005)、和(e)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
7.根据权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQID NO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、(c)包含在SEQ ID NO:161中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*003)、(d)包含在SEQ ID NO:163中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*005)、(e)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)、和(f)包含在SEQ ID NO:166中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*008)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
8.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变I60N和G62S的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
9.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变R13W、A25T和Q27R的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
10.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变Q56A和E57A的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
11.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
12.根据权利要求1-7所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与以下多肽的减小的结合：(a)具有氨基酸突变I60N和G62的突变体KIR3DL2多肽、和(b)具有氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变体KIR3DL2多肽。
13.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变R13W、A25T、Q27R、I60N和G62S的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
14.根据权利要求1-7中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变R78H和L82P的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
15.根据权利要求1-7中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变W226A的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
16.根据权利要求1-7或15中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变I231M和R246P的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
17.根据权利要求1-7或15-16中的任一项所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与具有氨基酸突变E239G的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
18.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体不造成KIR3DL2多肽在表达KIR3DL2的细胞中的内化。
19.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体可检测地减少KIR3DL2与KIR3DL2的HLA类别I配体之间的结合。
20.根据权利要求1-19所述的抗体，其中所述抗体可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间的结合。
21.根据权利要求1-19所述的抗体，其中所述抗体可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间的结合，但是不会可检测地减少KIR3DL2与HLA-A3之间的结合。
22.根据权利要求1-19所述的抗体，其中所述抗体可检测地减少KIR3DL2与HLA-A3之间的结合，但是不会可检测地减少KIR3DL2与HLA-B27之间的结合。
23.一种单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KIR3DL2多肽的D0结构域中的氨基酸残基，且其中所述抗体不实质上结合包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的KIR3DL1多肽。
24.一种单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的KIR3DL2多肽的D2结构域中的氨基酸残基，且其中所述抗体不实质上结合包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的KIR3DL1多肽。
25.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体至少部分地在配体结合面上结合KIR3DL2多肽。
26.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中与所述抗体和SEQ IDNO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变I60N和G62的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
27.根据权利要求26所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变R13W、A25T和Q27R的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
28.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中与所述抗体和SEQ IDNO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变R13W、A25T和Q27R的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
29.根据权利要求26-28所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体不具有与包含氨基酸突变Q56S和E57A的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
30.根据权利要求26-29所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
31.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中与所述抗体和SEQ IDNO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变P14S、S15A和H23S的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
32.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中与所述抗体和SEQ IDNO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变R78H和L82P的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
33.一种结合KIR3DL2多肽的单克隆抗体，其中与所述抗体和SEQ IDNO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变W226A的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
34.根据权利要求33所述的抗体，其中参考SEQ ID NO:1的KIR3DL2多肽，与所述抗体和野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变I231M和R246P的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
35.根据权利要求33-34所述的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型KIR3DL2多肽之间的结合相比，所述抗体具有与包含氨基酸突变E239G的突变体KIR3DL2多肽的减小的结合。
36.根据权利要求23-35所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、和(c)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
37.根据权利要求23-35所述的抗体，其中所述抗体结合：(a)包含在SEQ ID NO:160中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*001)、(b)包含在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*002)、(c)包含在SEQ ID NO:161中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*003)、(d)包含在SEQ ID NO:163中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*005)、(e)包含在SEQ ID NO:165中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*007)、和(f)包含在SEQ ID NO:166中所示的氨基酸序列的KIR3DL2多肽(等位基因_*008)，在每种情况下，其中所述KIR3DL2多肽在细胞表面上表达。
38.根据权利要求1-9、11-28和30-37所述的抗体，其中所述抗体不被内化到表达KIR3DL2的细胞中和/或不造成KIR3DL2多肽在表达KIR3DL2的细胞中内化。
39.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体能够通过ADCC诱导表达KIR3DL2的细胞的裂解。
40.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制配体诱导的KIR3DL2-信号传递。
41.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体与选自以下的抗体竞争结合KIR3DL2多肽：
(a)分别具有SEQ ID NO:13和14的VH和VL区域的抗体(2B12)，
(b)分别具有SEQ ID NO:23和24的VH和VL区域的抗体(10G5)，
(c)分别具有SEQ ID NO:2和3的VH和VL区域的抗体(10F6)，
(d)分别具有SEQ ID NO:34和35的VH和VL区域的抗体(13H1)，
(e)分别具有SEQ ID NO:45和46的VH和VL区域的抗体(1E2)，
(f)分别具有SEQ ID NO:56和57或67的VH和VL区域的抗体(9E10)，
(g)分别具有SEQ ID NO:170和171的VH和VL区域的抗体(1C3)，和
(h)分别具有SEQ ID NO:181和182的VH和VL区域的抗体(20E9)。
42.一种抗体，其与选自以下的抗体竞争结合KIR3DL2多肽：
(a)分别具有SEQ ID NO:13和14的VH和VL区域的抗体(2B12)，
(b)分别具有SEQ ID NO:23和24的VH和VL区域的抗体(10G5)，
(c)分别具有SEQ ID NO:2和3的VH和VL区域的抗体(10F6)，
(d)分别具有SEQ ID NO:34和35的VH和VL区域的抗体(13H1)，
(e)分别具有SEQ ID NO:45和46的VH和VL区域的抗体(1E2)，和
(f)分别具有SEQ ID NO:56和57或67的VH和VL区域的抗体(9E10)，
(g)分别具有SEQ ID NO:170和171的VH和VL区域的抗体(1C3)，和
(h)分别具有SEQ ID NO:181和182的VH和VL区域的抗体(20E9)。
43.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的单克隆抗体：
(a)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:15(HCDR1)、SEQ ID NO:18(HCDR2)和SEQ ID NO:20(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:10、21或22的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(b)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:4(HCDR1)、SEQ ID NO:7(HCDR2)和SEQ ID NO:9(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:10、11或12的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(c)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:25(HCDR1)、SEQ ID NO:28(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:31、32或33的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(d)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:36(HCDR1)、SEQ ID NO:39(HCDR2)和SEQ ID NO:41(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:42、43或44的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(e)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:47(HCDR1)、SEQ ID NO:50(HCDR2)和SEQ ID NO:52(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:53、54或55的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；和
(f)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:58(HCDR1)、SEQ ID NO:61(HCDR2)和SEQ ID NO:63(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:64、65或66的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(g)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:172、173或174(HCDR1)、SEQ ID NO:175或176(HCDR2)和SEQ ID NO:177(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:178、179或180的序列的CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；和
(h)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:183、184或185(HCDR1)、SEQ ID NO:186或187(HCDR2)和SEQ ID NO:188(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:189、190或191的序列的CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。
44.一种单克隆抗体，其选自：
(a)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:15(HCDR1)、SEQ ID NO:18(HCDR2)和SEQ ID NO:20(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:10、21或22的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(b)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:25(HCDR1)、SEQ ID NO:28(HCDR2)和SEQ ID NO:30(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:31、32或33的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(c)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:4(HCDR1)、SEQ ID NO:7(HCDR2)和SEQ ID NO:9(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:10、11或12的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(d)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:36(HCDR1)、SEQ ID NO:39(HCDR2)和SEQ ID NO:41(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:42、43或44的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(e)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:47(HCDR1)、SEQ ID NO:50(HCDR2)和SEQ ID NO:52(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:53、54或55的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；和
(f)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:58(HCDR1)、SEQ ID NO:61(HCDR2)和SEQ ID NO:63(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:64、65或66的序列的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；
(g)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:172、173或174(HCDR1)、SEQ ID NO:175或176(HCDR2)和SEQ ID NO:177(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:178、179或180的序列的CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***；和
(h)抗体，所述抗体具有：(i)重链，所述重链包含分别含有SEQ ID NO:183、184或185(HCDR1)、SEQ ID NO:186或187(HCDR2)和SEQ ID NO:188(HCDR3)的序列的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和(ii)轻链，所述轻链包含分别含有SEQ ID NO:189、190或191的序列的CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中每个CDR可以任选地包含1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或***。
45.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述KIR3DL2多肽是包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽(等位基因*002)。
46.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述KIR3DL1多肽是包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的多肽(等位基因*00101)。
47.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体对人KIR3DL2多肽具有小于10-8M的二价结合亲和力(KD)。
48.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含人IgG重链恒定区。
49.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含结合FcγIIIA受体的人重链恒定区。
50.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
51.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有至少一个氨基酸置换的经修饰的人重链恒定区，其中与不具有所述氨基酸置换的恒定区相比，所述经修饰的恒定区对FcγIIIA受体的结合亲和力增加。
52.根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有低岩藻糖基化的N-连接的聚糖的人重链恒定区，其中与不具有所述低岩藻糖基化的N-连接的聚糖的恒定区相比，所述经修饰的恒定区对FcγIIIA受体的结合亲和力增加。
53.一种通过嵌合或人源化根据权利要求1-49所述的抗体而得到的抗体。
54.一种药物组合物，其包含根据以上权利要求中的任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述抗体以约25mg至500mg之间的量存在。
56.一种试剂盒，其包含根据以上权利要求中的任一项所述的抗体，任选地进一步包含经标记的第二抗体，所述经标记的第二抗体特异性地识别根据以上权利要求中的任一项所述的抗体。
57.一种杂交瘤或重组宿主细胞，其生产根据权利要求1-53所述的抗体。
58.一种用于治疗或预防有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括：给所述患者施用有效量的根据权利要求1-53所述的抗体或根据权利要求54-55所述的组合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病是CD4+T细胞淋巴瘤。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述癌症选自蕈样肉芽肿病和塞扎里综合征。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病是炎症性或自身免疫性障碍。
62.一种用于鉴别受试者中的表达KIR3DL2的细胞的方法，所述方法包括：从受试者得到包含细胞的生物样品，使所述细胞与根据权利要求1-53所述的抗体接触，和评估所述抗体是否结合所述细胞。
63.一种用于鉴别受试者中的表达KIR3DL2的疾病相关细胞的方法，所述方法包括：从受试者得到包含疾病相关细胞的生物样品，使所述疾病相关细胞与根据权利要求1-53所述的抗体接触，和评估所述抗体是否结合疾病相关细胞，其中所述抗体结合疾病相关细胞的结果指示，所述受试者患有疾病，所述受试者携带疾病相关细胞，和/或所述疾病相关细胞表达KIR3DL2。
64.一种用于选择对使用根据权利要求1-53所述的抗体的治疗做出应答的患有疾病的受试者的方法，所述方法包括：确定所述受试者中的细胞是否表达KIR3DL2受体，KIR3DL2受体的表达指示应答者。
65.根据权利要求64所述的方法，所述方法进一步包括：给应答受试者施用根据权利要求1-53所述的抗体。
66.根据权利要求64-65所述的方法，其中所述疾病是CD4+T细胞癌症。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述癌症选自蕈样肉芽肿病和塞扎里综合征。
68.根据权利要求64-65所述的方法，其中所述疾病是炎症性或自身免疫性障碍。
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