CN101484470B - 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途 - Google Patents

具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101484470B
CN101484470B CN200680048006.XA CN200680048006A CN101484470B CN 101484470 B CN101484470 B CN 101484470B CN 200680048006 A CN200680048006 A CN 200680048006A CN 101484470 B CN101484470 B CN 101484470B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
mouse
antibodies
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200680048006.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN101484470A (zh
Inventor
丹尼尔·申德勒
哈里·M·米德
蒂莫西·埃德蒙兹
约翰·麦克弗森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
LFB USA Inc
Original Assignee
Genzyme Corp
GTC Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp, GTC Biotherapeutics Inc filed Critical Genzyme Corp
Publication of CN101484470A publication Critical patent/CN101484470A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101484470B publication Critical patent/CN101484470B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/04—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from milk
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/12—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from milk
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明的一部分涉及具有提高的ADCC活性的抗体。本发明还提供了生产这些抗体的方法。本发明的抗体在乳腺上皮细胞中产生，例如经改造在其乳中表达和分泌所述抗体的非人转基因动物的乳腺上皮细胞。所述抗体或包含所述抗体的组合物可用于治疗其中ADCC活性提供益处的疾病。因此，在一个实施方案中，所述抗体或包含所述抗体的组合物可用于治疗癌症、淋巴增生性疾病或自身免疫病。

Description

具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119要求2005年10月21日提交的美国临时申请序列号60/729054的优先权。其全部内容通过参考并入本文。
政府支持
本申请的一些方面可能是使用来自国家癌症研究院SBIR基金号5R43CA107608-02的经费进行的。因此，政府可拥有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明涉及具有增强的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)活性的抗体、其生产方法及其使用方法。
背景技术
在疾病治疗的***库中，单克隆抗体是一种重要的武器。例如，ADCC是抗癌抗体有效性的主要贡献者。介导ADCC的关键受体是FcγIIIa(CD16)受体——一种表达于自然杀伤(NK)细胞上的针对IgG的低亲和力受体。缺乏此受体的小鼠对利妥昔(rituximab)单抗的抗肿瘤应答显著更低(Clynes等，2000，Nat.Med 6：443-446)。在小鼠中，FcγIIIa受体在介导肿瘤的细胞毒性中发挥作用(Clynes等，1998，PNAS95：652-656)。编码FcγIIIa受体的FCGR3A基因中158位缬氨酸代替苯丙氨酸的多态性更紧密的结合IgG，赋予NK细胞以增强的ADCC活性(Wu等，1997，J Clin Invest 100：1059-1070)。FCGR3A基因的此基因型--FCGR3A-158V/V--在应答于利妥昔单抗的非何杰金淋巴瘤(Carton等，2002，Blood 99：754-758)、Waldenstrom′s巨球蛋白血症(Treon等，2005，J Clin Oncol 23：474-481)以及自身免疫病***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)(Anolik等，2003，Arthritis Rheum 48，455-459)患者中具有正效应。相同的多态性还与克罗恩病中对另一种抗体英利昔单抗(infliximab)的较好生物学应答相关(Louis等，2004，A Phar Ther 19：511-519)。这些发现示例了ADCC在人类中单克隆抗体的治疗作用中发挥了重要的作用。因此提高治疗性抗体促进ADCC活性的能力具有潜在的治疗价值。
人抗体具有两个糖基化位点，相同的重链上各有一个。使用糖基化和碳水化合物加工抑制剂的早先实验发现，在受到抑制的杂交瘤克隆中产生的抗体具有增强的ADCC活性(Rothman，1989)。其它工作显示，抗体的糖基化状态和ADCC活性都受到产生该抗体的细胞系的影响(Lifely，1995)。一些研究小组已经证明，在重链糖基化上缺乏1，6-岩藻糖的抗体具有对FcγRIII受体增强的结合亲和力以及增强的ADCC活性(Shields等，2002；Shinkawa等，2002)。另外，已经建立了对FcγRIII受体的结合亲和力与ADCC活性之间的相关性(Okazaki，2004；Dall’Ozzo，2004)。
已经建立了缺乏“FUT8”一一α-1，6-岩藻糖基转移酶(其催化此岩藻糖的转移)的细胞系。这些敲除细胞可用于产生具有较高ADCC活性的抗体。例如，已经建立了缺乏FUT8的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Yamane-Ohnuki等，2004)。小干扰RNA(siRNA)也已经用于阻断FUT8基因的表达(Mori等，2004)。大鼠细胞系已经用于产生具有增强的ADCC活性的抗体(Niwa等，2004，2005)。除了活性更高之外，低岩藻糖IgG1不依赖于FcγRIII多态性，由此缺乏野生型细胞中使用曲妥珠单抗(trastuzumab)或利妥昔单抗可见的差异(Niwa等，2004b，vol 10Clin Canc Res)。
尽管之前已经在多种表达***中产生了抗体，但是从未认识到在哺乳动物的乳腺上皮细胞(例如经改造在其乳中分泌所述抗体的转基因动物的哺乳动物乳腺上皮细胞)中产生的抗体具有增强的ADCC活性。
发明内容
已经发现，与来源于细胞培养物的材料相比，在哺乳动物乳腺上皮细胞(例如经改造在其乳中分泌所述抗体的转基因动物的哺乳动物乳腺上皮细胞)中产生的抗体具有增强的ADCC活性和增强的对CD16的结合。对乳来源抗体糖基化的研究显示，在乳来源的抗体中岩藻糖含量较低。因此，本文提供抗体及其组合物。所提供的抗体是在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生的抗体。还提供了产生所述抗体的方法及其使用方法。
具有增强的ADCC活性的抗体通过在哺乳动物乳腺上皮细胞中表达该抗体来产生。在一个实施方案中，哺乳动物乳腺上皮细胞是经改造在其乳中表达抗体的转基因非人哺乳动物的乳腺上皮细胞。在另一个实施方案中，所述乳腺上皮细胞是转染了编码抗体序列并能使所述抗体在乳腺上皮细胞中表达的核酸(例如DNA)构建体的培养细胞。
因此，在本发明的一个方面中，提供了包含乳腺上皮细胞来源抗体的组合物，其中所述抗体具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在本发明的另一个方面中提供了包含乳来源抗体的组合物，其中所述乳来源抗体具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在一个实施方案中，所述抗体的ADCC活性是细胞培养物来源抗体的ADCC活性的至少两倍。在另一实施方案中，所述抗体的ADCC活性是细胞培养物来源抗体的ADCC活性的至少3倍、4倍、5倍、7倍或10倍。在一个实施方案中，从其中获得乳来源抗体的乳是来自经改造以表达所述抗体的非人转基因哺乳动物的乳。
根据本发明的一个方面，如果IgG1抗体缺乏发现附着在Fc区Asn297糖基化位点的核心岩藻糖(例如连接到二天线结构基部(the baseof the biantennary structure)的岩藻糖)，那么所述抗体Fc区的结合增强。在一些方面中，本发明的抗体缺乏此核心岩藻糖。在其它一些方面中，乳产生的单克隆抗体主要是高甘露糖和杂合结构。一般地，本发明的抗体可更紧密地结合FcRIII受体，并且可导致增强的ADCC。
在本发明的另一个方面中，所述抗体经修饰具有如本文所提供的糖基化模式，因而具有增强的ADCC活性。所述修饰是产生所述抗体的结果，使得它在本文所提供的哺乳动物乳腺上皮细胞中表达。
所提供的组合物中的抗体就其糖基化而言可以是同质或异质的。
在一个实施方案中，所述抗体的至少一条链已经过修饰而不含有岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体的一条链已经过修饰而不含有岩藻糖。在另一实施方案中，所述抗体的一条链或至少一条链不含有1，6-岩藻糖。在又一个实施方案中，所述抗体的至少一条链经修饰从而不含有岩藻糖，而且该抗体还经过修饰从而含有甘露寡糖(oligomannose)或额外的甘露寡糖(additional oligomannose)。所述含有甘露寡糖的链可以是不含有岩藻糖的同一链，但是并不必需如此。在另一个实施方案中，所述抗体的氨基酸序列经过修饰，然后在哺乳动物乳腺上皮细胞中表达。在一个实施方案中，所述抗体的氨基酸序列经过了修饰。在另一个实施方案中，所述抗体(例如抗CD137抗体)的氨基酸序列具有Asn297的氨基酸替换。在又一个实施方案中，所述替换是替换为一个不会被岩藻糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，Asn297被替换为Gln。
在另一个实施方案中，所提供的抗体已经修饰而含有甘露寡糖或额外的甘露寡糖。在另一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得至少30％的所述抗体含有至少一个甘露寡糖。在另一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的抗体含有至少一个甘露寡糖。在又一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得少于50％、40％、30％、20％、10％或更少的抗体在一条或至少一条链上不含有岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的抗体含有至少一个甘露寡糖，并且少于50％、40％、30％、20％、10％或更少的抗体在一条或至少一条链上含有岩藻糖。
在另一个实施方案中，所述抗体的碳水化合物经过修饰以显示出高甘露糖的糖基化模式。在又一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得所述抗体的至少一条链含有甘露寡糖并且是非岩藻糖基化的。在又一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得抗体的主要碳水化合物是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中，所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化甘露寡糖。在另一个实施方案中，所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化Man5。在又一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得抗体中少于40％的碳水化合物含有岩藻糖。在又一个实施方案中，所述抗体经过了修饰使得抗体少于30％、20％、10％或更少的碳水化合物含有岩藻糖。在一个实施方案中，所述岩藻糖是1，6-岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得抗体中至少60％的碳水化合物是非岩藻糖基化甘露寡糖，并且所述抗体中少于40％的碳水化合物含有岩藻糖。在又一个实施方案中，所述抗体经过修饰以使得抗体中63％的碳水化合物是非岩藻糖基化甘露寡糖，所述抗体中16％的碳水化合物是含有核心岩藻糖的G1F，并且所述抗体中21％的碳水化合物是含有核心岩藻糖的G2F。
本发明的另一个方面中，具有增强ADCC活性的抗体事实上不是由本文提供的手段修饰的，而是针对上述糖基化模式选择出来的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在又一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体。在又一个实施方案中，所述抗体是全长单链抗体。在又一个实施方案中，所述全长抗体包含重链和轻链。在又一个实施方案中，所述抗体是抗体片段。在又一个实施方案中，所述抗体片段是Fc融合多肽的一部分。
在本发明的另一个方面中，所述抗体由转基因DNA构建体编码，所述构建体含有包含N-连接寡糖的Fc区。在一个实施方案中，所述抗体产生于非人转基因动物的乳中。在又一个实施方案中，所述抗体具有如本文所述的糖基化模式。
在一个实施方案中，所述抗体是IgG、IgA或IgD同种型。在又一个实施方案中，所述抗体是IgG同种型。在另一个实施方案中，所述抗体是IgG1或IgG2同种型。在又一个实施方案中，所述抗体是抗体片段。在本发明的另一个方面，提供了具有改进特征(例如ADCC特征)的本发明抗体的人源化形式。
所述抗体可以抗任何抗原。在一个实施方案中，所述抗体是针对CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD32B、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD59、CD74、CD80、CD126、CD138、CD137或GPIIbIIIa。在另一个实施方案中，所述抗体是针对HM1.24、HLA-DR、MUC1、生腱蛋白(tenascin)、PIGF、VEGF、癌基因、癌基因产物、坏死抗原、17-A1抗原、IL-2、T101、TAC、IL-6、TRAIL-R1、GD3、神经节苷脂(ganglioside)或TRAIL-R2。在一个实施方案中，所述抗体是抗CD137抗体。
在本文所提供的任何组合物和方法中，所述抗体是抗CD137抗体。
在一个实施方案中，包含所提供抗体的组合物可另外包含可药用载体。在另一个实施方案中，所提供的组合物可另外包含其它治疗剂。在一个实施方案中，所述其它治疗剂是抗癌剂或免疫调节剂。
应该注意，本发明的一些实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含一定量的目的转基因蛋白、其药物前体或者所述化合物或所述药物前体的可药用盐，以及可药用赋形剂、稀释剂或载体。
所提供的组合物可用于许多治疗方法。在本发明的一个方面，提供了治疗受试者的方法，其包括对受试者以在该受试者中有效增强ADCC的量施用本文所提供的组合物。在本发明的另一个方面，提供了治疗受试者的方法，其包括对有此需要的受试者以有效治疗疾病的量施用本文所提供的组合物，所述疾病是受试者所患疾病或者有患病风险的疾病。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，本发明抗体可提供有益疗效的具体适应症包括治疗实体瘤；黑色素瘤；以及乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌、***癌和肺癌。推测所述治疗可能是因为所述抗体会帮助提供有效的免疫调节治疗因而有效，但本发明并不受限于此。
因此，具体靶标还可包括抗CD3抗体(例如非何杰金淋巴瘤；自身免疫病-SLE)、抗CD16抗体(例如FcRIII)、抗CD19(例如非何杰金淋巴瘤)、抗CD20、抗CD32B抗体(例如FcRIIB和***反应)、抗CD30(例如何杰金病)、抗GPIIbIIIa(例如血栓症)、抗TNF-α(例如类风湿性关节炎和克罗恩病)、用于肿瘤内皮标志物的抗TEM抗体(例如用于控制血管发生-抗癌)等等。
在另一个实施方案中，所述疾病是淋巴增生性疾病。在又一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病。在本发明的另一个实施方案中，本发明的ADCC抗体在治疗自身免疫来源的脑-脊髓炎、***性红斑狼疮、以及其它抗CD137可提供某些益处的疾病上是有效的。
在一个实施方案中，施用给受试者的抗体量是约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天。
在另一个实施方案中，还对所述受试者施用了其它治疗剂。在一个实施方案中，所述其他治疗剂是抗癌剂。在另一个实施方案中，所述其它治疗剂是免疫调节剂。在一个实施方案中，所述免疫调节剂是IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素、紫杉醇、TNF-α或者其组合。在另一个实施方案中，还对受试者施用了IL-2。在另一个实施方案中，还对受试者施用了IL-12。在另一个实施方案中，还对受试者施用了抗癌剂和免疫调节剂。在一个实施方案中，还对受试者施用了免疫调节剂和曲妥珠单抗。在又一个实施方案中，还对受试者施用了IL-21和曲妥珠单抗。在一个实施方案中，乳腺上皮细胞来源的抗CD137抗体与IL-21和曲妥珠单抗联合使用。在另一个实施方案中，抗CD137抗体是缺乏核心岩藻糖的高甘露糖抗体。因此，在一些实施方案中，所述抗体与免疫调节剂一起使用，所述免疫调节剂在缩小实体瘤及防止其复发方面是有效的。在另一些实施方案中，所述抗体与其它抗癌治疗剂(例如IL-21、IL-12和/或曲妥珠单抗)一起使用。
所述受试者可以是任何期望ADCC活性的受试者。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者是狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类。
本文还提供了通过修饰抗体来产生ADCC活性增强的抗体的方法。这些方法包括通过在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生所述抗体来修饰所述抗体的糖基化。在一个实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞是经改造以在其乳中表达所述抗体的非人哺乳动物的细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞是培养物中的哺乳动物乳腺上皮细胞。
本发明的一个方面提供了产生转基因抗体及其变体和片段的方法，所述方法包括在非人转基因哺乳动物的乳中表达由核酸构建体编码的转基因抗体。在一个实施方案中，产生本发明抗体的方法包括：
(a)用编码所期望转基因抗体的转基因DNA构建体转染非人哺乳动物细胞；
(b)选择其基因组中已经***所述转基因DNA构建体的细胞；和
(c)实施第一次核移植操作，以产生对于所期望转基因抗体而言属杂合的非人转基因哺乳动物，所述抗体可在其乳中表达。
在另一个实施方案中，所述方法包括：
(a)提供经改造而表达抗体的非人转基因哺乳动物，
(b)在所述非人转基因哺乳动物的乳中表达所述抗体；和
(c)分离乳中所表达的所述抗体。
在其它一些实施方案中，所述方法还包括诱导泌乳的步骤和/或测定所得抗体的ADCC活性的步骤。在又一些实施方案中，所述方法还包括额外的分离和/或纯化步骤。在又一些实施方案中，所述方法还包括比较所得抗体与细胞培养物中所产生抗体的ADCC活性的步骤。在另一些实施方案中，所述方法还包括比较所得抗体与非乳腺上皮细胞所产生抗体的ADCC活性的步骤。这些细胞可以是细胞培养物的细胞。
在一些实施方案中，可通过从如本文所述产生的转基因动物的乳中收集所述抗体来获得所述抗体，或者从所述转基因动物的后代中收集。
在一些实施方案中，由至少一个β酪蛋白启动子来驱动编码所期望抗体(或抗体融合多肽)的构建体。在另一些实施方案中，所述非人转基因哺乳动物是有蹄动物。在又一些实施方案中，所述非人转基因哺乳动物是山羊。
在一些实施方案中，通过转基因哺乳动物产生的抗体以至少1克/升所产乳的水平产生。
在又一个方面，提供了增强抗体ADCC活性的方法，其包括通过本文所述方法修饰所述抗体的糖基化。在一个实施方案中，所述抗体经修饰以使得所述抗体的至少一条链中不含有岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体经修饰以使得所述抗体的一条链中不含有岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体经修饰以使其含有甘露寡糖或额外的甘露寡糖。在另一个实施方案中，所述抗体经修饰以使其含有甘露寡糖或额外的甘露寡糖。
在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体的碳水化合物表现出高甘露糖的糖基化模式。在一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体的至少一条链中含有甘露寡糖并且是非岩藻糖基化的。在另一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体的一条链含有甘露寡糖并且是非岩藻糖基化的。在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体的主要碳水化合物是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中，所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖。在另一个实施方案中，所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化Man5。在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体中少于40％的碳水化合物含有岩藻糖。在一个实施方案中，所述抗体经修饰以使所述抗体中少于30％、20％、10％或更少的碳水化合物含有岩藻糖。在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使至少30％的所述抗体带有至少一个甘露寡糖。在一个实施方案中，所述抗体经修饰以使至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的所述抗体带有至少一个甘露寡糖。在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的抗体含有至少一个甘露寡糖并且少于50％、40％、30％、20％、10％或更少的抗体在一条链或至少一条链上含有岩藻糖。在另一个实施方案中，所述抗体经修饰以使抗体中至少60％的碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖，并且所述抗体中少于40％的碳水化合物含有岩藻糖。在又一个实施方案中，所述抗体经修饰以使抗体中63％的碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖，所述抗体16％的碳水化合物是含有核心岩藻糖的G1F，以及所述抗体21％的碳水化合物是含有核心岩藻糖的G2F。
在本发明的又一个方面，提供了产生抗体的方法，其包括从经改造而在其乳中表达所述抗体的非人转基因哺乳动物的乳中收集所述抗体以及测定所述抗体的ADCC活性。在一个实施方案中，所述方法还包括比较所收集抗体与细胞培养物中所表达抗体的ADCC活性。在又一个实施方案中，所述非人转基因哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲驼(llama)。
在本发明的另一个方面，提供了产生抗体的方法，其包括从经改造以表达所述抗体的乳腺上皮细胞中收集所述抗体以及测定所述抗体的ADCC活性。在一个实施方案中，所述方法还包括比较所收集抗体与非乳腺上皮细胞中所表达抗体的ADCC活性。
在本发明的又一个方面，提供了这样的方法，其包括按照本文所述方法获得抗体以及比较所述抗体与其它抗体组的ADCC活性。在一个实施方案中，所述其它抗体组是获得自细胞培养物的抗体。在另一个实施方案中，所述其它抗体组是获得自培养的非乳腺上皮细胞的抗体。在又一个实施方案中，所述其它抗体组是获得自培养的乳腺上皮细胞的抗体。在又一个实施方案中，所述其它抗体组是获得自体液或身体组织的抗体。在又一个实施方案中，所述其它抗体组是获得自哺乳动物乳的抗体。在一个实施方案中，所述哺乳动物是经改造以在其乳中表达所述其它抗体组的非人转基因哺乳动物。
本发明的每个限定可包含本发明的多个实施方案。因此，预期本发明涉及任一要素或要素组合的每个限定可包含在本发明的每个方面中。
附图说明
图1提供了糖基化抗CD137抗体的N-连接寡糖的MALDI-TOF谱。通过PNG酶F释放聚糖。图1A提供了小鼠乳来源抗体的图谱；图1B提供了细胞培养物来源抗体的图谱；图1C提供了山羊乳来源抗体的图谱。
图2提供了通过使用荧光检测(2-AA标记的)从糖基化抗体所释放寡糖的HPLC获得的寡糖图的比较。图2A提供了与小鼠乳来源抗体的比较；图2B提供了与使用Endo H处理过的小鼠乳来源抗体的比较；图2C提供了与细胞培养物来源抗体的比较；图2D提供了与使用EndoH处理过的细胞培养物来源抗体的比较；图2E提供了与山羊乳来源抗体的比较；图2F提供了与使用Endo H处理过的山羊乳来源抗体的比较。
图3举例说明了释放自小鼠乳来源抗CD137抗体的主要寡糖的Endo H敏感性。用Endo H过夜处理来自图2的样品。图3A提供了小鼠乳来源抗体的结果；图3B提供了使用Endo H处理过的小鼠乳来源抗体的结果；图3C提供了细胞培养物来源抗体的结果；图3D提供了使用Endo H处理过的细胞培养物来源抗体的结果。
图4显示抗体的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A)结合。将A蛋白纯化的抗体上样到Con A柱，用含α甲基甘露糖苷酶的缓冲液洗脱。以280nm处的吸光度监测级分。图4A显示Con A柱上糖基化抗CD137抗体的结果；图4B显示Con A柱上非糖基化抗CD137抗体的结果。
图5证明了抗体与786-O细胞的结合。每种抗体的结合通过FACS分析进行测定，并覆盖了阴性对照抗体(抗2，4-二硝基苯酚(dinitrophenol，DNP))和抗HER2。图5A显示小鼠乳来源非糖基化(aglycosylated)抗体的结果；图5B显示小鼠乳来源糖基化抗体的结果；图5C显示细胞培养物来源糖基化抗体的结果；图5D显示山羊乳来源糖基化抗体的结果。
图6举例说明在ADCC测定中通过乳来源抗体增强对786-O细胞的杀伤。方块：小鼠乳来源；倒三角：山羊来源；菱形：细胞培养物来源；圆形：非糖基化小鼠乳来源；空心方块：曲妥珠单抗；三角：抗DNP抗体。
图7提供了用于抗体乳表达的转基因构建体的一般性示意图。目的基因替换了山羊β酪蛋白(一种乳特异性基因)的编码区。将6.2kb的启动子区与IgG H或L链的编码区连接，其后是非翻译的山羊β酪蛋白3’序列以及下游元件。黑色长方形：H和L 外显子；条纹长方形：基因组内含子；箭头：转录方向。
图8提供了由转基因动物产生的抗体上存在或不存在的碳水化合物的分解。
图9提供了一个生产方法实例的一般性示意图。
图10举例说明了显示核心岩藻糖物理位置的抗体空间填充模型。
图11证明了抗体与表达CD137的CHO细胞的结合。图11A提供了无CD137的CHO细胞的结果(阴性对照)；图11B提供了表达CD137的CHO细胞的结果。每张图上的实心曲线是用无关抗DNP抗体染色的。
图12举例说明了在ADCC测定中通过乳来源抗体来增强对表达CD137的CHO细胞的杀伤。
图13提供了IgG1-sFcgRIIIa结合的生物传感器分析结果。图13A显示来自山羊乳的抗体的结果；图13B显示来自小鼠乳的抗体的结果；图13C显示来自细胞培养物的抗体的结果；图13D显示来自小鼠乳的非糖基化抗体的结果。
图14举例说明了包含具有增强ADCC活性的抗体的试剂盒。
发明详述
已经发现，转基因动物乳中所产生的抗体相对于通过体外细胞培养物产生的重组抗体而言具有增强的ADCC活性。还已经评估了具有增强ADCC活性的抗体的糖基化模式。提供了乳腺上皮细胞中产生的抗体的组合物及其生产和使用方法。
在本发明的一个方面中，所述抗体具有增强的ADCC活性。本文使用的“增强的ADCC活性”意为当通过改变其糖基化模式的方法产生时，抗体或其组合物所显示的ADCC活性高于当通过不改变其糖基化模式的方法产生时，或者高于通过本文提供的方法改变其糖基化模式之前所具有的ADCC活性水平。具有增强的ADCC活性的抗体包括在改变之前不显示任何ADCC活性的抗体。本文所使用的“糖基化模式”指存在于单种抗体或抗体组之上的碳水化合物组。可通过改变一种抗体或一组抗体的糖基化来实现对糖基化模式的改变。抗体组合物糖基化模式的改变旨在包括以下情况：单个抗体、组合物中的抗体亚组或者组合物中所有抗体发生了改变。可通过许多本领域已知的许多方法确定糖基化模式。例如，分析蛋白质上碳水化合物的方法描述于美国专利申请序列号11/107982和序列号11/244826。分析蛋白质上碳水化合物的方法通过参考并入本文。
糖基化对于治疗性糖蛋白的正确折叠、靶向、生物活性以及清除是重要的。随着例如转基因动物作为表达***的开发，已经认识到不同的遗传背景导致了所产生蛋白质的不同表达和糖基化水平。从山羊乳中分离的转基因来源蛋白质的糖基化不同于从细胞培养物中收获的蛋白质的糖基化(Denman 等，1991)。在转基因产生的人抗凝血酶中，糖基化的类型是位点依赖性的。岩藻糖基化、唾液酸化(sialylated)寡糖可见于Asn96和Asn192位置，而Asn155具有甘露寡糖(Edmunds等，1998)。位点依赖性糖基化还可见于小鼠乳中产生的γ干扰素中(James等，1995)。
糖基化是能产生多种自然状态最终蛋白质形式的翻译后修饰。IgG分子在Fc区中CH2结构域的Asn297残基处被糖基化。碳水化合物结构的某些改变也可影响抗体的功能或治疗有效性。例如，在例如类风湿性关节炎的疾病中，高于正常发生率的非半乳糖基化结构(其似乎是IgGFc相关碳水化合物特异性的)已有报道(Parekh等1985；Rademacher等1988a)。已经提出，这种非糖基化结构比此区域通常所见的结构更易移动，因此可诱导糖蛋白四级结构的变化、促进所述抗体的免疫原性，或者其自身可对异常抗体功能有贡献(Rademacher等1988b；Axford等1992)。但是，在疾病状态下此结构仅是所观察到的众多糖型(glycoform)中的一种。
在一些实施方案中，本文所提供的抗体具有至少两倍于非乳腺上皮细胞培养物来源抗体的ADCC活性。在其它一些实施方案中，所述抗体的糖基化通过所提供的方法进行修饰，经修饰抗体的ADCC活性是相同抗体的未修饰形式的至少两倍。在一些实施方案中，所述抗体具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30倍高的ADCC活性。所提供的抗体获得自在哺乳动物乳腺上皮细胞中的表达。在本文中这些抗体也称为乳腺上皮细胞来源抗体。在一些实施方案中，所述抗体获得自在非人转基因动物乳中的表达。在本文中这些抗体也被称为“乳来源抗体”。本文所使用的“转基因”指细胞，所述细胞包含了人工***细胞或其祖先(ancestor)中并成为该细胞所发育出的动物基因组一部分的核酸分子。该术语也用于指代含有人工***其细胞或基因组中的核酸分子的动物。
一般地，在一些实施方案中，所述糖基化显示出高甘露糖的糖基化模式。本文所使用的“高甘露糖的糖基化模式”意指含有至少一个甘露寡糖的抗体，或者其中至少30％的所述抗体含有至少一个甘露寡糖的抗体组合物。在一些实施方案中，所述抗体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的碳水化合物是甘露寡糖。在一些实施方案中，所述抗体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖。在另一些实施方案中，所述抗体中少于50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少的碳水化合物含有岩藻糖。在又一些实施方案中，所述抗体是低岩藻糖且高甘露寡糖的。因此，在另一些实施方案中，所述抗体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的碳水化合物是甘露寡糖，并且所述抗体中少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的碳水化合物含有岩藻糖。因此在另一个实施方案中，所述抗体中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更多的碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖，并且所述抗体中少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的碳水化合物含有岩藻糖。本发明的一个实施方案涉及具有增强的ADCC活性且重链不含有1，6-岩藻糖的抗体。在一个实施方案中，如果抗体缺乏发现附着在Fc区Asn297糖基化位点上的核心岩藻糖(例如连接到二天线结构基部的岩藻糖)，则增强了所述抗体Fc区与单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上发现的FcγRIII受体的结合。
在本文的实施例中描述了具有特定糖基化模式的其它一些抗体。如本文中所使用的，当讨论抗体的组合物时，所述组合物在糖基化方面可以是同质或异质的。
可针对其结合受体或其它蛋白质(例如参与疾病过程和/或ADCC的蛋白质)的能力来选择所述抗体。所述抗体可以针对任何细胞标志物，其中提供针对该细胞标志物并具有ADCC活性的抗体会提供治疗益处。所述抗体包括可结合靶抗原(例如肿瘤细胞标志物)的抗体。细胞标志物实例及本文所考虑的示例性疾病包括：CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD32B、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD59、CD74、CD80、CD126、CD138、CD137或GPIIbIIIa。在一些实施方案中，所述抗体可以针对HM1.24、HLA-DR、MUC1、生腱蛋白、PIGF、VEGF、癌基因、癌基因产物、坏死抗原、17-A1抗原、IL-2、T101、TAC、IL-6、TRAIL-R1、GD3神经节苷脂或TRAIL-R2。其它靶标包括：抗CD3抗体(例如非何杰金淋巴瘤；自身免疫病-SLE)、抗CD16抗体(例如FcRIII)、抗CD19(例如非何杰金淋巴瘤)、抗CD20、抗CD32B抗体(例如FcRIIB和过敏)、抗CD30(例如何杰金病)、抗GPIIbIIIa(例如血栓症)、抗TNF-α(例如类风湿性关节炎和克罗恩病)、用于肿瘤内皮标志物的抗TEM抗体(例如用于控制血管发生-抗癌)。一旦结合肿瘤细胞标志物，本发明的抗体可募集单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞来攻击肿瘤细胞。因此，具有增强的ADCC的抗体可被认为是能有效缩小实体瘤并阻止其复发的免疫调节剂。
广泛的研究证明，通过其天然配体或激动性抗体刺激CD137增强了抗肿瘤应答，使得在多个模型中抑制已建立的小鼠肿瘤。CD137(也称为4-1BB)是在数种淋巴细胞类型中表达的膜糖蛋白。已有报道针对小鼠CD137的激动性单克隆抗体在体内缩小小鼠肿瘤并且阻止其复发。通过其天然配体或激动性抗体刺激CD137可通过刺激肿瘤反应性效应T细胞和增强了调节性NK活性而增强体内抗肿瘤免疫应答。全身性单独施用或与其它治疗方式联合施用抗小鼠CD137单克隆抗体在小鼠中诱导了对大肿瘤的完全抑制，例如弱免疫原性的AGF104A肉瘤和高致瘤性的P815肥大细胞瘤，以及EL4胸腺瘤、K1735黑色素瘤、B10.2和87肉瘤、RENCA肾癌、J558浆细胞瘤、MCA205肉瘤、JC乳腺癌、MCA26结肠癌和GL261神经胶质瘤。
在本发明的一个实施方案中，可克隆抗CD137抗体并作为基因组“小基因(mini-gene)”在数个品系的转基因小鼠和山羊的乳中表达。此基因的表达处于山羊β酪蛋白调控元件的控制下。在小鼠和山羊中均已建立了所述抗体变体的实质性表达。在一个实施方案中，本发明提供了具有增强的ADCC活性并因此具有增强的治疗特性的抗CD137抗体。根据本发明并使用转基因动物产生的抗CD137抗体作为本发明的一个实例，开发了非人：人嵌合单克隆抗体(即小鼠：人)激动剂抗CD137。预计抗CD137抗体的人源化可增强其用于接受免疫治疗的患者或者用于其它适应症的用途。基于所观察到的氨基酸序列同一性，将VL和VH区的互补决定区(complementary determining region，CDR)移植到人抗DNA相关独特型免疫球蛋白克隆上。通过竞争性ELISA观察到，与小鼠单克隆抗体相比，本发明的重组嵌合抗体显示出相似的生物活性谱。在测定时，所述抗CD137抗体在介导抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性中都是有效的。预计本发明抗体序列的人源化会消除任何不需要的人抗小鼠抗体应答，允许对人重复进行静脉内施用。
本文所使用的术语“抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，即包含由不同基因编码的两条相同IgH链和两条相同L链的共价异源四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为被相对保守的区域(称为构架区(framework region，FR))分隔开的高变区(称为互补性决定区(complementarity determining region，CDR))。每个VH和VL区由3个CDR和4个FR组成，从氨基端至羧基端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与免疫***的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一成员(C1q)的结合。当两种蛋白质以化学计量性的量(stoichiometric quantity)表达并以正确的构型自组装时，可形成成熟的功能性抗体分子。
术语抗体旨在包括其抗原结合片段。本文所使用的抗体的“抗原结合片段”指抗体中保持特异性结合抗原的能力的一个或多个部分。已经显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。包括在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过在铰链区的二硫桥相连的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由单个抗体臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域V和VH由不同的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们相连，所述接头使得它们可以作为单个蛋白质链产生，其中VL和VH配对形成一价分子(称为单链Fv(scFv)；参阅如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。这些单链抗体还旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”之中。这些抗体片段使用常规操作获得，例如J.Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，98-118页(N.Y.AcademicPress 1983)(通过参考并入本文)中所述的蛋白水解性片段化操作以及本领域技术人员已知的其它技术。以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
优选的抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段CDR3。在一个实施方案中，所述抗体片段是Fc融合多肽的一部分。例如，所述抗体片段是含有N连接寡糖的Fc区。
本文所使用的“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。但是，特异性结合抗原的表位、同工型或变体的分离的抗体可能与其它相关抗原(例如来自其它物种的抗原)交叉反应。另外，分离的抗体可基本不含其它细胞材料和/或化学物质。本文所使用的“特异性结合”指结合预定抗原的抗体。通常，抗体结合的亲和力至少两倍于其结合除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原的亲和力。因此，在一些实施方案中本文所提供的抗体特异性结合靶抗原。
在一些实施方案中，所述抗体是IgG、IgA或IgD同种型。在另一些实施方案中，所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE，或者具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE的免疫球蛋白恒定和/或可变结构域。在另一些实施方案中，所述抗体是双特异性或多特异性抗体。在又一些实施方案中，所述抗体是重组抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体，或者其混合物。在一些实施方案中，所述嵌合抗体是非人(如小鼠、大鼠、兔)抗体部分与人抗体部分的遗传工程融合物。在一些实施方案中，所述嵌合抗体可含有约33％的非人蛋白质和67％的人蛋白质。就小鼠嵌合体而言，可开发它们以降低小鼠抗体所引发的HAMA应答，因为它们可以将小鼠抗体的特异性与人抗体的高效人免疫***相互作用结合在一起。
在其它一些实施方案中，所述抗体是重组抗体。本文所使用的术语“重组抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从转入了另一物种免疫球蛋白基因的动物中分离的抗体、使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合抗体文库中分离的抗体，或者通过任何其它涉及将免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列进行剪接的手段制备、表达、产生或分离的抗体。
在其它一些实施方案中，所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。本文所使用的“嵌合抗体”指将小鼠可变区或高变区与人恒定区或恒定和可变构架区组合在一起的抗体。本文所使用的术语“人源化抗体”指只保留了与人构架区相关联的来自亲本抗体的抗原结合CDR的抗体(参见Waldmann，1991，Science 252：1657)。这些保留了小鼠抗体结合特异性的嵌合或人源化抗体预计在根据本发明以诊断、预防或治疗用途体内施用时预期具有降低的免疫原性。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体是具有提高的ADCC活性的人源化抗体。在一个实施方案中，此抗体是CD137。人源化(也被称为改形(reshaping)或CDR移植)是用于降低来自异种来源(例如小鼠)的单克隆抗体免疫原性的成熟技术。可通过标准分子生物学技术生成人源化抗体。在一个实施方案中，这包括将啮齿动物互补性决定区(CDR)移植到人构架中。但是，此技术很大程度上是一种反复性方法，当设计人源化抗体时有多种要素参与：CDR的长度、人构架以及将来自啮齿动物mAb的残基替换进入构架区(回复突变)。
治疗性小鼠mAb对于人类应用经常是不理想的，因为HAMA(人抗小鼠抗体，human anti-mouse antibody)应答中和了所述抗体，并且迅速将其从循环中清除，在最坏的情况下，还诱导严重的变应性超敏反应。已经开发了一些策略用于使用人序列替换大部分的小鼠Ig序列，使得在保持效力的同时副作用更小。一种用于开发人治疗性mAb的策略是使用人的区域替换小鼠重链(H)和轻链(L)恒定区(分别为CH和CL)，或者一般地替换非人链，以使所得的嵌合抗体除了抗原结合结构域仍为非人的之外主要由人IgG蛋白序列组成。此策略被用于开发美罗华(利妥昔抗人CD20单抗，Genentech)，它是第一个在美国获得批准的单克隆抗体，用于治疗非何杰金淋巴瘤。据估计，提供带有人CH和CL序列的治疗性mAb将减少小鼠抗体蛋白约90％的免疫原性。
根据本发明的一个方面，提供了非人：人嵌合单克隆抗体(即小鼠：人)抗CD137抗体。将小鼠抗体的VL和VH区的互补决定区(CDR)移植到人抗DNA相关独特型免疫球蛋白克隆上。通过竞争性ELISA，本发明的重组嵌合抗体显示出与小鼠单克隆抗体类似的生物活性谱。所述抗CD137抗体在介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性中均有效。
根据一个替代性实施方案，本发明的单克隆抗体可被修饰成双特异性抗体或者多特异性抗体的形式。术语“双特异性抗体”旨在包括任何具有两种不同结合特异性的物质(例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽的复合物)，其与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性抗体”旨在包括任何具有两种以上不同结合特异性的物质(例如蛋白质、肽、或者蛋白质或肽的复合物)，其与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面的Fc受体，和(c)至少一种其它成分结合或相互作用。因此，本发明包括但不限于针对细胞表面抗原并针对效应细胞上Fc受体的双特异性、三特异性、四特异性以及其它多特异性抗体。术语“双特异性抗体”还包括双抗体(diabody)。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但是使用了短到不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一条链上的互补结构域配对，形成了两个抗原结合位点(参见，例如Holliger，E，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：6444-6448；Poijak，RJ.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。
在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。本文所使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文所使用的术语“人抗体”不旨在包括其中将来源于另一种哺乳动物物种种系(如小鼠)的CDR序列移植到人构架区序列上的抗体(本文称之为“人源化抗体”)。使用带有人免疫***部分而非鼠免疫***部分的转基因小鼠产生人抗体。
也可通过免疫针对大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座而言为转基因的小鼠来制备全人单克隆抗体。参阅如美国专利5,591,669，5,598,369，5,545,806，5,545,807，6,150,584以及其中所引参考文献，其内容通过参考并入本文。这些动物经过了遗传修饰，从而功能性缺失了内源(例如小鼠)抗体的产生。所述动物被进一步修饰以含有所有或部分人种系免疫球蛋白基因座，使得对这些动物进行的免疫产生抗目的抗原的全人抗体。在免疫这些小鼠(例如XenoMouse(Abgenix)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))之后，根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体具有人免疫球蛋白氨基酸序列，因此在施用于人时不会激发人抗小鼠抗体(HAMA)应答。像本文所提供的其它抗体那样，人抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或者单克隆抗体和多克隆抗体的混合物。
在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方案中，所述全长抗体包含重链和轻链。
产生多克隆抗体的操作是公知的。例如，通过对已取血以获得免疫前血清的新西兰白兔皮下施用抗原来产生抗体。可以在六个不同部位以总体积100μl/部位注射所述抗原，通常有一个或多个调整。接着在初次注射两周后从所述兔子取血，每六周使用相同抗原定期加强3次。每次加强后十天收集血清样品。从血清中回收多克隆抗体，优选通过使用抗原捕获所述抗体的亲和层析来回收。用于产生多克隆抗体的这种操作及其它操作公开于E.Harlow等编辑，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)，其通过参考并入本文。
为了产生单克隆抗体，多次注射小鼠(参见上文)，取出小鼠脾并重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)中。脾细胞作为淋巴细胞的来源，其中的一些产生具有合适特异性的抗体。然后，将其与永生化骨髓瘤伴侣细胞融合，将融合产物铺在存在选择剂(例如HAT)的多个组织培养孔中。然后通过ELISA筛选这些孔以鉴定含有产生有用抗体的细胞的孔。然后，重新铺板。在生长一段时间后，再次筛选这些孔以鉴定产生抗体的细胞。实施若干克隆操作直至超过90％的孔含有抗体产生为阳性的单克隆。在此操作中建立了产生所述抗体的稳定克隆系。然后可通过使用A蛋白琼脂糖的亲和层析、离子交换层析以及这些技术的变型和组合来纯化所述单克隆抗体(参阅如美国专利6,998,467)。
开发mAb产物的一种替代性策略是在转基因小鼠中产生所述抗体，在所述小鼠中整个天然Ig库已被替换为人Ig基因。这些小鼠产生全人抗体蛋白。以这种方式可产生嵌合、人源化或全人抗体，均为本发明的实施方案。这些抗体均会具有效应子功能，且可用于治疗癌症和癌损伤。本发明的嵌合抗体实施方案保留了原始的小鼠可变(抗原结合)序列，因此应保留其结合及功能特性。
所述抗体可具有如本文任一处所述的糖基化模式，所述糖基化模式为抗体提供了或增强了ADCC活性。本发明包括所有产生具有如本文所提供的增强ADCC活性的抗体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括产生全人单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述方法包括使用转基因小鼠，或者其它非人动物受试者，它们的抗体基因被入基因替换，并且响应于目的抗原免疫而产生“人源化”抗体。在又一个实施方案中，可使用噬菌体展示来改造噬菌体，以在其表面展示全人单克隆抗体。通过上述任一方法产生的抗体可用于产生转基因动物。在一个实施方案中，这通过将编码所述抗体的DNA构建体***转基因动物的基因组来进行。
本发明的一个方面是转基因动物(包括小鼠和山羊)所产生的可包含大量含有甘露寡糖的抗体的乳。这些含有甘露寡糖的抗体具有增强的ADCC谱，并发挥单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞靶受体的优选靶标的功能。提供了用于重组产生本文所述抗体以使它们在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生的方法。这可在细胞培养物中完成。这也可通过在转基因动物的乳中表达抗体来完成。
在一个实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞已被改造为在所述转基因动物(如小鼠或山羊)的乳中表达所述抗体。例如，此基因的表达处于山羊β酪蛋白调控元件的控制之下。在小鼠和山羊中均已建立了所述抗体的实质性表达。可通过共转染含有H和L链的不同构建体或者同时含有两条链的一种构建体来产生转基因动物。在一些实施方案中，两种转基因都***到相同的染色***点，使得所述基因一起转移到后代中，并且蛋白质表达是受到共同调控。在一些实施方案中，针对产生乳蛋白的各个乳腺管上皮细胞对所述表达进行优化。所述动物可以是例如乳品动物(例如山羊和牛)或小鼠。
例如，为了产生含有构建体(例如编码嵌合抗人CD137)的原代细胞系以用于通过核移植产生转基因山羊，可将重链和轻链构建体转染进原代山羊皮肤上皮细胞，其进行了无性扩增并完全表征以评估转基因拷贝数、转基因结构完整性和染色体整合位点。本文所使用的“核移植”指将来自供体细胞的核移植到除去细胞核的***中的克隆方法。
目的蛋白质的编码序列可通过筛选基因组材料文库或者通过逆转录来自所选动物(如牛或小鼠)的信使RNA得到、从例如NCBI、Genbank的序列数据库得到或者通过获得抗体序列得到等。可将所述序列克隆进合适的质粒载体，并在合适的宿主生物(例如大肠杆菌)中扩增。在扩增所述载体之后，可切下DNA构建体，将其从载体的其余部分中纯化出来，并引入到可用于产生转基因动物的表达载体中。所述转基因动物将具有整合进其基因组中的期望的转基因蛋白。
在扩增所述载体之后，可将所述DNA构建体与合适的5’和3’控制序列一起切下，将其从载体的其余部分中纯化出来，并用于产生转基因动物，所述转基因动物具有整合进其基因组中的期望的非糖基化相关转基因蛋白。相反，使用一些载体(例如酵母人工染色体(yeast artificialchromosome，YAC))时，不需要将组装的构建体从载体中移出；在这些情况下所扩增的载体可直接用于产生转基因动物。所述编码序列可与使该编码序列能够在非人转基因哺乳动物的乳中表达的控制序列有效连接。
适于将产生导向至转基因动物乳中的DNA序列可携带来自天然来源乳蛋白的5’启动子区。由此该启动子处于激素和组织特异性因子的控制之下，在泌乳的乳腺组织中活性最高。在一些实施方案中，所述启动子是山羊β酪蛋白启动子。所述启动子可与指导蛋白质前导序列产生的DNA序列有效连接，所述前导序列指导转基因蛋白穿过乳腺上皮细胞分泌到乳中。在一些实施方案中，可添加来源于天然分泌乳蛋白的3’序列以改善mRNA的稳定性。
本文所使用的“前导序列”或“信号序列”是编码蛋白质分泌信号的核酸序列，其在与编码转基因蛋白的下游核酸分子有效连接时指导分泌。所述前导序列可以是天然人前导序列、人工来源的前导序列，或者可得自与用于指导转基因编码序列转录的启动子相同的基因，或者来自通常从细胞(例如哺乳动物乳腺上皮细胞)中分泌出来的另一个蛋白质。
在一些实施方案中，所述启动子是乳特异性启动子。本文所使用的“乳特异性启动子”是天然地指导基因在将蛋白质分泌进乳的细胞(如乳腺上皮细胞)中表达的启动子，并包括如酪蛋白启动子如α酪蛋白启动子(如αS-1酪蛋白启动子和αS2-酪蛋白启动子)、β酪蛋白启动子(如山羊β酪蛋白基因启动子(DiTullio BIOTECHINOLOGY 10：74-77，1992)、γ-酪蛋白启动子、κ-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白(whey acidicprotein，WAP)启动子(Gorton等，BIOTECHNOLOGY 5：1183-1187，1987)、β-乳球蛋白启动子(Clark等，BIOTECHNOLOGY 7：487-492，1989)和α乳白蛋白启动子(Soulier等，FEBS LETTS.297：13，1992)。此定义中还包括在乳腺组织中特异性激活的启动子，例如小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)的长末端重复(longterminal repeat，LTR)启动子。
如本文所使用的，当编码序列和调控序列以下述方式共价连接时被称为“有效连接”，所述方式使得该编码序列的表达或转录处于该调控序列的影响或控制之下。为了使编码序列翻译成功能性蛋白质，将编码序列与调控序列有效连接。如果诱导5’调控序列中的启动子引起编码序列转录并且两个DNA序列间的连接性质不出现下述情况，那么两个DNA序列被称为有效连接，所述情况为：(1)引入移码突变，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或者(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白质的能力。因此，如果启动子区能够实现DNA序列的转录以使所得转录物可翻译成期望的蛋白质或多肽，则所述启动子区与编码序列有效连接。
本文所使用的“载体”可以是多种核酸中的任一种，在所述核酸中可通过限制性处理及连接来***期望的序列，用于在不同遗传环境之间进行运送或者用于在宿主细胞中进行表达。尽管RNA载体也可以使用，但是载体通常由DNA组成。载体包括但不限于质粒和噬粒。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，并且进一步表征为一个或多个核酸内切酶限制性位点，在这些位点处可以以预定的方式切割所述载体，并可连接进期望的DNA序列，以使新的重组载体保留在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，所期望序列的复制可随着质粒在宿主细菌中拷贝数的增加而发生许多次，或者可随着宿主通过有丝***增殖而每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可在溶解期主动发生，或者在溶原期被动发生。表达载体是可通过限制性处理和连接将期望的DNA序列***其中，以使所述DNA序列与调控序列有效连接并可表达为RNA转录物的载体。载体可另外含有一个或多个适用于鉴定细胞是否已被所述载体转化或转染的标记序列。标记包括如编码提高或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码其活性可通过本领域已知的标准测定检测的酶(例如β半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因，以及可见地影响所转化或转染细胞、宿主、集落或菌斑表型的基因。优选载体是能够自主复制并表达与其有效连接的DNA区段中存在的结构基因产物的载体。
本发明的一个方面提供了产生转基因抗体及其变体和片段的方法，所述方法包括在非人转基因哺乳动物的乳中表达由核酸构建体编码的转基因抗体。在一个实施方案中，产生本发明抗体的方法包括：
(a)用编码期望的转基因抗体的转基因DNA构建体转染非人哺乳动物细胞；
(b)选择其基因组中已经***所述转基因DNA构建体的细胞；和
(c)实施第一次核移植操作以产生就所期望的转基因抗体而言为杂合的、并能将其在乳中表达的非人转基因哺乳动物。
在另一个实施方案中，所述方法包括：
(a)提供经改造而表达抗体的非人转基因哺乳动物，
(b)在所述非人转基因哺乳动物的乳中表达所述抗体；和
(c)分离乳中所表达的所述抗体。
这些方法还可包括诱导泌乳的步骤以及确定所得抗体的ADCC活性的步骤。所述方法还可包括额外的分离和/或纯化步骤。所述方法还可包括将所得抗体的ADCC活性与细胞培养物中所产生的抗体进行比较的步骤。在一些实施方案中，可将所得抗体的ADCC活性与非乳腺上皮细胞所产生的抗体进行比较。这些细胞可以是细胞培养物的细胞。用于评估所述抗体ADCC活性的实验技术可以是本领域技术人员已知或本文提供的任何技术，例如下文实施例中的技术。在一些实施方案中，可通过从如本文所述产生的转基因动物的乳中或者从所述转基因动物的后代收集抗体来获得所述抗体。
在一些实施方案中，通过至少一个β酪蛋白启动子来驱动编码所期望抗体(或抗体融合多肽)的构建体。在另一些实施方案中，所述非人转基因哺乳动物是有蹄动物。在又一些实施方案中，所述非人转基因哺乳动物是山羊。
在一些实施方案中，通过转基因哺乳动物产生的抗体以至少1克/升所产乳的水平产生。
也可根据本领域已知的方法产生能够重组表达抗体的转基因动物(参见如美国专利号5,945,577)。适于转基因表达的动物包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲驼。合适的动物还包括牛、山羊、绵羊和猪，其分别涉及多个物种的牛、山羊、绵羊和猪。合适的动物还包括有蹄动物。本文所使用的“有蹄动物”是或者涉及有蹄的通常食草的四足哺乳动物，其包括但不限于绵羊、猪、山羊、牛和马。在一个实施方案中，通过用含有重链和轻链的独立载体共转染原代细胞来产生所述动物。然后将这些细胞用于核移植。或者，如果使用显微注射产生所述转基因动物，共注射所述构建体。如果在一个实施方案中需要改变糖基化水平，那么可使用定点诱变。
克隆将得到多种转基因动物，每种能够产生抗体或其它目的基因构建体。生产方法包括使用所克隆的动物及其后代。在一些实施方案中，所克隆动物是猪、牛或小鼠。克隆还包括胚胎核移植、核移植、组织和器官移植以及产生嵌合体后代。
克隆方法的一个步骤包括将含有目的转基因的细胞基因组移植到去掉核的***中。本文所使用的“转基因”指任一段人工***到细胞或其祖先中的核酸分子，并且其成为细胞所发育成的动物基因组的一部分。这样的转基因可包括对转基因动物来说部分或完全外源(即外来的)的基因，或者可代表与动物内源基因具有同一性的基因。
***的合适的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、非人灵长类等。优选地，***获得自有蹄动物，最优选山羊或牛。分离***的方法是本领域公知的。基本上，所述方法包括从哺乳动物(例如山羊)的卵巢或生殖道分离***。方便可用的有蹄动物***来源是激素诱导的雌性动物。为了成功应用例如遗传工程、核移植和克隆的技术，***在其用作核移植的受体细胞之前和由***受精发育成胚胎之前可以在体内成熟。已在体内成熟的减数***II期***已成功地用于核移植技术。基本上，在发情期开始后数小时或者注射人绒毛膜***(human chorionicgonadotropin，hCG)或类似激素后数小时，通过手术从非超***或超***动物中收集成熟的减数***II期***。
用于预测重组蛋白在乳腺中表达的质和量的一个工具是通过诱导泌乳来实现(Ebert KM，1994)。诱导泌乳允许从转基因产生的早期开始表达和分析蛋白质，而不是从至少一年后怀孕所导致的第一次天然泌乳开始。诱导泌乳可通过激素或手动进行。多种泌乳操作(尤其是激素诱导泌乳)有可能影响乳腺中糖基化转移酶的转录调控。除了NeuGc含量之外，来自多个所克隆动物泌乳样品的N连接寡糖是相似的。来自天然泌乳的转基因抗体生产中的碳水化合物含有比其它泌乳操作更多量的NeuGc，尽管来自不同泌乳的样品中总唾液酸含量相当。类似地，山羊乳中产生的转基因蛋白看来也由各个蛋白质种类的复杂混合物组成(Zhou，2005)。
在体外分析从来自每个品系的合并乳样品中分离的A蛋白纯化的IgG级分，以表征抗体结合特异性和亲和力以及T细胞增殖的剂量依赖性增强。在一个实施方案中，是原始GW mAb的乳来源糖基化和非糖基化嵌合制备物。
建立了具有正常生长和繁殖特征以及合理的生物活性抗体水平(＞1mg/ml)的健康转基因小鼠。在带有给定构建体的小鼠生产可以是在如山羊或牛的物种中大规模产生的前提。嵌合抗CD137的产生和表征引起在小鼠模型中测试一种或多种这些制备物以证明体内抗肿瘤活性。其后，糖基化和非糖基化嵌合抗体构建体均用于产生在其乳中表达抗CD137的转基因山羊。
通过转基因技术修饰动物基因组的能力为生产具有修饰的糖基化模式的重组蛋白提供了新的替代方法。在转基因农场动物的乳中产生人重组药物解决了许多与微生物生物反应器相关(例如缺乏翻译后修饰、不正确的蛋白质折叠、高纯化成本)或与动物细胞生物反应器相关(例如高成本、培养基昂贵、低产率)的问题。在一些实施方案中，本发明包括抗体的转基因生产在优化抗体分子糖基化模式的期望基因为纯合的转基因动物乳中的用途。
根据本发明的另一个实施方案，靶分子的糖基化模式可以例如通过改变非人哺乳动物的喂食来修饰(Kerr等，2003)。
本发明还提供了生产抗体的方法，其包括从经改造以在其乳中表达所述抗体的转基因非人动物的乳中收集所述抗体，以及测定所述抗体的ADCC活性。在一些实施方案中，将其ADCC活性与细胞培养物中所表达抗体的ADCC活性进行比较。在另一个实施方案中，从经改造以表达所述抗体的培养的乳腺上皮细胞中收集抗体，并测定所述抗体的ADCC活性。在一些实施方案中，将其ADCC活性与细胞培养物中所表达抗体的ADCC活性进行比较。在一些实施方案中，所述细胞培养物中的细胞是非乳腺上皮细胞。用于评估ADCC活性的测定在下文实施例中提供，并且也是本领域已知的。
本文所使用的术语“基本上纯的”指蛋白质基本不含其它物质，其程度使其预期用途可行且适当。特别地，所述蛋白质是充分纯的并且充分地不含宿主细胞的其它生物成分，以使得可用于例如蛋白质测序或生产药物制剂。因此，在一些实施方案中，所述抗体是基本上纯的。
本文中就多肽而言所使用的“分离的”指从其天然环境中分离，并且以足以允许其鉴定或应用的量存在。当指蛋白质或多肽时，分离的意为，例如：(i)通过表达克隆选择性产生或者(ii)通过如层析或电泳进行纯化。分离的蛋白质或多肽可以是(但不必然是)基本上纯的。由于在药物制剂中分离的多肽可以与可药用载体混合，因此所述多肽可只占该制剂的一小部分重量百分比。无论怎样，所述多肽是都分离的，因为它已经与在活***中可与之相关的物质分离开，即从其它蛋白质中分离。因此，在一些实施方案中，所述抗体是分离的。
所述抗体表现出增强的ADCC活性，ADCC活性是在治疗中成功应用单克隆抗体的重要因素。同时结合本发明抗体的恒定或Fc区可诱导生物应答。这些应答之一是在靶细胞中诱导细胞凋亡或ADCC。ADCC通过Fc区与Fcγ受体的结合起作用，所述受***于单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的表面。一旦结合所述受体，这些细胞就被活化并释放细胞因子和可杀伤靶细胞(含有抗原靶标的细胞)的氧化自由基。
因此，在一个方面，本发明涉及具有增强的ADCC活性并因此具有增强治疗特性的抗体制剂。所提供的组合物可用于治疗ADCC活性会赋予至少某些医学益处的受试者。因此，所提供的组合物可用于治疗患病的受试者。在一些实施方案中，所述抗体可用于通过施用该抗体来增强受试者中的ADCC活性，从而治疗受试者。
本文所使用的术语“治疗”包括阻止性(例如预防性)和姑息性治疗。
所提供组合物可提供有益疗效的具体适应症包括癌症，例如对实体瘤、黑色素瘤以及乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌、***癌和肺癌的有效免疫调节治疗。
本文所使用的“癌症”指干扰身体器官和组织的正常功能的细胞非受控生长。从原发部位转移并波及重要器官的癌症可通过患病器官的功能性衰退最终导致该受试者死亡。癌症包括何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、蕈样肉芽肿/塞扎里综合征、组织细胞增多病X、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom’s巨球蛋白血症、冷球蛋白血症和重链病。造血***癌症(例如白血病)能够在竞争中胜过受试者中正常的造血对应物，由此导致造血障碍(为贫血、血小板减少和嗜中性粒细胞减少的形式)，最终导致死亡。
转移是由于癌细胞从原发肿瘤传播到身体其它部分而产生的不同于原发肿瘤部位的癌细胞区域。在诊断原发肿瘤块时，可监测受试者中转移的存在情况。除了监测具体症状以外，最经常通过单独或联合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层(CT)扫描、血及血小板计数、肝功能研究、胸部X射线和骨扫描来检测转移。
本文所使用的癌症包括下述癌症类型：乳腺癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌(包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤)、***、绒膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、白血病、血液瘤(包括急性淋巴细胞白血病和髓性白血病)、T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤、上皮内瘤(包括鲍恩病和佩吉特病)、肝癌、肺癌、淋巴瘤(包括何杰金病和淋巴细胞性淋巴瘤)、成神经细胞瘤、口癌(包括扁平上皮细胞癌)、卵巢癌(包括发生于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的癌)、胰腺癌、***癌、直肠癌、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑色素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、睾丸癌(包括生殖细胞瘤例如***瘤、非***瘤(畸胎瘤、绒膜癌)、基质癌和生殖细胞癌；胸腺癌(包括胸腺腺癌和髓癌)以及肾癌(包括腺癌和肾母细胞瘤)。其它癌症是本领域技术人员已知的，包括肥大细胞瘤、胸腺瘤、浆细胞瘤和神经胶质瘤。
本发明的组合物也可用于治疗免疫疾病。“免疫疾病”包括成人呼吸窘迫综合征、动脉硬化、哮喘、静脉硬化、胆囊炎、硬化病、克罗恩病、糖尿病、肺气肿、嗜酸性粒细胞增多症(hypereosinophilia)、炎症、肠易激综合征、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎或心包炎、骨关节炎、骨质疏松症、胰腺炎、类风湿性关节炎、硬皮病和结肠炎(参见如美国公开专利申请2003/0175754)。
本发明的组合物还可用于治疗自身免疫病，包括但不限于***性红斑狼疮、狼疮肾炎、糖尿病、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病、阿狄森氏病、Sjogren综合征、小舞蹈症(Sydenham’s chorea)、高安动脉炎、韦氏肉芽肿病、自身免疫性胃炎、自身免疫性肝炎、皮肤自身免疫病、自身免疫性扩张性心肌病、多发性硬化、心肌炎、重症肌无力、恶性贫血、多肌痛、银屑病、急进性肾小球肾炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、肌肉自身免疫病、睾丸自身免疫病、卵巢自身免疫病和眼自身免疫病。
在另一个实施方案中，具有增强ADCC活性的抗体在治疗自身免疫所产生的脑脊髓炎、***性红斑狼疮及其它疾病方面是有效的。
本文所提供的抗体可与其他治疗剂组合。可同时或依次施用所述抗体和其它治疗剂。当所述其它治疗剂同时施用时，它们可以在相同或不同制剂中施用，但是在同一时间施用。当所述其它治疗剂与所述抗体的施用在时间上分开时，所述其它治疗剂彼此依次施用，并与所述抗体依次施用。这些化合物的施用之间的时间间隔可以是数分钟或者可以更长。
其它治疗剂包括例如但不限于抗癌疗法。抗癌疗法包括癌症药物、放射和手术操作。本文所使用的“癌症药物”指出于治疗癌症的目的而施用于受试者的药剂。本文所使用的“治疗癌症”包括预防癌症发生、减少癌症症状和/或抑制已形成癌症的生长。在其他一些方面，对有发生癌症风险的受试者施用所述癌症药物，以降低发生癌症的风险。本文描述了用于治疗癌症的多种药物类型。就本说明书而言，癌症药物分为化疗剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、激素治疗和生物应答调节剂。
化疗剂可选自氨甲喋呤、长春新碱、阿霉素、顺铂、不含糖的氯乙基硝基脲类、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、葡甲胺GLA、戊柔比星、卡莫司汀和聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法呢基转移酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、米托蒽醌/Mitroxantrone、Metaret/苏拉明、巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、Picibanil/OK-432、AD 32/戊柔比星、美他特龙/锶衍生物、泰道/替莫唑胺、Evacet/脂质体多柔比星、Yewtaxan/紫杉醇、泰素/紫杉醇、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、Cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、尔吉咪唑/左旋咪唑、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、开普拓/左旋咪唑、Camptosar/伊立替康、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈滨、Paxex/紫杉醇、Doxil/脂质体多柔比星、Caelyx/脂质体多柔比星、Fludara/氟达拉滨、Pharmarubicin/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/-二萘二亚胺(Bis-Naphtalimide)、LU 103793/多拉司他汀、Caetyx/脂质体多柔比星、Gemzar/吉西他滨、ZD 0473/Anormed、YM116、碘粒、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/异环磷酰胺、威猛/替尼泊苷、伯尔定/卡铂、Plantinol/顺铂、Vepeside/依托泊苷、ZD 9331、泰索帝/多西紫杉醇、鸟嘌呤***糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂例如美法仑和环磷酰胺、氨鲁米特、门冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖胞苷、放线菌素、盐酸柔红霉素、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(hydroxycarbamide)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、乙酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥(氮芥子气)、巯嘌呤、美司钠、米托坦(o.p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸丙卡巴肼、链佐星、柠檬酸他莫昔芬、硫鸟嘌呤、塞替派、硫酸长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、***、六甲嘧胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG；甲基乙二醛丙酮双脒腙；MGBG)、喷司他丁(2′脱氧助间型霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛，但不限于此。
免疫治疗剂可选自Ributaxin、赫赛汀、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMART M195、ATRAGEN、Ovarex、百克沙、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗VEGF、赛尼哌、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egfr3、ior c5、BABS、抗FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10Ab、SMART ABL 364Ab和ImmuRAIT-CEA，但不限于此。
癌症疫苗可选自EGF、抗独特型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神经节苷脂缀合疫苗、Her2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、Melacine、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC病毒和ImmuCyst/TheraCys，但不限于此。
所述其它的治疗剂还可以是免疫调节剂。可施用的免疫调节剂实例有IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素、紫杉醇、TNF-α或其组合，但不限于此。本发明的抗体还可与免疫调节剂和/或其它的抗癌剂(例如IL-21、IL-12和/或曲妥珠单抗)联合施用。
有效量的所提供组合物是有用的。术语“有效量”指实现期望的生物效应所必需或足够的量。结合本文所提供的教导，通过在多种活性化合物和权重因子(例如效力、相对生物利用率、患者体重、不良副作用的严重程度和优选的给药模式)之间进行选择，可设计出不带来显著毒性但仍有效治疗特定受试者的有效的预防性或治疗性治疗方案。任一具体应用的有效量可根据以下因素而变化，例如所治疗的疾病或病症、所施用的具体组合物、受试者的身材或者疾病或病症的严重程度。本领域技术人员可经验性地确定具体组合物的有效量，而不需要过度实验。一般优选使用最大剂量，即根据一些医学判断的最大安全剂量。可以考虑每天多次给药以达到合适的化合物全身水平。合适的全身水平可通过例如测量患者的药物峰值或持续血浆水平来确定。在本文中“剂量”和“给药”可互换使用。
治疗有效量的确定具体取决于例如该药剂的毒性和效力的因素。可使用本领域公知的方法确定毒性。可使用同样的指导确定效力。因此，药用有效量是临床医师认为具有可容忍毒性且有效的量。例如，可通过测量靶组织处T淋巴细胞细胞毒性的诱导或显著诱导或者靶组织量的减小来测定疗效。根据一个优选实施方案，预计合适的剂量为约1mg/kg至10mg/kg。
根据一些涉及对需要治疗的受试者施用治疗有效量的本发明抗体的实施方案，“治疗有效”表示抑制或逆转疾病状况(例如减少或抑制癌生长)所需的抗体量。一些方法考虑与已知的癌症药物或疗法(如化疗，优选使用本文列出的化合物类型，或放射)的组合疗法。所述患者可以是人或非人动物。当患有特征为促进癌症维持或增殖的受体水平提高的癌症时，患者通常是需要治疗的。
一般地，活性化合物的每日经口剂量将是约每天0.01毫克/kg至1000毫克/kg。预计每日一次或多次施用的0.5至50毫克/kg剂量会获得期望的结果。可适当调整剂量以实现期望的药物水平(局部或全身)，这取决于给药模式。例如，预计静脉内给药将的每日剂量可低一个至几个数量级。如果在此剂量下受试者的应答不足，那么可使用程度为患者的耐性所允许的更高剂量(或者通过更为局部的不同递送途径实现的更高有效剂量)。考虑每日多次给药以达到合适的抗体全身水平。
在一些实施方案中，所提供的组合物用于体内应用。取决于预期的体内给药模式，所使用的组合物剂型可以是固体、半固体或液体，例如片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、凝胶剂、软膏剂、液体剂、混悬剂等。优选所述组合物以适于单次施用精确剂量的单位剂型施用。根据所期望的制剂，所述组合物还可包含可药用载体或稀释剂，其定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的水基载体。选择所述稀释剂以使其不影响目的人重组蛋白的生物活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。可使用相同稀释剂来重建冻干的目的人重组蛋白。另外，所述药物组合物还可包含其它药用剂(medicianl agent)、药剂(pharmaceutical agent)、载体、佐剂、非毒性、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等等。这些稀释剂或载体的有效量是有效获得就组分的溶解度、生物活性等方面而言可药用制剂的量。在一些实施方案中，本文提供的组合物是无菌的。
本文的组合物可经口、胃肠外或局部施用以及全身性形式施用于人，用于抗黑色素瘤、抗淋巴瘤、抗白血病和抗乳腺癌治疗。本发明的组合物还可用于治疗多种自身免疫病，例如类风湿性关节炎、***性狼疮、多发性硬化等。
在体内治疗过程中的施用可以通过任意种途径实现，包括胃肠外和经口，但是优选胃肠外。可使用囊内、静脉内、鞘内和腹膜内途径的施用，一般优选静脉内。本领域技术人员了解，给药途径根据所治疗的疾病而变化。
对于治疗应用，可通过任何将所述组合物递送到预期表面的方式对受试者施用有效量的所述组合物。可通过任何本领域技术人员已知的方式完成本发明药物组合物的给药。优选的给药途径包括但不限于经口、胃肠外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼、***和直肠的给药。
当需要全身递送时，可将所述化合物配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输注)进行胃肠外给药。用于注射的制剂可以是单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中，其中加入了防腐剂。所述组合物可采取如混悬液、溶液或者油载体或水载体乳剂的形式，并可含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药物制剂包括水溶性形式活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的混悬液可制备成合适的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)或脂质体。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加所述化合物溶解度的物质，以允许制备更高浓度的溶液。
或者，所述活性化合物可以是在使用前与合适载体(例如无菌无热原的水)混合的粉末形式。
对于经口给药，药物组合物可以采取片剂或胶囊剂的形式，其通过常规手段使用可药用赋形剂来制备，所述赋形剂为例如粘合剂(如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(如土豆淀粉或淀粉乙二醇酸钠)；或润湿剂(如月桂基硫酸钠)。所述片剂可通过本领域公知的方法进行包衣。用于经口给药的液体制剂可采取例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式，或者它们可在使用前与水或其它合适载体重建的干燥产物。这些液体制剂可使用可药用添加剂通过常规手段制备，所述添加剂为例如助悬剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂)；乳化剂(如卵磷脂或***胶)；非水载体(如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)和防腐剂(如甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸)。所述制备物在适当时还可含有缓冲盐、芳香剂、着色剂和甜味剂。
可适当地配制用于经口给药的制剂，以提供活性化合物的受控释放。对于口给药，所述组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于经口给药，例如可通过将活性抗体与本领域公知的可药用载体组合来简单地配制所述抗体。这些载体能够将本发明配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，以用于被所治疗的受试者经口消化。可作为固体赋形剂获得用于经口使用的药物制剂，任选地粉碎所得混合物，并且需要时在加入合适的辅料后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂芯。具体地，合适的赋形剂是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时可加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。任选地，经口制剂还可在盐水或缓冲液(即用于中和内在酸性条件的EDTA)中配制，或者可在无任何载体的情况下施用。
具体地，还考虑了所述抗体的经口剂型。可对所述组分进行化学修饰，以使所述抗体的经口递送是有效的。一般地，所考虑化学修饰是在抗体上附着至少一个部分，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解以及(b)从胃或肠摄入到血流中。还期望所述抗体的总稳定性提高，以及在身体中的循环时间提高。这些部分的实例包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，″Soluble Polymer-EnzymeAdducts″，Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts编辑，Wiley-Interscience，New York，NY，367-383页；Newmark，等，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。其它可使用的聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧八环。如上所述，优选用于药物应用的是聚乙二醇部分。
所述组合物的释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或者大肠。本领域技术人员拥有不在胃中溶解而在十二指肠或肠的其它位置释放所述物质的可用制剂。优选地，所述释放会避免对胃环境的有害作用，这是通过对抗体的保护或者通过生物活性物质在胃环境之外的地方(例如肠)释放来实现的。
为了确保完全的胃抗性，在至少pH 5.0下不透的包衣是必需的。更常见的用作肠衣的惰性成分实例是乙酸苯三甲酸纤维素(celluloseacetate trimellitate，CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropyhnethylcellulose phthalate，HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate，PVAP)、丙烯酸树脂(Eudragit)L30D、Aquateric、乙酸邻苯二甲酸纤维素(cellulose acetate phthalate，CAP)、丙烯酸树脂L、丙烯酸树脂S和虫胶。这些包衣可作为混合膜使用。
包衣或包衣的混合物还可用于不旨在提高胃保护的片剂上。这可包括糖包衣或使得所述片剂易于吞咽的包衣。胶囊可由用于递送干燥治疗剂(如粉剂)的硬壳(例如明胶)组成；对于液体形式，可使用软的明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是粗淀粉或其它可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或研制片剂，可使用湿法聚集(massing)技术。
所述治疗剂可作为细小的多颗粒(multi-particulate)包含在所述制剂中，所述多颗粒为约1mm大小的颗粒或小丸的形式。用于胶囊施用的材料的制剂还可以是粉剂、轻微压制的丸剂或甚至片剂。可通过压制来制备所述治疗剂。
着色剂和芳香剂都可包含在内。例如，可配制所述组合物(例如通过脂质体或微球封装)，然后进一步包含在可食用产品中，例如含有着色剂和芳香剂的清凉饮料。
可使用惰性材料来稀释治疗剂或增大其体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。一些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
崩解剂可包含固体剂型的治疗制剂中。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商品崩解剂Explotab。淀粉乙醇酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、桔皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可使用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状的树脂可用作崩解剂和粘合剂，它们可包括粉状树脂如琼脂、卡拉牙胶或黄芪胶。海藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
结合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂，包括来自天然产物的材料，如***胶、黄芪胶、淀粉和明胶。其它的包括甲基纤维素(methyl cellulose，MC)、乙基纤维素(ethyl cellulos，EC)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrolidone，PVP)和羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl cellulose，HPMC)均可用于醇溶液中，以对治疗剂进行造粒。
抗摩剂(anti-frictional agent)可包含在治疗制剂中，以防止配制过程中的粘附。润滑剂可用作治疗剂与模壁之间的层，它们可包括但不限于：硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，例如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
可以添加可改善药物在配制过程中的流动特性以及在压制过程中帮助重排的助流剂。所述助流剂可包括淀粉、滑石、热解硅石和水合硅铝酸。
为了帮助治疗剂溶解到水性环境中，可添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂例如月桂基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛酯磺酸钠。可使用阳离子去污剂，可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可包括在制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂列表如下：聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或作为不同比例的混合物存在于制剂中。
可经口使用的药物制剂包括明胶制成的压出式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。压出式胶囊可含有与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬于合适液体(例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。另外，可加入稳定剂。也可使用配制成用于经口给药的微球。这些微球是本领域中已经充分定义过的。所有用于经口给药的制剂均应该是适于这种给药的剂量。
对于口给药，所述组合物可采取常规方式制备的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，根据本发明应用的化合物可方便地以气雾剂的形式递送，所述气雾剂来自加压包或喷雾器，其使用了合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以递送计量的量。可将用于吸入器或吹入器的(例如明胶)胶囊和药筒配制成含有所述化合物与适当粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文还考虑了肺递送。所述组合物可在吸入时递送到哺乳动物的肺，并穿过肺上皮细胞层达到血流。吸入分子的其它一些报道包括Adjei等，1990，Pharmaceutical Research，7：565-569；Adjei等，1990，International Journal of Pharmaceutics，63：135-144(乙酸亮丙瑞林)；Braquet等，1989，Journal of Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard等，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.III，206-212页(a1-抗胰蛋白酶)；Smith等，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等，1990，″Aerosolization ofProteins″，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人生长素)；Debs等，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)和Platz等，美国专利No.5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。用于肺递送药物产生全身性作用的方法和组合物描述于Wong等1995年9月19日授权的美国专利号5,451,569。
考虑在本发明实践中使用多种设计用于肺递送治疗物的机械装置，包括但不限于喷雾器、计量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。
适于实施本发明的市售装置的一些具体实例为Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造的Ultravent喷雾器；Marquest Medical Products，Englewood，Colorado制造的Acorn II喷雾器；Glaxo Inc.，ResearchTriangle Park，North Carolina制造的Ventolin计量吸入器；和FisonsCorp.，Bedford，Massachusetts制造的Spinhale粉末吸入器。
所有这些装置都需要使用适于分散的制剂。通常，每种制剂对于所使用的装置类型是特定的，除了治疗中使用的常规稀释剂、佐剂和/或载体之外还可涉及使用合适的推进剂材料。还考虑使用脂质体、微胶囊或微球、包含络合物或其它类型的载体。化学修饰的抗体也可制备成不同制剂，取决于化学修饰的类型或所用装置的类型。
适于使用喷雾器(喷射或超声)的制剂通常包含溶解于水中的治疗剂，其溶解浓度为每毫升溶液约0.1至25mg生物活性治疗剂。所述制剂还可包含缓冲剂和单糖(例如用于稳定抗体和调节渗透压)。喷雾器制剂还可含有表面活性剂，以降低或防止在形成气雾剂过程中溶液雾化导致的表面诱导的治疗剂聚集。
用于计量吸入装置的制剂一般包含精细分割的粉末，其含有在表面活性剂帮助下悬于推进剂中的治疗剂。推进剂可以是任何用于此目的常规材料，例如氯氟碳化合物、氢氯氟碳化合物、氢氟碳化合物或碳氢化合物，其包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
用于从粉末吸入装置中分散的制剂会包含含有治疗剂的精细分割干粉，并且还可包含填充剂(例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露糖)，其量促进粉末从所述装置中分散，例如制剂重量的50至90％。所述治疗剂可以制备成平均粒径小于10毫米(或微米)、最优选0.5至5毫米的特定形式，以最有效地递送到远端肺。
还考虑了本发明药物组合物的鼻递送。鼻递送允许本发明药物组合物在对鼻施用所述治疗产品后直接传递到血流，而无需所述产品在肺中沉积。用于鼻递送的制剂包括含有葡聚糖糖或环糊精的制剂。
对于鼻给药，可用装置是附有计量喷雾器的小硬瓶。在一个实施方案中，通过将本发明药物组合物溶液吸到确定体积的腔室中来递送计量药剂，所述腔室具有雾化气雾剂所需的孔径尺寸，所述雾化是通过当在所述腔室中液体被压缩时形成喷雾来实现的。所述腔室被压缩以施用本发明药物组合物。在一个具体实施方案中，所述腔室是活塞设置。这些装置是市售的。
或者，使用塑料挤瓶，其具有尺寸为通过在挤压时形成喷雾来雾化气雾剂所需的孔径或开口。所述开口常见于所述瓶的顶部，所述顶部一般是逐渐变细的以适合鼻道，以有效施用气雾剂。优选地，所述鼻吸入器提供计量的气雾剂，以施用定量的药物。
所述化合物也可配制成直肠或***组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
除了前述制剂以外，所述化合物还可配制成长效制剂(depotpreparation)。这些长效制剂可使用下列项来配制：合适的聚合或疏水材料(例如可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，或者微溶衍生物例如微溶盐。
所述药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相的载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶以及聚合物例如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制剂形式为例如用于吸入的水或盐水溶液、微封装的、螺旋状的(encochleated)、涂敷在显微金粒上的、脂质体中包含的、喷雾化的、气雾剂、用于植入皮肤的小球、或者在用于划破进入皮肤的锋利物体上干燥的。所述药物组合物还可包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、滴剂或活性化合物受保护释放的制剂，其中制剂赋形剂和添加剂和/或辅料(例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、芳香剂、甜味剂或增溶剂如上文所述常规使用。所述药物组合物适用于多种药物递送***。药物递送方法的简要综述可参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，其通过参考并入本文。
所述抗体及任选的其它治疗剂可以以自身(纯的)施用，或者以可药用盐的形式施用。当用于药物时，所述盐应该是可药用的，但是非药用盐可方便地用于制备其可药用盐。这些盐包括但不限于由下述酸所制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸、奈2-磺酸和苯磺酸。这些盐还可制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如羧酸基的钠、钾或钙盐。
合适的缓冲剂包括：乙酸及盐(1-2％(重量/体积))；柠檬酸及盐(1-3％(重量/体积))；硼酸及盐(0.5-2.5％(重量/体积))；磷酸及盐(0.8-2％(重量/体积))。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％(重量/体积))；氯丁醇(0.3-0.9％(重量/体积))；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％(重量/体积))和硫柳汞(0.004-0.02％(重量/体积)).
本发明的药物组合物含有有效量的抗体以及任选的包含在可药用载体中的治疗剂。术语可药用载体指适于对人类或其它脊椎动物施用的一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。术语载体指天然或合成的有机或无机成分，其与活性成分相组合以便于应用。所述药物组合物的组分能够以不显著破坏所需药物疗效的方式与本发明的化合物混合，并彼此混合。
所述治疗剂(具体包括但不限于所述抗体)可以颗粒形式提供。本文所使用的颗粒指纳米或微米颗粒(或者在一些情况下更大)，其可全部或部分由抗体组成。所述颗粒可在核心含有所述治疗剂，所述核心被包衣(包括但不限于肠衣)包围。所述治疗剂还可分散在整个颗粒中。所述治疗剂还可被吸附到颗粒中。所述颗粒可以是任何级的释放动力学情况，包括零级释放、一级释放、二级释放、延迟释放、持续释放、立刻释放及其组合等。除了治疗剂之外，所述颗粒还可包含常规用于药剂和药物领域的任何材料，包括但不限于易蚀的、不易蚀的、可生物降解的或不可生物降解的材料或其组合。所述颗粒可以是微胶囊，其含有溶液或半固体状态的抗体。所述颗粒可以基本为任何形状。
不可生物降解的和可生物降解的聚合物均可用于制造用于递送所述治疗剂的颗粒。这些聚合物可以是天然或合成聚合物。所述聚合物根据期望的释放时间进行选择。特别感兴趣的生物粘附聚合物包括H.S.Sawhney，CP.Pathak和J.A.Hubell在Macromolecules，(1993)26：581-587中描述的生物易蚀水凝胶，其教导并入本文。它们包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸、壳聚糖、聚(异丁烯酸甲酯)、聚(异丁烯酸乙酯)、聚(异丁烯酸丁酯)、聚(异丁烯酸异丁酯)、聚(异丁烯酸己酯)、聚(异丁烯酸异癸酯)、聚(异丁烯酸月桂酯)、聚(异丁烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)以及聚(丙烯酸十八酯)。
所述治疗剂可包含在受控释放***中。术语“受控释放”意指药物从制剂释放的方式和特征谱受到控制的任何含有药物的制剂。这是指立即释放和非立即释放制剂，非立即释放制剂包括但不限于持续释放和延迟释放制剂。术语“持续释放”(也被称为“延长释放”)以其常规意义使用，指提供在延长的时间中逐渐释放药物并优选地(尽管不是必需的)导致在延长的时间内基本恒定的药物血液水平的制剂。术语“延迟释放”以常规意义使用，指在制剂的施用与药物释放之间有时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可涉及或不涉及药物在长期时间内的逐渐释放，因此可以是或不是“持续释放”。
长期持续释放植入物的应用可特别适用于治疗慢性病症。本文所使用的“长期”释放指构建并安置所述植入物以在至少7天、优选30-60天中递送治疗水平的活性成分。长期持续释放植入物是本领域技术人员公知的，其包括一些上文所述的释放***。
本文还提供了含有所提供抗体的试剂盒。图14显示了这些试剂盒的一个例子。试剂盒10包含抗体12。试剂盒10还可含有一种或多种管或容器14。所述试剂盒还包含用于对患有本文所述疾病(如癌症)或具有此疾病症状的受试者施用所述成分的说明。
在一些实施方案中，试剂盒10可包含药物制剂瓶、药物制剂稀释剂瓶、以及所述抗体。含有用于药物制剂的稀释剂的瓶是任选的。所述稀释剂瓶含有稀释剂例如生理盐水，以稀释所述抗体的浓溶液和冻干粉末。所述说明可包含混合特定量稀释剂和特定量浓药物制剂，由此制备用于注射或输注的最终制剂的说明。所述说明可包含在注射器或其它施用装置中使用的说明。说明20可包含使用有效量的抗体来治疗患者的说明。还应理解，含有所述制剂的容器(无论所述容器是瓶、带隔膜的瓶、带隔膜的安瓿、灌注袋等)都可含有标记例如常规标签，其在所述制剂经高压灭菌或其它灭菌时改变颜色。
“受试者”应指人或脊椎哺乳动物，其包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类，如猴。
除非本文另外定义，与本发明相关所使用的科技术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外需要，单数术语包含复数，复数术语包含单数。一般地，根据本领域公知的常规方法实施本发明的方法和技术。一般地，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交相关使用的命名法和技术是本领域公知且常规使用的。除非另有指出，本发明的方法和技术一般根据本领域公知的常规方法并如本说明书中引用并讨论的多个一般性和较具体的参考文献中所述来实施。
通过下述实施例进一步说明本发明，所述实施例不应以任何方式理解为进一步的限制。本申请中所引用的所有参考文献(包括文献、授权专利、公开的专利申请以及共同未决的专利申请)的全部内容通过参考明确地并入本文。
实施例
材料和方法
测序来自杂交瘤的mRNA
使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒(目录号74104)制备RNA。在第4天，将13ml培养物离心5分钟，重悬于PBS。再次离心5分钟。将所得沉淀重悬于含6μlμ-ME的600μl RNeasy RLT中。将裂解液5次穿过22g针，加入600μl70％EtOH并混合。两次将700μl等分试样加到RNeasy柱，离心30秒，用700μl RW1洗涤。用500μl PPE洗涤两次，干燥1分钟，用50μl水洗脱两次。
使用寡聚dT引物，用Promega逆转录***(目录号A3500)对2μl RNA进行逆转录。反应物在42℃孵育1小时，然后加热到95℃保持5分钟。然后用水将反应物稀释到100μl。用引物对1μl cDNA等分试样进行PCR，所述引物选自N端或5’末端之一以及C端或3’末端之一。使用仅来自恒定区的引物进行PCR作为阳性对照。
使用Qiagen QiaQuick PCR纯化试剂盒(目录号28104)来纯化PCR产物。进行另外的洗脱以使终体积为100μl测定260nm处的吸光度。浓度在10-26ng/μl变化，取出100ng与PCR所用的N端引物一起用于测序。
因为所用氨基端引物是抗体氨基端编码序列的一部分，所以它们可在所述序列中引入突变。使用所得序列，从小鼠基因组鉴定种系基因。然后合成这些基因末端的引物，用于从cDNA中PCR得到完整编码序列。以这种方式获得了所述抗体的完整编码序列，而不含任何PCR引物所贡献的序列。因为在每种情况下它都与氨基端序列一致，所以所述编码序列是所表达抗体的序列。如序列中标注出的，从已知J区中鉴定出J区。
抗人CD137重链和轻链基因的克隆和测序
构建含有四个主要IgG亚类的人恒定区序列的转基因表达载体。这些载体携带山羊β酪蛋白启动子以及确保乳腺特异性转基因表达的其它5’和3’调控序列。通过***小鼠抗人CD137抗体的可变区序列来构建所述嵌合抗体变体。通过对相应可变区测序来鉴定小鼠序列的抗CD137H和L链。组装代表来自多个小鼠免疫球蛋白家族5’编码区序列的寡核苷酸集合。单个使用小鼠免疫球蛋白序列作为5’引物来扩增从杂交瘤RNA制得的cDNA，对所得PCR产物进行克隆和测序。3’PCR引物从恒定区的已知序列中制得。所述PCR引物包含限制性内切酶位点，以使所扩增的序列可***表达载体中。将这些序列***所述构建体中以产生编码嵌合蛋白的基因。
用于克隆和测序抗CD137抗体基因可变区的方法包括下述步骤(1)-(5)。(1)从杂交瘤RNA得到cDNA。通过标准方法从杂交瘤制备RNA，通过使用市售试剂盒(Reverse Transcription System，Promega，Madison，WI)的逆转录来制备cDNA。(2)使用基于数个良好表征的小鼠单克隆抗体VH和VL区氨基端已知序列的引物，通过PCR扩增cDNA。(3)通过将PCR产生的序列***带有新霉素抗性(neoR)选择标记的克隆载体来扩增可变区序列，分离neoR菌落。(4)对从约6个菌落制得的H和L链cDNA进行测序，以确定每个可变区的共有序列。确保没有在PCR产物序列中引入突变是很重要的。DNA测序通过SequeGen，Co.(Worcester，MA)的付费服务进行。(5)对分离自杂交瘤上清液的H和L蛋白进行测序，将实际的蛋白质序列与从基因序列推导出的蛋白质序列进行比较。此步骤确认了所克隆的基因编码功能性抗体链。蛋白质测序通过Cardinal Health(San Diego，CA)的付费服务进行。
产生用于嵌合抗体的分离的嵌合IgG重链及轻链构建体
使用根据上文所提供方法获得的可变区序列来替换现有人IgG1抗体中的人可变区序列。在本发明的一个实施方案中，IgG1表达载体中的人可变区序列与小鼠可变区序列一起使用，以产生嵌合人源化抗体。所述抗体表达载体含有天然糖基化模式的IgG1H基因。IgG1糖基化位点是CH2结构域中297位的Asn残基。通过基因序列中的定点诱变将Asn297改变成Gln297，产生IgG1H链的非糖基化形式。这提供了3种构建体：L链、糖基化H链和非糖基化H链。使用每个构建体的两种形式进行测试。通过限制性作图和Southern印迹分析来评价每个构建体，所述构建体用于产生转基因动物。另外，所述构建体用于瞬时转染研究，以测试经遗传改造的嵌合蛋白的生物活性。
用于开发转基因动物的构建体含有山羊β酪蛋白启动子和用于确保高水平乳腺特异性转基因表达的其它5’和3’调控序列。因为启动子和其它调控元件的物种交叉识别，所以同一构建体可用于产生转基因小鼠和山羊。一旦育种后，针对糖基化水平和增强的ADCC特性来筛选山羊和/或小鼠。通过限制性作图来确认所述构建体的结构完整性。所述构建体用于产生瞬时转染的细胞和转基因动物。
构建重链嵌合物并***表达载体中
为了构建小鼠IgG2a恒定区被人IgG1恒定区替换的重链嵌合物，使用含有带小鼠前导序列的人抗体序列的BC2083表达载体(质粒1)。通过不改变C端附近甘氨酸编码的G到A沉默突变来消除剪接供***点。将唯一的位点置于BC2083表达载体中可变区附近。将DraIII和PmII置于N端，ApaI存在于重链恒定区的氨基部分中。通过使用引物从CMV-Zeo中进行zeo基因的PCR，将这些位点克隆到BC2083的XhoI位点中，得到p80BC2083zeo(质粒2)。这种将限制性位点***质粒的快速方法使用了zeo基因所赋予的zeocin抗性。通过使用NZYCM琼脂中25μg/ml的zeocin来选择zeocin抗性。
通过将人IgG1恒定区部分从BC2083中切出并克隆进p80来将其放回到唯一的ApaI和XhoI位点，得到p83BC2083DraIII IgG1(质粒3)。此质粒具有重链可变区侧翼的唯一的DraIII/PmlI和ApaI位点，使得任何重链可变区附着到人IgG1恒定区编码序列。
通过PCR将DraIII和PmlI位点置于氨基端并且将Apa位点置于C端，制备用于***的抗CD137抗体的重链可变区。所述ApaI位点天然存在于人IgG1恒定区的氨基端附近。使用引物MHE和MHEC，利用PfuTurbo(Stratagene目录号600153-81)和cDNA实施PCR。将PCR片段克隆进pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen目录号：K28602)，使用pcr2.1f和pcr2.1b进行测序。这得到了p96，其含有侧翼是DraIII-PmlI和ApaI的重链可变区(质粒4)。
通过分离p96pCR-BluntII-Mayo-重链DraIII-ApaI片段并连接到DraIII-ApaI切割的p83BC2083DraIII IgG1(质粒3)中来构建β酪蛋白表达载体，p100BC2083重链(BC2197)(质粒5)。
为了通过将靶天冬酰胺改变为谷氨酰胺来阻断糖基化，通过使用PfuTurbo和引物的PCR从BC2083来制备重链编码序列，将重链恒定N和重链恒定C亚克隆到pCR-Zero-Blunt中。这得到了p76和p77pCR2.1-Blunt-IgG1-重链恒定。对这些质粒进行测序以确保在PCR过程中没有在恒定区中引入突变。根据一个实施方案，使用QuickChangeXL Mutagenesis(Stratagene)试剂盒和诱变寡聚物对p77中亚克隆的抗CD137抗体恒定区进行诱变。此寡聚物将天冬酰胺297改变为谷氨酰胺并去除邻近的BsaAI位点，以便于通过苏氨酸密码子沉默突变的限制性酶分析来进行筛选。这得到了质粒p88、p89和p90pCR2.1-Blunt-IgG1-重链-mut。使用引物对这些质粒进行PCR以制备用于测序的片段。
构建轻链嵌合物并***到表达载体中
用于轻链的表达载体是BC1060(质粒6)。为了使得可变区能够与人κ恒定区融合，将两个限制性位点依次改造进入小鼠J区。通过将甘氨酸密码子从GGG或GGC改变为GGT来引入KpnI位点。将亮氨酸的编码序列从CTG改变为CTT以产生HindIII位点(质粒8)。
通过使用PfuTurbo(Stratagene)的PCR，使用引物从BC1060中分离出人κ链恒定区编码区，其带有编码区起始处的KpnI和HindIII位点以及编码区末端天然存在的SacI位点。将PCR产物克隆到ZEROBlunt TOPO PCR W EC中(Invitrogen目录号：K286020)。对这些质粒进行测序。这得到了p85pcr-blunt-1060κ恒定rev(质粒7)和p86pcr-blunt-1060κ恒定(质粒8)。
类似地，使用引物通过PCR从cDNA中分离出可变区，并克隆到pCR2.1-Blunt-TOPO中，得到p92pCR2.1-Blunt-κ可变(质粒9)，其中所述可变区的侧翼是340位核苷酸处的XhoI位点以及731位核苷酸附近的KpnI和HindIII位点。对这些质粒进行测序。
首先使用3段DNA将轻链嵌合物构建到pCR-Blunt中。p86pcr-blunt-1060κ恒定提供XhoI至SacI的主链。κ恒定区是来自p85pcr-blunt-1060κ恒定rev的HindIII-SacI片段。使用XhoI-HindIII片段由p92pCR2.1-Blunt-κ可变rev提供可变区。通过PCR使用引物pcr2.1f和pcr2.1b通过查找863bp片段的产生来检测菌落。这得到了p94pCR-BluntII-Mayo-kap-chim(质粒10)。通过使用XhoI和SacI的切割得到684bp片段来检测所述质粒。
将所述轻链嵌合物置于含有带小鼠重链前导序列的免疫原人轻链的β酪蛋白表达载体BC1060。用XhoI-SacI切割p94，分离小片段。用KpnI-SacI切割BC1060，分离5206bp的片段。用KpnI、XhoI和PacI切割BC1060以分离大主链。连接这三个片段，使用所需引物筛选菌落。用BglII检测阳性质粒，对PCR产物测序。此质粒是p104BC1060LC chim(BC2198)(质粒11)。
构建细胞培养表达载体
为了构建轻链的瞬时表达载体，将来自p104BC1060LC chim(质粒11)的XhoI片段连接进pCEP4的XhoI位点，得到p106和p107pCEP4-Mayo-LC(#2203)(质粒12)。通过使用寡聚CEPF和KVC的PCR来检测阳性克隆。
为了构建重链的瞬时表达载体，将p100BC2083重链的BamHI片段克隆进BamHI切割的pCEP4。通过使用HVC09和CEPF的PCR来筛选菌落。这得到了质粒p110pCEP4-BamHI-HC(#2202)(质粒13)。
通过将含有可变区的#110pCEP4-BamHI-HC(#2202)的KpnI-AgeI小片段连接进KpnII-AgeI切割的#88pCR2.1-Blunt-IgG1-重链-mut来制备带有抗CD137抗体重链可变区的嵌合物。这得到了质粒p111pCR2.1-Mayo-IgG1-重链-mut(质粒14)。用BsaAI-PstI检测此质粒。
为了构建瞬时表达载体，将来自含有嵌合抗体编码区的p111的XhoI小片段***到pCEP4的XhoI位点。通过使用HVC C09和CEPF的PCR来检测菌落。这得了了p112pCEP4-Xho-Mayo-IgG1-aglycos(BC2206)。使用EcoRV-HindIII消化(2479bp)和BamHI消化(1454bp)获得预期片段。为了构建β酪蛋白表达载体，将来自含有嵌合抗体编码区的p111的XhoI小片段***到BC2083的XhoI位点。通过使用寡聚HVC 09和CA5的PCR来检测菌落。用MluI-Eco47III-NotI消化得到预期的2479bp片段，而使用BamHI消化得到预期的1454bp片段。
克隆IgG1突变体
在小鼠乳中表达所使用的抗CD137抗体。对于小鼠表达，使用BC2197(p100BC2083重链)和(BC2198)p104BC1060轻链的构建技术。类似地，亲本质粒是用于重链的BC2083或用于轻链的BC1060。基本上，将亲本质粒中包含前导序列的可变区与来自抗CD137抗体cDNA重链和轻链可变区的cDNA序列进行交换。所述表达载体的恒定区(重链的IgG1和轻链的κ)被所克隆的序列取代。
克隆IgG1序列
从购自Invitrogen的cDNA中克隆所使用的抗体重链。使用胎盘cDNA和下文所示引物实施利用PfuTurbo的PCR。C端引物61960C11相对于野生型序列改变了一个碱基以破坏剪接供***点。将993bp片段克隆进ZeroBlunt。所述序列表明一个序列是G1m(3)。存在与来自人血清的γ球蛋白相关的内在差异(Grubb 1956；Grubb和Laurell1956)。具有Km类似的***(κ标记物，之前称为Inv，其代表ёInhibitriceVirmí)。这是白人同种异型G1m(f)或G1m(3)，其取代了起始质粒上存在的黑人同种异型G1m(z)或G1m(17)。
为了克隆其它的同种异型，如上所述从脑cDNA进行了PCR，得到质粒p116、p117、p118和p119。这些质粒中无一具有正确的序列。例如，大部分的所述质粒丢失了序列末端应该由PCR引物提供的ApaI和/或XhoI位点。使用p116或脑cDNA作为模板再次进行PCR。
对p116的PCR得到了121、122和123。对脑cDNA的PCR得到了124。使用来自质粒121的***片段产生p133、p134、p135和p136，它们是通过用ApaI和XhoI切割100c BC2083重链并用ApaI和XhoI切割p121ZeroBlunt-IgG1 G1m(17)、连接并在卡那霉素上进行选择的BC2083重链G1m(17)。使用了p133。
对于小鼠表达，只有质粒BC2083中的可变区发生了改变，所述质粒是含有带小鼠前导序列的人抗体序列的表达载体。它在IgG1恒定区末端具有剪接供***点，所述位点被不改变甘氨酸编码的G到A的沉默突变所消除。为了增强山羊表达，将所述恒定区改变为随后克隆的IgG1恒定区。将来自p114的克隆恒定区用于产生p137和138。用ApaI-XhoI切割p100BC2083重链(BC2197)，用ApaI和XhoI切割114ZeroBlunt-Ig G1G1m(3)，然后连接得到p138(BC2228)。从p121(G1m(17))克隆的恒定区用于产生p133、134、135和136BC2083重链G1m(17)。κ恒定区也被GTC Biotherapeutics克隆的所替换。SEQ.ID.NO.1：AGGGTACCAAGCTTGAAATCAAACGAAC-κ恒定人H01；SEQ IDNO.2：5’AAGGGTCCGGATCCTCGAGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-人κC#7734。
产生皮肤成纤维细胞系
在体外将来自新鲜山羊皮肤活检样品的成纤维细胞在原代培养物中维持。简言之，在无Ca++和Mg++的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中切碎皮肤样品，用EDTA中稀释的胰酶收获以回收单细胞悬液并培养于37℃下。用胰酶消化会合的细胞，传代培养。将细胞的等分试样冷冻于液氮中待用。
分析转染细胞系
使用转基因(例如β酪蛋白、嵌合抗CD137H和L链cDNA)特异性探针，通过Southern印迹分析来表征转染细胞，以确定转基因的拷贝数并鉴定可能的重排。还通过FISH分析每个细胞系，以证实单整合并确定染色***置。进行细胞遗传分析以证实细胞系的核型。FISH
对于***间期FISH，将来自每个扩增集落的数百个细胞固定在滤膜上，并与扩增转基因特异性的地高辛标记探针杂交。对于***中期FISH，细胞培养于Lab Tek室玻片(Nunc，Rochester，NY)，用5-溴-2’脱氧尿苷(BrdU)脉冲处理以得到复制带。用FITC缀合的抗地高辛检测探针结合，用4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)复染染色体。使用Zeiss Axioskop显微镜(Zeiss Imaging，Thornwood，NY)、Hamamatsu数码照相机(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)和Image Pro-Plus软件(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)来捕获图像。大部分探针是相对大且易于检测的。对于个体IgGH和L链(其由相对短的cDNA序列编码)的探针太小，以至于其自身不能得到好的分辨率。这些小探针与来自山羊β酪蛋白乳特异性启动子的序列相混合。
细胞遗传分析
实施对供体转染成纤维细胞系的细胞遗传分析。通过缺口翻译用地高辛-dUTP标记转基因探针。用FITC缀合的抗地高辛或者用辣根过氧化物酶缀合的抗地高辛和之后FITC缀合的酪胺来检测探针与变性染色体的结合。用DAPI使染色体带模式可见。山羊具有60个染色体，均为近端着丝粒(在一端而不是在中部或中部附近具有着丝粒)。在***中期伸展中检查严重异常的迹象，例如染色体丢失、重复或明显的重排。用于产生第一代转基因山羊的细胞系是核型一般正常的，并且携带结构完整的嵌合抗CD137H和L链基因以及β酪蛋白启动子和其它必要调控元件。
产生在乳中表达嵌合抗人CD137的转基因动物
已产生了糖基化和非糖基化形式的嵌合抗人CD137抗体。在从乳中纯化足够量的抗体以测试生物活性之后，发现尽管它们基本以相同的水平产生，但是两种形式的活性谱有所不同。
嵌合抗体的转基因构建体用于产生转基因小鼠和山羊。转基因动物通过引入H链和L链构建体的1∶1混合物来产生成熟抗体。L链构建体糖基化或非糖基化H链构建体相组合。具体地，在体外通过Western印迹分析和抗体结合测量对乳中生物活性产物的相对及绝对水平进行测量。
转基因小鼠
用于测试转基因小鼠中诱导型***可行性的实用策略是评估第一代(F1)小鼠乳中的转基因蛋白表达。已经确定，在一些转基因动物中，原始转基因构建体在显微注射后在细胞***时整合进染色***点。因此，初始动物是可影响转基因表达水平的嵌合体。这些染色体整合位点将在后续世代中发生分离，以形成稳定的同质转基因动物品系。因此，F1小鼠是用于确定转基因表达稳定性及其生物产物稳定性的合理模型。另外，为了让小鼠泌乳，它们必须成熟(需约2个月的时间)、交配并产生后代。在分析之后，确定分泌水平是稳定的，所使用的构建体是有效的。
通过CsCl梯度和之后的电洗脱来纯化来自每个所制备构建体的线性DNA，通过前核显微注射产生转基因小鼠。通过尾组织DNA的PCR分析来鉴定转基因初始小鼠，使用Southern印迹分析测定相对拷贝数。对每个构建体(糖基化和非糖基化)产生许多转基因第一代的携带转基因的“初始”(F0)雌性。在成熟时这些F0小鼠交配开始泌乳。用山羊抗人Fc抗体进行的Western印迹分析它们的乳，以鉴定分泌结构完整的带有人CH区的嵌合抗体的小鼠。
然后繁殖最佳初始动物(定义为具有在其乳中最大合理抗体表达的健康动物)以产生F1雌性，其用于提供足够收集用于体外和体内测试的抗体的乳。
转基因山羊
使用本领域中常规的核转移技术产生具有预先确定遗传学情况的转基因山羊。核转移消除了在前几代中转基因镶嵌现象的问题，因为所有来自于转基因细胞系的动物都应完全是转基因。通过标准转染方法(脂转染或电穿孔)将所述转基因构建体引入原代细胞系中。在重组原代细胞系用于产生转基因动物之前，针对重要特征(例如转基因拷贝数、完整性和整合位点)对它们进行体外筛选。雌性山羊皮肤成纤维细胞用于产生转染的转基因细胞，作为核转移的核供体，得到全部雌性后代。因此，可直接从F0山羊获得含有重组蛋白的乳。通过Western印迹测定乳中生物活性产物的相对和绝对水平。
结果
抗体的纯化和表征
产生了四种不同的嵌合抗CD137抗体。一种变体是通过将Ash297突变为谷氨酰胺而非糖基化的。此抗体变体可在功能性研究中发挥阴性对照的作用，因为已知非糖基化IgG不结合Fc受体，且在ADCC中无活性(Nose等，1983)。从乳中制备了另外两种抗体变体，一种来自小鼠乳，一种来自山羊乳。在HEK 293细胞(人细胞系)表达第四种抗体变体。
在人细胞中表达一种抗体变体。人胚肾293细胞系(293)适用于瞬时转染技术，因为它可被高效转染。使用稳定表达EBV EBNA1蛋白(293E)的遗传变体，其在EBV的oriP存在于载体骨架中时提供显著更高的蛋白表达。
当进行瞬时转染时，oriP/EBNA1***中获得的表达提高似乎与附加体复制无关，因为去除oriP中负责在EBNA1阳性细胞中起始DNA复制的DS结构域不降低转基因表达，而去除FR而不是DS则显著降低表达。因此，表达提高似乎是由于oriP的EBNA1依赖性增强子活性与质粒入核增多的联合作用，入核增多是由于EBNA1中存在核定位信号(Pham等，2003)。
使用设计用于从CMV启动子高水平组成型表达的载体pCEP4(目录号V04450；Invitrogen，Carlsbad，CA)来表达所述抗体。293EBNA/ebv载体宿主***表现出对基于COS7/SV40ori的***的显著改善(Jalanko等，1988；Shen等，1995)。高水平重组蛋白表达的一个重要问题在于使用具有在宿主细胞系中高活性启动子的载体，所述启动子例如CMV启动子，其在293细胞中特别有力，因为它通过组成型表达腺病毒E1a蛋白来反式活化(Durocher等，2002)。
通过用如前述的标准方法(Wilcox等，2002，J Clin Inv 109：651-659)将BALB/c小鼠的脾B细胞与小鼠浆细胞瘤融合来产生生产人CD137特异性单克隆抗体的杂交瘤(GW)，所述BALB/c小鼠已经用人CD137胞外部分和小鼠IgG2a Fc区的融合蛋白进行了免疫。所述抗CD137抗体是小鼠单克隆抗体(mAb)与人CD137的嵌合形式，其中重链和轻链的恒定区已分别被人IgG1恒定区和人κ恒定区所替换。这种抗体使用β酪蛋白启动子在小鼠和山羊乳中表达(Pollock等，JImmunol Meth 231：147-157)，或者使用巨细胞病毒(CMV)启动子通过瞬时转染在HEK 293细胞中表达。山羊乳来自转基因山羊的激素诱导泌乳(Ebert等，1994，Biotech 12：699-702)。通过A蛋白层析纯化所述抗体。在泌乳9天后纯化山羊乳抗体，以避免污染早期挤奶所得初乳的山羊抗体。通过尺寸排阻层析发现，山羊乳来源的嵌合抗CD137抗体的类似制剂是90％的单体和10％的聚集体。通过280nm处的吸光度来测量抗体浓度，使用1.4mg/ml为1OD的值作为换算因子。
糖分析
使用PNG酶F，在37℃下在含1％巯基乙醇的50mM磷酸钠缓冲液pH7.0中过夜释放天冬酰胺连接的寡糖。使用Voyager-DE PROBiospectrometry Workstation(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted laserdesorption-ionization time-of-flight，MALDI-TOF)质谱(massspectrometry，MS)分析来分析样品。以阳离子、反射模式使用2，5-二羟基苯甲酸/2-羟基-5-甲氧基苯甲酸(9∶1，体积/体积)基质来实施MALDI-TOF MS分析。小鼠乳来源抗体中的主要碳水化合物(63％)是非岩藻糖基化的Man5。图1显示通过PNG酶F消化从所述抗体中释放的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。将来自小鼠乳来源抗体的结果与来自细胞培养物来源抗体的结果进行比较，显然来自小鼠乳来源抗体的主要寡糖是含有5个甘露糖残基和2个GlcNAc残基的Man5。
对PNG酶F在37℃过夜消化后所释放的2-氨基苯甲酸标记的寡糖进行高压液相层析(high-pressure liquid chromatography，HPLC)分析。用PNGF酶在37℃过夜处理80μg抗体。用10kDa滤器过滤样品，然后在生物透析器中用水透析过夜。干燥样品，用2-氨基苯甲酸标记，回收以除去过量的标记物。在蒸发干燥之后，用500μl水重建样品，根据Anumula等所述的方法(Cammusco等，2000，Anim Biotech 11；1-17)，使用装备有荧光检测器(230nm激发，425nm发射)的HP1100***将100μl注入Asahipak NH2P-504D柱(4.6×250mm，Phenomenex)。Man5和Man6标准品购自Prozyme。通过HPLC分析进行定量，示于图2。确认来自小鼠乳来源的抗体种类(其与标准Man5的实验表现相同)是甘露糖寡糖的是其Endo H敏感性的证实(Maley等，1981和Tarentino等，1974)。用Endo H处理之后，Man5峰消失，证实了在小鼠乳来源抗体样品中36.5分钟所见峰的身份(图2和3)。存在一些次要种类，例如含有核心岩藻糖的G1F(16％)和G2F(21％)，以及更少量的非岩藻糖基化的G1和Man6。含有甘露寡糖结构的鸡IgG含有2068和1906处的种类，对应于Man8和Glc1Man8(Raju等)。尽管在1420处可检测到Man6，但是在1582、1744和1906处的高聚甘露寡糖明显不存在。相反，存在于HEK293细胞来源的材料中的主要种类是岩藻糖基化的G0F(55％)和G1F(37％)，G2F为次要种类(8％)。HEK293细胞已知无法有效对蛋白质进行高水平的唾液酸化(Chitlaru等，2002；Chitlaru等，1998)。
图1(MS数据)和图2均显示，乳来源抗体与细胞培养物来源抗体的碳水化合物组成显著不同。图2是使用荧光检测的HPLC所获得的寡糖图的比较，显示小鼠乳来源抗体中主要的碳水化合物(63％)是非岩藻糖基化Man5，而细胞培养物来源抗体中的主要碳水化合物则被岩藻糖基化。非糖基化抗体不得到任何峰。HPLC数据显示，乳来源抗体中的主要寡糖是甘露寡糖，而细胞培养物来源抗体中缺乏甘露寡糖。
伴刀豆球蛋白A(Con A)是一种结合末端甘露糖残基的凝集素(Goldstein等，1965a，Biochim Biophys Acta；Goldstein等，1965bBiochem)。与我们乳来源抗体中含有甘露寡糖的发现一致，其结合伴刀豆球蛋白A，并被α-甲基甘露糖苷洗脱(图4)。来源于细胞培养物的材料中的主要种类是具有末端GlcNAc残基的G0F，预计它不结合伴刀豆球蛋白A。图4显示转基因乳来源抗体中含有甘露寡糖。相反，所使用的非糖基化抗体在相同实验中不结合。
来源于HEK293细胞的材料中存在的主要种类是岩藻糖基化的G0F(55％)和G1F(37％)，G2F为次要种类(8％)。这意味着来源于细胞培养物的抗体是完全岩藻糖基化的。来源于细胞培养物的抗体中缺乏唾液酸修饰，因为已知HEK293无法有效对蛋白质进行高水平的唾液酸化(Chitlaru等，2002；Biochem J 363，619-631)。
与来源于细胞培养物的抗体中绝大多数糖基化是岩藻糖基化的情况相反，小鼠乳来源抗体中的主要碳水化合物(63％)是非岩藻糖基化Man5。小鼠乳来源抗体中的主要种类与标准Man5的实验表现一致。在HPLC分析中G1F的实验表现与Man5接近，但是确认该峰是甘露糖寡糖的是其Endo H敏感性的证实(Maley等，1981，J Biol Chem 256：1088-1090)。在用Endo H处理之后，小鼠乳来源抗体样品中36.5分钟处可见的峰消失(图2D)。存在次要种类例如含核心岩藻糖的G1F(16％)和G2F(21％)，以及更少量的非岩藻糖基化的G1和Man6。对山羊乳来源物质中糖的MALDI-TOF分析显示了比小鼠乳来源的材料中所见更为广泛的含甘露糖的糖分布，值得注意的是，Man7和Man8的存在表明甘露糖苷酶加工不足。这使得HPLC分析的定量更加困难，因为非岩藻糖基化糖分散在更宽的范围内。HPLC分析证明存在代表10-20％总糖的许多EndoH敏感峰(图2)。
流式细胞术分析
通过FACS分析评价不同形式嵌合抗体的结合。将2×105个细胞与5％FBS的PBS中1μg/ml浓度的抗体一起孵育。用1∶100稀释的FITC标记的山羊抗人Fc(Jackson Immuno Research Labs)检测抗体，通过FACSCalibur(Becton Dickinson)进行分析。图5所示数据证明，所研究的所有抗体均相似地结合抗原，无论其来源如何。与预计一致，抗DNP抗体对照不结合。
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance)
通过表面等离子共振在BIAcore2000设备和CM5传感芯片(BIACORE，Uppsala，Sweden)上测定IgG1与CD16a相互作用的动力学情况。用NHS/EDC偶联条件将抗HPC4抗体固定在所述芯片上。所述抗体浓度是20-50μg/ml，pH为5.0，得到11000RU的芯片。CD16a-HPC4被捕获到此抗体表面，其中使用3分钟注射的30μg/ml蛋白质，流速为5μg/分钟，所述蛋白质在含有0.15M NaCl和0.005％(体积/体积)P20表面活性剂(HBS-P缓冲液，BIAcore AB)并加入1mM CaCl2的10mM Hepes缓冲液(pH7.4)中。然后将测试抗体在上述结合缓冲液中稀释到50μg/ml，并以20μl/分钟的流速注射到所捕获的CD16a上一分钟。监测解离3分钟。然后，在下一轮的捕获-结合-再生之前，用HBS-P缓冲液中制得的5mM EDTA的3分钟注射来再生表面。图13显示与来源于细胞培养物的抗体相比，乳来源抗体具有更强的结合。接着确定这种增强的ADCC活性是否反映为对NK细胞受体CD16的亲和力提高。使用表面等离子共振测定测量多种抗体与固定化CD16的结合。乳来源抗体比来源于细胞培养物的抗体结合得更好(图13)。
细胞测定
人肾癌细胞786-O和人胚肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞购自ATCC。786-O是来自肾细胞腺癌的贴壁上皮细胞(Williams等，1978，In vitro 14：779-786)。所述细胞在调整为含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠、90％，胎牛血清(FBS)10％的RPMI 1640培养基中培养。
用表达CD137编码序列的pCEP4载体转染CHO细胞。通过用潮霉素选择来分离克隆，通过FACS对细胞表面表达进行筛选，使用一个克隆。
ADCC测定
为了测试乳来源和细胞培养物来源的抗体的相对ADCC活性，制备来自不同来源的相同抗体。制备了四种不同形式的嵌合抗CD137抗体。一种形式是通过将Asn297突变为谷氨酰胺而成为非糖基化。这作为阴性对照，因为已知非糖基化IgG不结合Fc受体，且在ADCC中无活性(Nose等，1983，PNAS 80：6632：6636)。从乳中制备了两种其它形式的抗体，一种来自小鼠乳，另一种来自山羊乳。第四种形式来自瞬时转染的HEK 293细胞(一种人细胞系)。
使用1∶50Versene(Invitrogen)收集786-O细胞，重悬于培养基中，使用Na2 51CrO4(1μC/μl)标记1.5小时，之后用RPMI将细胞洗涤三遍。效应细胞是如前之前van Epps等所述(Van Epps等，1999，J Virol 73：5301-5308)制备的人外周血单个核细胞(，peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。使用200∶1的效应细胞∶靶细胞比，因为解冻后PBMC的成活力只有40-60％。细胞在37℃下共孵育12小时，然后转移25μl上清液用于计数。通过将靶细胞与等量含抗体培养基(无PBMC)一起孵育来测定自发释放。通过将靶细胞与等体积含1％Triton-X100(Sigma)的培养基一起孵育来测定总放射性。按照如下计算特异性裂解百分比：([E-S]/(T-S))×100，其中T是总放射性，E是实验释放，S是自发释放，为19±3％。
为了测试这些制备物的ADCC活性，鉴定表达CD137的肿瘤细胞系。786-O是表达少量CD137并有时表达HER2的肾细胞癌细胞系。为了比较不同形式嵌合抗CD137抗体的结合，使用了FACS。就这个此标准而言所有抗体的结合是相同的(图5)。但是，当在ADCC测定中测定活性时，抗体的效力差别很大。两种乳来源蛋白都是有活性的，而来源于细胞培养物的材料尽管也结合，但不具有任何活性(图6)。无细胞时的细胞毒性(即自发释放)不存在，这证明该抗体自身不具有杀伤性。在图6中，显示在转基因动物的乳中所产生的分子具有增强的ADCC活性。此特征提高了转基因乳来源的抗体杀伤靶细胞(例如肿瘤细胞)的能力。所使用的对照是不应结合靶细胞的抗DNP抗体以及不应结合Fc受体的非糖基化抗CD137。
还测试了这些多种制剂对用CD137表达载体转染的CHO细胞的ADCC活性。同样，所有抗体制备均相同地结合转染细胞(图11)。乳来源抗体的活性是细胞培养物来源抗体的两倍(图12)。
在一些实施方案中，增强的ADCC活性是因为重链恒定区的糖基化中缺乏岩藻糖。在小鼠乳中，糖基化主要是前体Man5GlcNAc2，而不是岩藻糖。但是发生了一些加工，因为不存在高聚甘露糖种类。乳来源抗体Man6可在1420(图1)处检测到，而1582(Man7)、1744(Man8)和1906(Man9)处的高聚甘露寡糖明显不存在，表明发生了一些甘露糖苷酶I介导的加工。
N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnT-1)是引起生长中碳水化合物链对高尔基体α-甘露糖苷酶II的敏感性的关键酶。在小鼠乳腺中此酶似乎具有功能性限制，因为糖基化阻断导致Man5GlcNAc2的积累(Li等，1978，J Biol Chem 253：6426-6431)。这种积累也可以是所述抗体未在此酶所定位的中间高尔基体区室中度过足够时间的结果。不能将GlcNAc转移到此链阻止了它被高尔基体α-甘露糖苷酶II切割，该酶将允许N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GnT-II)和半乳糖苷转移酶的进一步加工。1，6-岩藻糖在GnT-II修饰之后加入，这解释了为何甘露寡糖结构不被岩藻糖基化(Longmore等，1982，carbohy Res 100：365-392)。IgG的这种甘露寡糖糖基化形式之前已在缺乏N-乙酰葡糖胺基转移酶I活性的Lec1细胞、CHO细胞中产生(Wright等，1994，J Exp Med 180：1087-1096)。发现它在补体介导的溶血和FcRI结合中有缺陷。相比于其它抗体，它显著更多地结合补体活性旁路途径中的C3(Wright等，J Immunol 160：3393-3402)。
来源于山羊乳的抗体显示出更异质的糖基化。尽管大量材料进行了G1F和G2F加工，但含有甘露糖的寡糖为Man5至Man8(图1)。
低水平的岩藻糖消耗导致在ADCC增强中的良好效果。抗体的重链是二聚体。如果重链的糖基化是全或无的，那么抗体会在两条重链上均具有甘露寡糖，或者在两条重链上均具有经加工的甘露糖Man3GlcNAc2；不会有混合的二聚体。高水平的ADCC表明，所述链是独立糖基化的，就增强活性而言仅需一条链中缺乏岩藻糖。抗体链在内质网中多聚化，而糖基化是在高尔基体中完成的。由于重链的独立糖基化及20％的链为高甘露糖，因此仅有4％的抗体分子两条链中均含甘露寡糖，64％的两条链均含加工甘露糖，而其余的32％由一条含甘露寡糖的链和一条含加工甘露糖的链组成。这使得共有36％的抗体分子具有至少一条甘露寡糖链。因此，看来单个缺乏岩藻糖的重链足以增强ADCC。考虑到Fc受体与免疫球蛋白分子的不对称结合，这是合理的，所述免疫球蛋白分子中大致是D1区结合一条链，D2区结合另一条链(Radaev等，2002，Mol Immun 38：1073-1083)。因此岩藻糖基化只影响与一个结构域的结合，这足以增强亲和力。在之前研究中，在岩藻糖基化抗体含有91％岩藻糖、缺乏岩藻糖的抗体含有72％岩藻糖的情况下观察到了相似的ADCC提高(Shinkawa等，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)。
令人惊奇的是，该实验在这样的低抗原密度下运行得如此良好。已经证明，从IgG1中除去岩藻糖可由于有效活化NK细胞而降低ADCC活性所需的抗原量。这种作用很可能解释了用CD137表达很弱的细胞系所获得的优良结果。
小鼠乳中产生的抗体在较高浓度时具有比山羊乳来源抗体更高的活性。山羊乳来源的抗体制备物可含有10％聚集体，所示聚集体可在不结合靶细胞的情况下直接结合PBMC。此非生产性结合可阻断PBMC的活性(Kipps等，1985，J Exp Med 161：1-17)。
因此，已经发现转基因乳是增强了ADCC活性的抗体的良好来源。有报道称，在昆虫细胞中产生的抗体比在哺乳动物细胞中产生的相同抗体更加有效(Lang等，2004)。尝试了其它***但是没有成功。在黑曲霉(Aspergillus niger)产生的抗体不具有增强的ADCC活性，可能是因为它是非糖基化抗体和糖基化抗体的混合物(Ward等，2004)。有报道称，在酵母中产生的嵌合抗体具有与来源于细胞培养物的抗体相同的ADCC活性(Horwitz等，1988)。FcγIIIb的活化也导致细胞因子的分泌。
在一些实施方案中，可以通过使抗体混合物通过凝集素柱来将含有岩藻糖的抗体与非糖基化抗体分离。
上文不旨在描述本发明的所有方面或所有实施方案，并且不以任何方式限制本发明。加入并构成说明书一部分的附图展示了本发明的实施方案，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
本说明书中提及的所有公开出版物和专利申请均通过参考并入本文，其程度等同于具体指明将每个独立的公开出版物或专利申请通过参考并入本文。
尽管结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，它能够进行其他改变，本申请旨在涵盖本发明的任何变化、用途或适应性调整，这些变化、用途或适应性调整总体上遵循本发明的原理，并包括本发明所属领域领域中已知或惯用实践范围内可用于本文公开必要特征的改动。
本文引用的参考文献不意为承认所述参考文献是现有技术文献。
参考文献
1.Anolik，J.H.，et al.，(2003)ARTHITTS RHEUM 48，455-459.
2.Anumula，K.R.，and Dhume，S.T.(1998)GLYCOBIOLOGY 8，685-694.
3.Axford，J.S.，N.Sumar，et al.(1992)，Changes In Normal Glycosylation MechanismsIn Autoimmune Rheumatic Disease，J.CLIN INVEST 89(3)：1021-31.
4.Baguisi A，et al.(1999)，Production of Goats by Somatic Cell Nuclear Transfer，NATURE BIOTECH，17：456-461.
5.Cammuso，C.，et al.，(2000)ANIM BIOTECHNOL 11，1-17.
6.Canfield，S.M.and S.L.Morrison(1991)The binding affinity of human IgG for itshigh affinity Fcreceptor is determined by multiple amino acids in the CH2 domainand is modulated by the hinge region，J.EXP.MED.173(6)：1483-91.
7.Cartron，G.，et al.，(2002)BLOOD 99，754-758.
8.Chen，S.H.，et al.(2000)，Rejection of Disseminated Metastases of Colon Carcinomaby Synergism of IL-12 Gene Therapy And 4-1BB Costimulation，MOL.THER.，2：39-46.
9.Chitlaru，T.，et al.，(2002)BIOCHEM J 363：619-31.
10.Chitlaru，T.，et al.，(1998)BIOCHEM J 336：647-58.
11.Chiu M.H.et al.(1994)，In Vivo Targeting Function of N-Linked Oligosaccharideswith Terminating Galactose and N-Acetylgalactosamine Residues，J.BIOL.CHEM.，269(23)：16195-202).
12.Clynes，R.A.，et al.，(2000)NAT MED 6，443-46.
13.Clynes，R.A.，et al.，(1998)PROC NATL ACAD SCI USA 95，652-56.
14.Dall′Ozzo，S.，et al.，(2004)CANCER RES 64，4664-69.
15.Denman，J.，et al.，(1991)BIOTECHNOLOGY (N Y)9，839-43.
16.Dorai，H.，B.M.Mueller，et al.(1991)，Aglycosylated Chimeric mouse/human IgG1Antibody Retains Some Effector Function，HYBRIDOMA 10(2)：211-17.
17.Ebert，K.M.，et al.，(1994)BIOTECHNOLOGY (NY)12，699-702.
18.Edmunds，T.，et al.，(1998)BLOOD 91，4561-71.
19.Foell，J.et al.(2003)，CD137 Co-Stimulatory T cell Receptor Engagement ReversesAcute Disease in Lupus-Prone NZB x NZW F1 mice，J.CLIN.INVEST.111(10)，1505-1518.
20.Fuji，S.，T.Nishiura，et al.(1990)，Structural Heterogeneity of Sugar Chains inImmunoglobulin G.Conformation of Immunoglobulin G Molecule and SubstrateSpecificities of Glycosyltransferases，J.BIOL.CHEM.265(11)：6009-18.
21.Goldstein，I.J.，et al.，(1965)BIOCHIM BIOPHYS ACTA 97，68-76.
22.Goldstein，I.J.，et al.，(1965)BIOCrmMISTRY 4，876-83.
23.Gottlieb，C.，et al.，(1975)J BIOL CHEM 250，3303-3309.
24.Gruel，Y.，et al.，(2004)BLOOD 10，10.
25.Guinn，B.A.et al.(1999)，4-1BB Cooperates With B7-1And B7-2In ConvertingA BCell Lymphoma Cell Line Into A Long-Lasting Antitumor Vaccine，J.IMMUNOL.162：5003-5010.
26.Harpaz，N.，and Schachter，H.(1980)J BIOL CHEM 255，4885-4893.
27.Hong，H.J.，J.W.Lee，et al.(2000)，A humanized anti-4-1BB monoclonal antibodysuppresses antigen-induced humoral immune response in nonhuman primates，J.IMMUNOTHER.23(6)：613-21.
28.Horwitz，A.H.，et aI.，(1988)PROC NATL ACAD SCI USA 85，8678-82.
29.Jalanko，A.，A.Kallio，et al.(1988)，An EBV-based mammalian cell expression vectorfor efficient expression of cloned coding sequences，BIOCHIM BIOPHYS ACTA 949(2)：206-12.
30.James，D.C.，et al.，(1995)BIOTECHNOLOGY (N Y)13，592-596.
31.Jeffeds，R.，J.Lund，et al.(1995)，Recognition sites on human IgGfor Fc gammareceptors：the role of glycosylation，IMMUNOL LETT 44(2-3)：111-17.
32.Kasinathan P.et al.(2001)，Production of Calves from G1Fibroblasts，NATUREBIOTECH，19：1176-78.
33.Kerr，D.E.，and Wellnitz，O.，Mammary Expression of New Genes to Combat Mastitis，J.ANIM.SCI.2003.81：38-47(2003).
34.Kim et al.(2001)，Divergent Effects of 4-1BB Antibodies on Antitumor Immunity andon TumorReactive T-Cell Generation，CANCER RESEARCH 61：2031-2037.
35.Kim，J.K.，M.F.Tsen，et al.(1994)，Catabolism of the murine IgG1molecule：evidence that both CH2-CH3 domain interfaces are required for persistence of IgG1in the circulation of mice，SCAND.J.IMMUNOL.40(4)：457-65.
36.Kipps，T.J.，etal.，(1985)J EXP MED 161，1-17.
37.Knight，D.M.，C.Wagner，et al.(1995)，The immunogenicity of the 7E3 murinemonoclonal Fab antibody fragment variable region is dramatically reduced inhumans by substitution of human for murine constant regions，MOL.IMMUNOL
32(16)：1271-81.
38.Koene，H.R.，et al.，(1997)BLOOD 90，1109-14.
39.Lang，P.，et al.，(2004)BLOOD 103，3982-85.
40.Leatherbarrow，R.J.，T.W.Rademacher，et al.(1985)Effector Functions of aMonoclonal Aglycosylated Mouse Igg2a：Binding andActivation of ComplementComponent C1and Interaction with Human Monocyte Fc Receptor，MOL.IMMUNOL.22(4)：407-15.
41.Li，Q.，et al.(2003)，Polarization Effects of 4-1BB during CD28Costimulation inenerating Tumor-reactive T Cells for Cancer Immunotherapy，CANCER RESEARCH63(10)：2546-52.
42.Li，E.，and Kornfeld，S.(1978)J BIOL CHEM 253，6426-31.
43.Lifely，M.R.，Hale，C.，Boyce，S.，Keen，MJ.and Phillips，J，(1995)GLYCOBIOLOGY 5，813-822.
44.LoBuglio，A.F.，R.H.Wheeler，et al.(1989)，Mouse/human chimeric monoclonalantibody in man：kinetics and immune response，PROC.NATL.ACAD.SCI.U S A86(11)：4220-24.
45.Louis，E.，et al.，(2004)ALIMENT PHARMACOL THER 19，511-19.
46.Lund，J.，N.Takahashi，et al.(1993)，Control ofIgG/Fc glycosylation：a comparisonof oligosaccharides from chimeric human/mouse and mouse subclassimmunoglobulin Gs，MOL.IMMUNOL.30(8)：741-8.
47.Lund，J.，N.Takahashi，et al.(1996)，Multiple interactions of IgG with its coreoligosaccharide can modulate recognition by complement and human Fa gammareceptor I and influence the synthesis of its oligosaccharide chains，J.IMMUNOL.157(11)：4963-9.
48.Lund，J.，N.Takahashi，et al.(1995)，Oligosaccharide-protein interactions in IgG canmodulate recognition by Fc gamma receptors，FASEB.J.9(1)：115-9.
49.Malaise，M.G.，C.Hoyoux，et al.(1990)，Evidencefor a role of accessible galactosylor mannosyl residues of Fc domain in the in vivo clearance of IgG antibody-coatedautologous erythrocytes in the rat，CLIN.IMMUNOL.IMMUNOPATHOL.54(3)：469-83.
50.Maley，F.，and Trimble，R.B.(1981)JBIOLCHEM 256，1088-1090.
51.Malhotra，R.，M.R.Wormald，et al.(1995)，Glycosylation changes ofIgG associatedwith rheumatoid arthritis can activate complement via the mannose-binding protein，NAT.MED.1(3)：237-43.
52.Martinet，O.，et al.(2000)，Immunomodulatory gene therapy with interleukin-12 and4-1BB ligand：long-term remission of liver metastases in a mouse model，J.NATL.CANCER Inst.92：931-936.
53.Maynard，J.and G.Georgiou (2000)，Antibodyengineering，ANNUAL REV.BIOMED.Eng 2：339-76.
54.Melero，I.，et al.(1997)，Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activationmolecule eradicate established tumors，NAT.MED.3：682-685.BMS.
55.Melero，I.，et al.(1998)，Ampli fication of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand：synergy with the CD28co-stimulatory pathway，EUR.J.LMMUNOL.28：1116～1121.
56.Mimura，Y.，P.Sondermann，et al.(2001)，Role ofoligosaccharide residues ofIgG1-Fc in Fc gamma RIIb binding，J.BIOL.CHEM.276(49)：45539-47.
57.Miller et al.(2002)，4-1BB-Specific Monoclonal Antibody Promotes the Generation ofTumor-Specific Immune Responses by Direct Activation of CD8T Cells in a CD40-Dependent Manner，THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY，169：1792-1800.Immunex.
58.Mittler，R.S.，et al.(1999)，Anti-4-1BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cellenergy，J.EXP.MED.190：1535.
59.Mizuochi，T.，T.Taniguchi，et al.(1982)，Structural and numerical variations of thecarbohydrate moiety ofimmunoglobulin G，J.IMMUNOL.129(5)：2016-20.
60.Mori，K.，et al.，(2004)BIOTECHNOL BIOENG 28，28.
61.Niwa，R.，et al.，(2004)CANCER RES64，2127-2133.
62.Niwa，R.，et al.，(2005)CLIN CANCER RES 11，2327-2336.
63.Niwa，R.，et al.，(2004)CLIN CANCER RES 10，6248-6255.
64.Nose，M，.and Wigzell H.(1983)，Biological Significance of Carbohydrate Chains onMonoclonal Antibodies，PROC.NATL.ACAD.SCI.U S A 80(21)：6632-36.
65.Okazaki，A.，et al.，(2004)J MOL BIOL 336，1239-1249.
66.Pham，P.L.，S.Perret，et al.(2003)，Large-scale transient transfection ofserum-freesuspension-growing HEK293EBNA1cells：Peptone additives improve cell growthand transfection effficiency，BIOTECHNOL BIOENG 84(3)：332-42.
67.Pollock，D.P.，et al.，(1999)J IMMUNOL METHODS 231，147-157.
68.Rademacher，T.W.(1993)，Glycosylation as a Factor Affecting Product Consistency，BIOLOGICALS 21(2)：103-4.
69.Rademacher，T.W.，S.W.Homans，et al.(1986)，Immunoglobulin G as aglycoprotein，BIOCHEM SOC SYMP 51：131-48.
70.Rademacher，T.W.，R.B.Parekh，et al.(1988)，The role ofIgG glycoforms in thepathogenesis of rheumatoid arthritis，SPRINGER SEMIN IMMUNOPATHOL 10(2-3)：231-49.
71.Raju，T.S.，et al.，(2000)GLYCOmOLOGY 10，477-486.
72.Rothman，R.L，et al.，(1989)MOL IMMUNOL 26，1113-23.
73.Rudd，P.M.，R.J.Leatherbarrow，et al.(1991)，Diversification of the IgG molecule byoligosaccharides，MOL.IMMUNOL.28(12)：1369-78.
74.REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES (16th ed.，Osol，A.，editor，Mack，EastonPress.(1980)).
75.Sacchi，S.，M.Federico，et al.(2001)，Treatment of B-cell non-Hodgkin′s lymphomawith anti CD 20monoclonal antibody Rituximab，CRIT.REV.ONCOL.HEMATOL.37(1)：13-25.
76.Sambrook et al.(1989)，MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL，ColdSpring Harbor Laboratory Press，(2nd Edition).
77.Shen，E.S.，G.M.Cooke，et al.(1995)，Improved exprsesion cloning using reportergenes and Epstein-Barr virus ori-containing vectors，GENE 156(2)：235-9.
78.Shields，R.L.，et al.，(2002)J BIOL CHEM 277，26733-26740.
79.Shinkawa，T.，et al.，(2002)J BIOL CHEM 8，8.
80.Simmons，L.C.，D.Reilly，et al.(2002)，Expression offull-length immunoglobulins inEscherichia coli：rapid and efficient production of aglycosylated antibodies，J.IMMUNOL.METHODS 263(1-2)：13347.
81.Stanley，P.(1984)，Glycosylation Mutants ofAnimal Cells，ANNUAL REV.GENET.18：525-52.
82.Stanley，P.，et al.，(1975)PROC NATL ACAD SCI U S A 72，3323-27.
83.Strome S.E.et al.(2002)，Strategies for antigen loading of dendritic cells to enhancethe antitumor immune response，CANCER RESEARCH 62：1884-89.
84.Sumar，N.，K.B.Bodman，et al.(1990)，Analysis ofglycosylation changes in IgGusing lectins，J.IMMUNOL.METHODS 131(1)：127-36.
85.Sutton，B.J.and D.C.Phillips (1983)，The three-dimensional structure of thecarbohydrate within the Fc fragment of immunoglobulin G，BIOCHEM SOC TRANS11(Pt 2)：130-2.
86.Sun，Y.et al.(2002)，Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of aspontaneous autoimmune disease，NAT MED.8(12)，1405-13.
87.Sun，Y.et al.(2002)，Administration ofagonistic anti-4-1BB monoclonal antibodyleads to the amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis，J.IMMUNOL.168(3)，1457-65.
88.Takeuchi，T.，et al.，(1999)AUTOIMMUNITY 31，265-271.
89.Tamamori，Y.，et al.，(2002)INT J ONCOL 21，649-654.
90.Tandai，M.，T.Endo，et al.(1991)，Structural study of the sugar moieties ofmonoclonal antibodies secreted by human-mouse hybridoma，ARCH.BIOCHEM.BIOPHYS.291(2)：339-48.
91.Tao，M.H.and S.L.Morrison (1989)，Studies ofaglycosylated chimeric mouse-human IgG.Role of carbohydrate in the structure and effector functions mediated bythe human IgG constant region，J.IMMUNOL.143(8)：2595-601.
92.Tao，M.H.，R.I.Smith，et al.(1993)，Structural features of human immunoglobulin Gthat determine isotype-specific differences in complement activation，J.EXP.MED.178(2)：661-67.
93.Tarentino，A.L.，et al.，(1974)J BIOL CHEM 249，818-24.
94.Treon，S.P.，et al.，(2005)J CLIN ONCOL 23，474-81.
95.Tsuchiya，N.，T.et al.(1989)，Effects ofgalactose depletion from oligosaccharidechains on immunological activities of human IgG，J.RHHEUMATOL.16(3)：285-90.
96.Van Epps，H.L.，Schmaljohn，C.S.，and Ennis，F.A.(1999)J VIROL 73，5301-5308.
97.Walker，M.R.，J.Lund，et al.(1989)，Aglycosylation of human IgG1and IgG3monoclonal antibodies can eliminate recognition by human cells expressing Fcgamma RI and/or Fc gamma RII receptors，BIOCHEMJ.259(2)：347-53.
98.Ward，M.，et al.，(2004)APPL ENVIRON MICROBIOL 70，2567-76.
99.White，K.D.，M.B.Frank，et al.(1996)，Effect ofimmunoglobulin variable regionstructure on C3b and C4b deposition，MOL.IMMUNOL.33(9)：759-68.
100.Wilcox R.A.，et al.(2002)，Provision of antigen and CD137signaling breaksimmunological ignorance，promoting regression of poorly immunogenic tumors，J.CLIN.INVEST.109：651-59.
101.Wilcox R.A.et al.(2002)，Signaling through NK cell-associated CD137promotesboth helper function for CD8+cytolytic T lymphocytes and responsiveness tointerleukin-2，J.IMMUNOL.169：4230-36.
102.Williams，R.D.，et al.，(1978)IN VITRO 14，779-786.
103.Wilmut I，et al.(Oct 10，2002)，Somatic CellNuclear Transfer，NATURE419(6907)：583-86.
104.Wilmut I，et al.(Feb 27，1997)，Viable Offspring Derived From Fetal and AdultMammalian Cells，NATURE 385(6619)：810-3.
105.Wolff，E.A.，et al.，(1993)CANCER RES 53，2560-65.
106.Wright，A.and S.L.Morrison (1994)，Effect of altered CH2-associated CarbohydrateStructure On The Functional Properties And In Vtvo Fate Of Chimeric Mouse-HumanImmunoglobulin G1，J.EXP.MED.180(3)：1087-96.
107.Wright，A.，and Mordson，S.L.(1998)J IMMUNOL 160，3393-3402.
108.Wu，J.，et al，.(1997)J CLIN INWST 100，1059-1070.
109.Yamane-Ohnuki，N.，et al.，(2004)BIOTECHNOL.BIOENG.87，614-22.
110.Zhou，Q.，et al.，(2005)J.BIOTECHNOL.117，57-72.
111.Zhu G.，et al.(2001)，Progressive depletion of peripheral B lymphocytes in 4-1BB(CD137)ligand/I-E βtransgenic mice，J.IMMUNOL.167：2671-6.
112.Zou X，et al.(2002)，Generation of Cloned Goats (Capra Hircus) from TransfectedFoetal Fibroblast Cells，the Effect of Donor Cell Cycle，MOL REPROD DEV.；61：164-172.
Chen et al.，20050013811

Claims (14)

1.一种增强抗体ADCC活性的非治疗方法，其包括：
修饰抗体的糖基化，其中通过在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生所述抗体来修饰所述糖基化，所述哺乳动物乳腺上皮细胞是经改造以在其乳中表达所述抗体的非人哺乳动物的细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体的至少一条链中不含有岩藻糖。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体的一条链中不含有岩藻糖。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体经修饰以使其含有甘露寡糖或额外的甘露寡糖。
5.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使其含有甘露寡糖或额外的甘露寡糖。
6.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体中的碳水化合物显示高甘露糖的糖基化模式。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体的至少一条链含有甘露寡糖并且是非岩藻糖基化的。
8.权利要求7的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体的一条链含有甘露寡糖并且是非岩藻糖基化的。
9.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体中的主要碳水化合物是非岩藻糖基化的。
10.权利要求9的方法，其中所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化的甘露寡糖。
11.权利要求10的方法，其中所述主要碳水化合物是非岩藻糖基化的Man5。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使该抗体中少于40％的碳水化合物含有岩藻糖。
13.权利要求1的方法，其中所述抗体经修饰以使至少30％的所述抗体含有至少一个甘露寡糖。
14.权利要求1的方法，其中所述抗体为IgG1或IgG2抗体。
CN200680048006.XA 2005-10-21 2006-10-23 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途 Expired - Fee Related CN101484470B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72905405P 2005-10-21 2005-10-21
US60/729,054 2005-10-21
PCT/US2006/041656 WO2007048077A2 (en) 2005-10-21 2006-10-23 Antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytoxicity activity, methods of their production and use

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013101589165A Division CN103435695A (zh) 2005-10-21 2006-10-23 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101484470A CN101484470A (zh) 2009-07-15
CN101484470B true CN101484470B (zh) 2014-07-23

Family

ID=37820635

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680048006.XA Expired - Fee Related CN101484470B (zh) 2005-10-21 2006-10-23 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途
CN2013101589165A Pending CN103435695A (zh) 2005-10-21 2006-10-23 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013101589165A Pending CN103435695A (zh) 2005-10-21 2006-10-23 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20080118501A1 (zh)
EP (3) EP1945666B1 (zh)
JP (2) JP5328019B2 (zh)
KR (3) KR20140133958A (zh)
CN (2) CN101484470B (zh)
AU (1) AU2006304886B2 (zh)
CA (1) CA2626542C (zh)
DK (2) DK1945666T3 (zh)
ES (2) ES2417147T3 (zh)
IL (1) IL218943A0 (zh)
NZ (1) NZ568433A (zh)
PL (1) PL1945666T3 (zh)
WO (1) WO2007048077A2 (zh)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080019905A9 (en) * 2005-02-18 2008-01-24 Strome Scott E Method of using an anti-CD137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection
EP1945666B1 (en) * 2005-10-21 2013-03-27 GTC Biotherapeutics, Inc. Antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytoxicity activity, methods of their production and use
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
WO2008030564A2 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Verenium Corporation Aglycosylated antibodies and methods of making and using those antibodies
FR2915398B1 (fr) * 2007-04-25 2012-12-28 Lab Francais Du Fractionnement "ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto-immune ou d'une maladie infectieuse"
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
WO2009046168A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Avaxia Biologics, Inc. Antibody therapy for use in the digestive tract
US8647626B2 (en) 2007-10-02 2014-02-11 Avaxia Biologics, Incorporated Compositions comprising TNF-specific antibodies for oral delivery
ES2336873B1 (es) * 2007-11-07 2011-01-24 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Composicion farmaceutica para el tratamiento de cancer.
US20110003338A1 (en) * 2008-03-11 2011-01-06 Robert Bayer Antibodies with enhanced adcc function
WO2009124109A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 The Government Of The U.S. A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health &Human Services Human monoclonal antibodies specific for cd22
US20110229460A1 (en) * 2008-05-01 2011-09-22 Gtc Biotherapeutics, Inc. anti-cd137 antibody as an agent in the treatment of inflammatory conditions
JP2012503656A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 エウレカ セラピューティクス，インコーポレイテッド 変異体グリコシル化パターンを有する細胞株およびタンパク質
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
TWI409079B (zh) * 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
PL2493922T3 (pl) 2009-10-26 2017-07-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposób wytwarzania glikozylowanych immunoglobulin
FR2962908A1 (fr) 2010-07-20 2012-01-27 Lfb Biotechnologies Formulation d'anticorps anti-cd20
KR20140093603A (ko) 2010-12-30 2014-07-28 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 병원체 불활성화제로서의 글리콜
FR2976811A1 (fr) 2011-06-22 2012-12-28 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom
US10221210B2 (en) 2011-07-20 2019-03-05 Zepteon, Incorporated Polypeptide separation methods
JP6433786B2 (ja) * 2011-08-10 2018-12-05 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 高度ガラクトシル化抗体
US20130302274A1 (en) * 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
WO2013114240A2 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for obtaining a glycoprotein composition
US10059770B2 (en) 2012-01-30 2018-08-28 Dr. Reddy's Laboratories Limited Process of modulating man5 and/or afucosylation content of a glycoprotein composition
EP2879697A4 (en) 2012-08-03 2016-01-20 Lfb Usa Inc USE OF ANTITHROMBIN IN OXYGENATION OF EXTRACORPOREAL MEMBRANE
US20150322119A1 (en) * 2012-12-03 2015-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
WO2014096672A1 (fr) 2012-12-17 2014-06-26 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
US20160002330A1 (en) 2013-02-13 2016-01-07 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Cetuximab with modified glycosylation and uses thereof
KR20160003634A (ko) * 2013-02-13 2016-01-11 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 고도로 갈락토실화된 항-her2 항체 및 이의 용도
AR094778A1 (es) 2013-02-13 2015-08-26 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Proteínas con glicosilación modificada y métodos para producirlas
KR20160002713A (ko) * 2013-02-13 2016-01-08 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 고도로 갈락토실화된 항-tnf-알파 항체 및 이의 용도
WO2014177771A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
JP2016532100A (ja) 2013-07-05 2016-10-13 ラボラトワール・フランセ・デュ・フラクシオンマン・エ・デ・ビョテクノロジーＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ Ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
FR3016633B1 (fr) 2014-01-17 2018-04-13 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Immunoglobuline anti-toxine du charbon
US10780182B2 (en) 2014-04-25 2020-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
FR3025515B1 (fr) 2014-09-05 2016-09-09 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'un anticorps monoclonal
FR3034420A1 (fr) 2015-03-31 2016-10-07 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-cd303
FR3038517B1 (fr) 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
CN105886656B (zh) * 2016-06-24 2019-11-12 河北医科大学第四医院 Gif基因在食管鳞癌诊治中的应用
CN106199005B (zh) * 2016-07-26 2019-02-01 浙江大学 采用cd137表达量检测淋巴细胞抗大肠癌活性的方法
CN107987160A (zh) 2016-10-26 2018-05-04 无锡科捷诺生物科技有限责任公司 一种无岩藻糖基化的单克隆抗体
WO2018098401A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Translational Drug Development, Llc Benzamide and active compound compositions and methods of use
FR3060395B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-her2
FR3060394B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii
CN107083362A (zh) * 2017-06-19 2017-08-22 金浩范 一种自体nk细胞制备方法及实施该方法的试剂盒
EP3498293A1 (en) 2017-12-15 2019-06-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Treatment of monogenic diseases with an anti-cd45rc antibody
FR3076294B1 (fr) 2017-12-29 2022-01-28 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'anticorps a partir de lait brut
KR20210029158A (ko) 2018-06-03 2021-03-15 람카프 바이오 베타 엘티디. Ceacam5 및 cd47에 대한 이중특이성 항체
EP3626265A1 (en) 2018-09-21 2020-03-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-human cd45rc antibodies and uses thereof
EP3636320A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-15 Numab Therapeutics AG Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
CN113614107A (zh) 2019-01-23 2021-11-05 Encefa公司 Cd31竞争剂及其用途
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
ES2967381T3 (es) 2020-12-18 2024-04-30 Lamkap Bio Beta Ag Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47
CN112724263B (zh) * 2021-04-02 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 改造抗cd20单克隆抗体以提高其药物疗效的方法及其应用
CN113648405B (zh) * 2021-08-19 2023-06-02 重庆医科大学 一种口服重组幽门螺杆菌蛋白疫苗纳米粒及其制备方法
CA3231944A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Carole GUILLONNEAU Anti-human cd45rc binding domains and uses thereof
WO2023118241A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vetoquinol Sa Anti-canine interleukine-31-receptor a (il-31ra) antibodies and the uses thereof
WO2023242351A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Lamkap Bio Beta Ag Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004009618A2 (en) * 2002-07-18 2004-01-29 Crucell Holland B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP1400171A1 (en) * 1993-12-20 2004-03-24 GTC Biotherapeutics, Inc. Transgenic production of antibodies in milk
WO2004050847A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Modified antibodies stably produced in milk and methods of producing same
WO2006088464A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Gtc Biotherapeutics, Inc. A method of using an anti-cd137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2459619B1 (fr) * 1979-06-26 1983-07-29 Agronomique Inst Nat Rech Procede pour l'obtention a partir de lactoserum, d'un produit enrichi en alpha-lactalbumine et applications dudit procede
US4257774A (en) * 1979-07-16 1981-03-24 Meloy Laboratories, Inc. Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA
US4361544A (en) * 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3432718C1 (de) * 1984-09-06 1986-05-22 Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung einer Loesung von Milch- und/oder Kolostralimmunglobulinen
US5322775A (en) * 1986-06-30 1994-06-21 Pharmaceutical Proteins Ltd. Peptide production
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5750172A (en) * 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5202238A (en) * 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US4897465A (en) * 1988-10-12 1990-01-30 Abbott Laboratories Enrichment and concentration of proteins by ultrafiltration
US20060002904A9 (en) * 1988-11-07 2006-01-05 Kwon Byoung S Receptor and related products and methods
US6303121B1 (en) * 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6362325B1 (en) * 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US6355476B1 (en) * 1988-11-07 2002-03-12 Advanced Research And Technologyinc Nucleic acid encoding MIP-1α Lymphokine
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5633076A (en) * 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5965789A (en) * 1991-01-11 1999-10-12 American Red Cross Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5674704A (en) * 1993-05-07 1997-10-07 Immunex Corporation Cytokine designated 4-IBB ligand
US7211259B1 (en) * 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US7138500B1 (en) * 1993-05-07 2006-11-21 Immunex Corporation Antibodies to human 4-1BB
CA2167580A1 (en) * 1993-07-22 1995-02-02 Howard Y. Chen Expression of human interleukin-1.beta. in a transgenic animal
AU697482B2 (en) * 1993-09-16 1998-10-08 Indiana University Research And Technology Corporation Human receptor H4-1BB
WO1995024488A1 (en) * 1994-03-09 1995-09-14 Abbott Laboratories Transgenic animals producing oligosaccharides and glycoconjugates
NZ282849A (en) * 1994-03-29 1998-05-27 Celltech Therapeutics Ltd Antibodies against e-selectin; whole antibodies of neutral isotype, being variants of natural antibodies altered in the fc region
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
EP0690452A3 (en) 1994-06-28 1999-01-07 Advanced Micro Devices, Inc. Electrically erasable memory and method of erasure
ES2181805T3 (es) * 1994-12-23 2003-03-01 Astrazeneca Ab Compuestos quimicos.
JP2911056B2 (ja) * 1995-04-08 1999-06-23 株式会社エルジ化学 ヒト４−１ｂｂに特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生する細胞株
US6998467B1 (en) 1995-04-28 2006-02-14 The Hospital For Sick Children Antibody specific for presenilin 1 and method of use thereof
US5874240A (en) * 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
US6268487B1 (en) * 1996-05-13 2001-07-31 Genzyme Transgenics Corporation Purification of biologically active peptides from milk
DE69718268D1 (de) * 1996-10-03 2003-02-13 Canon Kk Verfahren zur Detektion von Zielnukleinsäure, Verfahren zu ihrer Quantifizierung und Pyrylium-Verbindungen zur Chemilumineszenz-Analyse
NZ334691A (en) * 1996-10-11 2000-12-22 Bristol Myers Squibb Co Compositions of anti-4-1BB antibody effective for immunomodulation and treatment of T-cell autoimmune disease
US5945577A (en) 1997-01-10 1999-08-31 University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells
AU738888B2 (en) * 1997-05-29 2001-09-27 Agresearch Limited Processes for production of immunoglobulin A in milk
US20030175754A1 (en) 1998-06-29 2003-09-18 Incyte Genomics, Inc. RVP-1 variant differentially expressed in crohns disease
US20030096976A1 (en) * 1998-11-17 2003-05-22 Hong Hyo Jeong Humanized antibodies LB-00503 and LB-00506 specific for human 4-1BB and pharmaceutical compositions comprising said humanized antibodies
KR20000034847A (ko) * 1998-11-17 2000-06-26 성재갑 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US7414170B2 (en) * 1999-11-19 2008-08-19 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Transgenic bovines capable of human antibody production
EP1254177A1 (en) * 2000-02-03 2002-11-06 Hammarström, Lennart RUMINANT MHC CLASS I-LIKE Fc RECEPTORS
FR2807767B1 (fr) * 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US20040247563A1 (en) * 2000-11-02 2004-12-09 Lynch David H. Method of enhancing lymphocyte-mediated immune responses
US20030133936A1 (en) * 2001-07-12 2003-07-17 Byrne Michael Chapman CD25markers and uses thereof
US7651686B2 (en) * 2001-10-09 2010-01-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Enhancement of immune responses by 4-1bb-binding agents
US7053202B2 (en) * 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20030223989A1 (en) * 2002-04-18 2003-12-04 Pluenneke John D. CD137 agonists to treat patients with IgE-mediated conditions
JP2005536511A (ja) * 2002-07-15 2005-12-02 マヨ ファウンデーション フォー メディカル エデュケーション アンド リサーチ ４−１ｂｂ結合物質を用いる治療及び予防
PL375144A1 (en) * 2002-07-30 2005-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
CA2501415A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method of selecting cells for somatic cell nuclear transfer
US20060121030A1 (en) * 2002-12-16 2006-06-08 Herbert Schwarz Use of cd 137 antagonists for the treatment of tumors
WO2004063351A2 (en) * 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7471635B2 (en) * 2003-07-16 2008-12-30 Qlogic, Corporation Method and apparatus for test pattern generation
CN1871259A (zh) * 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US7288638B2 (en) * 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
WO2005095653A2 (en) * 2004-04-02 2005-10-13 Hematologics, Inc. Method for collecting purified cells
US20080019905A9 (en) * 2005-02-18 2008-01-24 Strome Scott E Method of using an anti-CD137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection
EP1851244A4 (en) * 2005-02-15 2009-04-15 Gtc Biotherapeutics Inc ANTI-CD137 ANTIBODY AS A MEANS FOR THE TREATMENT OF CANCER, AND GLYCOSYLATION VARIANTS THEREOF
US20060182744A1 (en) * 2005-02-15 2006-08-17 Strome Scott E Anti-CD137 antibody as an agent in the treatment of cancer and glycosylation variants thereof
WO2007029054A1 (en) * 2005-09-09 2007-03-15 Glycofi, Inc. Immunoglobulin comprising predominantly a man7glcnac2, man8glcnac2 glycoform
PL1945665T3 (pl) * 2005-10-21 2012-02-29 Genzyme Corp Leki oparte na przeciwciałach z ulepszoną aktywnością adcc
EP1945666B1 (en) * 2005-10-21 2013-03-27 GTC Biotherapeutics, Inc. Antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytoxicity activity, methods of their production and use
US20110229460A1 (en) * 2008-05-01 2011-09-22 Gtc Biotherapeutics, Inc. anti-cd137 antibody as an agent in the treatment of inflammatory conditions
US10798205B2 (en) 2016-04-13 2020-10-06 Facebook, Inc. Cache system for live broadcast streaming

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1400171A1 (en) * 1993-12-20 2004-03-24 GTC Biotherapeutics, Inc. Transgenic production of antibodies in milk
WO2004009618A2 (en) * 2002-07-18 2004-01-29 Crucell Holland B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
WO2004050847A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Modified antibodies stably produced in milk and methods of producing same
WO2006088464A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Gtc Biotherapeutics, Inc. A method of using an anti-cd137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AF Kolb et al.Virus-neutralizing monoclonal antibody expressed in milk of transgenic mice provides full protection againstvirus-induced encephalitis.《journal of virology》.2001,第75卷(第6期),2803-2909. *
Liu A et al.A comparison of herpes simplex virus specific antibodies found in human milk and serum.《Pediatric research》.1992,第31卷(第6期),表1、593页右栏第57-60行. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2388272A1 (en) 2011-11-23
IL218943A0 (en) 2012-05-31
JP5328019B2 (ja) 2013-10-30
AU2006304886A1 (en) 2007-04-26
ES2417147T3 (es) 2013-08-06
ES2642787T3 (es) 2017-11-20
CA2626542A1 (en) 2007-04-26
WO2007048077A2 (en) 2007-04-26
CA2626542C (en) 2018-07-03
NZ568433A (en) 2012-07-27
EP2388273A1 (en) 2011-11-23
KR20080068089A (ko) 2008-07-22
DK2388273T3 (en) 2017-10-09
KR101507027B1 (ko) 2015-03-31
KR20140133958A (ko) 2014-11-20
JP2012250984A (ja) 2012-12-20
EP2388273B1 (en) 2017-07-05
DK1945666T3 (da) 2013-07-01
EP1945666B1 (en) 2013-03-27
CN103435695A (zh) 2013-12-11
CN101484470A (zh) 2009-07-15
US20080118501A1 (en) 2008-05-22
AU2006304886B2 (en) 2012-04-12
JP2009512694A (ja) 2009-03-26
US20140046033A1 (en) 2014-02-13
US20200255518A1 (en) 2020-08-13
PL1945666T3 (pl) 2013-09-30
KR20130089673A (ko) 2013-08-12
EP1945666A2 (en) 2008-07-23
WO2007048077A3 (en) 2007-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101484470B (zh) 具有增强的抗体依赖性细胞毒性活性的抗体及其生产方法和用途
JP6433786B2 (ja) 高度ガラクトシル化抗体
US20130149301A1 (en) Anti-cd137 antibody as an agent in the treatment of inflammatory conditions
CN104640880A (zh) Kir3dl2结合剂
JP2014520092A (ja) 炎症性障害の治療のための抗ｋｉｒ抗体
EP1851244A1 (en) An anti-cd137 antibody as an agent in the treatement of cancer and glycosylation variants thereof
US20060182744A1 (en) Anti-CD137 antibody as an agent in the treatment of cancer and glycosylation variants thereof
JP2010525037A (ja) 悪性病変、自己免疫性疾患、あるいは感染性疾患を治療するための部品キット
AU2012201010B2 (en) Antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytoxicity activity, methods of their production and use
AU2015201981A1 (en) Antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytoxicity activity, methods of their production and use
AU2012293420B2 (en) Highly galactosylated antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GENZYME CORP.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20110919

Address after: The American state of Massachusetts

Applicant after: Gtc Biotherapeutics Inc

Co-applicant after: Genzyme Corp

Address before: The American state of Massachusetts

Applicant before: Gtc Biotherapeutics Inc

C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: The American state of Massachusetts

Applicant after: GTC BIOTHERAPEUTICS INC.

Applicant after: Genzyme Corp

Address before: The American state of Massachusetts

Applicant before: Gtc Biotherapeutics Inc

Applicant before: Genzyme Corp

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: GTC BIOTHERAPEUTICS INC. TO: IVO BIOLOGICAL PREPARATION CO., LTD.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: LFB AMERICAN LTD.

Free format text: FORMER OWNER: IVO BIOLOGICAL PREPARATION CO., LTD.

Effective date: 20141119

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20141119

Address after: The American state of Massachusetts

Patentee after: LFB USA Ltd

Patentee after: Genzyme Corp

Address before: The American state of Massachusetts

Patentee before: GTC BIOTHERAPEUTICS INC.

Patentee before: Genzyme Corp

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140723

Termination date: 20161023

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee