MX2015003476A

MX2015003476A - Agentes de union kir3dl2.

Info

Publication number: MX2015003476A
Application number: MX2015003476A
Authority: MX
Inventors: Laurent Gauthier; Simon Kollnberger; Benjamin Rossi; Hélène Sicard; Carine Paturel; Stéphanie Cornen; Stéphanie Zerbib
Original assignee: Innate Pharma
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2015-08-10
Also published as: AU2013320360A1; US11858990B2; WO2014044686A1; EP2897980A1; ES2770399T3; MX369148B; BR112015006060A2; US20240124579A1; IL237220A0; US10577419B2; US20150232556A1; CN104640880A; RU2682449C2; JP2015535820A; CA2881765C; EP2897980B1; DK2897980T3; BR112015006060B1; CA2881765A1; RU2015104760A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento de cáncer y enfermedad inflamatoria usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), fragmentos de anticuerpos y derivados de los mismos que se enlazan específicamente a KIR3DL2. La invención también se refiere a anticuerpos, células productoras de tales anticuerpos; métodos de fabricación de tales anticuerpos; fragmentos, variantes, y derivados de los anticuerpos; composiciones farmacéuticas que comprenden el mismo.

Description

AGENTES DE UNIÓN KIR3DL2 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona proteínas que enlazan a antígenos capaces de enlazarse a polipéptidos KIR3DL2. Los anticuerpos tienen una actividad incrementada en el tratamiento de trastornos caracterizados por células que expresan KIR3DL2, particularmente las células T CD4+, incluyendo tumores malignos tales como la micosis fungoide y síndrome de Sézary, y los trastornos autoinmunes que expresan KIR3DL2.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. N° 61/702.834, presentada el 19 de septiembre 2012, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, incluyendo algunas figuras.

REFERENCIA A LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud está siendo presentada junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado "KIR-3 PCT ST25", creado el 13 de septiembre de 2013, que es de 91 KB de tamaño. La información en el formato electrónico del Listado de Secuencias se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Receptores de tipo inmunoglobulina Killer (KIR) son una familia de receptores que, junto con los receptores de lectina tipo C (CD94-NKG2), se utilizan por las células NK humanas y subconjuntos de linfocitos T para reconocer específicamente moléculas MHC de clase I. Cierta inhibición y activación de KIR tienen dominios extracelulares muy similares y son reconocidos por el mismo anticuerpo monoclonal, por ejemplo, KIR2DL1 y KIR2DS1 son reconocidas por EB6, y 2DL2 y 2DS2 por GL183. Tres criterios (número de dominios tipo Ig extracelulares (dominios DO, DI, D2), longitud de la cola citoplasmática, y la secuencia de analogía) se han utilizado para categorizar las proteínas KIR en 13 grupos, a saber, KIR3DL1-2, KIR3DS1, KIR2DL1-5, y KIR2DS1-5. La nomenclatura 2D para 2 dominios o 3D para 3 dominios da el número de dominios tipo Ig; receptores ya sea con dominios citoplásmicos largos o cortos se clasifican como L o S. (Pascal V. et al, 2007, J. Immunol.179:1625-1633) Los receptores inhibidores poseen colas citoplasmáticas largas (L) (es decir, KIR2DL o KIR3DL) que contiene un ITIM canónica que se convierte en tirosina fosforilada después del acoplamiento KIR de sus ligandos HLA clase I. La ITIM fosforilada recluta el dominio 2 de homología Src que contiene proteínas tirosina fosfatasas 2 de homología Src que contienen el dominio de fosfatasa 1 y/o Src de homología 2 que contiene el dominio fosfatasa 2, la cual desfosforila sustratos celulares, abortando así la señal de activación de NK, es decir, afecta células diana con la auto-expresión de MHC de clase I adecuada. Receptores con colas citoplasmáticas cortas (S) carecen de ITIMs (es decir, KIR2DS o KIR3DS). Estos KIR de activación contienen un residuo cargado dentro de su dominio transmembrana facilitando la interacción con la cadena de señalización KARAP/DAP12. La participación de la familia de los receptores KIR2DS se ha demostrado que conducen a una cascada de KARAP/DAP12 mediada por eventos de señalización que culminan en un aumento de la actividad citolítica de las células NK y la producción de citoquinas proinflamatorias tales como IFN-? (Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179:1625-1633). Células NK maduras se predicen para adquirir al menos un receptor inhibidor específico para una molécula de auto-expresión de MHC de clase I, que generalmente prevalece funcionalmente sobre moléculas activadoras potencialmente auto-reactivas. Se propone que la respuesta de las células NK representa el resultado integrado tanto de activación y la señalización inhibitoria por la KIR y otros receptores.

KIR3DL2 se ha estudiado como un objetivo para el tratamiento de tumores malignos que implican células T CD4+ que expresan receptores KIR3DL2, particularmente las células T CD4+, incluyendo tumores malignos tales como la micosis fungoide y el síndrome de Sézary (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT W02010/081890 y W002/50122).

Un ligando de KIR3DL2, HLA-B27, está fuertemente asociado con la Espondiloartritis (SpA) un grupo de trastornos debilitantes artríticas inflamatorios tipificados por la Espondilitis Anquilosante (AS). Estudios de asociación de todo el genoma han implicado fuertemente genes involucrados en la regulación de la IL-17 producida por las células Thl7 en SpA (Reveille, et al (2011) Nat Genet 43:761-767.). La IL17 ha sido implicada en diversas enfermedades autoinraunes incluyendo SpA (Shen, et al. (2009) Arthritis Rheum. 60:1647-1656; Wendling, et al. (2007) Joint Bone Spine 74:304-305). La HLA-B27 (B27) se expresa en la superficie de las células que expresan el antígeno (APC) en la enfermedad tanto como heterotrímeros asociados b2ha clásicos y dímeros de cadena pesada enlazados a disulfuro libre de b2ih no canónicos (denominados B272) (Bird, et al. (2003) Eur J Immunol 33:748-759; Kollnberger, et al. (2002) Arthritis Rheum 46:2972- 2982). Dimeros B27 pero no heterotrimeros B27 son ligandos para los receptores KIR3DL2 tipo inmunoglobulina asesinos de las células (Kollnberger et al. (2002)). Los tres dominios de tipo inmunoglobulina DO, DI y D2 de KIR3DL2 están involucrados en el enlace del ligando. La ligadura KIR3DL2 por dimeros B27 promueve la supervivencia de los subconjuntos de células NK y TH17 (Bowness, et al. (2011) Journal of Immunology 186:2672-2680; Chan, et al. (2005) Arthritis Rheum 52:3586-3595). Se ha demostrado que hay un aumento de las proporciones de patógenos de subconjuntos de células Thl7 y NK que expresan KIR3DL2 en pacientes con SpA Bowness et al. (2011) y Chan et al. (2005). Los estudios sugieren fuertemente que las interacciones KIR3DL2-B27 tienen un papel central que desempeñar en SpA y que KIR3DL2 es una diana terapéutica prometedora.

Se ha reportado la existencia de anticuerpos reactivos contra diversos polipéptidos KIR3D. La existencia de dos anticuerpos anti-KIR3DL2 ha sido reportada: Q241 y Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184:505-518). Sin embargo, estos dos anticuerpos son del isotipo IgM (pentámeros) y no son fácilmente adecuados para uso farmacéutico; además, si sus regiones variables se colocaran en el contexto de un anticuerpo de tipo IgG bivalente, se esperarla que su afinidad sea baja. Se reportó que las células referidas como "AZ158" producen un anticuerpo adicional (Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII D. Masón, editor. Oxford University Press, Oxford 415-417: publicación PCT W02010/081890). El anticuerpo 5.133 está disponible en Miltenty Biotech (Auburn CA). Arabos anticuerpos AZ158 y 5.133 enlazan KIR3DL2, asi como KIR3DL1 (y además el KIR3DS1 altamente homólogo). KIR3DL2 y KIR3DL1 comparten identidad de aminoácidos relativamente alta y diversos ligandos HLA que se enlazan a KIR3DL2 también son reconocidos por KIR3DL1. A pesar de las inmunizaciones que dieron lugar a AZ158, Q241 y Q66, hay una necesidad de mejorar los anticuerpos en aplicaciones terapéuticas y otras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención da como resultado, entre otras cosas, desde el descubrimiento de que la KIR3DL2 puede internalizar cuando se enlaza a un anticuerpo. A la vez, identificamos una serie de mAbs KIR3DL2 que no internalizan. Se demuestra que la internalización KIR3DL2 dificulta fuertemente enfoques basados en ADCC. Aquí también ofrecemos anticuerpos anti-KIR3DL2 que inhiben interacciones del dimero B27 con KIR3DL2. Notablemente, el bloqueo del ligando se puede lograr sin causar la internalización del receptor. También proporcionamos anticuerpos que bloquean selectivamente interacciones KIR3DL2-HLA B27 sin bloquear las interacciones KIR3DL2-HLA-A3.

Se proporcionan anticuerpos que enlazan el mayor (en términos de frecuencias en las poblaciones humanas) alelos KIR3DL2, pero sin enlazar al polipéptido KIR3DL1 estrechamente relacionado (por ejemplo, alelo *00101 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 169). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a 1, 2, 3, 4 o 5 o más de los polipéptidos KIR3DL2 (por ejemplo, alelos *002, *003, *005, *007, y/o *008) de SEQ ID NOS: 1 y 159 a 168. En consecuencia, se proporcionan anticuerpos que tienen las propiedades funcionales ventajosas descritas en este documento, y que se pueden administrar para el tratamiento de la enfermedad sustancialmente a través de la población humana, por ejemplo, sin la necesidad de realizar pruebas de diagnóstico para evaluar el alelo KIR3DL2 expresado en un individuo.

También se proporciona, a través del estudio de los anticuerpos epitopos, son regiones en KIR3DL2 (en el dominio DO y dominio D2) que puede ser el blanco de los anticuerpos para dar lugar a propiedades ventajosas.

En un aspecto, los anticuerpos tienen además la ventaja adicional de enlazar múltiples alelos de KIR3DL2 humano, mientras que mantienen la especificidad KIR3DL2 sobre KIR3DL1.

Se proporcionan anticuerpos que tienen la ventaja de bloquear los ligandos naturales de KIR3DL2 y que son por lo tanto muy adecuados para el tratamiento o prevención de trastornos inflamatorios, ya sea como un agotamiento o de formato mAb de no-agotamiento. Por otra parte, diferentes epitopos proporcionan diferente especificidad de bloqueo de ligando.

También se proporcionan anticuerpos, incluyendo anticuerpos no internalizados, que no bloquean ligandos KIR3DL2 (HLA-A3 y HLA-B27); estos anticuerpos pueden ser ventajosos en los enfoques basados en ADCC en las que puede ser útil para evitar la competencia con ligandos.

En una modalidad proporcionada es un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2, en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1 (por ejemplo, en donde el polipéptido KIR3DL1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169), y en donde dicho anticuerpo no es internalizado dentro de las células que expresan KIR3DL2.

En una modalidad proporcionada es un anticuerpo que se enlaza a al menos dos polipéptidos KIR3DL2 (alelos), y en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1 (por ejemplo, KIR3DL1 alelo *00101 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 169).

En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a 1, 2, 3, 4 o 5 de los polipéptidos KIR3DL2 (alelos *002, *003, *005, *007, y/o *008) de SEQ ID NOS: 1, 161, 163, 165 y/o 166.

En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 1, 171 y 176 (alelos *002, *001 y *007 respectivamente). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 171 y 178 (alelos *001 y *009 respectivamente). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 171, 1, 176 y 178 (alelos *001, *002, *007 y *009 respectivamente). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 171, 1, 172, 174 y 176 (alelos *001, *002, *003, *005 y *007 respectivamente). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 171, 1, 176 y 177 (alelos *001, *002, *007 y *008, respectivamente). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a cada uno de los polipéptidos KIR3DL2 que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOS: 171, 1, 172, 174, 176 y 177 (alelos *001, *002, *003, *005, *007 y *008 respectivamente). En una modalidad de cualquiera de los anteriores, los anticuerpos se enlazan además a un polipéptido KIR3DL2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 178 (alelo *09). En una modalidad de cualquiera de los anteriores, los anticuerpos se enlazan además un polipéptido KIR3DL2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 173 (alelo *004). En una modalidad de cualquiera de los anteriores, los anticuerpos se enlazan además a un alelo polipéptido KIR3DL2 *010 (que tiene el mismo dominio extracelular de SEQ ID NO: 171 como *001). En una modalidad de cualquiera de los anteriores, los anticuerpos se enlazan además un alelo polipéptido KIR3DL2 *011 (que tiene el mismo dominio extracelular (de SEQ ID NO: 179) como *003). En una modalidad de cualquiera de los anteriores, los anticuerpos se enlazan además a un alelo polipéptido KIR3DL2 *006. Opcionalmente, en cada caso, el anticuerpo se enlaza a dicho polipéptido KIR3DL2 expresado en la superficie de una célula (por ejemplo, una linea celular reportera, en donde el KIR3DL2 está en una conformación nativa). Opcionalmente, el anticuerpo se enlaza a un epitopo conformacional.

Opcionalmente, en cada caso, el anticuerpo se enlaza a dicho polipéptido KIR3DL2 expresado en la superficie de una célula con afinidad de enlace (KD), opcionalmente en donde la afinidad de enlace es bivalente, para un polipéptido KIR3DL2 humano al de menos de 108 M. Preferentemente, el anticuerpo se enlaza a un epitopo conformacional en KIR3DL2.

En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a un residuo de aminoácido en el dominio DO o D2 de un polipéptido de KIR3DL2, y en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1.

Opcionalmente, el anticuerpo tiene afinidad de enlace (KD), opcionalmente en donde la afinidad de enlace es bivalente, para un polipéptido KIR3DL2 humano al de menos de (es decir, mejor afinidad que) 108 M, preferiblemente menos de 109 M, o preferiblemente menos que 10_1° M.

Opcionalmente, los anticuerpos tienen una EC50 de no más de 5 mg/ml, opcionalmente no más de 3 pg/ml, no más de 2 pg/ml, no más de 1 pg/mL o no más de 0.5 pg/mL para enlazar a las células hechas para expresar en su superficie un alelo KIR3DL2 en particular (por ejemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007 y/o *008).

En un aspecto proporcionado son anticuerpos que enlazan al KIR3DL2 en la región de enlace del ligando (HLA) (por ejemplo lugar de enlace HLA) o al menos parcialmente en la cara de enlace HLA de la proteina KIR3DL2.

Preferiblemente, en cualquiera de las modalidades de este documento se proporciona un aminoácido que enlaza a un residuo de aminoácido dentro del dominio DO (residuos 1 a 98 de SEQ ID NO: 1) y/o el dominio D2 (residuos 193-292 de SEQ ID NO: 1) de un polipéptido KIR3DL2. Opcionalmente, el enlace del anticuerpo a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en un residuo dentro del dominio DO y/o D2 es sustancialmente reducida, en comparación con el enlace a un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o más de los residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en: R13, P14, S15, H23, A25, Q27, 160 y G62 (con referencia a SEC ID NO: 1), y/o los anticuerpos que han reducido el enlace a un polipéptido de KIR3DL2 que tiene una mutación en un residuo seleccionado del grupo que consiste en: R13, P14, S15, H23, A25, Q27, 160 y G62 (con referencia a SEQ ID NO: 1)· La notación abreviada utilizada para las mutaciones en el presente documento es: residuo de tipo salvaje: posición en polipéptido, con numeración de residuos como se indica en SEQ ID NO: 1: residuo mutante.

En un aspecto proporcionado son anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos R13, A25 y/o Q27 del polipéptido KIR3DL2, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos R13, A25 y/o Q27 (con referencia a SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, un anticuerpo puede haber reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene las mutaciones R13W, A25T y/o Q27R. Opcionalmente, el epitopo comprende adicionalmente uno o más de los residuos 160 y/o G62 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos 160 y/o G62 (con referencia a la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, I60N, G62S). Opcionalmente, el epitopo comprende adicionalmente o alternativamente uno o más de los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, P14S, S15A, H23S). Opcionalmente, el epitopo no comprende residuos R32 y/o G33 (con referencia a la SEO ID NO: 1), y/o los anticuerpos no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos R32 y/o G33 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, R32H y/o G33R). Opcionalmente, el epitopo no comprende residuos F50 y/o R53 (con referencia a la SEC ID NO: 1), y/o los anticuerpos no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos F50 y/o R53 (con referencia a la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, F50A, R53S). El anticuerpo puede (por ejemplo, anticuerpos que bloquean las interacciones KIR3DL2-HLA B27 y -HLA A3) o puede que no (por ejemplo, anticuerpos no internalizados) se enlacen a residuos de Q56 y/o E57, y/o residuos F9 y/o Sil; Por lo tanto, en una modalidad, opcionalmente, el epitopo no comprende los residuos de F9, Sil, Q56 y/o E57 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos F9, Sil, Q56 y/o E57 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, F9S y SHA, Q56S y E57A); En otra modalidad, opcionalmente, el epitopo comprende los residuos F9, Sil, Q56 y/o E57 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos F9, Sil , Q56 y/o E57 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, F9S y S11A, Q56S y E57A). Opcionalmente, el epitopo no comprender residuos H29 y/o F34 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos H29 y/o F34 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, H29S, F34A). Opcionalmente, el epitopo no comprende uno o más de los residuos F9 y/o Sil (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos F9 y/o Sil (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, F9S, SHA) .

En un aspecto proporcionado son anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos 160 y/o G62 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos 160 y/o G62 (con referencia a SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, un anticuerpo puede haber reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene las mutaciones I60N y/o G62S. Opcionalmente, el epitopo comprende adicionalmente o alternativamente uno o más de los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, P14S, S15A, H23S). Opcionalmente, los anticuerpos no se enlazan a los residuos R13, A25 y/o Q27 del polipéptido KIR3DL2, y/o no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos R13, A25 y/o Q27 (por ejemplo, un polipéptido KIR3DL2 que tiene las mutaciones R13W, A25T y/o Q27R) En un aspecto proporcionado son anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos P14, S15 y/o H23 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, P14S, S15A, H23S).

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que han reducido el enlace a (1) un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos 160 y/o G62 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, I60N, G62S), y (2) un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos de P14, S15 y/o H23 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, P14S, S15A, H23S).

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende: (a) 1, 2 o 3 de los residuos R13, A25 y/o Q27 y (b) uno o ambos de los residuos 160 y/o G62 del polipéptido KIR3DL2. En un aspecto, anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido de KIR3DL2 que tiene: (a) una mutación en 1, 2 o 3 de los residuos R13, A25 y/o Q27, y (b) una mutación en uno o ambos de los residuos 160 y/o G62.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende residuos R78 y/o L82 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos R78 y/o L82 (con referencia a la SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, un anticuerpo puede haber reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene las mutaciones R78H y L82P. Opcionalmente, el epitopo comprende adicionalmente, o excluye, uno o más de los residuos de K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84 , W85, S86 y/o A87 (con referencia a la SEC ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a, o no han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos K7, Y30, R31 , P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 y/o A87 (con referencia a SEQ ID NO: 1). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos en el segmento correspondiente a los residuos 1 a 98 del polipéptido KIR3DL2 (con referencia a SEQ ID NO: 1), además opcionalmente en donde el epitopo comprende uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5) de los residuos de K7, Y30, R31, R78, P79, H80, S81, L82, T83, G84, W85, S86 y/o A87.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos W226 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos W226 (con referencia a SEQ ID NO: 1 ). Opcionalmente, el epitopo adicionalmente comprende uno o más de los residuos 1231 y/o R246 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos 1231 y/o R246 (con referencia a la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, I231M, R246P) . Opcionalmente, el epitopo adicionalmente comprende el residuo E239 (con referencia a SEQ ID NO: 1), y/o los anticuerpos han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en el residuo E239 (con referencia a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, E239G).

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos 1231 y/o R246 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1, y/o han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos 1231 y/o R246 (con referencia a la SEQ ID NO: 1)· En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende el residuo W226 y uno o ambos de los residuos 1231 y/o R246 del polipéptido KIR3DL2.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que han reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en los residuos W226 y una mutación en uno o ambos de los residuos 1231 y/o R246.

En cualquier modalidad en el presente documento, el anticuerpo opcionalmente no causa la internalización de los polipéptidos KIR3DL2 en las células que expresan KIR3DL2 y/o no se internaliza en células que expresan KIR3DL2.

En una modalidad, es proporcionado un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable (o elimina) el enlace entre el KIR3DL2 y un primer ligando natural HLA de KIR3DL2, pero no reduce de forma detectable (o eliminar) el enlace entre el KIR3DL2 y un segundo ligando natural HLA de KIR3DL2.

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y un ligando HLA de clase I de KIR3DL2 (por ejemplo, HLA-B27, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35 y/o HLA-A2).

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-B27, pero no reduce de forma detectable el enlace entre KIR3DL2 y HLA-A3.

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-A3, pero no reduce de forma detectable el enlace entre KIR3DL2 y HLA-B27.

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-B27, o entre KIR3DL2 y HLA-A3.

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente es un anticuerpo que se enlaza en al menos dos polipéptidos KIR3DL2 (alelos) que tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

En una modalidad, el anticuerpo opcionalmente es un anticuerpo que no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1.

En modalidades en el presente documento para el ligando de bloqueo de anticuerpos y/o para anticuerpos que se enlazan a un epitopo que comprende los residuos H32 y/o G33 del polipéptido KIR3DL2, el anticuerpo puede opcionalmente causar la internalización de los polipéptidos KIR3DL2 en las células que expresan KIR3DL2 y/o es internalizado en células que expresan KIR3DL2.

Un anticuerpo anti-KIR3DL2 puede ser útil para el tratamiento de cánceres, trastornos inflamatorios y trastornos autoinmunes, por ejemplo, en sujetos humanos. Este anticuerpo se puede utilizar con o sin acoplamiento a un agente tóxico o de otro tipo, dependiendo del efecto deseado o el uso hecho de los anticuerpos. En una modalidad, el anticuerpo anti-KIR3DL2 es un "anticuerpo desnudo" y no está acoplado a un agente tóxico. En una modalidad, un anticuerpo desnudo o acoplado comprende una cadena pesada que comprende una región Fe (por ejemplo, IgGl) que se enlaza a receptores Fe g (por ejemplo, CD16). Opcionalmente en donde dichos anticuerpos inducen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) hacia una célula que expresa KIR3DL2.

Opcionalmente, en cualquier modalidad, el anticuerpo (por ejemplo, IgG4, IgGl, fragmento de anticuerpo, etc.) comprende además un agente tóxico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) que es tóxico para una célula después de la internalización del conjugado de toxina de anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo está conjugado a un agente radioactivo.

La presente descripción además proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados que se enlazan específicamente a KIR3DL2 humano. La descripción proporciona tales composiciones de anticuerpos, así como su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para tratar, prevenir y diagnosticar el cáncer, trastornos inflamatorios o trastornos autoinmunes.

En una modalidad, los anticuerpos tienen una afinidad de enlace (KD) para un polipéptido KIR3DL2 humano de menos de 10-8 M, preferiblemente menos de 109 M, o preferiblemente menos de 10_1° M. Opcionalmente, la afinidad se refiere a enlaces bivalentes.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo puede tener una cadena pesada y/o ligera que tiene uno, dos o tres CDRs de la respectiva cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 y/o 20E9.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo compite por enlazarse a un polipéptido KIR3DL2 con cualquiera o cualquier combinación de anticuerpos monoclonales 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 y/o 20E9. En una modalidad, un anticuerpo compite por enlazarse a un polipéptido KIR3DL2, con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: En un aspecto, la descripción proporciona un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a KIR3DL2 seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 4, 5 o 6 (HCDR1), SEQ ID NOS: 7 o 8 (HCDR2) y SEQ ID NO: 9 (HCDR3), respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 o 12, respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (b) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 15, 16 o 17 (HCDR1), SEQ ID NOS: 18 o 19 (HCDR2) y SEQ ID NO: 20 (HCDR3), respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 21 o 22, respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (c) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 25, 26 o 27 (HCDR1), SEQ ID NOS: 28 o 29 (HCDR2) y SEQ ID NO: 30 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31, 32 o 33 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (d) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 36, 37 o 38 (HCDR1), SEQ ID NOS: 39 o 40 (HCDR2) y SEQ ID NO: 41 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 42, 43 o 44 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (e) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 47, 48 o 49 (HCDRl), SEQ ID NOS: 50 o 51 (HCDR2) y SEQ ID NO: 52 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 53, 54 o 55 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (f) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NOS: 58, 59 o 60 (HCDRl), SEQ ID NOS: 61 o 62 (HCDR2) y SEQ ID NO: 63 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 64, 65 o 66 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; (g) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 172, 173 o 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 o 176 (HCDR2) y SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 178, 179 o 180 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones; y (h) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 183, 184 o 185 (HCDRl), SEQ ID NOS: 186 o 187 (HCDR2) y SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 189, 190 o 191 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, supresiones o inserciones.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a KIR3DL2, en donde el anticuerpo tiene una o más (incluyendo cualquier combinación de los mismos, en la medida en que tal combinación no es contradictoria) de las siguientes propiedades: (a) tiene una Kd de menos de 10-8 M, preferiblemente menos de 109 M, o preferiblemente menos de 1CT10 M para enlazarse a un polipéptido KIR3DL2; (b) se enlaza a al menos un residuo en el segmento correspondiente a los residuos 1-98 o residuos 193-292 del polipéptido KIR3DL2; (c) compite por enlazarse a un polipéptido KIR3DL2 con el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 y/o 20E9; (d) compite o no con un ligando natural de KIR3DL2 (por ejemplo, polipéptidos HLA, HLA-A3, HLA-11 y/o HLA-B27) para enlazarse a un polipéptido KIR3DL2 (por ejemplo, en un ensayo de interacción de polipéptido); (e) no causa la internalización de los polipéptidos KIR3DL2 en las células gue expresan KIR3DL2 y/o no se internaliza en células que expresan KIR3DL2; (f) inhiben o no señalizando de KIR3DL2 inducida por un ligando natural de KIR3DL2 (por ejemplo, polipéptido HLA, HLA-A3, HLA-11 y/o HLA-B27); (g) no se enlazan sustancialmente a polipéptidos KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DL3, KIR2DL1 y/o KIR2DS4; (h) se enlaza a 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los polipéptidos KIR3DL2 (por ejemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007 y/o *008) de SEQ ID NOS: 160 , 1, 161, 163, 165 y/o 166); (i) se enlaza a un epitopo que comprende cualquiera uno o más de los residuos de aminoácidos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, 1231 y/o R246 de un polipéptido KIR3DL2; y (j) ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una mutación en uno o más de los residuos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, 1231 y/o R246 de un polipéptido KIR3DL2.

En cualquiera de las modalidades del presente documento, un anticuerpo se puede caracterizar por cualquiera una o más características de (a)-(j), anteriores.

En una modalidad, el anticuerpo es humano adecuado. En una modalidad, el anticuerpo es quimérico, por ejemplo, contiene un no-murina, opcionalmente un ser humano, una región constante. En una modalidad, el anticuerpo es humano o humanizado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de ratón.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, el isotipo del anticuerpo es IgG, opcionalmente IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. En una modalidad, el anticuerpo comprende un dominio Fe o es de un isotipo que está enlazado por Fe yR (por ejemplo Fe yRIIIA), por ejemplo, un anticuerpo de IgGl o isotipo IgG3.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, diacuerpos, fragmento de anticuerpo de una sola cadena, o un anticuerpo multiespecífico que comprende múltiples diferentes fragmentos de anticuerpos. En un aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo no comprende un dominio Fe o es de un isotipo que no está unido sustancialmente por Fe yR. En una modalidad, el anticuerpo es de un isotipo IgG2 o IgG4.

Opcionalmente, tales anticuerpos son además tetraméricos (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) y son asi bivalentes (por ejemplo, anticuerpos IgG).

En ciertas modalidades, los anticuerpos comprenden además un agente tóxico. En una modalidad, los anticuerpos que comprenden un agente tóxico son capaces de causar directamente la muerte de las células que expresan KIR3DL2. En una modalidad, los anticuerpos son capaces de inducir directamente (por ejemplo, en la ausencia de células efectoras inmunes) al menos 20%, 30%, 40% o 50% la muerte celular, por ejemplo, en un ensayo in vitro, de las células que expresan KIR3DL2.

En una modalidad, los anticuerpos son capaces de inducir CDC y/o ADCC de células que expresan KIR3DL2. En una modalidad, los anticuerpos son capaces de inducir al menos 20%, 30, 40 o 50% de lisis de células, en un ensayo de citotoxicidad, de las células que expresan KIR3DL2 (por ejemplo, de células T de linfoma de células, células de pacientes con SS o líneas de células SS).

En una modalidad, se proporciona un método para probar un anticuerpo anti-KIR3DL2, dicho método comprende enlazarse a un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de KIR3DL2 en contacto con una célula que expresa un polipéptido KIR3DL2 y evaluar si el anticuerpo se internaliza en las células que expresan KIR3DL2 y/o si los anticuerpos inducen y/o aumenta la internalización intracelular de un polipéptido de KIR3DL2, y seleccionar un anticuerpo si el anticuerpo no induce y/o no incrementa la internalización intracelular de un polipéptido KIR3DL2.

En otra modalidad, se proporciona un método para producir un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de KIR3DL2 en un sujeto mamífero, opcionalmente para el tratamiento de un cáncer, un trastorno inflamatorio o un trastorno autoinmune, dicho método comprende las etapas de: a) proporcionar una pluralidad de anticuerpos, opcionalmente inmunizando un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR3DL2 humano; b) determinar si cada uno de la pluralidad de anticuerpos son capaces de enlazarse a 1, 2, 3, 4, 5, o más polipéptidos diferentes KIR3DL2 alelos (por ejemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007, *008, *009 y/o *011), opcionalmente en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula, y c) seleccionar (por ejemplo, para la producción, el desarrollo, uso en terapia, etc.) un anticuerpo a partir de dicha pluralidad que son capaces de enlazarse a 1, 2, 3, 4, 5, o más polipéptidos diferentes KIR3DL2 alelos (por ejemplo, alelos *001 *, *002, *003, *005, *007, *008, *009 y/o *011), opcionalmente en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula. Opcionalmente, el método comprende además determinar si cada uno de la pluralidad de anticuerpos son capaces de enlazarse a un polipéptido de KIR3DL1, y seleccionar un anticuerpo a partir de dicha pluralidad que son capaces de enlazarse a dicho polipéptido KIR3DL1.

En otra modalidad, se proporciona un método para producir un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de KIR3DL2 en un sujeto mamífero, opcionalmente para el tratamiento de un cáncer, un trastorno inflamatorio o un trastorno autoinmune, dicho método comprende las etapas de: a) proporcionar una pluralidad de anticuerpos, opcionalmente inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR3DL2 humano; y b) seleccionar (por ejemplo, para la producción, desarrollo, uso en terapia, etc.) un anticuerpo de dicha pluralidad que: i. se enlaza al polipéptido KIR3DL2, pero no a un polipéptido KIR3DL1; y/o ii. (a) se enlaza a al menos un residuo en el segmento correspondiente a los residuos 99 a 192, del polipéptido KIR3DL2 maduro de SEQ ID NO: 1, y/o a cualquiera uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) de los residuos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, 226, 1231 y/o R246, y/o ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una sustitución de aminoácido en dicho residuo(s), o (b) se enlaza a al menos un residuo en el segmento correspondiente a los residuos 1-98, del polipéptido KIR3DL2 maduro de SEQ ID NO: 1, y/o a cualquier uno o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5 o más ) de los residuos R13, P14, S15, H23, ?25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, 1231 y/o R246, y/o se ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 que tiene una sustitución de aminoácido en dicho residuo(s); y/o iii. no se internaliza en las células que expresan KIR3DL2 y/o no induce y/o aumenta la internalización intracelular de un polipéptido KIR3DL2.

En un aspecto, se proporcionan métodos para inhibir la actividad biológica de una célula que expresa KIR3DL2 que comprende poner a la célula en contacto con anticuerpos anti- KIR3DL2, in vitro, ex vivo o in vivo. Opcionalmente dicha puesta en contacto es en presencia de un ligando (por ejemplo, HLA) de KIR3DL2, opcionalmente una célula que expresa un ligando (por ejemplo, HLA) de KIR3DL2. Preferiblemente, la célula que expresan KIR3DL2 es una célula inmune, por ejemplo, una célula T o una célula NK, una célula maligna T o NK, una célula CD4 Thl7 (por ejemplo, un células T CD4 proinflamatoris que expresan IL-23R y producen IL-17A) o una célula NK proinflamatoria que expresa produce IL-17A. En una modalidad, se proporcionan métodos para inhibir la actividad biológica de una KIR3DL2 que expresa células T o NK que producen IL-17A que comprende poner en contacto la célula con anticuerpos anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo o in vivo. Preferiblemente, la actividad biológica es la activación, la actividad litica, citoquinas (por ejemplo IL-17A) la producción y/o la proliferación celular. Preferiblemente, la actividad biológica es inducida por un ligando (por ejemplo, inducida por HLA) de señalización. En un aspecto, se proporcionan métodos para inhibir la actividad biológica de una célula que expresan KIR3DL2 que comprende poner a la célula en contacto con un anticuerpo anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo o in vivo.

En un aspecto, se proporcionan métodos para eliminar o agotar una célula que expresan KIR3DL2 que comprende poner a la célula en contacto con un anticuerpo anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo o in vivo. La célula puede ser, por ejemplo, una célula maligna T o NK, una célula T o una célula NK, una célula CD4 Thl7 (por ejemplo, unas células T CD4 proinflamatorias que expresan IL-23R y producen IL-17A) o una célula NK proinflamatoria que expresa produce IL-17A.

En un aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento utilizando los anticuerpos anti-KIR3DL2 del presente documento. Los anticuerpos se pueden usar como tratamiento profiláctico o terapéutico; en cualquiera de las modalidades en el presente documento, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo puede intercambiarse con una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo. En un aspecto, se proporciona un método de tratamiento de un paciente con un cáncer, por ejemplo, un linfoma de células T, un CD4+ o CD8+ CTCL, síndrome de Sezary (SS), micosis fungoide (MF), un linfoma de células T CD30+, el método comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que enlaza al antígeno descrito en el presente documento que específicamente se enlaza a un polipéptido KIR3DL2. En otra modalidad, se proporciona un método de tratamiento de un paciente con un trastorno autoinmune o inflamatorio mediado al menos en parte por las células T que expresan KIR3DL2, el método comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que se enlaza al antigeno descrita en el presente, que se enlaza específicamente a un polipéptido KIR3DL2.

Los métodos de tratamiento y el anticuerpo anti-KIR3DL2 se pueden utilizar para un tratamiento de un individuo en combinación con un segundo agente terapéutico, incluyendo inmunomoduladores (por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos, fármacos anti-inflamatorios, vacunas tumorales, anticuerpos que se enlazan a antígenos específicos de tumores en las células tumorales, anticuerpos que inducen ADCC hacia células tumorales, anticuerpos que potencian la respuesta inmune, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs), etc.). En una modalidad, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo anti-CD4 o un anticuerpo anti-CD30.

La presente descripción se refiere además a un método para seleccionar sujetos que tienen una enfermedad que responde a un tratamiento usando un antagonista de KIR3DL2 (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2), el método comprende determinar si las células relacionadas con la enfermedad en dicho sujeto expresan un receptor KIR3DL2, la expresión de un receptor KIR3DL2 es indicativa de un sujeto que responde. Opcionalmente, el método además comprende la administración a un sujeto que responde un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-KIR3DL2 de la invención) que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2. En una modalidad, el método se utiliza para seleccionar sujetos que tienen un cáncer, y las células relacionadas con la enfermedad son células cancerosas. En una modalidad, el método se utiliza para la seleccionar sujetos que tienen un trastorno inflamatorio o autoinmune, y las células relacionadas con la enfermedad son las células T.

La expresión de un receptor KIR3DL2 en dicha célula relacionada con la enfermedad puede ser determinada usando un ligando KIR3DL2 especifico. Preferiblemente, el ligando es un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo. En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden, y métodos de uso de anticuerpos monoclonales, incluyendo, pero no limitado a, fragmentos de anticuerpos y derivados que se enlazan específicamente a KIR3DL2 humano.

En otro aspecto, se proporciona un método (por ejemplo, un método para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico, un ensayo de respuesta, etc.), que comprende la evaluación de si un paciente tiene células relacionadas con la enfermedad que expresan un polipéptido KIR3DL2, por ejemplo, un polipéptido KIR3DL2 (uno o más alelos KIR3DL2) unidos por un anticuerpo descrito en el presente documento. Dicho método puede comprender, por ejemplo, obtener una muestra biológica de un paciente, que comprende células relacionados con la enfermedad, poner dichas células relacionadas con la enfermedad en contacto con dicho anticuerpo y la evaluación de si el anticuerpo se enlaza a las células relacionadas con la enfermedad. Una constatación de que KIR3DL2 se expresa por las células relacionadas con la enfermedad indica que el paciente tiene una enfermedad caracterizada por células que expresan KIR3DL2 y/o es adecuado para el tratamiento con un anticuerpo anti-KIR3DL2 descrito aquí. El paciente puede ser tratado además con un tratamiento adecuado para la enfermedad particular que se caracteriza por células que expresan KIR3DL2. Opcionalmente, el paciente es tratado con el anticuerpo anti-KIR3DL2. En una modalidad, el método se utiliza para seleccionar sujetos que tienen un cáncer, y las células relacionadas con la enfermedad son células cancerosas. En una modalidad, el método se utiliza para seleccionar sujetos que tienen un trastorno inflamatorio o autoinmune, y las células relacionadas con la enfermedad son las células T. En una modalidad, el anticuerpo se pone en contacto con las células relacionadas con la enfermedad con el fin de evaluar, si el anticuerpo se enlaza a las células relacionadas con la enfermedad es un anticuerpo descrito en el presente documento.

También se proporciona un método de tratamiento de un paciente, el método comprende: a) determinar si el paciente tiene células que expresan KIR3DL2 patógenas, y b) si el paciente se determina como un paciente que tiene células que expresan KIR3DL2 patógenas, se le administra un compuesto que enlaza a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) de la descripción.

También se proporciona un método para la evaluación del nivel de desarrollo de un CTCL (enfermedad de estadificación) que permite la evaluación de la proporción (por ejemplo, porcentaje) de malignas células CD4+ CTCL presentes dentro de un determinado compartimento del cuerpo de un paciente. De acuerdo con este método, las células de una muestra biológica obtenida de dicho compartimento del cuerpo se ponen en contacto con un anticuerpo anti-KIR3DL2 de la invención y la proporción de células CD4+ que expresan un polipéptido de KIR3DL2 en su superficie se mide. La proporción de células CD4+ CTCL que están realmente presentes en dicho compartimento del cuerpo pueden considerarse como sustancialmente iguales a dicha proporción medida, por ejemplo, dentro de un rango ±10% alrededor de esta proporción medida .

También se proporciona un método para el diagnóstico de CTCL, que comprende poner las células de una muestra biológica de un individuo en contacto con un anticuerpo anti-KIR3DL2 de la invención y la proporción (por ejemplo, porcentaje) de las células T que expresan un polipéptido de KIR3DL2 en su superficie es medida, y la comparación de dicha proporción de la proporción media (por ejemplo en porcentaje) de las células T que expresan un polipéptido de KIR3DL2 en su superficie observado en los humanos sin CTCL (preferiblemente en seres humanos sanos), en donde un diagnóstico CTCL positivo se hace cuando dicha proporción medida es significativamente mayor que dicha proporción media.

Estos y otros aspectos ventajosos y características de la invención pueden ser descritos en otra parte en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando los residuos de aminoácidos mutados se indicados como "Mutante 1", "Mutante 2", "Mutante 3" y "Mutante 6", que dio como resultado (en diferentes combinaciones) en la pérdida del enlace por anticuerpos La figura 2 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 1", "Mutante 2" y "Mutante 3", los mutantes 1, 2 y 6 resultantes (en diferentes combinaciones ) en pérdida de enlaces de anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5 y 13H1, con sombreado de residuos adyacentes a los residuos (F9, Sil, P14, F34 y/o S140 adyacentes al mutante 2, y G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 y/o H68 adyacente al mutante 1).

La Figura 3 muestra una vista de cada cara del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 6", que resultó en la pérdida del enlace por el anticuerpo 5H1, con "Mutante 3" que no resultó en la pérdida del enlace mostrado. También lo que se muestra sombreado son residuos adyacentes a los residuos adyacentes al mutante 6 que también puede ser enlazado por los anticuerpos (K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 y/o A87).

La figura 4 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio D2 (enlace D1/D2), que muestra los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 14" a los que los anticuerpos 1C3 y 20E9 pierden el enlace, y "Mutante 12" y "Mutante 17", a los cuales no causó pérdida de enlace de anticuerpos; también se muestran en sombreado residuos adyacentes a los residuos (Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 y/o T254 adyacentes al mutante 14).

La Figura 5 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio D2 (enlace D1/D2), que muestra los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 15" a los que el anticuerpo 20E9 perdió el enlace; también se muestra en sombreado residuos adyacentes a los residuos (D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 y/o P280) adyacentes al mutante 14).

La Figura 6 muestra la capacidad de los anticuerpos para mediar CDC; mAb anti-KIR3DL2 que se enlazan al dominio DO están en gris, los que se enlazan al dominio DI están en negro, lo que demuestra que con los anticuerpos mAbs murinas de los padres, el isotipo del mAb tiene la influencia más prominente en los CDC.

La Figura 7 muestra que la internalización de KIR3DL2 tras el enlace anula totalmente la capacidad de mol9Hl2 para matar B221-KIR3DL2 con el reclutamiento del complemento, mientras que en condiciones de temperatura que limitan la internalización, la actividad CDC de mol9H12 se observa claramente.

La Figura 8 muestra la capacidad de mAbs anti-KIR3DL2 quiméricos para mediar CDC contra B221-KIR3DL2 in vitro.

La Figura 9 muestra la capacidad de una serie de mAbs anti-KIR3DL2, probada a la misma concentración final (10 pg/ml), para matar la linea celular HUT78 de la Sezary prototipica a través de un mecanismo de ADCC mediado.

La Figura 10 muestra la capacidad de mAbs anti-KIR3DL2 para la muerte mediada por ADCC de las células B221 transfectadas por KIR3DL2. Los mAbs mostrados en gris inducen la internalización del receptor y parecen ser menos eficientes que los otros 4 mAbs que no inducen la internalización KIR3DL2.

La Figura 11 muestra una comparación de anticuerpos en un experimento de rango de dosis de la capacidad de la HuIgGl quimerizada mAbs anti-KIR3DL2 para mediar ADCC contra objetivos B221 que expresan KIR3DL2.

La Figura 12 muestra los resultados de un experimento (n=6 ratones NOD-SCID por grupo) en donde la eficacia del isotipo murina 3 IgG2b anti-KIR3DL2 9E10 y 19hl2 fue probado contra xenoinjertos de SC-B221-KIR3DL2. Sin internalización 9E10 de anticuerpo anti-DO mostró una mayor supervivencia en comparación tanto con PBS y la internalización de anticuerpos 19hl2 anti-Dl.

La Figura 13 muestra los resultados de otro experimento (n=6 ratones NOD SCID por grupo) en donde la eficacia de 19hl2 anti-KIR3DL2 murina se probó frente a xenoinjertos SC RAJI-KIR3DL2. In vitro, células Raji transfectadas por KIR3DL2 mostraron menos internalización sobre mAb enlazadas que B221-KIR3DL2 o líneas de células de Sézary. En el modelo de xenoinjerto RAJI-KIR3DL2, mol9H12 mAb fue más eficiente que en el modelo B221-KIR3DL2. Esto es debido al menos a la potente internalización de la diana in vivo.

La figura 14 muestra anticuerpos de dominio DO KIR3DL2 inhibiendo enlaces HLA-A3 y dímeros B27 de cadena pesada (B272). FACS representativos de tinción muestran el efecto de anticuerpos anti-KIR3DL2 DO sobre HLA-A3 y tetrámeros B272 enlazados a las células Baf3 transducidas por KIR3DL2. (Representativo de 1 de tres experimentos independientes).

La figura 15 muestra anticuerpos de dominio KIR3DL2 anti-Dl y anti-D2 (anticuerpo 1C3) inhibiendo el enlace HLA-A3 pero no al dimero B27 de cadena pesada (B272). FACS representativos de tinción muestran el efecto de anticuerpos KIR3DL2 D1/D2 sobre enlaces de HLA-A3 y tetrámero B272 a las células Baf3 transducidas por KIR3DL2. (Representativo de 1 de tres experimentos independientes).

La figura 16A muestra anticuerpos de dominio KIR3DL2 DO inhibiendo enlaces HLA-A3 y de tetrámero dímero de cadena pesada B27. La Figura 16B. mAb del dominio Anti-D2 (1C3) inhibiendo enlaces de tetrámero de HLA-A3 pero no de dímero de cadena pesada B27 (B272). Los resultados se expresan como % de la tinción de tetrámero, en presencia de mAb de control de isotipo.

La Figura 17 muestra anticuerpos de dominio KIR3DL2 DO pero no anticuerpos del dominio D1/D2 inhibiendo la secreción de IL-2 por el reportero celular CD3e KIR3DL2 estimulado con HLA-B27 que expresan lineas celulares B (221B27). Anticuerpos DO inhiben la producción de IL-2 por los reporteros celulares estimuladas con lineas de células B que expresan el control de HLA de clase 1 en un grado menor en comparación con las células estimuladas con HLA-B27. ELISA representativos para la producción de IL-2 a partir de uno de los tres experimentos independientes.

La Figura 18 muestra una vista del alelo de polipéptido KIR3DL2 *001, incluyendo el sitio de enlace del anticuerpo correspondiente al utante 2 que tiene sustituciones I60N y G62S dentro del dominio DO (por ejemplo, sitio de enlace para los anticuerpos 2B12, 10F6, 18C10, 10G5 y 13H1). También se muestra en la figura diferencias de aminoácidos entre alelo KIR3DL2 *001 y *002, *004, *006/*007, *008 y *009 alelos.

La Figura 19 muestra una vista alternativa del alelo polipéptido KIR3DL2 *001, incluyendo el sitio de enlace del anticuerpo correspondiente al mutante 2 que tiene sustituciones I60N y G62S dentro del dominio DO. También se muestra en la figura diferencias de aminoácidos entre alelo KIR3DL2 *001 y *005 y *003/*011 alelos.

La Figura 20 muestra dos vistas alternativas (anverso y reverso) del alelo de polipéptido KIR3DL2 *001, incluyendo el sitio de enlace del anticuerpo correspondiente al mutante 2 que tiene sustituciones I60N y G62S dentro del dominio DO. También se muestra en la figura diferencias de aminoácidos entre alelo KIR3DL2 *001 y *004 alelo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción Los anticuerpos de la invención son capaces de dirigir directa y específicamente células que expresan KIR3DL2, en particular CD4+, células T KIR3DL2t, sin dirigirse a otras células, tales como células KIR3DL1+ (o células KIR3DL2+ KIR3DL1+, células KIR3DS1+; o células KIR3DS1 KIR3DL2 +), y no internalizan en células KIR3DL2+. También se proporcionan anticuerpos que inhiben o no el enlace de ligandos naturales de KIR3DL2 (o señalizan KIR3DL2 inducida por ligandos). La invención proporciona un número de anticuerpos que tienen tales propiedades, y que compiten entre sí por el enlace a una región de KIR3DL2+ que incluye dominios 0 y 2 definidos por residuos de aminoácidos 1-98 y residuos 193-292, respectivamente, de polipéptidos KIR3DL2 maduros de SEQ ID NO: 1.

KIR3DL2 (CDl58k) es un homodimero enlazado por disulfuro de tres moléculas del dominio Ig de aproximadamente 140 kD, que se describen en Pende et al. (1996) J. Exp. Med.184:505-518, cuya descripción se incorpora aquí por referencia. KIR3DL1 (CD158el) es una molécula monomérica de aproximadamente 70 kD, que se describe en Colonna y Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408; el lugar de enlace del HLA se ha descrito en Vivían et al. (2011) Nature 479: 401-405. Ligandos naturales de KIR3DL2 incluyen, entre otros, polipéptidos HLA-A y HLA-B, en particular HLA-A3 y HLA-All (ver Hansasuta et al (2004) Eur J. Immunol 34:1673-1679 y HLA-B27. HLA-B27 (ver, por ejemplo, Weiss et al (1985) Imunobiology 170 (5):367-380 para la organización, secuencia y expresión del gen HLA-B27, y para multímeros de HLA-B27 y homodímeros de HLA-B272 ver Alien et al. (1999) J. Immunol 162:5045-5048 y Kollnberger et al. (2007) Eur J. Immunol 37:1313-1322. La descripción de todas las referencias anteriores se incorporan aquí por referencia. Como se usa aquí, "KIR3D" se refiere a cualquier receptor KIR3D (por ejemplo, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DS1) individual o colectivamente, y el término "KIR3D" puede ser sustituido por el término "KIR3DL1, KIR3DL2 y/o KIR3DS1". Del mismo modo, "KIR3DL" se refiere a cualquier receptor KIR3DL (por ejemplo, KIR3DL1, KIR3DL2) individual o colectivamente, y el término "KIR3DL" puede ser sustituido por el término "KIR3DL1 y/o KIR3DL2". Los términos "KIR3D", "KIR3DL", "KIR3DL1", "KIR3DL2", "KIR3DS1" cada uno incluye además cualquier variante, derivado o isoforma del gen KIR3D o codificada proteína(s) a las que se refiere. Varias variantes alélicas se han reportado para polipéptidos KIR3D (por ejemplo KIR3DL2), cada una de ellas están comprendidos por los respectivos términos. La secuencia de aminoácidos de la KIR3DL2 humana madura (alelo *002) se muestra en SEQ ID NO: 1, correspondiente a GenBank adhesión no. AAB52520 en donde la secuencia lider de residuos de 21 aminoácidos se ha omitido, y corresponde a la base de datos IPD KIR (publicado por el EMBL-EBI, Instituto Europeo de Bioinformática, Reino Unido) adhesión no. KIR00066. El ADNc de KIR3DL2 (alelo *002) se muestra en GenBank adhesión no. U30272. La secuencia de aminoácidos precursora (incluyendo la secuencia lider) de un alelo KIR3DL2 humano *002 se muestra en SEQ ID NO: 159, correspondiente a GenBank adhesión no. AAB52520. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *001 se muestra en SEQ ID NO: 160, correspondiente a la base de datos IPD KIR adhesión no. KIR00065. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *003 se muestra en SEQ ID NO: 161, correspondiente a GenBank adhesión no. AAB36593 y base de datos IPD KIR adhesión no. KIR00067. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *004 se muestra en SEQ ID NO: 162, correspondiente a la base de datos IPD KIR adhesión de no. KIR00068. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *005 se muestra en SEQ ID NO: 163, correspondiente a la base de datos IPD KIR adhesión no.

KIR00069. La secuencia de aminoácidos de un alelo humano KIR3DL2 *006 (madura) se muestra en SEQ ID NO: 164, correspondiente a GenBank adhesión no. AAK30053 y base de datos IPD KIR adhesión· no. KIR00070. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *007 (madura) se muestra en SEQ ID NO: 165, correspondiente a GenBank adhesión no. AAK30052 y base de datos IPD KIR adhesión no.

KIR00071.The secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *008 se muestra en SEQ ID NO: 166, correspondientes a GenBank adhesión no. AAK30054 y base de datos IPD KIR adhesión no. KIR00072. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *009 se muestra en SEQ ID NO: 167, correspondiente a la base de datos IPD KIR adhesión no.

KIR00457. La secuencia de aminoácidos de un alelo KIR3DL2 humano *011 se muestra en SEQ ID NO: 168, correspondiente a la base de datos IPD KIR adhesión no. KIR00544. El ADNc que codifica un polipéptido KIR3DL1 (CD158e2) (alelo *00101) se muestra en GenBank adhesión no. L41269; la secuencia de aminoácidos codificada se muestra en la SEQ ID NO: 169, correspondiente a GenBank adhesión no. AA?69870. Cuando una secuencia líder está presente en una en particular SEQ ID NO describiendo una secuencia de polipéptido KIR3DL2 (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1 y 159 a 168), cualquier referencia a las posiciones de residuos de aminoácidos en el presente documento será al polipéptido maduro KIR3DL.

Se proporcionan métodos para usar los compuestos que enlazan a antígenos; por ejemplo, un método para inhibir la proliferación o la actividad de las células, para la entrega de una molécula dentro de una célula (por ejemplo, una molécula tóxica, un marcador detectadle, etc.), para la marcar, identificar o purificar una célula, para agotar, matar o eliminar una célula , para la reducir la proliferación celular, el método comprende exponer una célula, tal como una célula T que expresa un polipéptido KIR3DL, a un compuesto que enlaza al antigeno de la invención que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2. Se apreciará que para los propósitos de la presente invención, "proliferación celular" puede referirse a cualquier aspecto del crecimiento o proliferación de células, por ejemplo, el crecimiento celular, la división celular, o cualquier otro aspecto del ciclo celular. La célula puede estar en cultivo celular (in vitro) o en un mamífero (in vivo), por ejemplo, un mamífero que padece una patología que expresan KIR3DL2. También se proporciona un método para inducir la muerte de una célula o inhibir la proliferación o la actividad de una célula que expresa un polipéptido KIR3DL2, que comprende exponer la célula a un compuesto que enlaza al antígeno que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2 ligado a un agente tóxico, en una cantidad efectiva para inducir la muerte y/o inhibir la proliferación de la célula. Por lo tanto, se proporciona un método para el tratamiento de un mamífero que padece una enfermedad proliferativa, y cualquier condición que se caracteriza por una expansión patógena o activación de células que expresan un polipéptido de KIR3DL2, el método comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que se enlaza al antígeno descrito en este documento al mamífero. Ejemplos de tales condiciones incluyen el síndrome de Sezary, micosis fungoide, CTCL, y condiciones autoinmunes o inflamatorias, por ejemplo, artritis, enfermedad cardiovascular. Preferiblemente, tales células expandidas patogénicamente que expresan KIR3DL2 pero no expresan prominente KIR3DL1 (por ejemplo, no más de 20%, 40%, 50% o 60% de las células patógenas expresan KIR3DL1), estas condiciones se benefician particularmente de anticuerpos selectivos .

Varios trastornos que expresan KIR3DL2, particularmente trastornos mediadas por células T y NK se pueden tratar o diagnosticar con ayuda de los métodos y composiciones de la invención. Los trastornos pueden ser, por ejemplo, tumores malignos de células T CD4+ como CTCL, MF o SS, o trastornos autoinmunes o inflamatorias donde la eliminación o inhibición de la actividad y/o la proliferación de células T y/o NK seria útil. Células T CD4+ incluyen, por ejemplo células T CD4+ activadas, células Thl7 T, células T CD4+ que expresan o no uno o más de otros marcadores (por ejemplo, CD2+, CD3+, CD5+, CD8-, CD28+, CD28-, CD45RO+ y TCRap+). Células T-CD4+CD28, por ejemplo, son conocidos por ser capaces de expresar KIR3DL2 y están presentes en altas frecuencias de células clónales expandidas en algunos trastornos autoinmunes e inflamatorios, pero son raros en individuos sanos. Estas células T pueden ser citotóxicas, secretan grandes cantidades de IFN-gam a, y proliferan a la estimulación con células mononucleares adherentes autólogas.

Los anticuerpos de la invención tienen la ventaja de enlazar a través de diferentes alelos KIR3DL2 que permiten un amplio uso para tratar, caracterizar y diagnosticar enfermedades. Células MF/SS cutáneas y que circulan, se ha reportado que no expresan alelos preferenciales entre nueve alelos KIR3DL2 probados. Trece alelos también se han descrito hasta la fecha. Mientras que el receptor pl40-KIR3DL2 se expresa en un subconjunto menor de las células NK y en raras células T CD8 + en personas sanas, que parece estar restringido a los tumores CTCL de células T CD4+ en los pacientes de MF/SS. Otros receptores que normalmente se observan en la superficie de las células NK (tales como p58.1, p58.2, p70KIRs, CD94/NKG2A) no se encuentran en la superficie de células malignas T CD4+ (Bahler D.W. et al., (2008) Cytometry B Clin Cytom 74(3):156-62). Células SS también se caracterizan típicamente, además de CD4+, por tener un fenotipo maduro de linfocitos T, CD2+, CD3+, CD5+, CD8-, CD28+, CD45RO+ y + TCR ab+.

Los métodos y composiciones de la invención pueden usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias caracterizadas por la expresión de KIR3DL2, mediante la eliminación de células que expresan KIR3DL2 y/o mediante la inhibición de las células que expresan KIR3DL2 de actividad biológica (es decir, mediante el bloqueo de la señalización KIR3DL2 inducida por sus ligandos naturales). La inhibición de la actividad biológica de células que expresan KIR3DL2 pueden comprender, por ejemplo, la disminución de la proliferación de las células que expresan KIR3DL2, la disminución de la reactividad o la citotoxicidad de las células que expresan KIR3DL2 hacia las células diana, la disminución de la activación, marcadores de activación (por ejemplo, expresión CD107) y/o la producción de citoquinas (por ejemplo, la producción IFN g) por una célula que expresa KIR3DL2, y/o disminuyendo la frecuencia in vivo de tales activadas, reactivas, citotóxicas y/o células que expresan KIR3DL2 activadas.

Por ejemplo, se ha demostrado que varios de estos trastornos están mediados al menos en parte por las células T CD4+, incluyendo las células T CD4+CD28null particulares. La activación de las células T CD4+ se piensa generalmente es gobernada por la interacción entre los receptores estimuladores e inhibidores, donde el predominio de señales estimuladoras favorece las reacciones autoinmunes. Chan et al. ((2005) Arthrit. Rheumatism 52(11): 3586-3595 reporta que el aumento del número de sangre periférica y células T CD4+ de liquido sinovial y células NK que expresan KIR3DL2 en espondiloartritis en pacientes con artritis reumatoide, la expresión de la molécula coestimuladora critica, CD28, se pierde con frecuencia. En su lugar, una población de células T CD4+ que carece de CD28 (células T CD4+CD28), los receptores de tipo inmunoglobulina asesinas expreso (KIRs). Células T CD4+CD28nu11 en particular se han reportado para expresar polipéptidos KIR3D. En comparación con su contraparte CD28+, las células CD4+CD28 producen niveles significativamente más altos de IFN -g, dándoles la capacidad de funcionar como células proinflamatorias, células clones T CD4+CD28null persisten durante años en circulación. Estas células T son conocidas por diferir de las células T CD28+ por ser resistentes a la apoptosis mediada por Fas sobre la reticulación de células CD3. Células T CD28null progresan a través del ciclo celular, y las células en todas las etapas del ciclo celular son resistentes a la apoptosis, a diferencia de su homólogo CD28+. La desregulación de las vías de apoptosis en las células T CD4+CD28null se ha demostrado favorecen su excreción clonal y el mantenimiento in vivo. Namekawa et al. ((2000) J. Immunol 165:1138-1145 reporta que KIR, incluyendo KIR3DL2, estuvo presente en las células T CD4+CD28null expandidas en la artritis reumatoide. La artritis reumatoide implica infiltrados de linfocitos, mediadores de la inflamación, y la hiperplasia sinovial resultantes de la proliferación agresiva de sinoviocitos tipo fibroblasto y macrófagos. Pronósticos de erosiones articulares y gravedad de la enfermedad se correlacionan con altas frecuencias de las células clónales T CD4+CD28-.

Lamprecht et al. (2001) Thorax 56:751-757 reporta reclutamiento de las células T CD4+CD28- en granulomatosis de Wegener. Markovic-Plese et al. (2001) J Clin Invest. 108: 1185-1194 se reporta la presencia de células T CD4+CD28- independiente de coestimulación de células T en el CNS, y su asociado con la esclerosis múltiple. Los métodos y composiciones por lo tanto, pueden ser utilizados en el tratamiento o prevención de la granulomatosis de Wegener, la esclerosis múltiple u otros trastornos inflamatorios o autoinmunes del sistema nervioso central, artritis u otros trastornos reumáticos caracterizadas por inflamación.

Células T CD4+CD28- también se han asociado con trastornos cardiovasculares. Betjes et al. (2008) Kidncy International 74, 760-767 reporta que el mayor riesgo de enfermedad aterosclerótica en pacientes con citomegalovirus (CMV) la seropositividad es asociada con un aumento dependiente de la edad de las células T CD4+CD28-, que puede comprender más de la mitad de las células T CD4 circulantes en individuos. Se informa que los pacientes mayores de 50 años de edad tienen un porcentaje 50 veces mayor de células V CD4+CD28- en comparación con los pacientes seronegativos CMV y un 5 veces mayor porcentaje en comparación con los controles sanos seropositivos. Nakajima et al. ((2003) Circ. Res. 93:106-113) reporta la expresión de novo de KIR en el síndrome coronario agudo, donde las células T CD4+ de los pacientes con síndrome coronario agudo (ACS) expresan múltiples KIR mientras que las células T CD4+CD28null normales de donantes saludables no expresan KIR. Yen et al.

Journal of Experimental Medicine, Volume 193, Number 10, 21 de mayo 20011159-68 estudió clones de células T CD4+CD28null establecidas a partir de pacientes con vasculitis reumatoide para la expresión de KIR inhibitoria y estimulante por RT-PCR. En pacientes con artritis reumatoide y un paciente con ACS, los patrones de expresión favorecieron el inhibidor KIR, incluyendo KIR3DL2, mientras que la expresión de los receptores estimulantes fue altamente restringida a KIR2DS2. Por tanto, los métodos y composiciones se pueden usar en el tratamiento o prevención de los trastornos cardiovasculares, por ejemplo, ACS, enfermedad aterosclerótica, vasculitis reumatoide, caracterizada por la inflamación.

Bowness et al (2011) J. Immunol.186:2672-2680 reporta que las células T CD4+KIR3DL2 representan la mayoría de la expresión IL-23R de sangre periférica por las células T CD4, y que tales células KIR3DL2+ del tipo Thl7 producen más IL-17 en presencia de IL-23. A pesar de que las células KIR3DL2+ comprenden una media de sólo el 15% de T CD4 en la sangre periférica de pacientes con SpA, este subconjunto representó el 70% del aumento observado en el número de Thl7 en pacientes con SpA en comparación con los sujetos control. Sangre periférica con TCR estimulada en líneas de células T KIR3DL2+CD4 de pacientes SpA secretaron 4 veces más IL-17 que líneas KIR3DL2+ de controles o células T CD4-KIR3DL2.

Se proporcionan métodos para producir y usar anticuerpos y otros compuestos adecuados para el tratamiento de trastornos (por ejemplo, cánceres, trastornos inflamatorios y autoinmunes), donde la eliminación de células que expresan KIR3DL2 seria útil. Los anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y la producción de células ellos están englobados, como lo son métodos de producción de la misma y métodos de tratamiento de pacientes que utilizan los anticuerpos y compuestos.

Dado que los presentes anticuerpos son específicos para KIR3DL2, pueden ser utilizados para una variedad de propósitos, incluyendo purificación de KIR3DL2 o células que expresan KIR3DL2, modulando (por ejemplo, la activación o inhibición) de receptores KIR3DL2 in vitro, ex vivo o in vivo, orientando células que expresan KIR3DL2 para la destrucción in vivo, o específicamente etiquetado/enlazando KIR3DL2 in vivo, ex vivo, o in vitro, incluyendo para métodos tales como inmunotransferencía, análisis IHC, es decir, en las biopsías congeladas, análisis de FACS, e inmunoprecipitación.

DEFINICIONES Tal como se utiliza en la descripción, "un" o "una" puede significar uno o más. Tal como se utiliza en la reivindicación(es), cuando se utiliza junto con la palabra "comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.

Cuando "que comprende" se utiliza, este puede ser sustituido preferentemente por "consiste esencialmente en", más preferiblemente por "consiste en".

"Tratamiento de una enfermedad proliferativa" o "tratamiento de un tumor", o "tratamiento del cáncer" o similar, con referencia al agente de enlace anti-KIR3DL2 (por ejemplo, anticuerpos), incluye, pero no se limita a: (a) método de tratamiento de una enfermedad proliferativa, dicho método comprende la etapa de administrar (por lo menos un tratamiento) un agente de enlace anti-KIR3DL2, (por ejemplo, en un material portador farmacéuticamente aceptable) a un animal de sangre caliente, especialmente un ser humano, en necesidad de tal tratamiento, en una dosis que permite el tratamiento de dicha enfermedad (una cantidad terapéuticamente efectiva), por ejemplo, en una dosis (cantidad) como se especifica anteriormente y en el presente documento a continuación; (b) el uso de un agente que enlaza a un anti-KIR3DL2 para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, o un agente que enlaza anti-KIR3DL2, para su uso en dicho tratamiento (especialmente en un ser humano); (c) el uso de un agente que enlaza anti-KIR3DL2, para la fabricación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, un método para usar un agente que enlaza anti-KIR3DL2 para la fabricación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, que comprende mezclar un agente que enlaza anti-KIR3DL2 con un portador farmacéuticamente aceptable, o una preparación farmacéutica que comprende una dosis efectiva de un agente que enlaza anti-KIR3DL2 que es apropiada para el tratamiento de una enfermedad proliferativa; o (d) cualquier combinación de a), b) y e), de acuerdo con la materia permisible para las patentes en un pais donde se presente esta solicitud. En los casos en que una enfermedad en particular (por ejemplo, enfermedad inflamatoria o autoinmune) o un tumor especifico (por ejemplo CTCL) se mencionan en lugar de "enfermedad proliferativa", categorías a) a e) también se incluyen, lo que significa que la enfermedad respectiva se puede llenar en bajo a) hasta e) anterior en lugar de "enfermedad proliferativa", de acuerdo con la materia patentable.

Los términos "cáncer" y "tumor" como se usa en este documento se definen como un nuevo crecimiento de las células o tejidos que comprenden la multiplicación incontrolada y progresiva. En una modalidad especifica, en un curso natural del cáncer es fatal. En modalidades específicas, un cáncer es invasivo, metastásico, y/o anaplásico (pérdida de la diferenciación y de la orientación entre sí y su marco axial).

Trastornos "autoinmunes" incluyen cualquier trastorno, afección o enfermedad en la cual el sistema inmunológico monta una reacción contra células propias o tejidos, debido a una avería en la capacidad de distinguir lo propio de lo no propio o de otra manera. Ejemplos de trastornos autoinmunes incluyen artritis reumatoide, vascularitis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, granulomatosa de Wegener, espondiloartritis, y otros. Un "trastorno inflamatorio" incluye cualquier trastorno caracterizado por una respuesta inmune no deseada. Trastornos autoinmunes e inflamatorios pueden afectar a cualquier componente del sistema inmune, y pueden dirigirse a cualquier tipo de célula o tejido en el cuerpo.

El término "biopsia" como se usa en el presente documento se define como la remoción de un tejido de un órgano (por ejemplo, una articulación) con el propósito de examinarlo, tal como para establecer el diagnóstico. Ejemplos de tipos de biopsias incluyen por aplicación de succión, tal como a través de una aguja unida a una jeringa; por eliminación instrumental de un fragmento de tejido; por la eliminación de los instrumentos apropiados a través de un endoscopio; mediante escisión quirúrgica, tal como de toda la lesión; y similares.

El término "anticuerpo", como se usa aquí, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de las cinco clases principales; IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Varias de éstas se dividen en subclases o isotipos, tales como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una "luz" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan "alfa", "delta", "epsilon", "gamma" y "mu", respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

IgG y/o IgM son las clases preferidas de anticuerpos empleados en el presente documento, con IgG siendo particularmente preferido, debido a que son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque son los más fáciles de hacer en un entorno de laboratorio. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Particularmente preferidos son los anticuerpos humanizados, quiméricos, humanos, o de lo contrario del hombre adecuado. Los "anticuerpos" también incluyen cualquier fragmento o derivado de cualquiera de los anticuerpos descritos aquí.

El término "enlaza específicamente a" significa que un anticuerpo puede enlazarse preferiblemente en un ensayo de enlace competitivo a la pareja de enlace, por ejemplo, KIR3DL2, tal como se evaluó utilizando cualquiera de las formas recombinantes de las proteínas, epítopos de las mismas, o proteínas nativas presentes en la superficie de las células diana aisladas. Ensayos de enlace competitivo y otros métodos para determinar el enlace especifico se describen adicionalmente más adelante y son bien conocidos en la téenica.

Cuando se dice que un anticuerpo "compite con" un anticuerpo monoclonal particular (por ejemplo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9), significa que el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal en ensayo de enlace, ya sea utilizando moléculas KIR3DL2 recombinantes o moléculas KIR3DL2 expresadas en la superficie. Por ejemplo, si un anticuerpo de ensayo reduce el enlace de 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9 a un polipéptido KIR3DL2 o una célula que expresa KIR3DL2 en un ensayo de enlace, el anticuerpo se dice que "compite" respectivamente con 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9.

El término "afinidad", como se usa aquí, significa la fuerza del enlace de un anticuerpo a un epitopo. La afinidad de un anticuerpo está dada por la constante de disociación Kd, definida como [AB]x[Ag]/[Ab-Ag], donde [Ab-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antigeno, [Ab] es la concentración molar del anticuerpo no enlazado y [Ag] es la concentración molar del antigeno no enlazado. La constante de afinidad Ka se define por 1/Kd. Ejemplos de métodos para determinar la afinidad de los mAb se pueden encontrar en Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Inmunology, Greene Publishing Assoc. y Wilcy Interscience, N.Y., (1992, 1993), y Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), cuyas referencias se incorporan en su totalidad en el presente documento por referencia. Uno de los métodos estándar bien conocidos en la téenica para determinar la afinidad de los mAb es el uso de resonancia de plas ón superficial (SPR) de detección (tal como por análisis con un dispositivo de análisis BIAcore ™ SPR).

Como se usa en este documento, un "determinante" designa un sitio de interacción o de enlace en un polipéptido.

El término "epitopo" se refiere a un determinante antigénico, y es la zona o región en un antigeno al que se enlaza un anticuerpo. Un epitopo de proteina puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en el enlace, asi como residuos de aminoácidos que están bloqueados efectivamente por el anticuerpo especifico de enlace a antigeno o péptido, es decir, residuos de aminoácidos dentro de la "huella" del anticuerpo. Es la forma más simple o área estructural más pequeña en una molécula de antigeno complejo que puede combinarse con, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor. Los epitopos pueden ser lineales o conformacionales/estructurales. El término "epitopo lineal" se define como un epitopo compuesto de residuos de aminoácidos que son contiguos en la secuencia lineal de aminoácidos (estructura primaria). El término "epitopo conformacional o estructural" se define como un epitopo compuesto de residuos de aminoácidos que no son todos contiguos y por lo tanto representan partes separadas de la secuencia lineal de aminoácidos que se ponen en proximidad entre si mediante el plegado de la molécula (estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias). Un epitopo conformacional es dependiente de la estructura tridimensional. El término "conformacional" es por lo tanto a menudo usada de forma intercambiable con "estructural".

El término "internalización intracelular", o "internalización" cuando se refiere a un polipéptido de KIR3DL2 y/o anticuerpo que se enlaza a dicha, se refiere a los eventos moleculares, bioquímicos y celulares asociados con el proceso de translocación de una molécula de la superficie extracelular de una célula a la superficie intracelular de una célula. Los procesos responsables de la internalización intracelular de moléculas son bien conocidos y pueden incluir, entre otras cosas, la internalización de moléculas extracelulares (tales como hormonas, anticuerpos y moléculas orgánicas pequeñas); moléculas asociadas a la membrana (tales como los receptores de la superficie celular); y complejos de moléculas asociadas a la membrana enlazados a moléculas extracelulares (por ejemplo, un ligando enlazado a un receptor de transmembrana o un anticuerpo enlazado a una molécula asociada a la membrana). Por lo tanto, "inducir y/o aumentar la internalización intracelular" comprende eventos en donde se inicia la internalización intracelular y/o se aumenta la velocidad y/o extensión de la internalización intracelular.

El término "agotar", con respecto a las células que expresan KIR3DL2 significa un proceso, método, o un compuesto que puede matar, eliminar, lisar o inducir tal matanza, la eliminación o lisis, a fin de afectar negativamente el número de células que expresan KIR3DL2 presentes en una muestra o en un sujeto.

El término "agente" se usa aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos. El término "agente terapéutico" se refiere a un agente que tiene actividad biológica.

Los términos "agente tóxico" y "agente citotóxico" abarcan cualquier compuesto que puede ralentizar, detener o revertir la proliferación de las células, disminuir su actividad en cualquier forma detectable, o directa o indirectamente matarlos. Preferiblemente, los agentes citotóxicos causan la muerte celular principalmente al interferir directamente con el funcionamiento de la célula, e incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, inhibidores del factor de necrosis tumoral, intercaladores, inhibidores de microtúbulos, inhibidores de quinasa, inhibidores del proteasoma y los inhibidores de la topoisomerasa. A "carga útil tóxica" tal como se utiliza aquí se refiere a una cantidad suficiente de agente citotóxico que, cuando se suministra a un célula resulta en la muerte celular. La entrega de una carga útil tóxica puede llevarse a cabo mediante la administración de una cantidad suficiente de inmunoconjugado que comprende un fragmento enlazado a anticuerpo o antigeno y un agente citotóxico. La entrega de una carga útil tóxica también puede llevarse a cabo mediante la administración de una cantidad suficiente de un inmunoconjugado que comprende un agente citotóxico, en donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo secundario o fragmento enlazado a antigeno de los mismos que reconoce y se enlaza a un fragmento de enlace a anticuerpo o antigeno.

A los efectos del presente documento, un anticuerpo "humanizado" o "humano" se refiere a un anticuerpo en donde la región marco constante y variable de una o más inmunoglobulinas humanas se fusiona con la región de enlace, por ejemplo, los CDR, de una inmunoglobulina animal. Tales anticuerpos están diseñados para mantener la especificidad de enlace del anticuerpo no humano del que se derivan las regiones de enlace, pero para evitar una reacción inmune contra el anticuerpo no humano. Tales anticuerpos pueden ser obtenidos a partir de ratones transgénicos u otros animales que han sido "logrados" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una estimulación antigénica (véase, por ejemplo, Green et al. (1994) Nature Genet 07:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int I un 6:579, la totalidad de las enseñanzas de las cuales se incorporan aquí por referencia). Un anticuerpo totalmente humano puede ser construido también mediante métodos de transfección genéticas o cromosómicas, así como la teenología de presentación en fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Los anticuerpos humanos también pueden ser generados in vitro de células B activadas (ver, por ejemplo, US Pat. Nos.5,567,610 y 5,229,275, que se incorporan en su totalidad por referencia).

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, sustituye o intercambiada para que el sitio de enlace al antígeno (región variable) está unido a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especies, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, está alterada, sustituida o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad de antigeno diferente o alterada.

Los términos "dominio Fe", "porción Fe" y "región Fe" se refieren a un fragmento C-terminal de una cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido (aa) 230 a aproximadamente aa 450 de humano g (gamma) de cadena pesada o su secuencia homologa en otros tipos de cadenas pesadas del anticuerpo (por ejemplo, OÍ, d, e y m para los anticuerpos humanos), o un alotipo de origen natural de los mismos. A menos que se especifique lo contrario, la numeración de aminoácido Kabat comúnmente aceptada para inmunoglobulinas se utiliza en toda esta invención (ver Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).

El término "citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células" o "ADCC" es un término bien entendido en la téenica, y se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no especificas que expresan receptores Fe (FcRs) reconocen el anticuerpo enlazado en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. Las células citotóxicas no especificas que median la ADCC incluyen células asesinas naturales (NK), macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentran en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando téenicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación se purifica sustancialmente.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de origen natural y polímero de aminoácido de origen no natural.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o la alteración de un ácido nucleico nativo o proteína, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa de la célula (no recombinante) o expresan genes nativos que se expresan anormalmente de otra forma, bajo expresado o no expresado en absoluto.

El término "modificación" cuando se refiere a una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, "modificación de aminoácidos"), se entiende una sustitución de aminoácido, inserción y/o eliminación en una secuencia de polipéptido. Por "modificación" o "modificación de aminoácidos" se quiere decir una sustitución de aminoácido, inserción y/o eliminación en una secuencia de polipéptido. Por "sustitución de aminoácido" o "sustitución" en el presente documento se entiende la sustitución de un aminoácido en una posición dada en una secuencia de proteina con otro aminoácido. Por ejemplo, los P14S de sustitución se refieren a una variante de un polipéptido padre, en donde la prolina en la posición 14 se sustituye con serina. Una "variante" de un polipéptido se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a un polipéptido de referencia, típicamente un polipéptido "padre" o nativo. La variante de polipéptido puede poseer uno o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos nativa .

Como se usa en la presente, "células T" se refiere a una subpoblación de linfocitos que maduran en el timo, y que muestran, entre otras moléculas de receptores de células T en su superficie. Las células T pueden ser identificadas en virtud de ciertas características y propiedades biológicas, tales como la expresión de antígenos de superficie específicos, incluyendo el TCR, CD4 o CD8, opcionalmente CD4 y IL-23R, la capacidad de ciertas células T para matar las células tumorales o infectadas, la capacidad de ciertas células T para activar otras células del sistema inmune, y la capacidad de liberar moléculas de proteina llamadas citoquinas que estimulan o inhiben la respuesta inmune. Cualquiera de estas características y actividades se pueden utilizar para identificar las células T, utilizando métodos bien conocidos en la téenica. Tal como se usa en el presente documento, las células T "activas" o "activadas" designan las células T biológicamente activas, más particularmente células T que tienen la capacidad de citolisis o de estimular una respuesta inmune mediante, por ejemplo, la secreción de citoquinas. Células activas se pueden detectar en cualquiera de una serie de métodos bien conocidos, incluyendo ensayos funcionales y los ensayos basados en la expresión, tales como la expresión de citocinas tales como TNF-alfa o IL-17A.

Como se usa aqui, el término anticuerpo que "se enlaza" a un polipéptido o epítopo designa un anticuerpo que se enlaza a dicho determinante con especificidad y/o afinidad.

ANTICUERPOS Y EPÍTOPOS Los anticuerpos descritos son anticuerpos que se enlazan a KIR3DL2 humano. En una modalidad, los anticuerpos se enlazan selectivamente a KIR3DL2 (por ejemplo, los 1, 2, 3, 4 o más alelos KIR3DL2 más predominantes) y no se enlazan a KIR3DL1 (por ejemplo, los 1, 2, 3, 4 o más alelos KIR3DL1 más predominantes). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan al dominio DO de KIR3DL2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 1-98 de los polipéptidos KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos se enlazan al dominio D2 de KIR3DL2, o a una región que abarca tanto los dominios DI y D2 (en la frontera de los dominios DI y D2), del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos tienen una afinidad por KIR3DL2 humano caracterizado por una KD de menos de 109 M, preferiblemente menos de 10_1° M.

En otra modalidad, los anticuerpos se enlazan sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9. En otra modalidad, los anticuerpos se superpone al menos parcialmente, o incluyen al menos un residuo en el segmento correspondiente a los residuos 1-98 o residuos 193-292 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO.: 1 (o una subsecuencia de la misma). En una modalidad, todos los residuos clave del epitopo están en un segmento correspondiente a los residuos 1-98. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza a un residuo presente en el dominio DI, asi como un residuo presente en el dominio D2; opcionalmente uno o más restos clave están en la frontera de los dominios DI (residuos 99-192) y D2 (residuos 193-292). En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos en el segmento correspondiente a los residuos 1-98, 99-292, 99-192, o 193-292 del polipéptido KIR3DL2 de la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, los residuos ligados por el anticuerpo están presentes en la superficie del polipéptido KIR3DL2.

En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos R13, A25, y/o Q27. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos R13, A25, y/o Q27, asi como restos 160 y/o G62. Opcionalmente, los anticuerpos no se enlazan a residuos H32 y/o H33. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan además a residuos Q56 y/o E57.

En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos 160 y/o G62.

Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende uno o más de los residuos 160 y/o G62, pero no los residuos R13, A25, y/o Q27.

En una modalidad, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende uno o más de los residuos 160 y/o G62, así como uno o más de los residuos de P14, S15 y/o H23. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de los residuos G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 y/o H68.

Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende uno o más de los residuos R78 y/o L82. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de los residuos de K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 y/o A87.

Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos W226. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de los residuos Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 y/o T254.

Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende uno o más de los residuos 1231 y/o R246. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos 1231 y/o R246, así como a un epitopo que comprende el residuo 226. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de residuos D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 y/o P280.

Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan a un epitopo que comprende los residuos E239. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan además a uno o más de los residuos 1231 y/o R246. Opcionalmente, los anticuerpos se enlazan además al residuo W226.

La sección de Ejemplos de este documento describe la construcción de una serie de polipéptidos KIR3DL2 humanos mutantes. El enlace del anticuerpo anti-KIR3DL2 a las células transíectadas con los mutantes KIR3DL2 se midió y comparó con la capacidad del anticuerpo anti-KIR3DL2 para enlazarse al polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). Una reducción en el enlace entre un anticuerpo anti-KIR3DL2 y un polipéptido KIR3DL2 mutante como se usa en este documento significa que hay una reducción en la afinidad de enlace (por ejemplo, tal como se mide por métodos conocidos tales como pruebas de FACS de células que expresan un mutante particular, o por medio de pruebas de Biacore del enlaces a polipéptidos mutantes) y/o una reducción en la capacidad de enlace total del anticuerpo anti-KIR3DL2 (por ejemplo, como se evidencia por una disminución en Bmax en una gráfica de concentración de anticuerpo anti-KIR3DL2 frente a la concentración de polipéptido). Una reducción significativa en el enlace ·indica que el residuo mutado está directamente implicado en el enlace al anticuerpo anti-KIR3DL2 o está en estrecha proximidad a la proteina de enlace cuando el anticuerpo anti-KIR3DL2 se enlaza a KIR3DL2. Un epitopo de anticuerpo incluirá asi preferiblemente tal residuo y puede incluir residuos adicionales adyacentes a dicho residuo.

En algunas modalidades, una reducción significativa en los enlaces significa que la afinidad y/o capacidad entre un anticuerpo anti-KIR3DL2 y un polipéptido KIR3DL2 mutante se reduce en más del 40%, más del 50%, más del 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90% o más del 95% en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje (por ejemplo, el polipéptido se muestra en la SEQ ID NO: 1). En ciertas modalidades, el enlace se reduce por debajo de los limites detectables. En algunas modalidades, una reducción significativa en el enlace es evidenciado cuando el enlace de un anticuerpo anti-KIR3DL2 a un polipéptido KIR3DL2 mutante es menor que 50% (por ejemplo, menor de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% o 10%) del enlace observado entre el anticuerpo anti-KIR3DL2 y el polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje (por ejemplo, el dominio extracelular mostrado en la SEQ ID NO: 1). Tales mediciones de enlace se pueden realizar utilizando una variedad de ensayos de enlace conocidos en la téenica. Un ejemplo específico de un ensayo de este tipo se describe en la sección de Ejemplos.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-KIR3DL2 se proporciona que presentan un enlace significativamente menor para un polipéptido KIR3DL2 mutante en donde un residuo en un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) se sustituye. En la notación abreviada utilizada en el presente, el formato es: residuo de tipo salvaje:Posición en el polipéptido:residuo mutante, con la numeración de los residuos como se indica en SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-KIR3DL2 se enlaza a un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje, pero ha disminuido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene una o más de las siguientes mutaciones (con referencia a SEQ ID NO: 1): R13W, A25T y/o G25R; I60N y/o G62S; P14S, S15A y/o H23S; uno o más de R13W, A25T y/o G25R, y uno o más de I60N y/o G62S; uno o más de P14S, S15A y/o H23S, y uno o más de I60N y/o G62S; uno o más de R13W, A25T y/o G25R, uno o más de I60N y/o G62S; y uno o más de P14S, S15A y/o H23S; uno o más de P14S, S15A y/o H23S, y uno o más de I60N y/o G62S; R78H y/o L82P; W226A; I231M y/o R246P; uno o más de I231M y/o R246P, y además, W226A; o uno o más de I231M y/o R246P, pero en donde el anticuerpo no tiene disminución del enlace a un mutante tiene una mutación en W226A.

Preferiblemente el enlace al mutante(es) particular(es) de KIR3DL2 se reduce significativamente en comparación con el enlace a la KIR3DL2 de tipo salvaje.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-KIR3DL2 Los anticuerpos pueden ser producidos por una variedad de téenicas conocidas en la técnica. Típicamente, se producen por inmunización de un animal no humano, preferiblemente un ratón, con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR3DL2, preferiblemente un polipéptido KIR3DL2 humano. El polipéptido KIR3DL2 puede comprender la secuencia de longitud completa de un polipéptido KIR3DL2 humano, o un fragmento o derivado del mismo, típicamente un fragmento inmunogénico, es decir, una porción del polipéptido que comprende un epítopo expuesto en la superficie de células que expresan un polipéptido KIR3DL2, preferiblemente el epitopo reconocido por el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9. Tales fragmentos contienen típicamente al menos aproximadamente 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de polipéptido maduro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos de las mismas. Los fragmentos típicamente son esencialmente derivados del dominio extracelular del receptor. En una modalidad, el inmunógeno comprende un polipéptido KIR3DL2 humano de tipo salvaje en una membrana lipídica, típicamente en la superficie de una célula. En una modalidad específica, el inmunógeno comprende células intactas, particularmente células humanas intactas, opcionalmente tratados o lisadas. En otra modalidad, el polipéptido es un polipéptido recombinante KIR3DL2. En una modalidad específica, el inmunógeno comprende células SS o MF intactas, células T CD4+ malignas humanas intactas, o células T CD4+CD28, opcionalmente tratada o lisadas. En otra modalidad, el polipéptido es un polipéptido KIR3DL2 dimérica recombinante.

La etapa de inmunizar un mamífero no humano con un antígeno, puede llevarse a cabo de cualquier manera bien conocida en la téenica para estimular la producción de anticuerpos en un ratón (ver, por ejemplo, E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (1988) toda la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia). El inmunógeno se suspende o se disuelve en un amortiguador, opcionalmente con un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo o incompleto. Los métodos para determinar la cantidad de inmunógeno, tipos de amortiguadores y cantidades de adyuvante son bien conocidos por los expertos en la téenica. Estos parámetros pueden ser diferentes para diferentes inmunógenos, pero se ha dilucidado fácilmente.

Del mismo modo, la ubicación y la frecuencia de la inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos es también conocida en la técnica. En un protocolo típico de la inmunización, los animales no humanos se inyectan por vía intraperitoneal con antígeno en el día 1 y de nuevo una semana más tarde. Esto es seguido por inyecciones de recuerdo del antígeno alrededor del día 20, opcionalmente con un adyuvante tal como el adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones de recuerdo se realizan por vía intravenosa y pueden repetirse durante varios días consecutivos. Esto es seguido por una inyección de refuerzo a los 40 días, ya sea por vía intravenosa o por vía intraperitoneal, típicamente sin adyuvante. Este protocolo da como resultado la producción de antígenos específicos de células B productoras de anticuerpos después de aproximadamente 40 dias. Otros protocolos también pueden usarse siempre que resulten en la producción de células B que expresan un anticuerpo dirigido contra el antigeno utilizado en la inmunización.

Para la preparación de anticuerpos policlonales, se obtiene suero de un animal no humano inmunizado y los anticuerpos presentes en el mismo aislado por téenicas bien conocidas. El suero puede ser purificado por afinidad utilizando cualquiera de los inmunógenos establecidos anteriormente unido a un soporte sólido para obtener anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos KIR3DL2.

En una modalidad alternativa, los linfocitos de un mamífero no inmunizado no humano se aíslan, se cultivan in vitro, y luego se exponen al inmunógeno en cultivo celular. Los linfocitos se recogieron a continuación y la etapa de fusión descrita a continuación se lleva a cabo.

Para los anticuerpos monoclonales, el siguiente paso es el aislamiento de esplenocitos del mamífero no humano y la posterior fusión de los esplenocitos con una célula inmortalizada con el fin de formar un hibridoma productor de anticuerpos. El aislamiento de esplenocitos de un mamífero no humano es bien conocido en la técnica y típicamente consiste en extraer el bazo de un mamífero no humano anestesiado, se corta en trozos pequeños y apretando los esplenocitos de la cápsula esplánica a través de una malla de nylon de un filtro de células en un amortiguador apropiado a fin de producir una única suspensión celular. Las células se lavan, se centrifugaron y se resuspenden en un amortiguador que lisa las células rojas de la sangre. La solución se centrifuga de nuevo y los linfocitos restantes en el sedimento se resuspenden finalmente en amortiguador fresco.

Una vez aislado y presente en suspensión de células individuales, los linfocitos se pueden fusionar a una linea celular inmortal. Esto es típicamente una línea celular de mieloma de ratón, aunque muchas otras líneas celulares inmortales útiles para la creación de hibridomas son conocidos en la téenica. Líneas de mieloma urina incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Cell Distribution Center, San Diego, U.S.A., X63 Ag8653 y las células SP-2 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. La fusión se efectúa utilizando polietilenglicol o similar. Los hibridomas resultantes se cultivan en medio selectivo que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridoraas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), tales sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Los hibridomas se cultivan normalmente sobre una capa de alimentación de macrófagos. Los macrófagos son preferiblemente de compañeros de camada del mamífero no humano usado para aislar esplenocitos y típicamente están preparados con adyuvante incompleto de Freund o similares varios días antes de chapado los hibridomas. Los métodos de fusión se describen en Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice," pp.59-103 (Academic Press, 1986), cuya descripción se incorpora aquí por referencia.

Las células se dejan crecer en el medio de selección durante un tiempo suficiente para la formación de colonias y la producción de anticuerpos. Esto es generalmente entre aproximadamente 7 y aproximadamente 14 días.

Las colonias de hibridoma son entonces ensayadas para la producción de anticuerpos que se enlazan específicamente a los productos génicos de polipéptido KIR3DL2, opcionalmente el epítopo reconocido específicamente por el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9. El ensayo es típicamente un ensayo de tipo ELISA colorimétrico, aunque cualquier ensayo se puede emplear, que se pueda adaptar a los pocilios en los que se cultivan los hibridomas. Otros ensayos incluyen radioinmunoensayos o clasificación de células activadas por fluorescencia. Los pocilios positivos para la producción del anticuerpo deseado se examinan para determinar si uno o más colonias distintas están presentes. Si más de una colonia está presente, las células se pueden volver a clonar y se cultivaron para asegurar que sólo una sola célula ha dado lugar a la producción de la colonia del anticuerpo deseado.

Los hibridomas que se confirman para producir un anticuerpo monoclonal adecuado se pueden cultivar en grandes cantidades en un medio apropiado, tal como DMEM o RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Después de un crecimiento suficiente para producir el anticuerpo monoclonal deseado, el medio de crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal (o el fluido de ascitis) se separa lejos de las células y el anticuerpo monoclonal presente en el mismo se purifica. La purificación se logra típicamente por electroforesis en gel, diálisis, cromatografía usando proteína A o proteína G-Sepharose, o un anti-Ig de ratón unido a un soporte sólido tal como agarosa o perlas de Sepharose (todos descritos, por ejemplo, en Antíbody Purification Handbook, Biosciences, publicación No. 18-1037-46, Edición AC, cuya descripción se incorpora aquí por referencia). El anticuerpo unido se eluye típicamente en columnas de proteína A/proteína G mediante el uso de amortiguadores de pH bajo (amortiguadores de glicina o acetato de pH 3.0 o menos) con la neutralización inmediata de las fracciones que contienen anticuerpos. Estas fracciones se agrupan, dializan y concentran, según sea necesario.

Los pocilios positivos con una sola colonia aparente típicamente se volvieron a clonar y re-ensayaron para asegurar sólo un anticuerpo monoclonal que se está detectando y produciendo.

Los anticuerpos también pueden ser producidos por selección de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas, como se describe por ejemplo en (ard et al. Nature, 341 (1989) p. 544, toda la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia).

La identificación de uno o más anticuerpos que se enlaza (n) a KIR3DL2, en particular sustancialmente o esencialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, se puede determinar fácilmente utilizando uno cualquiera de una variedad de ensayos de cribado inmunológicos en los que la competencia de anticuerpos se puede evaluar. Muchos de estos ensayos se practican de forma rutinaria y son bien conocidos en la téenica (ver, por ejemplo, US Pat. No.5,660,827, que se incorpora específicamente en este documento por referencia). Se entenderá que la determinar actualmente el epítopo al que un anticuerpo descrito en el presente documento se enlaza no es en modo alguno necesario para identificar un anticuerpo que se enlaza al mismo o sustancialmente al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal descrito aquí.

Por ejemplo, cuando los anticuerpos de prueba a examinar se obtienen de diferentes animales de origen, o son incluso de un isotipo de Ig diferente, un ensayo de competición simple puede ser empleado en la que el control (10F6, por ejemplo para fines de ilustración, o cualquier otro anticuerpo tal como 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9) y los anticuerpos de prueba se mezclan (o pre adsorben) y se aplican a una muestra que contiene polipéptidos KIR3DL2. Protocolos basados en el Western Blot y el uso del análisis BIACORE son adecuados para uso en tales estudies de competición.

En ciertas modalidades, una pre-mezcla de los anticuerpos de control (10F6, por ejemplo, aunque cualquier otro de anticuerpos) con cantidades variables de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, aproximadamente 01:10 o aproximadamente 1: 100) durante un período de tiempo antes de aplicar a la muestra de antígeno KIR3DL2. En otras modalidades, las cantidades· de control y variables de anticuerpos de prueba simplemente se pueden mezclar durante la exposición a la muestra de antigeno de KIR3DL2. Mientras uno pueda distinguir unido de anticuerpos libres (por ejemplo, mediante el uso de téenicas de separación o lavado para eliminar los anticuerpos no unidos) y (10F6 de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos secundarios específicos de la especie o isotipo específicas o mediante el etiquetado específicamente 10F6 con un marcador detectable) se puede determinar si los anticuerpos de prueba reducen el enlace de 10F6 a los antígenos, lo que indica que el anticuerpo de ensayo reconoce sustancialmente el mismo epitopo que 10F6. El enlace de los anticuerpos de control (marcados) en ausencia de un completamente irrelevante anticuerpo puede servir como el alto valor de control. El valor bajo de control se puede conseguir mediante la incubación de los anticuerpos marcados (10F6) con anticuerpos no marcados de exactamente el mismo tipo (10F6), donde se produciría la competencia y se reduce el enlace de los anticuerpos marcados. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epitopo, es decir, uno que "reacciona de forma cruzada" o compite con el anticuerpo marcado (10F6). Cualquier anticuerpo de ensayo que reduce el enlace de antigenos KIR3DL2 a 10F6 en al menos aproximadamente 50%, tal como al menos aproximadamente 60%, o más preferiblemente al menos aproximadamente 80% o 90% (por ejemplo, aproximadamente 65-100%), en cualquier proporción de 10F6:anticuerpo de prueba entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100 se considera que es un anticuerpo que se enlaza a sustancialmente al mismo epitopo o determinante como 10F6. Preferiblemente, dicho anticuerpo de ensayo reducirá el enlace de 10F6 al antigeno KIR3DL2 en al menos aproximadamente 90% (por ejemplo, aproximadamente 95%).

La competencia también se puede evaluar mediante, por ejemplo, un ensayo de citometria de flujo. En tal prueba, las células que llevan un polipéptido KIR3DL2 dado pueden incubarse primero con 10F6, por ejemplo, y luego con el anticuerpo de ensayo marcado con un fluorocromo o biotina. El anticuerpo se dice que compite con 10F6 si el enlace obtenido tras la preincubación con una cantidad saturante de 10F6 es de aproximadamente 80%, preferiblemente de aproximadamente 50%, aproximadamente el 40% o menos (por ejemplo, aproximadamente 30%, 20% o 10%) de la de enlace (medida por medio de fluorescencia) obtenida por el anticuerpo sin preincubación con 10F6. Alternativamente, un anticuerpo se dice que compite con 10F6 si el enlace obtenido con un anticuerpo 10F6 marcado (por un fluorocromo o biotina) en células preincubadas con una cantidad saturante de anticuerpo de prueba es de aproximadamente 80%, preferiblemente de aproximadamente 50%, aproximadamente el 40%, o menos (por ejemplo, aproximadamente 30%, 20% o 10%) del enlace obtenido sin preincubación con el anticuerpo de prueba.

Un ensayo de competición simple en donde un anticuerpo de prueba es pre-adsorbido y aplicado a la concentración de saturación a una superficie sobre la cual un antigeno KIR3DL2 se inmoviliza también se pueden emplear. La superficie en el ensayo de competición simple es preferentemente un chip BIACORE (u otros medios adecuados para el análisis de resonancia de plasmón superficial). El anticuerpo de control (por ejemplo, 10F6) se pone entonces en contacto con la superficie a una concentración de saturación de la KIR3DL2 y la KIR3DL2 y el enlace de la superficie del anticuerpo de control se mide. Este enlace del anticuerpo de control se compara con el enlace del anticuerpo de control a la superficie que contiene KIR3DL2 en ausencia de anticuerpo de ensayo. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en el enlace de la superficie que contiene KIR3DL2 por el anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba indica que el anticuerpo de ensayo reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo de control tal que el anticuerpo de prueba "reacciona de forma cruzada" con el anticuerpo de control. Cualquier anticuerpo de ensayo que reduce el enlace del control anticuerpo (tales como 10F6) a un antigeno KIR3DL2 en al menos aproximadamente 30% o más, preferiblemente de aproximadamente 40%, puede ser considerada como un anticuerpo que se enlaza a sustancialmente al mismo epitopo o determinante como un control (por ejemplo, 10F6). Preferiblemente, un anticuerpo de prueba tal reducirá el enlace del anticuerpo de control (por ejemplo, 10F6) para el antigeno KIR3DL2 en al menos aproximadamente 50% (por ejemplo, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, o más). Se apreciará que el orden de los anticuerpos control y de prueba se puede invertir: es decir, el anticuerpo de control puede ser primero unido a la superficie y el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la superficie a partir de entonces en un ensayo de competición. Preferiblemente, el anticuerpo que tiene mayor afinidad por el antigeno KIR3DL2 se enlaza a la superficie primera, ya que se espera que la disminución en el enlace visto para el segundo anticuerpo (suponiendo que los anticuerpos son de reacción cruzada) será de mayor magnitud. Otros ejemplos de tales ensayos se proporcionan en, por ejemplo, Saunal (1995) J. Immunol. Métodos 183: 33-41, cuya divulgación se incorpora aquí por referencia.

Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales que reconocen un epitopo de KIR3DL2 reaccionan con un epitopo que está presente en un porcentaje sustancial de o incluso todas las células pertinentes, por ejemplo, células T CD4+ malignas, células de un paciente SS o MF, pero no reaccionará significativamente con otra células, es decir, células que no expresan KIR3DL2. En un aspecto, los anticuerpos anti-KIR3DL2 se enlazan KIR3DL2, pero no enlazan KIR3DL1 y/o KIR3DS1.

En algunas modalidades, los anticuerpos se unirán a las células que expresan KIR3DL2 de un individuo o individuos con una enfermedad caracterizada por la expresión de células de KIR3DL2 positivas, es decir, un individuo que es un candidato para el tratamiento con uno de los métodos descritos en el presente documento usando un anticuerpo anti -KIR3DL2. En consecuencia, una vez que se obtiene un anticuerpo que reconoce específicamente KIR3DL2 en las células, puede ser probado por su capacidad para unirse a las células KIR3DL2-positivas (por ejemplo, células T CD4+ malignas) tomadas de un paciente con un trastorno como la SS o MF. En particular, antes de tratar a un paciente con uno de los presentes anticuerpos, será beneficioso para probar la capacidad del anticuerpo para unirse a las células malignas tomadas del paciente, por ejemplo, en una muestra de sangre, para maximizar la probabilidad de que la terapia será beneficiosa en el paciente.

En una modalidad, los anticuerpos son validados en un inmunoensayo para poner a prueba su capacidad para enlazarse a las células que expresan KIR3DL2, por ejemplo, las células T CD4+ malignas, células CD4+ pro-inflamatorias. Por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica (PBL) se toman a partir de una pluralidad de pacientes, y las células T CD4+ se enriquecen a partir de los PBL, por ejemplo, mediante cito etría de flujo utilizando anticuerpos relevantes (para células CD4 + malignas ver, por ejemplo, Bagot et al. (2001) Blood 97:1388-1391, cuya descripción se incorpora aquí por referencia), o fracciones de células CD4+CD28 se aislaron por separación magnética en una columna MACS (Miltenyi Biotec). La capacidad de un anticuerpo dado para unirse a las células se evaluó a continuación, utilizando métodos estándar bien conocidos en la téenica. Los anticuerpos que se encontró se enlazan a una proporción sustancial (por ejemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más) de las células se sabe que expresan KIR3DL2, por ejemplo, células T, a partir de un porcentaje significativo de individuos o pacientes (por ejemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más) son adecuados para su uso en esta invención, tanto con fines de diagnóstico para determinar la presencia o el nivel de células T malignas en una paciente o para su uso en los métodos terapéuticos aqui descritos, por ejemplo, su uso para aumentar o disminuir el número de células T malignas o actividad. Para evaluar el enlace de los anticuerpos a las células, los anticuerpos pueden ser o bien directa o indirectamente etiquetados. Cuando esté etiquetado indirectamente, se añade típicamente un anticuerpo marcado secundario. El enlace de los anticuerpos a las células se puede detectar usando, por ejemplo, el análisis citofluorométrico (por ejemplo FACScan). Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la téenica.

La determinación de si un anticuerpo se enlaza dentro de una región de epítopo puede llevarse a cabo de maneras conocidas para el experto en la técnica. Como un ejemplo de tales métodos de mapeo/caracterización, una región de epítopo para un anticuerpo anti-KIR3DL2 puede ser determinada por epítopo "huella" mediante la modificación química de las aminas/carboxilos expuestos en la proteína KIR3DL2. Un ejemplo específico de una técnica como pies de impresión es el uso de HXMS (intercambio de hidrógeno-deuterio detectada por espectrometría de masas) en donde intercambio de hidrógeno/deuterio de receptores y ligando de protones de amida de proteínas, enlazando, y el intercambio ocurre de nuevo, en donde la columna vertebral de grupos amida que participan en el enlace a proteínas están protegidos de intercambio de vuelta y por lo tanto permanecerán deuterados. Regiones relevantes pueden ser identificadas en este punto por proteolisis péptica, separación de cromatografía líquida de alto rendimiento de microbore rápido, y/o espectrometría de masas de ionización electrospray. Ver, por ejemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, vol.267 (2) pp.252-259 (1999) Engen, JR y Smith, D.L. (2001) Anal. Chem.73, 256A-265A. Otro ejemplo de una téenica de identificación epítopo adecuada es el mapeo de epítopos de resonancia magnética nuclear (RMN), donde típicamente la posición de las señales en los espectros de RMN de dos dimensiones del antígeno libre y el antígeno complejo con el péptido de enlace al antígeno, como un anticuerpo, se comparan. El antígeno típicamente es selectivamente isotópicamente marcado con 15N de manera que sólo las señales correspondientes al antígeno y no hay señales de que el péptido de enlace a antígeno se ven en el Espectro de RMN. Señales de antígenos procedentes de aminoácidos implicados en la interacción con el péptido de enlace a antígeno típicamente cambian de posición en el espectro del complejo en comparación con el espectro del antígeno libre, y los aminoácidos implicados en el enlace se pueden identificar de esa manera. Ver, por ejemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al.Journal of Molecular Biology, vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); y Saito and Patterson, Methods.1996 Jun; 9 (3): 516-24.

El mapeo/caracterización de epítopo también se puede realizar usando métodos de espectrometría de masas. Ver, por ejemplo, Downward, J Mass Spectrom.2000 Apr; 35 (4): 493-503 and Kiselar and Downard, Anal Chem.1999 May 1; 71 (9): 1792-801. Téenicas de digestión con proteasa también pueden ser útiles en el contexto de apeo de epítopos y la identificación. Antigénicos determinantes relevantes de regiones/secuencias pueden ser determinados por la digestión con proteasas, por ejemplo, mediante el uso de tripsina en una relación de aproximadamente 1:50 a KIR3DL2 o en la digestión y pH 7-8, seguido por análisis de espectrometría de masas (MS) para la identificación de péptidos. Los péptidos protegidos de la escisión de tripsina por el aglutinante anti-KIR3DL2 posteriormente se pueden identificar por comparación de muestras sometidas a digestión con tripsina y muestras incubadas con el anticuerpo y después se somete a la digestión por ejemplo, tripsina (revelando así una huella para el aglutinante). Otras enzimas como la quimotripsina, pepsina, etc., también o alternativamente se pueden utilizar en los métodos de caracterización de epítopo similares. Por otra parte, la digestión enzimática puede proporcionar un método rápido para analizar si una secuencia de determinante antigénico potencial es dentro de una región del polipéptido KIR3DL2 que no está expuesto en la superficie y, por consiguiente, lo más probable no es relevante en términos de inmunogenicidad/antigenicidad. Ver, por ejemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27: 15-9 para una discusión de téenicas similares.

Mutagénesis dirigida al sitio es otra técnica útil para la elucidación de un epitopo de enlace. Por ejemplo, en un "barrido de alanina", cada residuo dentro de un segmento de proteína se vuelve a colocar con un residuo de alanina, y mide las consecuencias para la afinidad de enlace. Si la mutación conduce a una reducción significativa en la afinidad de enlace, es más probable que participan en el enlace. Los anticuerpos monoclonales específicos para los epítopos estructurales (es decir, anticuerpos que no se enlazan la proteina desplegada) se pueden utilizar para verificar que el reemplazo de alanina no influye sobre el pliegue de la proteína. Ver, por ejemplo, Clackson y Wells, Science 1995; 267: 383-386; y Wells, Proc Nati Acad Sci USA 1996; 93: 1-6.

La microscopía electrónica también se puede utilizar para "huella" de epitopo. Por ejemplo, Wang et al., Nature 1992; 355:275-278 usa la aplicación coordinada de micros- copia de crioelectron, reconstrucción de la imagen tridimensional, y cristalografía de rayos X para determinar la huella física de un fragmento Fab en la superficie de la cápside del virus del mosaico del caupí nativo.

Otras formas de ensayo "sin etiqueta" para la evaluación de epítopo incluyen resonancia de plasmones superficiales (SPR, BIACORE) y espectroscopia de interferencia reflectométrica (RifS). Ver, por ejemplo, Fágerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.

También hay que señalar que un anticuerpo de enlace a la misma o sustancialmente al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en este documento puede ser identificado en uno o más de los ensayos de competición de ejemplo descritos en el presente documento.

Opcionalmente, la captación celular o localización se evalúa a fin de seleccionar un anticuerpo que es fácilmente absorbido en la célula y/o en el compartimento celular donde KIR3DL2 está presente. La captación o localización celular generalmente se miden en las células en las que se haya solicitado o se cree que ejerce su actividad el anticuerpo. La captación o localización celular pueden evaluarse por métodos estándar, tales como por tinción confocal utilizando un anticuerpo marcado con un resto detectadle (por ejemplo, un resto fluorescente).

Tras la inmunización y producción de anticuerpos en un vertebrado o célula, en particular los pasos de selección se puede realizar para aislar anticuerpos como se reivindica. En este sentido, en una modalidad especifica, se proporcionan métodos para producir dichos anticuerpos, que comprende: (a) inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno que comprende un polipéptido KIR3DL2; y (b) preparar anticuerpos de dicho animal inmunizado; y (c) seleccionar anticuerpos de la etapa (b) que son capaces de enlazar KIR3DL2.

Típicamente, un anticuerpo anti-KIR3DL2 en el presente documento tiene una afinidad para un polipéptido de KIR3DL2 en el intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 1011 M_1 (por ejemplo, aproximadamente 108 a aproximadamente 1010 M-1). Por ejemplo, un anticuerpo puede tener una constante de disociación media (Kd) de menos de lxlO9 M con respecto a KIR3DL2, tal como se determina mediante, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (SPR) de detección (por ejemplo, por análisis con un dispositivo analítico BIAcore ™ SPR) . En un aspecto a modo de ejemplo más particular, un anticuerpo puede tener una Kd de aproximadamente lxlO8 M a aproximadamente lxlO-10 M, o aproximadamente lxlO9 M a aproximadamente lxlO11 M, para KIR3DL2.

Los anticuerpos pueden ser caracterizados por ejemplo, por una media Kd de no más de aproximadamente (es decir, mejor afinidad que) 100, 60, 10, 5, o 1 nanomolar, preferiblemente sub-nanomolar U opcionalmente no más de aproximadamente 500, 200, 100 o 10 picomolar. Kd se puede determinar, por ejemplo, mediante la inmovilización de proteínas KIR3DL2 humanas producidas de forma recombinante en una superficie del chip, seguida de la aplicación del anticuerpo a ensayar en solución. En una modalidad, el método comprende además una etapa (d), seleccionar anticuerpos a partir de (b) que son capaces de competir por el enlace a KIR3DL2 con el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1,. 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades, los anticuerpos preparados de acuerdo con los presentes métodos son anticuerpos monoclonales. En otro aspecto, el animal no humano usado para producir anticuerpos de acuerdo con los métodos de la invención es un mamífero, tal como un roedor, bovino, porcino, aves, caballo, conejo, cabra u oveja. Los anticuerpos abarcan 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9. Además, los anticuerpos de opcionalmente pueden especificarse para ser anticuerpos distintos de cualquiera de los anticuerpos Q241 y Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184:505-518), clone 5.133 (Miltenyi Biotec), "AZ158" (Parolini, S., et al. (2002). In Leucocyte typing VII. D. Masón, editor. Oxford University Press, Oxford.415-417) and W02010/081890 (por ejemplo, anticuerpos que tienen la región variable de cadena pesada y ligera de la SEQ ID NOS: 8 y 10 de W02010/081890), o derivados de los anteriores, por ejemplo, que comprenden la región de enlace en su totalidad o en parte antigeno.

De acuerdo con una modalidad alternativa, el ADN que codifica un anticuerpo que se enlaza a un epitopo presente en los polipéptidos KIR3DL2 se aísla a partir del hibridoma y se coloca en un vector de expresión adecuado para la transfección en un huésped apropiado. El anfitrión se utiliza entonces para la producción recombinante del anticuerpo, o variantes del mismo, tal como una versión humanizada de que el anticuerpo monoclonal, fragmentos activos del anticuerpo, anticuerpos quiméricos que comprenden la porción de reconocimiento del antígeno del anticuerpo, o versiones que comprenden un resto detectable.

ADN que codifica los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, el anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, se puede aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinas). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego son transíectados en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Como se describe en otra parte de la presente especificación, tales secuencias de ADN se pueden modificar para cualquiera de un gran número de propósitos, por ejemplo, para humanizar anticuerpos, producir fragmentos o derivados, o para la modificación de la secuencia del anticuerpo, por ejemplo, en el sitio de enlace de antígeno con el fin de optimizar la especificidad de enlace del anticuerpo.

La expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se conoce bien en la téenica (ver, por ejemplo, Skerra et al., Curr. Opinión in Imunol·., 5, pp 256 (1993); y Pluckthun, Immunol.130, p.151 (1992).

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD Una vez que se obtiene un compuesto de enlace al antígeno por lo general será evaluado por su capacidad de internalizar en las células diana que expresan KIR3DL2 o causan la internalización de KIR3DL2 en élulas diana que expresan KIR3DL2 para inducir ADCC o CDC a través, inhibiendo la actividad proinflamatoria y/o la proliferación de y/o causar la eliminación de células diana que expresan KIR3DL2. Evaluación de la capacidad del compuesto de enlace al antigeno a internalizar o para inducir ADCC, CDC o generalmente conducir a la eliminación o inhibición de la actividad de las células diana que expresan KIR3DL2, puede llevarse a cabo en cualquier etapa adecuada del método, por ejemplo, como en los ejemplos aquí contenidos. Esta evaluación puede ser útil en uno o más de las diversas etapas involucradas en la identificación, producción y/o desarrollo de un anticuerpo (u otro compuesto) destinados para uso terapéutico. Por ejemplo, la actividad se puede evaluar en el contexto de un método de cribado para identificar compuestos de enlace a antigenos candidatos, o en métodos en los que se selecciona un compuesto de enlace al antigeno y fabricado adecuado al humano (por ejemplo, fabricados quimérico o humanizado en el caso de un anticuerpo), donde una célula expresando el compuesto que enlaza antigeno (por ejemplo, una célula huésped que expresa un compuesto de enlace a antigeno recombinante) se ha obtenido y fue evaluada por su capacidad para producir anticuerpos funcionales (u otros compuestos), y/o donde una cantidad de compuesto que enlaza antigeno se ha producido y se ha de evaluar la actividad (por ejemplo, para probar lotes o lotes de producto). Generalmente, el compuesto de enlace al antigeno se sabe que se enlaza específicamente a un polipéptido KIR3DL2. El paso puede implicar un análisis de una pluralidad (por ejemplo, un número muy grande utilizando métodos de cribado de alto rendimiento o un número más pequeño) de los compuestos de enlace a antigeno.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti-KIR3DL2 que no es "internalizado" o que no "internaliza" es uno que no está tomada sustancialmente por (es decir, entra en) la célula tras el enlace a KIR3DL2 en una célula de mamífero (es decir, de la superficie celular KIR3DL2). El anticuerpo no internalizado puede por supuesto, incluir fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanos o humanizados y anticuerpos conjugados.

Si un anticuerpo anti-KIR3DL2 internaliza tras el enlace KIR3DL2 en una célula de mamífero, o si un polipéptido de KIR3DL2 se somete a internalización intracelular (por ejemplo, al ser unido por un anticuerpo) puede determinarse mediante diversos ensayos, incluyendo los descritos en los ejemplos experimentales de este documento. Por ejemplo, para poner a prueba la internalización in vivo, el anticuerpo de prueba se marca y se introduce en un animal conocido por tener KIR3DL2 expresado en la superficie de ciertas células. El anticuerpo puede ser radiomarcado o marcado con partículas fluorescentes o de oro, por ejemplo. Los animales adecuados para este ensayo incluyen un mamífero tal como un ratón desnudo que contiene un trasplante de tumor humano que expresa KIR3DL2 o xenoinjerto, o un ratón en donde se han introducido células transfectadas con KIR3DL2 humano, o un ratón transqénico que expresa el transgén humano KIR3DL2. Controles apropiados incluyen animales que no recibieron el anticuerpo de prueba o que recibieron un anticuerpo no relacionado, y animales que recibieron un anticuerpo a otro antígeno en las células de interés, tal anticuerpo es conocido para ser internalizado tras el enlace al antígeno. El anticuerpo puede administrarse al animal, por ejemplo, por inyección intravenosa. A intervalos de tiempo apropiados, las secciones de tejido del animal se pueden preparar usando métodos conocidos o como se describe en los ejemplos experimentales a continuación, y se analizaron mediante microscopía de luz o microscopía electrónica, para la internalización así como la ubicación del anticuerpo internalizado en la célula. Para la internalización in vitro, las células se pueden incubar en placas de cultivo de tejido en presencia o ausencia de los anticuerpos relevantes añadidos al medio de cultivo y procesados para análisis microscópico en puntos de tiempo deseados. La presencia de un anticuerpo marcado internalizado en las células puede ser visualizado directamente por microscopía o mediante autorradiografía si se usa anticuerpo radiomarcado . Opcionalmente, en microscopía, co-localización con un polipéptido conocido u otro componente celular se puede evaluar; por ejemplo co-localización con marcador LAMP-1 (CD107a) endosomal/lisosomal puede proporcionar información sobre la localización subcelular del anticuerpo internalizado. Alternativamente, en un ensayo bioquímico cuantitativo, una población de células que comprenden células que expresan KIR3DL2 se ponen en contacto in vitro o in vivo con un anticuerpo de prueba radiomarcado y las células (si entran en contacto in vivo, las células son entonces aisladas después de una cantidad de tiempo adecuado) son tratadas con una proteasa o sometidas a un lavado ácido para eliminar el anticuerpo no internalizado en la superficie celular. Las células se muelen y la cantidad de resistentes a la proteasa, los recuentos radiactivos por minuto (cpm) asociados con cada lote de células se mide haciendo pasar el homogeneizado a través de un contador de centelleo. Basándose en la actividad específica conocida del anticuerpo radiomarcado, el número de moléculas de anticuerpo internalizadas por célula se puede deducir de los recuentos de centelleo de las células molidas.

Las células se ponen en "contacto" con el anticuerpo in vitro preferiblemente en forma de disolución al ir añadiendo las células al medio de cultivo celular en el matraz o placa de cultivo y mezclando el anticuerpo bien con los medios para asegurar una exposición uniforme de las células al anticuerpo.

Pueden llevarse a cabo pruebas de CDC y ADCC, pueden ser determinadas mediante diversos ensayos, incluyendo los descritos en los ejemplos experimentales en el presente documento (ver los Ejemplos 4 y 5). Pruebas de ADCC típicamente implican la evaluación de la citotoxicidad mediada por células en donde una célula diana que expresa KIR3DL2 (por ejemplo, una célula Cou-L, célula de Síndrome de Sezary u otra célula que expresa KIR3DL2) con anticuerpo anti-KIR3DL2 unido es reconocido por una célula efectora que lleva receptores Fe, sin la participación del complemento. Una célula que no expresa un antígeno de KIR3DL2 opcionalmente se puede utilizar como un control. La activación de la citotoxicidad de células NK se evaluó midiendo un aumento en la producción de citoquinas (por ejemplo, producción de IFN-CD) o marcadores de citotoxicidad (por ejemplo, de movilización de CD107). Preferiblemente, el anticuerpo induce un aumento en la producción de citoquinas, la expresión de marcadores de citotoxicidad, o la lisis de la célula diana de al menos 20%, 50%, 80%, 100%, 200% o 500% en presencia de las células diana, en comparación con un anticuerpo de control (por ejemplo, un anticuerpo no se enlaza a KIR3DL2, un anticuerpo KIR3DL2 que tiene regiones constantes murina). En otro ejemplo, se detecta la lisis de las células diana, por ejemplo, en un ensayo de liberación de cromo, preferiblemente el anticuerpo induce la lisis de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% de las células diana. Cuando un compuesto de enlace al antigeno se prueba tanto por su capacidad para (a) inducir tanto ADCC y (b) internalizar en las células que expresan KIR3DL2 y/o inducir la internalización KIR3DL2, los ensayos de (a) y (b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden. Sin embargo, el alcance y la velocidad de internalización puede generalmente esperarse sea asociada con una disminución de la extensión de CDC y la actividad ADCC.

ANTICUERPO 10F6 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo 10F6 se muestra como SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable se muestra como SEQ ID NO: 3. En una modalidad especifica, se proporciona un anticuerpo que se enlaza esencialmente al mismo epitopo o determinante como anticuerpos monoclonales 10F6; Opcionalmente, el anticuerpo comprende una región de enlace al antigeno del anticuerpo 10F6. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 10F6 se puede caracterizar por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 10F6. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de la región variable de 10F6. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDR de la cadena pesada de la región variable de 10F6. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende además la cadena ligera variable de región variable de 10F6 o uno, dos o tres de las CDR de la cadena ligera región variable de 10F6. Opcionalmente, uno cualquiera o más de dichas CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener modificaciones uno, dos, tres, cuatro o cinco o más aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de la cadena ligera y/o pesada de regiones variables que comprende parte o la totalidad de un antigeno enlazando la región de anticuerpo 10F6 esta fusionado a una constante de inmunoglobulina de tipo IgG humana, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl humana o isotipo IgG3.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDRl que comprende una secuencia de aminoácidos GYTFTIAGMQ como se expone en SEQ ID NO: 6, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo IAGMQ (SEQ ID NO: 4), GYTFTI (SEQ ID NO: 5)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos WINTHSGVPKYAEDFKG como se expone en SEQ ID NO: 7, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo WINTHSGVPK (SEQ ID NO: 8)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos GGDEGVMDY como se expone en SEQ ID NO: 9, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos KASQDVSTAVA como se expone en SEQ ID NO: 10, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia WASTRHT de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 11, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR3 que comprende una secuencia QQHYNTPWT de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 12, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden ser eliminados o sustituidos por un aminoácido diferente.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 4-6, 7-8 y 9, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 4, 7 y 9, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente; y las secuencias de aminoácidos CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 10, 11 y 12, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido con un aminoácido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se pueden caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como las que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR o conjunto de CDR listado en la SEQ correspondiente ID NO.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que compite por el enlace KIR3DL2 con un anticuerpo monoclonal de (a) a (f), anterior.

ANTICUERPO 2B12 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región variable del anticuerpo 2B12 aparece en SEQ ID NO: 13, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable se muestra como SEQ ID NO: 14. En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que se enlaza esencialmente al mismo epitopo o determinante como anticuerpos monoclonales 2B12; Opcionalmente, el anticuerpo comprende una región de enlace a antigeno del anticuerpo 2B12. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 2B12 puede ser caracterizado por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 2B12. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de la región variable de 2B12. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDR de la cadena pesada de la región variable de 2B12. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende, además, la cadena ligera de la región variable del 2B12 o uno, dos o tres de las CDR de la región variable de cadena ligera de la 2B12. Opcionalmente uno o más de dichas CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener uno, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o la totalidad de un antigeno enlazando la región del anticuerpo 2B12 esta fusionado a una región constante de inmunoglobulina de tipo IgG, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl o isotipo de IgG4.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos GYTFTTAGMQ como se expone en SEQ ID NO: 17, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo, TAGMQ (SEQ ID NO: 15), GYTFTT (SEQ ID NO: 16)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos WINSHSGVPKYAEDFK como se expone en SEQ ID NO: 18, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo WINSHSGVP (SEQ ID NO: 19)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos GGDEGVMDYW como se expone en SEQ ID NO: 20, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 1 , 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDRl que comprende una secuencia de aminoácidos KASQDVSTAVA como se expone en SEQ ID NO: 10, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos WTSTRHT como se expone en SEQ ID NO: 21, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o una región LCDR3 que comprende una secuencia QQHYSTPWT de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 22, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos puede ser eliminado o sustituido por un aminoácido diferente, o donde la secuencia puede comprender una inserción de uno o más aminoácidos.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más de los residuos de aminoácido puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 14, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más de los residuos de aminoácido puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más de los residuos de aminoácido puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 14, opcionalmente en donde uno o más de los residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 15-17, 18-19 y 20, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 10, 21 y 22, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 15, 18 y 20, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente; y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 10, 21 y 22, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido con un aminoácido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se puede caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como las que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR o conjunto de CDR listadas en la correspondiente SEQ ID NO.

ANTICUERPO 10G5 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región variable de anticuerpo 10G5 se muestra como SEQ ID NO: 23, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable se muestra como SEQ ID NO: 24. En una modalidad especifica, se proporciona un anticuerpo que se enlaza esencialmente el mismo epitopo o determinante tal como anticuerpos monoclonales 10G5; Opcionalmente, el anticuerpo comprende una región de enlace a antigeno del anticuerpo 10G5. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 10G5 puede ser caracterizado por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 10G5. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la región variable de cadena pesada 10G5. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de cadena pesada de la región variable de 10G5 También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende además la región variable de cadena ligera variable de 10G5 o uno, dos o tres de las CDRs de la región variable de cadena ligera de 10G5. Opcionalmente uno cualquiera o más de dichos CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener uno, dos, tres, cuatro o cinco o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o la totalidad de un antigeno enlazado a la región del anticuerpo 10G5 está fusionado a una región constante de inmunoglobulina de tipo IgG humana, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl humana o un isotipo IgG3.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDRl que comprende una secuencia de aminoácidos GYTFTSYTMH como se expone en SEQ ID NO: 27, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 1 , 8 , 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos (por ejemplo, SYTMH (SEQ ID NO: 25), GYTFTS (SEQ ID NO: 26)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos YINPSSGYTENNRKF como se expone en SEQ ID NO: 28, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo YINPSSGY (SEQ ID NO: 29)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos RLGKGLLPPFDY como se expone en SEQ ID NO: 30, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos RASENIYSNLA como se expone en SEQ ID NO: 31, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia AATNLAD de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 32, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos QHFWGTPYT como se expone en SEQ ID NO: 33, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden ser eliminados o sustituidos por un aminoácido diferente.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos puede ser sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23, opcionalmente en donde uno o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24 en donde uno, dos, tres o más residuos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 25-27, 28-29 y 30, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 31, 32, y 33, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 25, 28 y 30, respectivamente, opcionalmente en donde uno o más residuos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y las CDR secuencias de aminoácidos de cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 31, 32, y 33, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se pueden caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como los que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR particular o conjunto de CDR listadas en la correspondiente SEQ ID NO.

ANTICUERPO 13H1 La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 13H1 se muestra como SEQ ID NO: 34, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera se muestra como SEQ ID NO: 35. En una modalidad específica, se proporciona un anticuerpo que se enlaza esencialmente al mismo epítopo o determinante como anticuerpos monoclonales 13H1; Opcionalmente, el anticuerpo comprende una región de enlace al antígeno del anticuerpo 13H1. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 13H1 se puede caracterizar por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 13H1. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la cadena pesada de la región variable de 13H1. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la región variable de cadena pesada de 13H1 También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende además la región variable de cadena ligera variable de 13H1 o uno, dos o tres de las CDRs de la región variable de cadena ligera 13H1. Opcionalmente uno cualquiera o más de dichos CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener uno, dos, tres, cuatro o cinco o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o la totalidad de un antígeno que enlaza una región de anticuerpo 13H1 está fusionado a una región constante de inmunoglobulina de tipo IgG humana, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl humana o un isotipo IgG3.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos HYSFIGYTM como se expone en SEQ ID NO: 38, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos (por ejemplo, GYTMN (SEQ ID NO: 36), HYSFIG (SEQ ID NO: 37)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos LINPYNGDTTYNQKFKG como se expone en SEQ ID NO: 39, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo LINPYNGDTT (SEQ ID NO: 40)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos ENWGYPYAMDY como se expone en SEQ ID NO: 41, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR1 que comprende una secuencia RASESVDNFGISFMN de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 42, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos AASNQGS como se expone en SEQ ID NO: 43, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR3 que comprende una secuencia QQSKEVPYT de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 44, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden ser eliminados o sustituidos por un aminoácido diferente.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34, opcionalmente en donde uno o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35, en donde uno, dos, tres o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencias de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 36-38, 39-40 y 41, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 42, 43 y 44, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 36, 39 y 41, respectivamente, opcionalmente en donde uno o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 42 43 y 44 opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se pueden caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como los que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR o conjunto de CDR listadas en la correspondiente SEQ ID NO.

ANTICUERPO 1E2 La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada del anticuerpo 1E2 se muestra como SEQ ID NO: 45, la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera se muestra como SEQ ID NO: 46. En una modalidad especifica, se proporciona un anticuerpo que se enlaza esencialmente al mismo epítopo o determinante como anticuerpos monoclonales 1E2; Opcionalmente, el anticuerpo comprende un antigeno que enlaza una región del anticuerpo 1E2. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 1E2 puede ser caracterizado por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 1E2. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la región variable de cadena pesada de la 1E2. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de región variable de cadena pesada de la de 1E2. Se proporciona también un anticuerpo monoclonal que comprende además la región variable de cadena ligera variable de 1E2 o uno, dos o tres de las CDRs de la región variable de cadena ligera de 1E2. Opcionalmente uno cualquiera o más de dichos CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener uno, dos, tres, cuatro o cinco o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o la totalidad de un antigeno que enlaza la región del anticuerpo 1E2 está fusionado a una región constante de inmunoglobulina de tipo IgG humana, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl humana o un isotipo IgG3.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos GYTFTDYAMN como se expone en SEQ ID NO: 49, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo DYAMN (SEQ ID NO: 47), GYTFTD (SEQ ID NO: 48)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos VISTYYGDANYNQKFKG como se expone en SEQ ID NO: 50, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos (por ejemplo, VISTYYGDAN (SEQ ID NO: 51)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos IYYDYDGSY como se expone en SEQ ID NO: 52, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos RSSQSLVHSNGNTYLH como se expone en SEQ ID NO: 53, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos KVSNRFS como se expone en SEQ ID NO: 54, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos SQSTHVPPYT como se expone en SEQ ID NO: 55, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden ser eliminados o sustituidos por un aminoácido diferente.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 42, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 43, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 42, opcionalmente en donde uno o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 43, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 47-49, 50-51 y 52, respectivamente, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 53, 54 y 55, opcionalmente en donde uno, dos, tres residuos de aminoácidos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 47, 50 y 52, opcionalmente en donde uno o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 53, 54 y 55, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se pueden caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como las que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR o conjunto de CDR listadas en la correspondiente SEQ ID NO.

ANTICUERPO 9E10 La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada 9E10 se muestra como SEQ ID NO: 56, la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (dos cadenas ligeras alternativas disponibles) de 9E10 se muestra como SEQ ID NOS: 57 y 67. En una modalidad especifica, está proporcionado un anticuerpo que se enlaza esencialmente al mismo epitopo o determinante como anticuerpos monoclonales 9E10; Opcionalmente, el anticuerpo comprende un antigeno que enlaza a la región del anticuerpo 9E10. En cualquiera de las modalidades del presente documento, el anticuerpo 9E10 se puede caracterizar por su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico que lo codifica. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende los fragmentos Fab o F(ab')2 porción de 9E10. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la región variable de cadena pesada de la 9E10. Según una forma de modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la región variable de cadena pesada de la 9E10. También se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende además la región variable de cadena ligera de 9E10 o uno, dos o tres de los CDRs de región variable de cadena ligera de la 9E10. Opcionalmente uno o más de dichos CDRs de cadena ligera o pesada pueden contener uno, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables cadena ligera y/o pesada que comprende parte o la totalidad de un antigeno que enlaza a la región del anticuerpo 9E10 está fusionado a una región constante de inmunoglobulina de tipo IgG, opcionalmente una región constante humana, opcionalmente una IgGl humana o un isotipo IgG4.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una región HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos GYTFTSYTMH como se expone en SEQ ID NO: 60, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo, SYTMH (SEQ ID NO: 58), GYTFTS (SEQ ID NO: 59)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos YINPSSGYTDYNQKFKD como se expone en SEQ ID NO: 61, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos del mismo (por ejemplo YINPSSGYTD (SEQ ID NO: 62)), en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos LGKGLLPPFDY como se expone en SEQ ID NO: 63, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos KSNQNLLWSGNQRYCLV como se expone en SEQ ID NO: 64, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos WTSDRYS como se expone en SEQ ID NO: 65, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; una región LCDR3 que comprende una secuencia QQHLHIPYT de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 66, o una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, en donde uno o más de estos aminoácidos pueden ser eliminados o sustituidos por un aminoácido diferente, o donde la secuencia puede comprender una inserción de uno o más aminoácidos.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que se enlaza a KIR3DL2 humano, que comprende: (a) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 56, opcionalmente en donde uno, dos, tres o residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (b) la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NOS: 57 o 67, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (c) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 56, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NOS: 57 o 67, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos por un aminoácido diferente; y/o (d) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1 y 2 (HCDRl, HCDR2) como se muestra en SEQ ID NOS: 58, 59 o 60, 61-62 y 63, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido por un aminoácido diferente; y/o (e) la secuencia de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 64, 65 y 66, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede ser sustituido por un aminoácido diferente; y/o (f) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 58, 61 y 63, opcionalmente en donde uno, dos, tres residuos de cualquier CDR puede estar sustituido con un aminoácido diferente; y las secuencias de aminoácidos de cadena ligera CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 64, 65 y 66, opcionalmente en donde uno, dos, tres o más residuos de cualquier CDR puede estar sustituido con un aminoácido diferente.

En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo 1C3 (dominio anti-D2), su región variable y CDRs. En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene, respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS:.170 y 171 (1C3) En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende las CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2 , HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 172, 173 o 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 o 176 (HCDR2) y SEQ ID NO: 177 (HCDR3), respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones. En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende las CDRs 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 172 , 173 o 174 (HCDRl), SEQ ID NO: 175 o 176 (HCDR2) y SEQ ID NO: 177 (HCDR3), respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDRl, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 178, 179 o 180, respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones.

En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo 20E9 (anti-dominio D2), su región variable y CDRs. En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene, respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS.: 181 y 182 (20E9). En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende las CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 183, 184 o 185 (HCDRl), SEQ ID NO: 186 o 187 (HCDR2) y SEQ ID NO: 188 (HCDR3), respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones. En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende las CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 183 , 184 o 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 o 187 (HCDR2) y SEQ ID NO: 188 (HCDR3), respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO.: 189, 190 o 191, respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos, deleciones o inserciones.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades del presente documento, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se pueden caracterizar por una secuencia de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos contiguos de los mismos, y/o como que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR o conjunto de CDR enumeradas en la correspondiente SEQ ID NO.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo que compite por el enlace KIR3DL2 con un anticuerpo monoclonal anterior.

En cualquiera de los anticuerpos, la región variable especificada y secuencias de CDR pueden comprender uno, dos, tres, cuatro cinco o más modificaciones de secuencia conservativas. Modificaciones de secuencia conservativas se refiere a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones de aminoácidos, adiciones y deleciones. Las modificaciones pueden ser introducidas en un anticuerpo por téenicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Sustituciones conservativas de aminoácidos son típicamente aquellas en las que un residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. Secuencias de CDR y región variable especificada pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. Donde se realizan sustituciones, las sustituciones pueden opcionalmente ser modificaciones conservativas. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo pueden ser reemplazados por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede ser probado para la función de retenida (es decir, las propiedades expuestas en este documento), utilizando los ensayos descritos en el presente documento.

El término "identidad" o "idéntico", cuando se utiliza en una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, se refiere al grado de polipéptidos relacionados entre secuencias, como se determina por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pegueña de dos o más secuencias con alineamientos de brecha (si existen) dirigido por un programa de ordenador o modelo matemático particular (es decir, "algoritmos"). Identidad de polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed, Oxford University Press, New York, 1988.; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jerscy, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en los programas de ordenador disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of isconsin, Madison, is .), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol.215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Centro Nacional para la Información Bioteenológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/N1H Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

Las secuencias de los CDRs de anticuerpos, de acuerdo con AbM (definición de software de modelado de anticuerpos ABM Moleculares de Oxford), definiciones de sistemas Kabat y Chothia, se han resumido en la Tabla 1 para CDR de cadena pesada, y en la Tabla 2 a continuación para CDR de cadena ligera (CDRs de cadena ligera son los mismos para cada una de las definiciones de AbM, de Kabat y de Chothia). Las secuencias de aminoácidos descritas en este documento están numeradas de acuerdo con los sistemas de numeración Abm, Kabat y Chothia. Mientras que cualquier sistema de numeración adecuado puede ser utilizado para regiones designadas de CDR, en ausencia de cualquier otra indicación, Abm de numeración puede ser utilizado. Tal numeración se ha elaborado a partir de las siguientes indicaciones: CDR-Ll: inicio: aproximadamente residuo 24, residuo antes: siempre un Cys, después de residuo: siempre un Trp (típicamente Trp-Tyr-Gln, sino también, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu), longitud: 10 a 17 residuos; CDR-L2: Inicio: siempre 16 residuos después del final de Ll, Residuos antes: en general Ile-Tyr (pero también, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe), longitud: siempre 7 residuos; CDR-L3, Inicio: siempre 33 residuos después del fin de la L2, Residuo antes: siempre Cys, Residuos después: siempre Phe-Gly-Xaa-Gly, Longitud: 7 a 11 residuos; CDR-H1, Inicio: aproximadamente residuo 26 (siempre 4 después de una Cys) (definición de Chothia/AbM, la definición de Kabat comienza 5 residuos después), Residuos antes: siempre Cys-Xaa-Xaa-Xaa, Residuos después: siempre un Trp ( típicamente Trp-Val, sino también, Trp-Ile, Trp-Ala), longitud: 10 a 12 residuos (definición AbM, definición Chothia excluye los últimos 4 residuos); CDR-H2, Inicio: siempre 15 residuos después del final de la definición de Kabat/AbM de CDR-H1, Residuos antes: normalmente Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (pero una serie de variaciones, Residuos después de Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala), longitud: definición Kabat de 16 a 19 residuos; definición AbM (y Chothia) termina 7 residuos antes; CDR-H3, Inicio: siempre 33 residuos después del fin de CDR-H2 (siempre 2 después de una Cys), Residuos antes: siempre Cys-Xaa-Xaa (típicamente Cys-Ala-Arg), Residuos después: siempre Trp-Gly-Xaa -Gly, Duración: 3 a 25 residuos.

En una modalidad, los anticuerpos son del isotipo IgGl humano o de ratón. En otra modalidad, los anticuerpos son del isotipo IgGl humana. En una modalidad, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos que retienen sus propiedades de enlace y/o funcionales.

Tabla 2 10 H 15 20 2i Las secuencias de las cadenas variables de los anticuerpos se enumeran en la Tabla 3 a continuación, con las CDR subrayadas. En cualquier modalidad aquí, un VL o secuencia VH se pueden especificar o numerar para contener o carecer de un péptido señal o cualquier parte del mismo.

Tabla 3 FRAGMENTOS ? DERIVADOS Fragmentos y derivados de anticuerpos (que están abarcados por el término "anticuerpo" o "anticuerpos" tal como se utiliza en esta solicitud, a menos que se indique otra cosa o se contradiga claramente por el contexto), preferiblemente un anticuerpo similar a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, pueden ser producidos por téenicas que son conocidas en la técnica. "Fragmentos" comprenden una porción del anticuerpo intacto, generalmente el sitio de enlace de antigeno o región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria que consistente en una secuencia ininterrumpida de residuos aminoácidos contiguos (denominado en este documento como un "fragmento de anticuerpo de cadena única" o "polipéptido de cadena única"), incluyendo, sin limitación (1) moléculas Fv de cadena única (2) polipéptidos de cadena única que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de la misma que contiene los tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociado y (3) polipéptidos de cadena única que contienen sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene los tres CDRs de la región variable de cadena pesada, sin una porción de cadena ligera asociada; y los anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Incluye, entre otras cosas, que son nanocuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos de dominio único o un "dAb".

Los fragmentos de los presentes anticuerpos pueden obtenerse utilizando métodos estándar. Por ejemplo, fragmentos Fab o F(ab')2 pueden ser producidos por la digestión con proteasas de los anticuerpos aislados, de acuerdo con téenicas convencionales. Se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos se pueden modificar mediante métodos conocidos, por ejemplo, para reducir el aclaramiento in vivo y obtener un perfil farmacocinético más deseable el fragmento, puede ser modificado con polietilenglicol (PEG). Los métodos para acoplamiento y específicamente en el sitio de conjugación de PEG a un fragmento Fab' se describen en, por ejemplo, Leong et al, 16 (3): 106-119 (2001) y Delgado et al, Br. J. Cáncer 73 (2): 175-182 (1996), cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia.

Alternativamente, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo similar a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, puede ser modificado con el fin de codificar un fragmento. Luego se inserta el ADN modificado en un vector de expresión y se usa para transformar o transfectar una célula apropiada, el cual a continuación expresa el fragmento deseado.

En ciertas modalidades, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo similar 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, se puede modificar antes de la inserción en un vector de expresión, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias no humanas homologas (por ejemplo, Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la inmunoglobulina codificante de la totalidad o parte de la secuencia que codifica para un polipéptido que no es inmunoglobulina. De esa manera, los anticuerpos o "híbridos" "quiméricos" se preparan para tener la especificidad de enlace del anticuerpo original. Típicamente, tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo.

Así, de acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo similar a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, es humanizado. Las formas "humanizadas" de anticuerpos son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de enlace a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina murina. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donante) mientras se mantiene la especificidad deseada, afinidad y capacidad del anticuerpo original.

En algunos casos, residuos del marco de Fv de la inmunoglobulina humana se pueden sustituir por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las del anticuerpo original y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp.323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp.593 (1992); Verhocyen et Science, 239, pp.1534; y en la Patente US No.4,816,567, la totalidad de cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia).

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para ser usados en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que está más próxima a la del ratón se acepta entonces como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151, pp.2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp.901). Otro método utiliza un marco particular, de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p.2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de una elevada afinidad por los receptores KIR3DL2 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento ejemplar, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la téenica. Programas informáticos disponibles que ilustran y muestran estructuras tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de secuencias consenso y de importación de manera que la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antígeno(s) objetivo, es conseguida. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en influenciar el enlace al antígeno.

Otro método de preparación de anticuerpos monoclonales "humanizados" es utilizar una serie murina huésped conforme que ha tenido sus genes de inmunoglobulina reemplazado por genes de inmunoglobulina humana funcionales (véase, por ejemplo, Patente US No.6,162,963, que se incorpora aqui en su totalidad por referencia).

Los anticuerpos humanos también se pueden producir de acuerdo con diversas otras téenicas, tales como mediante el uso, para la inmunización, otros animales transgénicos que han sido diseñados para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz et al·., Nature 362 (1993) 255), o por la selección de repertorios de anticuerpos utilizando métodos de presentación de fagos. Tales técnicas son conocidas para el experto y pueden ser iplementadas a partir de anticuerpos monoclonales como se describe aqui.

Los anticuerpos, opcionalmente un anticuerpo similar a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9, también se pueden derivatizar a anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena(s) pesada/ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en el anticuerpo original, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada y especificidad de enlace (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., pp.6851 (1984)).

Varias formas del anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser una de longitud completa o anticuerpo intacto, tal como una de longitud completa o IgGl intacta o anticuerpo IgG . En una modalidad, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo IgG4 de longitud completa o un fragmento del mismo. Para producir tales anticuerpos humanizados, las regiones VH y VL, o versiones variantes de la misma, se pueden clonar en vectores de expresión de codificación de longitud completa o las regiones constantes truncadas de un anticuerpo humano de acuerdo con métodos recombinantes estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a Ed., Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1989). El resultado es una linea celular transfectada que expresa y secreta la molécula de anticuerpo humanizado de interés, que comprende las regiones VH y VL seleccionadas y regiones constantes. Secuencias de ADNc que codifican las regiones constantes de anticuerpos humanos son conocidas.

La región constante puede además ser modificada de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, en una región constante de IgG4, residuo S241 puede ser mutado a un residuo de prolina (P) para permitir la formación de puente de disulfuro completa en la bisagra (véase, por ejemplo, Angal et al., Mol Immunol 1993; 30: 105-8).

REGIONES CONSTANTES MODIFICADAS En vista de la capacidad de los anticuerpos anti-KIR3DL2 (en particular los anticuerpos no internalizados) para inducir ADCC y CDC, los anticuerpos también se pueden hacer con las modificaciones que aumenten su capacidad para unirse a receptores Fe que pueden afectar a las funciones efectoras tales como anticuerpo dependiente de la citotoxicidad, la desgranulación de mastocitos, y la fagocitosis, asi como señales de inmunomoduladores tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Las modificaciones típicas incluyen regiones constantes de IgGl humana modificada que comprenden al menos una modificación de ácidoamino (por ejemplo, sustitución, deleciones, inserciones), y/o glicosilación de tipos alterados, por ejemplo, hipo fucosilación. Tales modificaciones pueden afectar a la interacción con los receptores de Fe: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), y FcyRIII (CD 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y FcyRIII (CD 16) están activando receptores (es decir, mejora del sistema inmunológico) mientras que FcyRIIB (CD32b) es un inhibidor del receptor (es decir, amortiguación del sistema inmunitario). Una modificación puede ser, por ejemplo, aumentar el enlace del dominio Fe de FcyRIIIa en células efectoras (por ejemplo, NK).

Los anticuerpos anti-KIR3DL2 preferiblemente comprenden un dominio de Fe (o parte del mismo) de la IgGl humana o isotipo IgG3, opcionalmente modificado. Los residuos 230-341 (Kabat UE) son la región Fe CH2. Los residuos 342-447 (Kabat UE) son la región Fe CH3. Los anticuerpos anti-KIR3DL2 pueden comprender una región Fe variante que tiene una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, deleciones, inserciones) en una o más partes, en una o más porciones, tales modificaciones aumentan la afinidad y avidez de la variante de la región Fe para una FcyR (incluyendo la activación e inhibitorios FcyRs). En algunas formas de modalidad, dichas una o más modificaciones de aminoácidos aumentan la afinidad de la región Fe variante para FcYRIIIa y/o FcyRIIA. En otra modalidad, la variante de la región Fe se enlaza más específicamente a FcyRIIB con una menor afinidad que hace la región Fe del anticuerpo parental comparable (por ejemplo, un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el anticuerpo a excepción de las una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe). Por ejemplo, el uno o ambos de los residuos de histidina en las posiciones de aminoácidos 310 y 435 puede estar sustituido, por ejemplo por lisina, alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, triptófano, fenilalanina, serina o treonina (ver, por ejemplo, la publicación PCT no. WO 2007/080277); tales regiones constantes sustituidos proporcionan disminución del enlace a la FcyRIIB inhibitoria sin disminuir el enlace a la FcyRIIIA activadora. En algunas modalidades, tales modificaciones aumentan la afinidad de la variante de la región Fe para FcyRIIIa y/o FcyRIIA y también mejoran la afinidad de la variante de la región Fe para FcyRIIB relativa con el anticuerpo parental. En otras formas de modalidad, dichas una o más modificaciones de aminoácidos aumentan la afinidad de la variante de la región Fe para FcyRIIIa y/o FcyRIIA pero no alteran la afinidad de las regiones Fe variantes para FcyRIIB relatvas a la región Fe del anticuerpo parental. En otra modalidad, dichas uno o más modificaciones de aminoácidos mejoran la afinidad de la región Fe variante para FcYRIIIa y FcyRIIA pero reducen la afinidad por FcyRIIB en relación con el anticuerpo parental. Aumento de la afinidad y/o avidez resulta en la actividad de enlace detectadle a la FcyR o FcyR relacionadas en las células que expresan bajos niveles de la FcyR cuando la actividad de la molécula parental (sin la región Fe modificada) de enlace no se pueden detectar en las células.

Las afinidades y las propiedades de enlace de los anticuerpos para una FcyR pueden determinarse usando ensayos in vitro (ensayos basados bioquímicos o inmunológicos) conocido en la téenica para la determinación de anticuerpo-antígeno o interacciones Fc-FcyR, es decir, el enlace específico de un antígeno a un anticuerpo o de enlace específico de una región Fe a una FcyR, respectivamente, incluyendo pero no limitándose a ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de inmunoprecipitación.

En algunas modalidades, los anticuerpos que comprenden una variante de la región Fe comprenden al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, poscyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más modificaciones de aminoácidos) en el dominio CH3 de la región Fe. En otras modalidades, los anticuerpos que comprenden una variante de la región Fe que comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, poscyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más modificaciones de aminoácidos) en el dominio CH2 de la región Fe, que se define como que se extiende desde los aminoácidos 231-341. En algunas modalidades, los anticuerpos comprenden al menos dos modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, poseyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más modificaciones de aminoácidos), en donde al menos una tal modificación está en la región CH3 y al menos una tal modificación está en la región CH2. También abarca modificación de los aminoácidos en la región bisagra. En una modalidad, se abarcan modificaciones de aminoácido en el dominio CH1 de la región Fe, que se define como que se extiende desde los aminoácidos 216-230.

Cualquier combinación de modificaciones Fe se puede hacer, por ejemplo, cualquier combinación de diferentes modificaciones dadas a conocer en las patentes estadounidenses Nos., 7,632,497; 7,521,542; 7,425,619; 7,416,727; 7,371,826; 7,355,008; 7,335,742; 7,332,581; 7, 183,387; 7, 122,637; 6,821,505 y 6,737,056; en las publicaciones PCT Nos. WO 2011/109400.; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 y WO 04/063351; y en Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30( ):87-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 and Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol·. Chem.276(9):6591-6604).

Los anticuerpos anti-KIR3DL2 pueden comprender una variante de la región Fe, en la que la variante de la región Fe comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, poscyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más modificaciones de aminoácidos) relativos a una región Fe de tipo salvaje, de manera que la molécula tiene una función efectora mejorada con respecto a una molécula que comprende una región Fe de tipo salvaje, opcionalmente en donde la región variante de Fe comprende una sustitución en uno cualquiera o más de las posiciones 221, 239, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399, 402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 y/o 439. En una modalidad, anticuerpos anti- KIR3DL2 pueden comprender una variante de la región Fe, en la que la variante de la región Fe comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, poscyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más modificaciones de aminoácidos) relativa a una región Fe de tipo salvaje, de manera que la molécula tiene una función efectora mejorada con respecto a una molécula que comprende una región Fe de tipo salvaje, opcionalmente en donde la región variante de Fe comprende una sustitución en uno cualquiera o más de las posiciones 329, 298, 330, 332, 333 y/o 334 (por ejemplo, sustituciones S239D, S298A, A330L, I332E, E333A y/o K334A).

En una modalidad, los anticuerpos que tienen regiones Fe variantes o de tipo salvaje pueden haber alterado los patrones de glicosilación que aumentan la capacidad de enlazar al receptor Fe de los anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con la maquinaria de glicosilación alterada. Las células con la maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la téenica y se pueden utilizar como células huésped en las cuales se expresan anticuerpos recombinantes para producir de este modo un anticuerpo con la glicosilación alterada. Ver, por ejemplo, Shields, RL et al. (2002) J. Biol . Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat.

Biotech. 17: 176-1, asi como, la Patente Europea No: EP 1176195; Publicaciones PCT WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/54342, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Generalmente, tales anticuerpos con la glicosilación alterada son "glico-optimizados" tal que el anticuerpo tiene una estructura de N-glicano particular que produce ciertas propiedades deseables, incluyendo pero no limitadose a, el aumento de ADCC y actividad de enlace de células efectora en comparación con anticuerpos o anticuerpos que tienen una región constante de origen natural y son producidos por mieloma murina NSO y células de ovario de hámster chino (CHO) (Chu and Robinson, Current Opinión Biotechnol.2001, 12: 180-7), anticuerpos que expresan HEK293T como se producen en el presente documento en la sección de Ejemplos, o de otras líneas de células huésped de mamífero usadas comúnmente para producir anticuerpos terapéuticos recombinantes.

Los anticuerpos monoclonales producidos en las células huésped de mamíferos contienen un N-enlazado al sitio de glicosilación en Asn297 de cada cadena pesada. Los glicanos en anticuerpos son típicamente estructuras biatenarias complejas con muy poca o ninguna bisectriz N-acetilglucosamina (bisectriz GlcNAc) y altos niveles de fucosilación núcleo. Temini Glycan contiene ácido siálico no terminal o muy bajo y cantidades variables de galactosa. Para una revisión de los efectos de la glicosilación sobre la función de anticuerpos, ver, por ejemplo, Wright y Morrison, Trend Biotechnol. 15:26- 31 (1997). Un trabajo considerable muestra que los cambios en la composición de azúcar de la estructura de anticuerpos glicano pueden alterar las funciones efectoras Fe. Las estructuras de hidratos de carbono importantes que contribuyen a la actividad del anticuerpo se cree que son los residuos de fucosa unidos a través de alfa-1,6 vinculados con los residuos N-acetilglucosamina (GlacNAc) más internos de los oligosacáridos N-enlazados a la región Fe (Shields et al., 2002). Por lo tanto, los anticuerpos que tienen contenido de fucosa rebajado en glicanos ligados a N (glicanos N-enlazados a hypofucosylated) pueden ser producidos.

FcyR de enlace requiere la presencia de oligosacáridos unidos covalentemente a la Asn297 conservado en la región Fe de IgGI IgG2 o IgG3 del tipo humana. Estructuras oligosacáridas no fucosiladas han sido recientemente asociadas con un aumento espectacular de actividad in vitro ADCC . "Asn 297" se refiere al aminoácido asparagina situado aproximadamente en la posición 297 en la región Fe; basado en variaciones de secuencia menores de anticuerpos, Asn297 también puede estar ubicado en algunos aminoácidos (normalmente no más de 3 aminoácidos) rio arriba o rio abajo.

Históricamente, los anticuerpos producidos en células CHO que contienen alrededor de 2 a 6% en la población que son no fucosilados. YB2/0 (mieloma de rata) y linea celular Lecl3 (una lectina mutante de la línea CHO que tiene una deficiencia en GDP-manosa 4,6-deshidratasa que conduce a la deficiencia de GDP-fucosa) o intermedios de azúcar GDP que son el sustrato de alfa6-fucosiltransferasa se han reportado para producir anticuerpos con especies 78-98% de no fucosilados. En otros ejemplos, la interferencia de ARN (RNAi) o téenicas de knock-out se pueden emplear para diseñar células a cualquiera de disminuir los niveles de transcripción de FUT8mARN o knock out en la expresión de genes completamente, han sido reportados y tales anticuerpos para contener hasta 70% de glicanos no fucosilados.

Un anticuerpo de enlace a KIR3DL2 puede estar glicosilado con una cadena de azúcar en Asn297, dicho anticuerpo mostrando aumentó en la afinidad de enlace a través de su porción Fe a FcyRIII. En una modalidad de la invención, un anticuerpo comprenderá una región constante que comprende al menos una alteración de aminoácidos en la región Fe que mejora el enlace del anticuerpo a FcyRIIIa y/o ADCC.

En un aspecto, los anticuerpos se hipo fucosilan en su región constante. Tales anticuerpos pueden comprender una alteración de aminoácido o pueden no comprender una alteración de aminoácido pero son producidos o tratados en condiciones tales para dar tal hipo fucosilación. En un aspecto, una composición de anticuerpo comprende un anticuerpo quimérico, humano o humanizado descrito en el presente documento, en donde al menos 20, 30, 40, 50, 60, 75, 85, 90, 95% o sustancialmente todas las especies de anticuerpos en la composición tienen una región constante que comprende una estructura de carbohidrato central (por ejemplo, estructuras de alta mañosa, híbrida y compleja) que carece de fucosa. En una modalidad, se proporciona una composición de anticuerpo que está libre de anticuerpos que comprenden una estructura de hidratos de carbono de núcleo que tiene fucosa. El núcleo del carbonohidrato será preferiblemente una cadena de azúcar en Asn297.

En una modalidad, se proporciona una composición de anticuerpo, por ejemplo, una composición que comprende anticuerpos que se enlazan a KIR3DL2, son glicosiladas con una cadena de azúcar en Asn297, en donde los anticuerpos están parcialmente fucosilados. Anticuerpos parcialmente fucosilados se caracterizan en que la proporción de anticuerpos anti-KIR3DL2 en la composición que carece de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297 está entre 20% y 90%, preferiblemente entre 20% y 80%, preferiblemente entre 20% y 50%, 55%, 60%, 70% o 75%, entre 35% y 50%, 55%, 60%, 70% o 75%, o entre 45% y 50%, 55%, 60%, 70% o 75%. Preferiblemente, el anticuerpo es de IgGl humana o tipo IgG3.

La cadena de azúcar además muestra que puede mostrar cualquier características (por ejemplo, presencia y proporción de estructuras de alta mañosa, híbrida y compleja), incluyendo las características de glicanos N-enlazados unidos a Asn297 de un anticuerpo de una célula humana, o de un anticuerpo expresado de forma recombinante en una célula de roedor, célula murina (por ejemplo células CHO) o en una célula aviar.

En una modalidad, el anticuerpo se expresa en una célula que es deficiente en una enzima de fucosiltransferasa de tal manera que la línea celular produce proteínas que carecen de fucosa en sus carbohidratos de núcleo. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y MS709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), tal que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y MS709 carecen de fucosa en sus carbohidratos de núcleo. Estas líneas celulares fueron creadas por la alteración dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (ver la Patente US No. 20040110704 por Yamane et al·.; y Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia). Otros ejemplos incluyen el uso de la supresión antisentido, interferencia de ARN de doble cadena (dsRNA), horquilla de ARN (hpRNA), interferencia u horquilla de ARN que contiene introñes (ihpRNA), interferencia para perturbar funcionalmente el gen FUT8. En una modalidad, el anticuerpo se expresa en una linea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, tal que los anticuerpos expresados en dicha linea celular que exhibe hipo fucosilación mediante la reducción o la eliminación de la enzima relacionada al enlace alfa 1,6.

En una modalidad, el anticuerpo se expresa en lineas celulares diseñadas para expresar glicoproteinas que modifican glicosiltransferasas (por ejemplo, beta (1,4) -N-acetilglucosaminil-transferasa III (GnTHI)) tales que los anticuerpos expresados en las lineas celulares diseñadas exhiben aumentó estructuras GlcNAc bisectriz que resultan en aumento de la actividad ADCC de los anticuerpos (Publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al.; y Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180, cuyas descripciones se incorporan en el presente documento por referencia).

En otra modalidad, el anticuerpo se expresa y el residuo (s) de fucosil se escinde usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, el fucosidase alfa-L-fucosidasa elimina los residuos fucosil de anticuerpos (Tarentino, et al. (1975) Biochem. 14:5516-5523). En otros ejemplos, una línea celular produciendo un anticuerpo puede ser tratada con un inhibidor de la glicosilación; Zhou et al. Biotech. y Bioengin. 99:652-665 (2008) describe el tratamiento de células CHO con la alfa-manosidasa I inhibidor, kifunensine, resultando en la producción de anticuerpos con oligomanosa no fucosilada de tipo N-glucanos.

En una modalidad, el anticuerpo se expresa en una línea celular que, naturalmente, tiene una baja actividad de la enzima para añadir fucosil a la N-acetilglucosamina que se enlaza a la región Fe del anticuerpo o no tiene la actividad de la enzima, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). Otro ejemplo de las líneas celulares incluyen una variante línea celular CHO, células Led 3, con disminución de la capacidad para unir fucosil a carbohidratos vinculados a Asn (297), también resulta en hipo fucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (WO 03/035835 (Presta et al); y Shields, RX. et al. (2002) J. Biol. Che . 277:26733-26740, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia). En otra modalidad, el anticuerpo se expresa en una célula aviar, preferiblemente una célula EBx® (Vivalis, Francia), que produce naturalmente anticuerpos con bajo contenido de fucosa por ejemplo WO2008/142124. Glicanos Hipo fucosilados también se pueden producir en líneas celulares de origen vegetal, por ejemplo, el documento WO 07/084926 A2 (Biolex Inc.), WO 08/006554 (Greenovation Biotech GMBH), cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia.

USOS EN DIAGNÓSTICO Y TERAPIA En ciertas modalidades, los presentes anticuerpos se utilizan para purificar o identificar células positivas KIR3DL2 a partir de una muestra biológica. Las muestras biológicas pueden obtenerse de un paciente, por ejemplo para fines de diagnóstico o terapéuticos ex vivo, o de individuos o primates no humanos para obtener una fuente de dichas células con fines de investigación.

Células positivas KIR3DL2 se pueden purificar o identificar usando los presentes anticuerpos con cualquiera de un número de métodos estándar. Por ejemplo, las células de sangre periférica pueden ser ordenados usando un escáner FACS usando anticuerpos marcados específicos para KIR3DL2, y opcionalmente a otras moléculas normalmente presentes en las células de la superficie celular, por ejemplo, CD4, CD8 o CD30 de las células T; CD4 CD2+, CD3+, CD5+, CD8-, CD28+, CD45RO+ y/o TCR ab+ de células malignas en el Síndrome de Sezary; CD4+ (opcionalmente CD4+ y CD28-) en las enfermedades inflamatorias, autoinmunes o cardiovasculares .

Además, los anticuerpos pueden conjugarse o unirse covalentemente a un soporte sólido y utilizado para purificar o identificar células positivas KIR3DL2 o cualquier célula que exprese KIR3DL2 a partir de una muestra biológica, por ejemplo, a partir de una muestra de sangre o una biopsia de tejido de la mucosa de un paciente u otro individuo. Específicamente, la muestra biológica se pone en contacto con los anticuerpos en condiciones que permiten a las células dentro de la muestra enlazarse al anticuerpo, y luego las células se eluyen a partir del anticuerpo unido al soporte sólido.

Independientemente del método usado para aislar, purificar o identificar las células positivas KIR3DL2, la capacidad de hacerlo es útil para numerosos propósitos, por ejemplo, para diagnosticar un trastorno caracterizado por una expansión patógena de células que expresan KIR3DL2, mediante la evaluación del número o la actividad u otras características de las células positivas KIR3DL2 obtenidas de un paciente, o para evaluar la capacidad de los anticuerpos, o fragmentos o derivados de los mismos, para modular la actividad o el comportamiento de las células de un paciente antes de, por ejemplo, para uno de los tratamientos aquí descritos utilizando los anticuerpos. Además, las células positivas purificadas KIR3DL2 son útiles en un contexto de investigación, por ejemplo, para caracterizar mejor las células y sus diversas propiedades y comportamientos, así como para identificar compuestos o métodos que se pueden utilizar para modular su comportamiento, la actividad, o la proliferación. Los anticuerpos también pueden ser útiles en métodos de diagnóstico, por ejemplo en métodos de detección de polipéptidos KIR en células, por ejemplo células de la enfermedad de un paciente.

La presente descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que se enlaza específicamente a polipéptidos KIR3DL2 en la superficie de las células. El anticuerpo inhibe preferentemente el crecimiento o la actividad (por ejemplo la producción de citoquinas) de las células y/o conduce a la eliminación de las células KIR3DL2 positivas, preferiblemente a través de la inducción de la CDC y/o ADCC. La composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La descripción proporciona además un método para inhibir el crecimiento o la actividad de, y/o agotar, células positivas KIR3DL2, en un paciente en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición descrita en el presente documento. Tales métodos de tratamiento pueden ser utilizados para una serie de trastornos, incluyendo, pero no limitadose a CTCL, SS y MF, inflamatorias, autoinmunes y trastornos cardiovasculares.

Independientemente de la forma de las células CD4+CTCL, hay células T CD4+ malignas que expresan KIR3DL2 en su superficie. Asi KIR3DL2 cubre el rango de CD4+CTCL, y en particular el síndrome de Sézary ("SS"), micosis fungoide transformada ("MF transformada"), Limfomatoide Papulosis ("LP"), y CD30+linfornas.

Un diagnóstico (por ejemplo, un diagnóstico CTCL) puede basarse en el análisis de la presencia de KIR3DL2 en la superficie de las células CD4+ recogidas de la zona sospechosa del cuerpo (por ejemplo, muestra de piel eritrodermia cuando se sospecha MF transformada, o una muestra de sangre periférica cuando una forma CTCL más agresiva, como SS, se sospecha). Por lo general se puede concluir que una célula T CD4+ es tumoral tan pronto como hay polipéptidos KIR3DL2 detectados en la superficie de estas células T CD4+. El porcentaje de células T CD4+ KIR3DL2+ se puede medir en una muestra de sangre periférica obtenida de un paciente al que se sospecha de una SS, y dicho porcentaje corresponde sustancialmente con el porcentaje de células SS malignas que están realmente presentes en la sangre periférica de este paciente (generalmente dentro de un rango de ±10% o incluso un ±5% para la gama KIR3DL2+, células CD4+. KIR3DL2 y los anticuerpos anti-KIR3DL2 descritos en este documento, por lo tanto se pueden utilizar en la estadificación de la enfermedad, particularmente SS.

En la medida en que KIR3DL2 es un marcador universal para CTCL, los anticuerpos se pueden usar en combinación con otros tratamientos o marcadores de diagnóstico para la CTCL. Por ejemplo, CD30 de los cuales la presencia en la superficie de las células T CD4+ malignas indica que el paciente tiene una forma particular de CD4+CTCL de la cual se hace referencia en la téenica como CD30+linforna. Por lo tanto, CD30 es un marcador CTCL por una forma particular de CTCL (CD30+linforna), sin embargo CD30 no cubre todas las formas de CD4+CTCL ya que para CD4+CTCL tal como SS, MF transformada, o LP, allí no existe necesariamente una célula T CD4+ maligna la cual pueda expresar CD30 en su superficie. Por lo tanto, CD30 puede ser utilizado además de KIR3DL2 como un marcador en el diagnóstico y la terapia de CTCL. Además, un hallazgo de un paciente que tiene CD4+CTCL que expresa CD30 puede indicar que el paciente es adecuado para tratamiento con un anticuerpo anti-KIR3DL2 y un anticuerpo anti-CD30; Opcionalmente, el paciente puede entonces ser tratado con anticuerpo anti-KIR3DL2 y un anticuerpo anti-CD30.

En algunas modalidades, antes de la administración del anticuerpo o composición anti-KIR3DL2, la presencia de CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD30, CD45RO y/o TCRap será evaluada en células (por ejemplo, células patógenas) de un paciente. Un paciente cuyas células expresan (o no expresan, de conformidad con el trastorno y las células buscadas a las que va dirigida) un marcador puede entonces ser tratado con un anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición. En algunas modalidades, antes de la administración del anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición, la presencia de KIR3DL2 en las células del paciente serán evaluadas, por ejemplo, para determinar el nivel relativo y la actividad de las células positivas KIR3DL2 en el paciente, asi como para confirmar la eficacia de enlace de los anticuerpos a las células del paciente. Un paciente cuyas células expresan KIR3DL2 puede entonces ser tratado con un anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición. Esto se puede lograr mediante la obtención de una muestra de PBL o células desde el sitio de la enfermedad, y probar por ejemplo, usando inmunoensayos, para determinar la importancia relativa de los marcadores tales como CD4, CD8, CD30 o KIR3DL2 sobre las células.

En una modalidad, donde se busca inhibir la actividad o el crecimiento de, o agotar, las células positivas KIR3DL2 de un paciente, la capacidad del anticuerpo anti-KIR3DL2 para inhibir la proliferación de o agotar las células positivas KIR3DL2 de un paciente se evalúa. Si las células KIR3DL2-positivas se agotan por el anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición, el paciente se determina que es sensible a la terapia con un anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición, y, opcionalmente, el paciente es tratado con un anticuerpo anti-KIR3DL2 o composición.

En algunas modalidades, el método puede comprender la etapa adicional de administrar a dicho paciente un (segundo) agente terapéutico apropiado adicional seleccionado entre un agente inmunomodulador, un agente inmunosupresor, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un segundo anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de agotamiento) que se enlaza a un polipéptido presente en una célula que expresa KIR3DL2. Tales agentes adicionales se pueden administrar a dicho paciente como una forma de dosificación única junto con dicho anticuerpo, o como una forma de dosificación separada. La dosificación del anticuerpo (o anticuerpo y la dosificación del agente terapéutico adicional colectivamente) son suficientes para inducir de forma detectable, promover, y/o mejorar una respuesta terapéutica en el paciente. Cuando se administran por separado, el anticuerpo, fragmento, o derivado y el agente terapéutico adicional son deseablemente administrados bajo condiciones (por ejemplo, con respecto a la sincronización, el número de dosis, etc.) que dan como resultado un beneficio terapéutico combinado detectable para el paciente.

La micosis fungoide y el síndrome de Sézary más agresivo representan las formas más comunes de CTCL. El curso clínico de MF/SS suele ser indolente, con áreas eritematosas pruriginosas lentamente desarrolladas durante largos períodos. Eventualmente, sin embargo, las placas eritematosas se vuelven infiltradas progresivamente, convirtiéndose en placas y finalmente a los tumores ulcerosos. El pronóstico de MF/SS se basa en la extensión de la enfermedad en presentación. Los pacientes con enfermedad en fase I tienen una media de supervivencia de 20 años o más, en comparación con una supervivencia media de aproximadamente 3 a 4 años para los pacientes con fase III/IV enfermedad.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para el tratamiento en combinación con cualquier agente conocido por ser útil en el tratamiento de la malignidad de células T en particular. Varios tratamientos para CTCL están en uso, incluyendo los corticosteroides, mostaza nitrogenada, carmustina, tacrolimus tópico (Protopic®), imiquimod (Aldara®; 3M Inc.), retinoides tópicos, y rexinoides (bexaroteno; Targretin®; Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA)), así como la terapia de luz ultravioleta (Psoralen + UVA (PUVA), UVB de banda estrecha, y UVB), terapia fotodinámica (PDT) y la irradiación corporal. Los tratamientos también incluyen inhibidores de la histona desacetilasa tales como vorinostat (ácido hidroxámico suberoilanilida, Zolinza®) y Romidepsin (depsipéptido, FK-228, Istodax®), un péptido cíclico que inhibe selectivamente isotipos de histona desacetilasa 1, 2, 4 y 6. La quimioterapia o la combinación de quimioterapia también se utilizan. Los ejemplos incluyen gemcitabina, análogos de antifolatos tales como Pralatrexate (Folotyn®). Otras terapias incluyen IMiDs (fármacos inmunomoduladores), análogos derivados de la talidomida que tienen una amplia gama de efectos, incluyendo los efectos relacionados tanto inmunes y no inmunes. Los representantes de la clase IMiD incluyen CC-5013 (lenalidomida; Revli id®), CC-4047 (Actimid), y ENMD-0995. Otros tratamientos incluyen inhibidores de proteosoma tales como bortezomib (Velcade®), un inhibidor del proteasoma 26S reversibles. También se utiliza el trasplante de células madre.

Aunque no existe un tratamiento estándar actual para MF/SS, hay una tendencia general a confiar en las intervenciones tópicas para la terapia sistémica y más tóxica temprana del retraso de la enfermedad hasta el desarrollo de los síntomas extensos. Psoraleno y radiación ultravioleta A (PUVA), combinada o no con dosis bajas de interferón -a, es efectivo en las primeras etapas de MF/SS, induciendo la remisión completa (CR) en la mayoría de los pacientes. La radioterapia local o total de la piel de la irradiación con haz de electrones (haces de electrones) se ha utilizado con éxito para controlar la enfermedad avanzada en la piel. Fotoféresis extracorpórea también se puede utilizar con éxito pero generalmente no está disponible. Una vez que el enfermedad se vuelve refractaria a la terapia tópica, interferón -a, el bexaroteno rexinoid (Targretin®, Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA), un análogo retinoide sintético diana es el receptor X retinoide, la quimioterapia de un solo agente o quimioterapia de combinación se puede administrar. Los tratamientos, en particular las terapias dirigidas por la piel, incluyen, por ejemplo, corticosteroides, mostaza de nitrógeno, carmustina, tacrolimus tópico (Protopic®) e imiquimod (Aldara®; 3M Inc.). La duración de la respuesta es sin embargo a menudo menos de 1 año, y en última instancia, todos los pacientes tienen recaídas y la enfermedad se vuelve refractaria. La IL 2-diftérica denileukin diftitox toxina recombinante (DAB389IL-2, ONTAK®, Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA) es activa en pacientes con estadio Ib al estadio IV LCCT refractario a los tratamientos anteriores (respuesta global objetiva en el 30% de los 71 pacientes con una respuesta media de duración de 7 meses) y parece tener un efecto beneficioso en el alivio de los síntomas y la calidad de vida. Más recientemente, denileukin diftitox se ha probado en un ensayo de fase I en combinación con bexaroteno, ya que induce la regulación de CD25 in vitro. La combinación fue bien tolerada e indujo respuesta objetiva en el 67% de los 14 pacientes. Los eventos adversos más importantes son los que ya se han informado con bexaroteno solo (hipertrigliceridemia y la supresión de la función tiroidea debido a la disminución de la producción de TSH) y linfopenia grado 3 o 4 pero resolviendo el plazo de un mes de suspensión del tratamiento. El tiempo hasta el fracaso del tratamiento no se informó en este estudio. En otros estudios, los anticuerpos anti-CD4 que agotan las células que expresan CD4 se han desarrollado. Los ejemplos incluyen la IgGl totalmente humana anti-CD4 anticuerpo zanolimumab (HuMax-CD4; Genmab A/S y TenX BioPharma Inc.), y el quimérico monoclonal anti-CD4 (CM-T412, Centocor, Malvern, PA) se administró a 8 pacientes con MF y e inducijo respuesta objetiva en 7 de ellos, pero con una· duración media de respuesta de sólo 5 meses. Uvadex® (metoxaleno, Therakos Inc. Exton, PA) en fotoforesis corporal extra, también ha dado muestras de eficacia. El anticuerpo alemtuzumab monoclonal humanizado (hu-IgGi anti-CD52 mAb, Campath®, Millennium Pharmaceuticals, Inc. y ILEX Oncología, Inc., comercializado y distribuido en los EE.UU. por Berlex Laboratories, Inc., Montville, NJ) está indicado para el tratamiento de la Leucemia linfática crónica (LLC-B) en los pacientes que han sido tratados con agentes alquilantes y que han fracasado la terapia con fludarabina. Se ha probado en pacientes con MF/SS avanzada (fase III o IV) y dio lugar a respuestas objetivas en al menos la mitad de los casos (55% de 22 pacientes). Su perfil de efectos secundarios se compone principalmente de las reacciones de inmunosupresión y de infusión. Un estudio retrospectivo independiente describe también la toxicidad cardiaca significativa en 4 de 8 pacientes. Con remisiones duraderas observadas (media de tiempo hasta el fracaso del tratamiento de 12 meses, rango de 5 a 32+ meses), la terapia con alemtuzumab parece ser el tratamiento con la duración mediana de respuesta más favorable en comparación con todos los tratamientos reportados hasta la fecha. Otros agentes que pueden ser útiles incluyen anticuerpos anti-CCR4 (receptor 4 de quimiocinas C-C; CD194). Un ejemplo es mogamulizumab (KW-0761; AMG-761; nombre comercial Poteligeo, Kyowa Hakko Kirin Ltd., Japón y Amgen, EE.UU.), y anticuerpo anti-CCR4 humanizado. Otros agentes que pueden ser útiles incluyen anticuerpos anti-CD30. Un ejemplo es SGN-35 que es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que contiene el potente fármaco antimitótico, monometilauristatina E (MMAE), vinculado con el anticuerpo monoclonal anti-CD30, cAClO (Okelcy et al. (2010) Clin. Cáncer Res. 16(3): 888-897); otros ejemplos es la inmunoglobulina anti-CD30 humano (Ig) anticuerpo monoclonal GIK MDX-060 (Medarex Inc. y Bristol Myers Squibb; Ansell et al (2007) J. Clin Oncol 25:2767-2769). Cada uno de estos tratamientos pueden ser utilizados en combinación con los anticuerpos de la divulgación .

Los anticuerpos producidos utilizando los presentes métodos son particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios, asi como trastornos cardiovasculares más particularmente síndrome coronario agudo, artritis, artritis reumatoide, vascularitis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple y granulomatosas de Wegener, espondiloartritis. En general, los presentes métodos se pueden utilizar para tratar cualquier trastorno causado al menos en parte por la presencia o actividad de las células que expresan KIR3DL, por ejemplo, células NK o células T, T proinflamatorias o células NK que producen IL-17A, las células T tales como células Thl7 o células CD4+CD28 que expresan KIR3DL2, y que por lo tanto pueden ser tratados eficazmente por matar o inhibir selectivamente la proliferación o activación de células que expresan KIR3DL2.

En algunas modalidades, antes de la administración del anticuerpo anti-KIR3DL2, se evaluó la expresión de KIR3DL2 en las células subyacentes del trastorno particular. Esto se puede lograr mediante la obtención de una muestra de PBL o células desde el sitio de la enfermedad (por ejemplo, a partir de la membrana sinovial en pacientes con RA), y el ensayo por ejemplo, usando inmunoensayos, para determinar la importancia relativa de los marcadores tales como CD4, CD28, etc., asi como KIR3DL2 en las células. Otros métodos también pueden utilizarse para detectar la expresión de KIR3DL2 y otros genes, tales como los métodos basados en ARN, por ejemplo, RT-PCR o transferencia Northern.

El tratamiento puede implicar múltiples rondas de administración del anticuerpo o del compuesto. Por ejemplo, tras una ronda inicial de administración, el nivel y/o actividad de KIR3DL expresando células T o NK (por ejemplo, células T CD4+CD28, células T CD4+ malignas) en el paciente serán generalmente re-medidas, y si es todavía elevada, una ronda adicional de la administración se puede realizar. De esta manera, múltiples rondas de detección de receptor y de la administración del anticuerpo o del compuesto pueden realizarse, por ejemplo, hasta que el trastorno se pone bajo control.

Cuando se utiliza para el tratamiento de trastornos autoinmunes o inflamatorios, los anticuerpos anti-KIR3DL2 de la divulgación pueden usarse para el tratamiento en combinación con cualquier agente conocido por ser útil en el tratamiento del trastorno inflamatorio particular, trastorno autoinmune, o trastorno cardiovascular. Los anticuerpos anti-KIR3DL2 se pueden combinar por ejemplo con agentes esteroideos antiinflamatorios, agentes anti-inflamatorios no esteroideos, anti-metabolitos y otros agentes utilizados en el tratamiento cardiovascular, enfermedades inflamatorias o autoinmunes. En algunas modalidades, los agentes antiinflamatorios comprenden agentes anti-inflamatorios esteroideos, que incluyen glucocorticosteroides y mineralocorticoides. Estos pueden ser administrados por cualquiera de los métodos adecuados para el tratamiento de los trastornos inflamatorios, incluyendo, entre otros, oral, intravenosa, intramuscular, dérmica, o rutas nasales. En algunas modalidades, los agentes anti-inflamatorios comprenden agentes antiinflamatorios no esteroideos. Estos agentes actúan generalmente mediante la inhibición de la acción de las enzimas ciclooxigenasa y lipoxigenasa, o receptores de los mediadores generados por estas enzimas. Los compuestos anti-inflamatorios no esteroideos incluyen inhibidores no selectivos de la COX, inhibidores selectivos de la COX, asi como antagonistas de FLAP y antagonistas de 5-lipoxigenasa. En algunas modalidades, los agentes anti inflamatorios pueden comprender anti-metabolitos que afectan la proliferación de las células implicadas en la respuesta inmune. Antimetabolitos adecuados incluyen análogos de folato, tales como metotrexato; inhibidores inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH), tales como micofenolato de mofetilo; y azatiopurina. Los compuestos de este grupo en general, afectan la producción de los sustratos necesarios para la replicación del ADN, inhibiendo de ese modo la proliferación de las células que participan o se activan en respuesta a una reacción inflamatoria. En algunas modalidades, el agente anti-inflamatorio es un agente que bloquea la acción del TNF-alfa, la principal citoquina implicada en trastornos inflamatorios. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNF es un anticuerpo que bloquea la acción de TNFalfa. Un anticuerpo anti-TNF ejemplar es infliximab (Remicade®). En otras modalidades, el agente anti-TNFalfa es un constructo receptor que se enlaza a TNFalfa e impide su interacción con receptores de TNF presentes en las células, por ejemplo, entanercept (Enbrel®). En otras modalidades, el agente anti-inflamatorio es cualquier otro agente (por ejemplo, un agente de anticuerpos) que tiene propiedades inmunosupresoras y útiles en el tratamiento del trastorno que está siendo tratado con el anticuerpo KIR3DL2 descrito aquí.

LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Los portadores farmacéuticamente aceptables que pueden ser usados en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio , mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos saturados vegetales, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietileno glicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros que bloquean polietileno-polioxipropileno-, polietilenglicol y grasa de lana. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden emplear en un método para modular, por ejemplo inhibir, la actividad de las células que expresan KIR3DL2 en un paciente. Este método comprende la etapa de poner en contacto dicha composición con dicho paciente. Dicho método será útil tanto para la profilaxis y fines terapéuticos.

Para uso en la administración a un paciente, la composición se formula para la administración al paciente. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar por vía oral, parenteral, por pulverización para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El uso en este documento incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o téenicas de infusión. El anticuerpo puede estar presente en una dosis única en una cantidad, por ejemplo, de entre aproximadamente 25 mg y 500 mg.

Las formas inyectables estériles de las composiciones descritas en este documento pueden ser acuosas o una suspensión oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente parenteralmente aceptable no tóxico o disolvente, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los portadores y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo suave puede emplearse incluyendo sintéticos mono o diglicéridos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en las preparaciones inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietilados. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente de alcohol de cadena larga o dispersante, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de sólido farmacéuticamente aceptable, liquido, u otras formas de dosificación también pueden ser utilizados para los propósitos de formulación.

Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar por via oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitadose a, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, portadores comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. Agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, también se añaden típicamente. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen, por ejemplo, lactosa. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.

Alternativamente, las composiciones descritas en este documento se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero liquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.

Las composiciones descritas en este documento también pueden administrarse tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo, la . piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, las composiciones se pueden formular en un ungüento adecuado que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para administración tópica de los compuestos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina liquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones se pueden formular en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cetil ésteres de cera, alcohol cetearilico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

Los presentes anticuerpos pueden ser incluidos en los kits. Los kits pueden contener además opcionalmente cualquier número de anticuerpos y/o en otros compuestos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o cualquier otro número de anticuerpos y/o compuestos terapéuticos. Se apreciará que esta descripción de los contenidos de los kits no es limitante de ninguna manera. Por ejemplo, el kit puede contener otros tipos de compuestos terapéuticos. Preferiblemente, los kits también incluyen instrucciones para usar los anticuerpos, por ejemplo, detallando los métodos descritos en este documento.

FORMAS DE DOSIFICACIÓN Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos se preparan para.su almacenamiento mediante la mezcla de los anticuerpos que tienen el grado de pureza deseado con portadores farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Para obtener información general sobre las formulaciones, ver, por ejemplo, Gilman et al. (eds.), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed. (Pergamon Press, 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990); Avis et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications (Dekker, New York, 1993); Lieberman et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Dekker, New York, 1990); Lieberman et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems (Dekker, New York, 1990); and Walters (ed.), Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119 (Dekker, New York, 2002).

Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) polipéptidos; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.

Formulaciones de anticuerpos ejemplares se describen por ejemplo en el documento WO 1998/56418, que describe una formulación de multidosis líquida para un anticuerpo anti-CD20, que comprende 40 mg/mL de rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, 0.9% de alcohol bencílico, y 0.02% polysorbate20™ a pH 5.0 que tiene una vida útil mínimo de dos años de almacenamiento a 2-8°C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/mL de rituximab en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 7.35 mg/mL de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/mL POLYSORBATE80™, y agua estéril para inyección, pH 6.5.

Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administración subcutánea se describen, por ejemplo, en la patente US. No. 6,267,958 (Andya et al.). Dichas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado hasta una concentración elevada de proteínas y la formulación reconstituida puede administrarse por vía subcutánea al mamífero a ser tratado en el presente documento.

La formulación del presente documento también puede contener más de un compuesto activo (un segundo medicamento como se señaló anteriormente), preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Las cantidades de tipo y eficaces de tales medicamentos dependen, por ejemplo, de la cantidad y tipo de células B antagonista presentes en la formulación, y los parámetros clínicos de los sujetos. Ejemplares de segundos medicamentos se han señalado anteriormente.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante téenicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales téenicas se describen en Pharmaceutical Sciences de Remington, supra, por ejemplo.

Formulaciones de liberación sostenida se pueden preparar. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli (alcohol vinílico)), polilactidas (Patente US No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y g| etil L-glutamato, acetato de etilen-vinil no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradadles tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Los portadores farmacéuticamente aceptables que pueden ser usados en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina de suero humano, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio , glicéridos parciales mezclas de ácidos grasos de vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato disódico hidrogenado, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietileno glicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros que bloquean polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Otros aspectos y ventajas se describen en la sección experimental siguiente, que debe considerarse como ilustrativa y no limitante del alcance de esta aplicación.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Generación de anticuerpos anti-KIR3DL2 Materiales y métodos Exámenes de citometría de flujo primaria y secundaria mAbs anti-KIR3DL2 fueron seleccionados principalmente en citometría de flujo para el enlace a líneas celulares de Sézary que expresan KIR3DL2 (HUT78 y COU-L) y para las lineas celulares tumorales KIR3DL2 transfectadas (HEK-293T). Dispositivos de citometría de flujo incluyen: FACSarray (BD Biosciences, pantallas primarias), FACSCanto II n°l et n°2 (BD Biosciences)(pantallas secundarias) y FC500 (Beckman Coulter) (pantallas secundarias). El KIR3DL2+ y otras lineas celulares tumorales utilizadas incluyen: • HUT-78 (lineas celulares Sézary positivas KIR3DL2) cultivadas en IMDM completo ; • HEK-293T (cáncer de riñón humano)/KIR3DL2 y HEK- 293T/KIR3DL2 Dominio 0 - linea celular eGFP (cultivadas en DMEM completo) ; • COU-L (lineas celulares Sézary positivas KIR3DL2) (cultivados en RPMI completo complementado con 10% de suero humano AB); • HEK-293T/KIR3DL1 y HEK-293T/KIR3DL1 - línea celular eGFP (cultivadas en DMEM completo); • B221 (linfoblastoide-B, línea celular humana positiva CD20)/línea celular KIR3DL2 (cultivada en RPMI completo que contenía suero FCS); y • RAJI (línea celular humana positiva CD20 de |)/línea celular KIR3DL2 (cultivadas en RPMI completo que contiene suero FCS).

Considerando que ninguna de las lineas celulares de Sézary utilizadas crecen después de la transferencia IV o SC a ratones inmunes comprometidos, B221 que transfecta KIR3DL2 o células Raji crecen como diseminadas (IV) o tumores sólidos (SC) después de la inyección a los ratones.

Basado en la información disponible en Gardiner et al, Journal of Immunology 2001 (vol 166, p2992-3001), se determinaron los alelos de genes KIR3DL2 presentes en las lineas de células tumorales utilizadas. Hemos establecido que la linea celular Sezary COU-L es heterocigótica para los alelos 3DL2*003 y 3DL2*008 y HUT-78 es heterocigoto para alelos 3DL2*002 y 3DL2*007. Todos los 4 alelos 3DL2*003, 3DL2*008, 3DL2*002 y 3DL2*007 codifican variantes de la proteina KIR3DL2 teniendo diferencias en sus dominios extracelulares. De nota, el recombinante de proteina de fusión KIR3DL2-Fc que se utilizó para inmunizar ratones está codificado por diferentes alelos del gen KIR3DL2 3DL2*006 y 3DL2*007 (clon 1.1, ambos alelos que codifican la misma secuencia de proteina del dominio extracelular).

Líneas celulares de dominios KIR3DL2 0 , 1 y 2 17 células/HEK293T fueron cultivadas en DMEM (Gibco) suplementado con piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 U/ l), estreptomicina (100 mg/ml) y 10% FCS inactivado por calor (PAN biotech). Reactivo Lipofectamino 2000, Trizol, SuperScript II de la transcriptasa inversa, vector pcDNA3.1 y anticuerpos anti-V5-FITC fueron adquiridos de Invitrogen. (H+L)-PE de cabra anti-ratón se adquirió de Beckman Coulter. PBMC (5xl06 células) de Homo Sapiens se resuspendieron en 1 L de reactivo Trizol. La extracción de ARN se realizó mediante la adición de 200 ml de cloroformo. Después de la centrifugación (15 min, 13000 rpm), el ARN se precipitó de la fase acuosa con 500 ml de isopropanol. Después de la incubación (10 min, RT) y centrifugación (10 min, 13000), el ARN se lavó con etanol al 70% y se re-centrifugó (5 min, 13000 rpm). El ARN se re-suspendió en H2O RNasa libre de agua. cDNA se obtuvo utilizando transcriptasa inversa SuperScript II usando 2 mg de ARN especifico y siguiendo las instrucciones del fabricante. Secuencias de dominio 0, dominio 1 y el dominio 2 KIR3DL2 humano (número de acceso U30272, KIR3DL2 alelo*002) se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Secuencias KIR3DL2 de Homo Sapiens (número de acceso U30272) dominio 0, dominio 1 y dominio 2 fueron amplificadas por la reacción de PCR de cDNA utilizando 5' AA GCT AGC GGT AAG AAC AAC AAC AAC ATC CTC CTC CTC GGT GAT TCT ACG CTC ATG GGT GGT CAG GAC AAA C (SEQ ID NO: 71) (forward) y 3 ' AA GGA TCC TCC CTC TGA TTT CAG CAG GGT (SEQ ID NO: 72) (reverse); 5 'GCT AA AGC GGT AAG AAC AAC AAC AAC ATC CTC CTC CTC GGT GAT TCT ACG ACA GTC ATC CTG CAA TGT TGG (SEQ ID NO: 73) (forward) y 3' AA GGA TCC CTC TCC TGC CTG AAC CGT GGG ( SEQ ID NO: 74) (reverse); 5 'GCT AA AGC GGT AAG AAC AAC AAC AAC ATC CTC CTC CTC GGT GAT TCT ACG AAC GTG ACC TTG TCC TGT AGC (SEQ ID NO: 75) (a delante) y 3' AA GGA TCC ATG CAG GTG TCT GCA GAT CAC ( SEQ ID NO: 76) (reverse) oligonucleótidos respectivamente.

Después de la clonación de TA y secuenciación, las secuencias se clonaron en el vector pcDNA3.1 entre los sitios de restricción Nhel y BamHI. Estas construcciones se insertaron entre el péptido CD33 líder y el anclaje CD24 GPI (ADN de anclaje CD24 GPI y las secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOS: 77 y 78, respectivamente) sintetizado por MWG Biotech (insertado entre sitios de restricción BamHI y HindIII). 17 células/HEK-293T fueron sembradas 24 horas antes de la transfección en placas de 6 pozos (células/pocillo 5.105) en DMEM sin antibióticos. Las transfecciones se realizaron utilizando 5 mg de las diferentes construcciones pcDNA3.1/KIR3DL2 dominio 0, pcDNA3.1/ KIR3DL2 dominio 1 o pcDNA3.1/ KIR3DL2 dominio 2 utilizando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para asegurar la pureza del ADN para la transfección, se utilizó un kit libre de endotoxina Maxi-prep de Qiagen. La relación de Lipofectamine/ADN utilizado se fijó en 2/1. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección para experimentos de citometría de flujo.

INMUNIZACIÓN Los ratones fueron inmunizados con proteína de fusión Fc-KIR3DL2 recombinante (alelo *006). El sobrenadante (SN) de los hibridomas en crecimiento fueron probados por citometria de flujo en HUT78, COU-L y HEK-293T/KIR3DL2 Dominio 0-eGFP.

Potencialmente hibridomas interesantes seleccionados de la selección inicial se clonaron limitando téenicas de dilución en placas de 96 pozos. La pantalla secundaria involucrada en la selección de hibrido as de interés probando sobrenadantes de los subclones por citometria de flujo en HUT78, COU-L, HEK-293T/KIR3DL1 Dominio 0-eGFP y HEK-293T/KIR3DL2 Dominio 0-eGFP. Subclones positivos fueron inyectados en ratones para producir ascitis y los anticuerpos de interés se purificaron antes de ser probados en un ensayo Biacore usando chips KIR3DL2 REC, seguido de varios formatos de ensayos basados en el enlace a células que expresan KIR3DL2 humanos. Entre los clones seleccionados fueron sobrenadantes de anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 y 20E9. Basado en la pantalla que permite la selección entre el dominio de enlace DO o Dl/2, los anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1 y 1E2 se enlazan a KIR3DL2 presente en el dominio extracelular 0 (DO), mientras 1C3 y 20E9 enlazaron a un epitopo presente en un medio de dominio (D2).

Las secuencias de dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VL) de anticuerpos seleccionados fueron amplificados por PCR a partir del ADNc de cada anticuerpo. Las secuencias amplificadas se corrieron en gel de agarosa y luego se purificaron usando el kit de extracción de Gel Qiagen. Secuencias VH y VL fueron Sub-clonadas después en los vectores de expresión Lonza (Vectores de doble gen) utilizando el sistema de infusión (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la secuenciación, los vectores que contienen las secuencias VH y VL se prepararon como Maxiprep usando el Promega PureYield™ Plasraid Maxiprep System. Los vectores fueron utilizados para la transfección de células HEK-293T usando Lipofectamina de Invitrogen 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2 - Los anticuerpos que no inducen la internalización KIR3DL2 En pocas palabras, ya sea sin anticuerpo o 20 mg/mL de un anticuerpo anti—KIR3DL2 dominio 0, o anticuerpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9 fueron incubados con células frescas de Síndrome de Sezary de 5 diferentes donantes humanos, durante 24 horas a 37°C. Las células fueron lavadas, fijadas y permeabilizadas usando el reactivo de permeabilización IntraPrep de Beckman Coulter. Presencia de enlace KIR3DL2 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 o 20E9 Ab se revela con un anticuerpo de cabra anti-ratón, marcado con GAM-PE. La Tabla 6 muestra un ejemplo de un anticuerpo 13H1 anti-KIR3DL2 dominio 0, después de la incubación de 24 h, respectivamente.

La Tabla 5 muestra una fuerte disminución de la fluorescencia para 13H1 en cada uno de los diferentes donantes, lo que confirma que el enlace de este anticuerpo disminuye la modulación de la expresión de KIR3DL2 en las células SS. Se obtuvieron resultados similares para el anticuerpo anti-DO 4B5, asi como para una gama de anticuerpos anti-Dl. Por el contrario, los anticuerpos anti-KIR3DL2 dominio 0 o dominio 2 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 5H1, 1E2, 1C3 y 20E9 no resultaron en una disminución en la fluorescencia lo que indica que este anticuerpo no disminuye la modulación de la expresión de KIR3DL2 en las células SS. La Tabla 6 muestra un ejemplo representativo para el anticuerpo 10G5.

Tabla 5 Ejemplo 3 - anticuerpos que no se internaliza en la linea celular de Sezary Sydrome La internalización de los anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 y 20E9, así como del anticuerpo AZ158 (un mAb anti-dominio 0) y otros anticuerpos anti-Dl se evaluaron por fluoro-microscopía utilizando la línea celular HUT78 SS.

MATERIALES Y MÉTODOS Células Hut-78 se incubaron durante 1 hora a 4°C con 10 mg/raL de los diferentes anticuerpos. Después de esta incubación las células fueron ya sea fijo (t = 0 horas) o incubadas durante 2 horas a 37°C. Las células incubadas durante 2 horas fueron fijadas y teñidas. Los anticuerpos fueron teñidos utilizando anticuerpos de cabra anti-ratón acoplados a Alexa594 (Invitrogen, A11032). Compartimentos LAMP-1 fueron teñidos utilizando anticuerpos de conejo anti-LAMP-1 (Abcam, ab24170) revelados por anticuerpos policlonales de cabra anti-conejo acoplados a FITC (Abcam ab6717). Fotos fueron adquiridas mediante un dispositivo Apotome (Zeiss) y analizados utilizando el software Axiovision.

RESULTADOS MAb anti-KIR3DL2 eran visibles en rojo mientras que compartimentos LAMP-1 eran visibles en verde. En el momento de adición de anticuerpos, la tinción de KIR3DL2 en rojo era visible en la superficie celular mientras que LAMP-1 era visible intracelularmente en verde. Sin embargo, a las 2 horas siguientes a la adición de anticuerpos, cada uno de los anticuerpos AZ158, 13H1 y 4B5, y los anticuerpos anti-Dl causaron tinción roja que se localizó con la tinción de verde, junto con una disminución en la tinción con roja en la superficie celular, lo que indica que AZ158 , 13H1 y 4B5, y los anticuerpos anti-Dl se internalizaron rápidamente. Los anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 5H1, 1E2, 1C3 y 20E9, sin embargo no se internalizaron, y a las 2 horas siguientes a la adición del anticuerpo, la tinción roja se mantuvo completamente en la superficie celular.

Ejemplo 4 - Los anticuerpos son capaces de matar una KIR3DL2 que expresar objetivos a traves del mecanismo dependiente del complemento (CDC) En resumen, 50 mL de 20 mg/mL de anticuerpos diluidos (concentrados 2x) se proporcionaron en medio estándar unos White clear bottom P96 wells (Ref 655098 - Greiner), a los que se agregaron 50 ml de una suspensión celular a 2 millones por mL (100000 células por pocilio ) en medio estándar, y se incubaron durante 30 min a 4°C. Se añadieron 5pl por pocilio de complemento recién reconstituido (Cedarlan Ref CL3441) seguido de 1 hora de incubación a 37°C. Se añadieron 100 pl por pocilio de Cell Titer Glo (Ref G7572 - Promega), seguido por 10 min a temperatura ambiente de incubación protegido de la luz. Los resultados se leen utilizando un luminómetro (VICTOR).

Usando complemento purificado a partir de sangre de conejo, la capacidad de nuestros mAbs anti-KIR3DL2 para reclutar células B221 transfectadas con KIR3DL2 del complemento y lisis fue dirigida in vitro.

La Figura 6 muestra la capacidad de los anticuerpos para mediar CDC; mAbs anti-KIR3DL2 que se enlazan al dominio DO están en gris, los que se enlazan al dominio DI están en negro. Con los mAbs de murinas parentales, el isotipo del mAb tiene la influencia más prominente en el resultado de este ensayo como las mAbs murinas IgG2b que enlazan al complemento de manera más eficiente que cualquier otro isotipo (IgGl de ratón no se enlazan al complemento en absoluto).

Para hacer frente al impacto en la muerte de la célula diana mediada por el complemento la internalización de KIR3DL2 tras el enlace con mABs anti-KIR3DL2, utilizamos mol9Hl2, un anticuerpo anti-KIR3DL2 que induce una rápida internalización de KIR3DL2 en linea celular Sezary HUT78 y B221-KIR3DL2. Antes de la incubación con el complemento, se pre-incubaron las B221-KIR3DL2 objetivo con mol9Hl2 ya sea a 4°C (la internalización se bloquea) o a 37°C (que permite la internalización óptima). Después, se añadió complemento, se incubó y se midió la CDC como anteriormente.

En este experimento, la internalización de KIR3DL2 tras el enlace anula totalmente la capacidad de mol9H12 para matar B221-KIR3DL2 con el reclutamiento del complemento, mientras que en condiciones de temperatura que limitan la internalización, la actividad CDC de mol9H12 se observa claramente (Figura 7). Rituximab anti-CD20 se utiliza como un control que media la CDC contra objetivos CD20+, pero no induce la internalización CD20.

MAbs seleccionados fueron quimerizados en IgGl humana para hacerlos capaces de mediar funciones efectoras (ADCC y CDC). La Figura 8 muestra la capacidad de mAbs anti-KIR3DL2 quiméricos para mediar CDC contra B221-KIR3DL2 in vitro.

Ciertos clones de mAb tipo 1E2 y 10G5 tienen, después de la quimerización, la capacidad adquirida de matar objetivos KIR3DL2 positivos a través de un mecanismo de CDC. En este experimento, por mAbs anti-DO, la internalización potente (tal como la inducida por 13H1, en negro), pueda prevenir la eficacia óptima como se observa para 1E2 y 10G5 en particular.

Ejemplo 5 - Anticuerpos que son capaces de matar KIR3DL2 expresando objetivos a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) La lisis celular a través de un mecanismo de ADCC fue monitoreada experimento de liberación basado en la radiactividad de 51Cr (el nivel de radiactividad liberada de las células diana precargadas es proporcional a su muerte). Un millón de células diana se cargaron con 51Cr durante 1 hora a 37°C y se lavaron 3 veces.3000 células fueron sembradas por pozo (U-shaped bottom 96-well piafes) y Abs de prueba se añaden a 10 o 20 mg/mL de concentración final (o aumentan las concentraciones si se estudia la relación dosis-respuesta). Se añadieron células efectoras en una relación definida efector: objetivo (en general 10:1) y la mezcla se incubó a 37°C durante 4 horas. El sobrenadante se analiza en un aparato Lumaplate. Cuando se utilizan mAbs HuIgGl quiméricas, las células efectoras fueron células NK humanas alogénicas purificadas a partir de PBMC obtenida de un donante voluntario sano.

Para la evaluación óptima, los experimentos de ADCC se realizaron generalmente usando mAbs HuIgGl quimerizados generados a partir de diferentes mAbs anti-KIR3DL2 murinas parentales. La Figura 9 muestra la capacidad de una serie de mAbs anti-KIR3DL2, probadas a la misma concentración final (10 pg/ml), para matar la linea celular de Sezary prototipica HUT78 a través de un mecanismo de ADCC mediada.

La Figura 10 muestra un experimento similar en donde las células diana utilizadas son B221 KIR3DL2-transfectadas que son en general más sensibles a la muerte ADCC mediada por mAb anti-KIR3DL2 . Los mAbs mostrados en gris inducen la internalización del receptor y parecen ser menos eficientes que los otros 4 mAbs que no inducen la internalización KIR3DL2.

La Figura 11 muestra una comparación de anticuerpos en un experimento de rango de dosis de la capacidad de mAbs anti-KIR3DL2 HuIgGl quimerizados para mediar ADCC contra objetivos B221 que expresan KIR3DL2, el perfil de eficacia de mAbs que no inducen la internalización del objetivo (10F6, 2B12 y 10G5) es mejor que la de mAbs que inducen la internalización KIR3DL2 (13H1 y anti-DO mAb 15C11 y 18B10).

Ejemplo 6 - La actividad en modelos de xenoin ertos de ratón de KIR3DL2 expresando tumores humanos MATERIALES Y MÉTODOS Ratones NOD-SCID comprometidos inmunes utilizados para los modelos RAJI-KIR3DL2 y B221-KIR3DL2 fueron adquiridos de Charles River Laboratories. En los siguientes modelos, 5 millones de células tumorales humanas (en 100 mL de PBS como portador) fueron injertados IV en el día 0 (DO), es decir, 1 día antes de la iniciación del tratamiento (Di). De DI, los ratones fueron tratados IV con diferentes dosis de mAbs (las dosis fueron adaptadas al peso corporal del ratón) diluido en PBS, 2 inyecciones por semana durante la duración de todo el experimento Los grupos control incluían, dependiendo del experimento: • Ratones tratados con PBS/placebo como control de crecimiento tumoral normal/no afectado; • Los ratones inyectados con la misma dosis de isotipo del mismo control de mAb dirigidos contra un antigeno irrelevante.

Los ratones se pesaron y se observaron para detectar signos clínicos cada 2 a 5 días, dependiendo del modelo. Porcentaje de cambios de peso corporal se calculó en comparación con el peso corporal en DO antes de injerto del tumor o con el más alto peso corporal alcanzado durante el experimento. Muertes de los ratones o pérdidas de peso importantes se registraron y se utilizaron para trazar las curvas de supervivencia Kaplan-Meier y calcular mejora de la supervivencia en comparación con los grupos de control de ratones.

RESULTADOS La Figura 12 muestra los resultados de un experimento (n=6 ratones NOD-SCID por grupo) en donde la eficacia de 9E10 y 19hl2 anti-KIR3DL2 murina isotipo 3 IgG2b (ambos administrados en 300 mg/ratón, dos veces a la semana) fue probado contra xenoinjertos B221-KIR3DL2 SC. No internalizando el anticuerpo anti-DO 9E10 mostró una mayor supervivencia en comparación con los dos PBS y la internalización de anticuerpos anti-Dl/D219hl2.

La Figura 13 muestra los resultados de otro experimento (n=6 ratones NOD-SCID por grupo) en donde la eficacia de anti-KIR3DL2 murina 19hl2 (dado en 300 mg/ratón, dos veces a la semana) fue probada contra xenoinjertos RAJI-KIR3DL2 SC. In vitro, células Raji KIR3DL2 transíectadas mostraron menos internalización sobre el enlace mAb que B221-KIR3DL2 o lineas de células de Sézary. En el modelo de xenoinjerto RAJI-KIR3DL2, mAb mol9H12 fue más eficiente que en el modelo B221-KIR3DL2. Esto es debido a la internalización menos potente del objetivo in vivo.

Ejemplo 7 - Ligando bloqueo MATERIALES Y MÉTODOS Inhibición de anticuerpos de tinción de tetrámero.

La preparación y tinción FACS del dimero B27 y el tetrámero HLA-A3 se han descrito previamente (Kollnberger, et al. (2007). Eur J Immunol 37:1313-1322). Tetrámeros HLA-A3 se prepararon. Para experimentos de inhibición de anticuerpos de células Baf3 transducidas con KIR3DL2 se tiñeron con 5 mg de anticuerpo o control de isotipo IgGl/IgG2a (Biolegend UK Ltd) a 4°C durante 20 minutos antes de la tinción con tetrámero a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células teñidas se lavaron y se fijaron como se ha descrito anteriormente antes del análisis FACS en una máquina BD Fortessa FACS. Se realizó un análisis FACS utilizando software Flowjo (Tree star Inc US).

La inhibición de anticuerpos de las células reportero KIR3DL2 CD3e Jurkat Células reportero Jurkat transducidas para expresar la proteina de fusión KIR3DL2CD3 se han descrito previamente (Payeli, et al. (2012) Arthritis Rheum.). Para experimentos de inhibición de anticuerpos, células reportero 100000/pocillo en RPM1640 (Sigma, suplementado con FCS al 10% y penicilina y estreptomicina) se tiñeron primero en 4°C con 10 mg de anticuerpo o anticuerpo de control de isotipo durante 20 minutos. Las células reportero posteriormente fueron estimuladas con 200000 células LCL.LBL.721.221 parentales (en adelante referidas como 221 células) o 221 células transíectadas con HLA-B27 o control HLA de clase 1 en un volumen final de 200 pL. Los sobrenadantes se recogieron después de la estimulación durante la noche para el ensayo IL-2 mediante ELISA (eBiosciences UK Ltd) realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RESULTADOS Anticuerpos específicos de dominio DO inhiben la tinción de tetrámero dímero HLA-A3 y B27 (B27) de las células transducidas KIR3DL2 En primer lugar se estudió la capacidad de anticuerpos anti-KIR3DL2 de dominio específico DO y D1/D2 para inhibir la tinción de tetrámero dímero HLA-A3 y B27 de KIR3DL2. El dominio DO específica anticuerpos anti-KIR3DL2 1E2 y 13H1 consistentemente inhiben HLA A3 y B27 de cadena pesada (B272) tinción de las células Baf3 transducidas KIR3DL2 (Figuras 14 y 16A). 2B12 inhibe la B272 al tiempo que demuestra efectos insignificantes en la tinción de tetrámero de HLA-A3 de KIR3DL2. Por el contrario 10G5 no inhibió la tinción de KIR3DL2, ya sea con tetrámeros HLA-A3 o B272.

El anticuerpo 1C3 de dominio específico D2 inhibe HLA-A3 pero no al dímero B27 (B272) tetrámero de tinción de KIR3DL2 El anticuerpo 1C3, D2 específico inhibe consistentemente la tinción de tetrámero HLA-A3 de las células transducidas KIR3DL2 (Figura 15 y 16B). Por el contrario MAb 1C3 no afectó la tinción de B272 de las células Baf3 KIR3DL2 y anticuerpos específicos DI no afectaron significativamente la tinción de tetrámero ni de HLA-A3 ni de B272 de KIR3DL2 (Figura 15 y 16B) .

Dominio DO pero no D1/D2 específicos MAbs anti -KIR3DL2 inhiben interacciones de la celula reportera KIR3DL2 con HLA de clase 1.

A continuación se determinó el efecto de anticuerpos específicos KIR3DL2 en el reconocimiento de KIR3DL2 de HLA-B27 y otra HLA-clase 1 mediante el estudio del efecto de los anticuerpos en la producción de IL-2 de células Jurkat reportero transducidas KIR3DL2CD3s estimuladas con 221 transíectantes. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores 221 células que expresan HLA-B27 consistentemente estimuladas 6 veces mayor que la producción de IL-2 por células reportero KIR3DL2 en comparación con la estimulación con células que expresan el control de HLA de clase 1 (Figura 17).

Anticuerpos del dominio DO específicos 2B12, 1E2, 10G5 y 13H1 todos inhibieron la producción de IL-2 por las células reportero KIR3DL2 estimuladas con células transíectadas HLA-B27 en algún grado (Figura 4) con 2B12 y 1E2 demuestrando el mayor efecto inhibitorio. Por el contrario, el anticuerpo D2 específico 1C3 no tuvo ningún efecto significativo en el reconocimiento de células reportero de HLA-B27.

Anticuerpos de dominio DO específicos también inhibieron la producción de IL-2 por las células reportero KIR3DL2 estimuladas con 221 células transíectadas con HLA-B7, HLA-B35 y HLA-A2 y HLA-A3, aunque los efectos fueron menos pronunciados que los observados cuando las células fueron estimuladas con HLA-B27. Por el contrario, el anticuerpo D2 especifico 1C3 no tuvo ningún efecto significativo sobre la producción de IL-2 por las células reportero KIR3DL2 estimuladas con 221 células transíectadas con HLA-B7, HLA-B35 y HLA-A2 y HLA-A3.

RESUMEN Aquí nos muestran que los anticuerpos monoclonales contra el dominio DO de KIR3DL2 (2B12, 1E2, 13H1) inhiben el enlace a dímeros de cadena pesada B27 (B272) libres de b2p\ y ligandos asociados a b2ih como el HLA-A3. En contraste, anticuerpos contra el dominio D2 de KIR3DL2 (1C3) sólo inhibieron las interacciones con HLA-A3 y tienen poco efecto sobre enlace de tetrámero B272.

Aunque las células T reportero KIR3DL2 producen IL-2 cuando se estimulan con HLA-B27, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A2 y HLA-A3 transfectaron células LBL.721.221 B, células reportero producen consistentemente 6 veces más IL-2 en respuesta a HLA-B27. Interacciones KIR3DL2 con células B que expresan HLA-B27 y otros HLA de clase 1 se inhiben consistentemente con los anticuerpos de dominio DO específicos 2B12 y 1E2, y en menor medida 13H1. Esto sugiere que el dominio DO de KIR3DL2 puede tener alguna afinidad para las características comunes compartidas de diferentes HLA de clase 1. El dominio DO KIR3DL2 se puede unir al menos en parte a una región en HLA-B27 que es compartida entre los diferentes HLA clase 1. El aumento de la avidez de KIR3DL2 por HLA-B27 puede resultar de la dimerización de cadenas pesadas B27.

Se ha informado de que los tres dominios de tipo inmunoglobulina DO, DI y D2 de KIR3DL2 están involucrados en el enlace del ligando. Los resultados de los estudios de inhibición de anticuerpos sugieren que el contacto dominante de KIR3DL2 con HLA clase 1 es a través del dominio DO. Cabe destacar que el D2 anticuerpo 1C3 sólo inhibió HLA-A3 enlazada a KIR3DL2 y no al dimero B27. Por tanto, proponemos que los residuos de contactos de dominio DO se conservan entre diferentes HLA clase 1 y los dominios Di y D2 contactan regiones polimórficas y el péptido en el complejo MHC péptido. Los anticuerpos identificados se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y otras investigaciones, dependiendo de la aplicación particular, para bloquear selectivamente diferentes ligandos, o para bloquear múltiples ligandos, o para no competir con ligandos para el enlace a KIR3DL2.

Ejemplo 8 - Mapeo de epitopos Se desarrollaron mutantes KIR3DL2 para identificar anticuerpos-KIR3DL2 específicos que tenían deseadas de enlace. Los anticuerpos podrán ventajosamente tener enlace a la mayoría o todos de los principales alelos KIR3DL2 en la población (en términos de frecuencia de los alelos), mientras que no se enlaza a los principales alelos KIR3DL1 (por ejemplo, alelo *00101).

Las mutaciones fueron generadas para corresponder a residuos que difieren entre KIR3DL1 y KIR3DL2. Un primer conjunto de mutaciones se generaron en donde el aminoácido en KIR3DL1 fue sustituido en KIR3DL2. Sin embargo, muchas de estas proteínas mutadas fallaron para expresar en la superficie celular, lo que sugiere que la incorporación de la KIR3DL1 impactó profundamente el plegamiento de la molécula KIR3DL2 entera. En particular, los mutantes en grupos D21, D22, D23, D26 y D27 que se muestran a continuación en la Tabla 7A no expresan en la superficie celular.

Tabla 7A Otros mutantes fueron rediseñados y probados, con la última serie de mutaciones que se muestran en la Tabla 7B a continuación. Los anticuerpos se ensayaron para enlazar KIR3DL2 a diversos KIR3DL2 mutantes. KIR3DL2 mutantes fueron generados por PCR (ver Tabla 7B más adelante). Todos los cebadores Mx-R se utilizaron con el siguiente cebador 5' ACCCAAGCTGGCTAGCATGTCGCTCACGGTCGTCAGCATG (SEQ ID NO: 79). Todos los cebadores Mx-F se utilizaron con el siguiente cebador 3' AGCACAGTGGCGGCCGCCTAGAAAA CCCCCTCAAGACC (SEQ ID NO: 80). Las secuencias amplificadas se corrieron en gel de agarosa y luego se purificaron usando el kit de extracción Qiagen Gel.

Para crear mutantes 12 y 21, era necesario hacer una tercera PCR. Los cebadores utilizados para estos PCR fueron: cebador M12a-F (5'-GCCACAGGTGCATATGAGAAACCTTCTCTCTCAGCC-3') (SEQ ID NO: 81) con el cebador M12b-R (5'- TGGGTCACTTGCGGCTGACCACACGCAGGGCAGGG-3') (SEQ ID NO: 82) y cebador M21a-F (5'-CGTGCCCTGCCCTACGTGTGGTCAAACTCAAGTGAC-3') (SEQ ID NO: 83) con el cebador M21b-R (5'-ATG CAGGTGTCTGGGGATACCAGATTTGGAGCTTGGTTC-3') (SEQ ID NO: 84).

Los dos o tres productos de PCR generados para cada mutante se ligaron a continuación en un vector pcDNA3.1, se digirió con la enzima de restricción Nhel y Notl, con el sistema de InFusión (Clontech) según las instrucciones del fabricante.

Después de la secuenciación, los vectores que contienen las secuencias mutadas se prepararon como Maxiprep usando el Promega PureYield™ Plasmid Maxiprep System. Los vectores fueron utilizados para la transfección de células HEK-293T usando Lipofectamine 2000 de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tabla 7B - - - - - - - - - - - - - - - - - - g - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - a - - - - - - - Cada anticuerpo fue probado para el enlace a KIR3DL2 de tipo salvaje y para cada uno de los mutantes de dominio DO, DI y D2. Los anticuerpos no mostraron ninguna pérdida del enlace a KIR3DL2 de tipo salvaje no mutado (WTaKIR3DL2), pero perdieron el enlace a uno o más mutantes, identificando de este modo varios epitopos.

Un resumen se muestra en las Tablas 7C y 7D ("+" indica que no hay pérdida significativa de enlace, indica una disminución en el enlace (o pérdida parcial del enlace) y indica una pérdida sustancialmente completa del enlace). La mayoría de los anticuerpos DO que no internalizaron perdieron sustancialmente todo el enlace al mutante 2 (cuatro anticuerpos: 10F6, 2B12, 18C6, 10G5). Todos estos anticuerpos también tenían pérdida al menos parcial del enlace a mutante 2A3 . Un anticuerpo DO que no internalizó mostró la pérdida de enlace sólo al mutante 1 (9E10). Un anticuerpo DO que no internalizó (1E2) perdió enlace sólo para el mutante 2A3. Un anticuerpo (5H1) perdió el enlace al 6 mutante.

El bloqueo de ligando natural y el anticuerpo 13H1 de internalización mostró, además, disminución del enlace al mutante 2A2 y MD0/HLA1, además de los mutantes 1 y 2.

En cuanto a los anticuerpos que enlazaron a los anticuerpos 1C3 y 20E9 de KIR3DL2 dominio D2 (ambos no internalizados) perdieron el enlace al mutante 14, asi como la pérdida parcial del enlace al mutante 15 y al mutante 16.

Los anticuerpos 10F6, 2B12, 18C6 y 10G5 tuvieron pérdida de enlace al mutante 2 que tienen sustituciones I60N y G62S y disminuyen en el enlace al mutante 2A3 que tiene sustituciones P14S, S15A y H23S, pero no perdieron el enlace a otros mutantes. El principal epitopo de estos anticuerpos, por tanto, incluye residuos 160 y/o G62 (y el epitopo incluye además opcionalmente uno o más de P14, S15, y H23). Los residuos 60 y 62 están dentro del dominio DO de KIR3DL2.

El anticuerpo 13H1 tuvo pérdida de enlace a ambos del mutante 1 que tienen R13W, A25T y Q27R y del mutante 2 que tiene sustituciones I60N y G62S. 13H1 también había disminuido el enlace a mutante 2A2 (Q56S, E57A) y al mutante MD0/HLA1 (F9S, Slla). El epitopo de 13H1, por tanto, incluye residuos F9, Sil, Q56 y/o E57. Estos residuos se encuentran dentro del dominio DO.

El anticuerpo 9E10 tuvo disminución del enlace al Mutante 1 que tiene sustituciones R13W, A25T y Q27R, pero no a los otros imitantes. El epitopo de 9E10 y 10G5 por tanto, incluye restos R13, A25 y/o Q27.

La Figura 1 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 1", "Mutante 2", "Mutante 3" y "Mutante 6", que dio como resultado (en diferentes combinaciones) en la pérdida del enlace por anticuerpos. La figura 2 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 1", "Mutante 2" y "Mutante 3", que dio como resultado (en diferentes combinaciones) en la pérdida del enlace por anticuerpos, con sombreado de residuos adyacentes a los residuos (F9, Sil, P14, F34 y/o S140 adyacentes al mutante 2, y adyacente al Mutante 1 G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 y/o H68).

El anticuerpo 5H1 tuvo pérdida de enlace al mutante 6 que tiene sustituciones R78H y L82P, pero no perdió el enlace a otros mutantes. El principal epitopo 5H1 por tanto, incluye los residuos R78 y/o L82. Los residuos R78 y L82 están dentro del dominio DO de KIR3DL2. Los residuos expuestos en la superficie adyacente a estos residuos mutados también pueden contribuir a los epitopos de los anticuerpos. La Figura 3 muestra una vista de cada cara del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio DO, mostrando residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 6", que dio como resultado (en diferentes combinaciones) en la pérdida del enlace por los anticuerpos, con "Mutante 3" que no dio como resultado la pérdida del enlace mostrado. También se muestra en sombreado residuos adyacentes a los residuos adyacentes al mutante 6 que también puede ser enlazado por los anticuerpos (K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 y/o A87).

Los anticuerpos 1C3 y 20E9 tuvieron pérdida de enlace al mutante 14 que tiene una sustitución W226A. Los anticuerpos además tuvieron disminución del enlace al mutante 15 que tiene sustituciones I231M y R246P y al mutante 16 que tiene una sustitución E239G. El principal epitopo 1C3, por tanto, incluye residuos 226. El principal epitopo de 20E9 puede incluir residuos I231M y/o R246P, y/o puede incluir adicionalmente E239. Residuos W226, 1231 y R246 están en la región del enlace de los dominios DI y D2 de KIR3DL2. Residuos expuestos en la superficie adyacente a los residuos mutados también pueden contribuir a los epitopos de los anticuerpos, incluyendo por ejemplo los residuos de Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 y/o T254 (referencia a la SEC ID NO: 1) situado en la superficie de KIR3DL2 en la región del epitopo W226, pero fuera de la región de las mutaciones KIR3DL2 que no resultaron en la pérdida de enlace de los anticuerpos (por ejemplo, mutantes 12 y 17). Residuos expuestos en la superficie adyacente a los residuos mutados 1231 y R246 también pueden contribuir a los epitopos de los anticuerpos, incluyendo por ejemplo los residuos D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275,R277 y/o P280 (referencia a SEQ ID NO: 1) situada en la superficie de KIR3DL2 en la región del epitopo I231/R246, pero fuera de la región de las mutaciones KIR3DL2 que no resultan en la pérdida de enlace de los anticuerpos (por ejemplo, mutantes y 12 y 17).

La figura 4 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio D2 (empalme Di /D2), que muestra los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 14" al cual los anticuerpos perdieron el enlace, y "Mutante 12" y "Mutante 17" que no causó pérdida de enlace para anticuerpos; también se muestra en sombreado residuos adyacentes a los residuos (Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 y/o T254 adyacente al mutante 14) que también pueden estar consolidados.

La Figura 5 muestra una vista del polipéptido KIR3DL2, incluyendo porciones dentro del dominio D2 (empalme D1/D2), que muestra los residuos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 15" al cual los anticuerpos perdieron el enlace; también se muestra en sombreado residuos adyacentes a los residuos (D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 y/o P280) adyacentes al mutante 14 que también pueden estar consolidados.

Las figuras 18, 19 y 20 muestran vistas del polipéptido KIR3DL2, alelo *001, con el sitio de enlace del mutante 2 mostrado, y mostrando las diferencias de aminoácidos vistos en diferentes alelos KIR3DL2 que tienen mayor frecuencia (estudios de las poblaciones en los Estados Unidos). Se puede observar que el sitio de enlace del anticuerpo se encuentra en un sitio que se conserva a través de alelos KIR3DL2, que es consistente con la capacidad del anticuerpo para unirse a las células de todos los individuos ensayados.

Tabla 7C: Dominio 0 mutantes 5 10 15 - Tabla 7D: mutantes del Dominio 2 Todos los títulos y subtítulos se utilizan únicamente para conveniencia y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera. Cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos están abarcados por la invención a menos que se indique lo contrario en este documento o se contradiga claramente por el contexto. La recitación de intervalos de valores en la presente memoria pretenden simplemente servir como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si fuera recitado individualmente en el presente documento. A menos que se indique lo contrario, todos los valores exactos proporcionados en este documento son representativos de los correspondientes valores aproximados (por ejemplo, todos los valores exactos proporcionados a modo de ejemplo con respecto a un factor o medida en particular pueden ser considerados también para proporcionar una medición aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente", cuando proceda ).

Todos los métodos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o se contradiga claramente por el contexto.

El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en este documento pretende meramente aclarar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se indique lo contrario. Ningún lenguaje en la especificación deberla interpretarse como una indicación de que cualquier elemento es esencial para la práctica de la invención a menos que como mucho, se indique explícitamente.

La citación y la incorporación de los documentos de patentes en este documento se hace sólo para conveniencia y no refleja ningún punto de vista de la validez, la patentabilidad y/o aplicabilidad de tales documentos de patentes, la descripción de este documento de cualquier aspecto o forma de modalidad de la invención, utilizando términos como referencia a un elemento o elementos está destinado a proporcionar apoyo para un aspecto o modalidad similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos en particular, a menos que se indique lo contrario o claramente se contradiga por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en la presente memoria como que comprende un elemento particular debe entenderse como que describe también una composición que consiste de ese elemento, a menos que se indique otra cosa o se contradiga claramente por el contexto).

Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto expuesta en los aspectos o reivindicaciones presentadas en este documento en la medida máxima permitida por la lcy aplicable.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia en su totalidad como si cada publicación o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será fácilmente evidente para un experto ordinario en la téenica a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse en la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas. 0

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza un polipéptido de KIR3DL2 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169, y en donde dicho anticuerpo es no internalizado en las células que expresan KIR3DL2.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 (alelo *002), y (c) un polipéptido KIR3DL2 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo * 007), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

3. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza a un polipéptido KIR3DL2, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable (o elimina) el enlace entre el KIR3DL2 y un primer ligando natural HLA de KIR3DL2, pero no reduce de forma detectable (o elimina) el enlace entre el KIR3DL2 y un segundo ligando natural HLA de KIR3DL2.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 (alelo *002), y (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

5. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza un polipéptido KIR3DL2, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un 0 polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 (alelo *002), y (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

6. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 (alelo *002), (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 161 (alelo *003), (d) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 163 (alelo *005), y (e) un polipéptido KIR3DL2 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

7. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de 0 aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende las secuencias de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 (alelo *002), (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 161 (alelo *003), (d) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 163 (alelo *005), (e) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), y (f) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 166 (alelo *008), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 utante que tiene mutaciones de aminoácidos I60N y G62S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos R13W, ?25T y Q27R, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO : 1.

10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos Q56A y E57A, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO : 1.

11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos P14S, S15A y H23S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO : 1.

12. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-7, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a (a) un polipéptido KIR3DL2 mutante que tienen mutaciones de aminoácidos I60N y G62, y (b) un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos P14S, S15A y H23S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos R13 , A25T, Q27R, I60N y G62S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos R78H y L82P, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene la mutación de aminoácidos W226A, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o 15, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutaciones de aminoácidos I231M y R246P, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO : 1.

17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o 15-16, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que tiene mutación de aminoácido E239G, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO : 1.

18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo no causa la internalización de los polipéptidos KIR3DL2 en las células que expresan KIR3DL2.

19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y un ligando HLA clase I de KIR3DL2.

20. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-19, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-B27.

21. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-19, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-B27, pero no reduce de forma detectable el enlace entre KIR3DL2 y HLA-A3.

22. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-19, en donde dicho anticuerpo reduce de forma detectable el enlace entre el KIR3DL2 y HLA-A3, pero no reduce de forma detectable el enlace entre KIR3DL2 y HLA-B27.

23. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza a un residuo de aminoácido en el dominio DO del polipéptido KIR3DL2 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.

24. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza a un residuo de aminoácido en el dominio D2 del polipéptido KIR3DL2 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde dicho anticuerpo no se enlaza sustancialmente a un polipéptido KIR3DL1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169.

25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo se enlaza a un polipéptido KIR3DL2 al menos parcialmente en la parte de enlace del ligando.

26. Un anticuerpo monoclonal que enlaza un polipéptido de KIR3DL2 en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos I60N y G62, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos R13W, A25T y Q27R, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

28. Un anticuerpo monoclonal que enlaza un polipéptido de KIR3DL2 en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos R13W, A25T y Q27R, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

29. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 26-28, en donde dicho anticuerpo no ha reducido el enlace a un polipéptido mutante de KIR3DL2 que comprende mutaciones de aminoácidos Q56S y E57A, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

30. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 26-29, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos P14S, S15A y H23S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

31. Un anticuerpo monoclonal que enlaza un polipéptido KIR3DL2 en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos P14S, S15A y H23S, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

32. Un anticuerpo monoclonal que enlaza un polipéptido KIR3DL2 en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos R78H y L82P, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

33. Un anticuerpo monoclonal que enlaza un polipéptido KIR3DL2 en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutación de aminoácido W226A, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende mutaciones de aminoácidos I231M y R246P, con referencia al polipéptido KIR3DL2 de SEQ ID NO: 1, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje.

35. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 33-34, en donde dicho anticuerpo ha reducido el enlace a un polipéptido KIR3DL2 mutante que comprende la mutación de aminoácido E239G, en relación al enlace entre el anticuerpo y un polipéptido KIR3DL2 de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

36. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 23-35, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 (alelo *002), y (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

37. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 23-35, en donde dicho anticuerpo enlaza: (a) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 (alelo *002), (c) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 161 (alelo *003), (d) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 163 (alelo *005), (e) un polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 165 (alelo *007), y (f) un , . polipéptido KIR3DL2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 166 (alelo *008), en cada caso en donde el polipéptido KIR3DL2 se expresa en la superficie de una célula.

38. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-9, 11-28 y 30-37, en donde dicho anticuerpo no se internaliza en células que expresan KIR3DL2 y/o no causa la internalización de los polipéptidos KIR3DL2 en las células que expresan KIR3DL2.

39. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es capaz de inducir, a través de ADCC, la lisis de una célula que expresan KIR3DL2.

40. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo inhibe la señalización KIR3DL2 inducida por ligando.

41. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo compite por enlazar a un polipéptido KIR3DL2 con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 13 y 14 (2B12), (b) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región 0 VH y VL de SEQ ID NOS: 23 y 24 (10G5), (c) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 2 y 3 (10F6), (d) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 34 y 35 (13H1), (e) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 45 y 46 (1E2), (f) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 56 y 57 o 67 (9E10), (g) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de la SEQ ID NOS: 170 y 171 (1C3), y (h) un anticuerpo que tiene, respectivamente, una región VH y VL de la SEQ ID NOS: 181 y 182 (20E9).

42. Un anticuerpo que compite por enlazar un polipéptido KIR3DL2 con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 13 y 14 (2B12), (b) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 23 y 24 (10G5), (c) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 2 y 3 (10F6), (d) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 34 y 35 (13H1), (e) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 45 y 46 (1E2), y (f) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de SEQ ID NOS: 56 y 57 o 67 (9E10), (g) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de la SEC ID NOS: 170 y 171 (1C3), y (h) un anticuerpo que tiene respectivamente, una región VH y VL de la SEC ID NOS: 181 y 182 (20E9).

43. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDRs 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 15 (HCDRl), SEQ ID NO: 18 (HCDR2) y SEQ ID NO: 20 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 21 o 22 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (b) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4 (HCDRl), SEQ ID NO: 7 (HCDR2) y SEQ ID NO: 9 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 o 12 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (c) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25 (HCDR1), SEQ ID NO: 28 (HCDR2) y SEQ ID NO: 30 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31, 32 o 33 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (d) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 36 (HCDR1), SEQ ID NO: 39 (HCDR2) y SEQ ID NO: 41 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 42, 43 o 44 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (e) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 47 (HCDR1), SEQ ID NO: 50 (HCDR2) y SEQ ID NO: 52 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 53, 54 o 55 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; y (f) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 58 (HCDR1), SEQ ID NO: 61 (HCDR2) y SEQ ID NO: 63 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 64, 65 o 66 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (g) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 172, 173 o 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 o 176 (HCDR2) y SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 178, 179 o 180 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; y (h) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 183, 184 o 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 o 187 (HCDR2) y SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 189, 190 o 191 respectivamente , en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos.

44. Un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 15 (HCDRl), SEQ ID NO: 18 (HCDR2) y SEQ ID NO: 20 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 21 o 22 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (b) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25 (HCDRl), SEQ ID NO: 28 (HCDR2) y SEQ ID NO: 30 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 31, 32 o 33 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (c) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 4 (HCDR1), SEQ ID NO: 7 (HCDR2) y SEQ ID NO: 9 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 10, 11 o 12 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (d) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 36 (HCDR1), SEQ ID NO: 39 (HCDR2) y SEQ ID NO: 41 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 42, 43 o 44 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (e) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 47 (HCDRl), SEQ ID NO: 50 (HCDR2) y SEQ ID NO: 52 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 53, 54 o 55 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; y (f) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 58 (HCDRl), SEQ ID NO: 61 (HCDR2) y SEQ ID NO: 63 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 64, 65 o 66 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; (g) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que 0 comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDRl, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 172, 173 o 174 (HCDRl), SEQ ID NO: 175 o 176 (HCDR2) y SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 178, 179 o 180 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos; y (h) un anticuerpo que tiene (i) una cadena pesada que comprende CDR 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 183, 184 o 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 o 187 (HCDR2) y SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, y (ii) una cadena ligera que comprende CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 189, 190 o 191 respectivamente, en donde cada CDR puede comprender opcionalmente 1, 2, 3 o 4 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos.

45. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido KIR3DL2 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (alelo *002).

46. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipéptido KIR3DL1 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130 (alelo *00101).

47. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo tiene afinidad de enlace bivalente (KD) para un polipéptido KIR3DL2 humano de menos de 108 M.

48. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG humana.

49. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana que se enlaza a un receptor FcylIIA.

50. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.

51. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana modificada con al menos una sustitución de aminoácido, en donde la afinidad de enlace de dicha región constante modificada a un receptor FcylIIA se incrementa, en comparación con una región constante que no tiene dicha sustitución de aminoácidos.

52. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana que tiene glicanos N-ligados a hipo fucosilados, en donde la afinidad de enlace de dicha región constante modificada a un receptor FcylIIA se incrementa, en comparación con una región constante que no tiene dichos glicanos N-ligados a hipo fucosilados.

53. Un anticuerpo obtenido por quimerización o humanización de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 49.

54. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador farmacéuticamente aceptable.

55. La composición de conformidad con la reivindicación 54, en donde el anticuerpo está presente en una cantidad de entre aproximadamente 25 g y 500 mg.

56. Un kit que comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, opcionalmente, además comprende un anticuerpo secundario marcado que reconoce específicamente el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

57. Un hibridoma o una célula huésped recombinante que 0 produce el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 53.

58. Un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un paciente en necesidad del mismo, el método comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-53 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 54- 55.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, en donde dicha enfermedad es un linfoma de células T CD4+.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, en donde dicho cáncer se selecciona de Micosis Fungoide y Síndrome de Sezary.

61. El método de conformidad con la reivindicación 58, en donde dicha enfermedad es un trastorno inflamatorio o autoinmune.

62. Un método para identificar una célula que expresan KIR3DL2 en un sujeto, el método comprende la obtención de una muestra biológica que comprende células de un sujeto, poniendo dichas células en contacto con un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-53 y evaluar si el anticuerpo se enlaza a las células.

63. Un método para identificar una célula relacionada con la enfermedad que expresa KIR3DL2 en un sujeto, el método comprende la obtención de una muestra biológica de un sujeto, que comprende células relacionados con la enfermedad, poner dichas células relacionados con la enfermedad en contacto con un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-53 y evaluar si el anticuerpo se enlaza con las células relacionadas con la enfermedad, en donde una constatación de que el anticuerpo se enlaza a las células relacionadas con la enfermedad indica que el sujeto tiene una enfermedad, que el sujeto alberga células relacionados con la enfermedad y/o que la célula relacionada con la enfermedad expresa KIR3DL2.

64. Un método para seleccionar sujetos que tienen una enfermedad que responde a un tratamiento con un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-53, el método comprende determinar si las células en dicho sujeto expresan un receptor KIR3DL2, la expresión de un receptor KIR3DL2 es indicativa de un sujeto que responde al tratamiento.

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque además comprende la administración a un sujeto que responde al tratamiento, un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1-53.

66. El método de conformidad con las reivindicaciones 64-65, en donde dicha enfermedad es un cáncer de células T CD4+.

67. El método de conformidad con la reivindicación 66, 0 en donde dicho cáncer se selecciona de Micosis Fungoide y Síndrome de Sezary.

68. El método de conformidad con las reivindicaciones 64-65, en donde dicha enfermedad es un trastorno inflamatorio o autoinmune.