CN104640561A - 包含轻链和重链的选择性配对的免疫球蛋白构建体 - Google Patents
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Abstract
本文公开一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含连接至第二恒定结构域多肽的第二单链Fv多肽;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域、CH2结构域以及CH3结构域或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月23日提交的美国申请序列号61/674,820;和2013年7月23日提交的美国申请序列号61/857,652的权益,所述申请各自特此以引用的方式整体并入。
发明领域
本发明的领域是合理设计用于生物治疗剂的定制研发的免疫球蛋白构建体。
发明背景
治疗性单克隆抗体(Mab)被广泛用于治疗人疾病。然而,仅靶向一种抗原通常在适应症如肿瘤学中是不足的,并且肿瘤在潜伏期之后进展。用于将现有抗体转化成IgG样双特异形式的一般方法论将大大促进双特异性抗体的临床开发。自抗体工程化的早期以来,在产生能够同时结合两种不同靶标的这类抗体方面一直存在广泛兴趣。本领域中已描述了双特异性抗体如四价IgG-单链可变片段(scFv)融合体、卡妥索单抗(catumaxomab)(一种三官能大鼠/小鼠杂合双特异性上皮细胞粘附分子-CD3抗体)、双特异性CD19-CD3scFv抗体兰妥莫单抗(blinatumomab)、“双作用Fab”(DAF)抗体、四价双特异性形式如IgG样双重可变结构域抗体(DVD-Ig)。这些方法各自具有局限性,如免疫原性、较差的药物代谢动力学特性或由片段可结晶(Fc)区的缺乏引起的效应子功能的损失;此外,它们可能倾向于聚集或可能包含潜在免疫原性非人结构域。大多数形式从天然IgG蛋白质结构显著地偏离,或者它们不能应用于基于可供使用的抗体以一般方式制备稳定的双特异性IgG抗体。
发明概述
本文提供包含单链Fab区(scFab)的免疫球蛋白构建体,所述单链Fab区包含来自免疫球蛋白重链的可变区多肽(VH)、来自免疫球蛋白轻链的可变区多肽(VL)、来自免疫球蛋白轻链的恒定区多肽(CL)以及来自免疫球蛋白重链的恒定区多肽(CH1);其中VH多肽和VL多肽通过第一接头连接以形成单链Fv构建体(scFv)。在一些实施方案中,所述CL和CH1通过第二接头连接。在某些实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VH-L1-VL-CL-L2-CH1的序列,其中L1和L2是第一接头和第二接头。在某些实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VH-L1-VL-L3-CL-L2-CH1的序列,其中L1、L2以及L3是接头。在一个实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VL-L4-VH-CH1-L5-CL的序列,其中L4和L5是接头。这类构建体的某些实施方案在本文或者被称为轻链***物(LCI)。
在某些实施方案中,每个接头是包含约1至约100个氨基酸的多肽。在一些实施方案中,所述接头包含含有选自Gly(G)、Ser(S)和Glu(E)的氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述接头由通式(Gly-Gly-Gly-Ser)n的多肽组成,其中n是4至10的整数。
提供一种包含单链Fab区(scFab)的分离的免疫球蛋白构建体,所述单链Fab区包含来自免疫球蛋白重链的可变区多肽(VH)、来自免疫球蛋白轻链的可变区多肽(VL)、来自免疫球蛋白轻链的恒定区多肽(CL)以及来自免疫球蛋白重链的恒定区多肽(CH1);其中所述VH和CL通过接头多肽连接,其中所述接头多肽表现出形成螺旋结构的倾向。在一些实施方案中,单链Fab多肽具有包含VL-CL-L8-VH-CH1的序列;其中L8是所述具有形成螺旋结构的倾向的接头。在一些实施方案中,所述接头的至少约25%以螺旋形式存在。在一些实施方案中,所述接头的至少约50%以螺旋形式存在。在某些其它实施方案中,所述接头的至少约60%以螺旋形式存在。在另一个实施方案中,所述接头的至少约75%以螺旋形式存在。在另一个实施方案中,所述接头的至少约80%以螺旋形式存在。在其它实施方案中,所述接头的至少约90%以螺旋形式存在。在其它实施方案中,所述接头的至少约95%以螺旋形式存在。在某些实施方案中,所述接头包含多个螺旋区段。
提供本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头多肽形成α螺旋、聚脯氨酸I型螺旋、聚脯氨酸II型螺旋以及310螺旋中的至少一个。在一些实施方案中,所述接头形成约1圈至约20圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约3圈至约5圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约2圈至约4圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约2圈至约10圈之间的螺旋。在一些实施方案中,所述接头包含至少一对形成螺旋稳定相互作用的氨基酸。在一个实施方案中,所述螺旋稳定相互作用是电荷-电荷相互作用、阳离子-π相互作用、疏水相互作用以及大小互补相互作用中的至少一个。
提供本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体包含至少一个具有形成螺旋的倾向的接头多肽,并且其中所述接头多肽包含选自Gly(G)、Ser(S)、Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Val(V)以及Ile(I)的氨基酸。在某些实施方案中,所述接头多肽包含选自Met(M)、Ala(A)、Leu(L)、Glu(E)以及Lys(K)的氨基酸。在一个实施方案中,所述接头多肽包含至少一个Pro(P)残基。在某些实施方案中,所述接头具有包含至少一个(Asp-Asp-Ala-Lys-Lys)n基序的氨基酸序列,其中n是1至10的整数。
本文提供包含以下各项的免疫球蛋白构建体:第一多肽构建体,其包含本文所描述的第一scFab和含有第一CH3区的第一重链多肽;以及第二多肽构建体,其包含含有第二CH3区的第二重链多肽,其中所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个任选地包含变体CH3区,所述变体CH3区促进异二聚体的形成。在一些实施方案中,所述第一多肽构建体和第二多肽构建体还包含抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中,所述抗原结合多肽构建体是scFv或scFab中的至少一个。在一些实施方案中,所述scFab是本文所描述的scFab。
在一些实施方案中,所述第一重链多肽和第二重链多肽形成异二聚体Fc。在某些实施方案中,所述异二聚体Fc包含含有至少一个氨基酸突变的变体免疫球蛋白CH3结构域。在某些实施方案中,所述至少一个氨基酸突变促进具有可比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体Fc的形成。在一个实施方案中,所述变体CH3结构域具有约73℃或更大的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约70%的纯度。在一些实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约70%的纯度并且Tm是至少约73℃。在另一个实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约75%的纯度并且Tm是约75℃。
提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个还包含变体CH2结构域,所述变体CH2结构域包含氨基酸修饰以便促进与至少一种Fcγ受体的选择性结合。在一个实施方案中,所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个包含变体CH2结构域或铰链,所述变体CH2结构域或铰链包含阻止与至少一种Fcγ受体的功能有效结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中,所述Fc区是糖基化的。在一些实施方案中,所述Fc区是无糖基化的。在一个实施方案中,所述Fc区是岩藻糖化的。在另一个实施方案中,所述Fc区是无岩藻糖化的。
在一些实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述免疫球蛋白构建体是多特异性免疫球蛋白构建体。在一个实施方案中,所述免疫球蛋白构建体是双特异性的。
提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含通过接头连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含通过接头连接至第二恒定结构域多肽的与所述第一Fv多肽不同的第二单链Fv多肽;每个所述恒定结构域多肽包含CL区、CH1区以及CH3区或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述CL区和CH1区通过接头连接,并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。在一些实施方案中,所述构建体不包含任何CH2结构域。在一些实施方案中,来自所述第一恒定结构域多肽的CH3结构域不同于来自所述第二恒定结构域多肽的CH3结构域,并且所述第一和第二恒定结构域多肽CH3结构域配对以形成稳定的异二聚体Fc。
在一个实施方案中提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含与第一恒定结构域多肽融合的第一scFab多肽;以及第二单体多肽,其包含与第二恒定结构域多肽融合的、与所述第一Fab多肽不同的第二scFab多肽;其中所述第一和第二scFab多肽中的至少一个包含具有形成螺旋结构的倾向的接头多肽;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异二聚体Fc区,所述变体免疫球蛋白CH3区包含至少一个氨基酸突变,所述至少一个氨基酸突变促进具有比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体的形成。
提供本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体结合选自CD3、CD19、HER2、组织因子和CD16a的至少一种靶抗原。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由免疫细胞、白细胞、内皮下细胞或癌细胞表达的至少一种抗原。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由T细胞表达的抗原。在一些实施方案中,所述T细胞是CD4+、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞和CD16a+自然杀伤T细胞中的至少一种。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由B细胞表达的抗原。在一些实施方案中,所述B细胞是CD19+和癌细胞。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由癌细胞表达的抗原如HER2。在一些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由内皮下细胞或白细胞表达的抗原如组织因子。
在一个实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种T细胞或自然杀伤细胞以及表达抗原的至少一种其它细胞。在一个实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种T细胞和至少一种B细胞。在一些实施方案中,所述T细胞是人细胞。在一个实施方案中,所述T细胞是非人哺乳动物细胞。在一些实施方案中,本文所描述的免疫球蛋白构建体结合细胞上表达的与疾病相关的抗原。在一些实施方案中,所述疾病是癌症。在一个实施方案中,所述癌症选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和神经胶质瘤。在一个实施方案中,所述癌症是肉瘤、胚细胞瘤、***状瘤以及腺瘤中的至少一种。在一些实施方案中,所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌、骨肉瘤和软组织肉瘤中的至少一种。
在一些实施方案中,本文所描述的免疫球蛋白构建体结合为自身免疫反应性细胞的至少一种细胞上的抗原。在一些实施方案中,所述自身免疫反应性细胞是淋巴或骨髓细胞。
本文提供一种包含本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体和适合的赋形剂的药物组合物。
在一个实施方案中是一种用于产生本文所描述的药物组合物的方法,所述方法包括:在允许如本文所描述的免疫球蛋白构建体表达的条件下培养宿主细胞;从所述培养物回收所产生的免疫球蛋白构建体;以及产生所述药物组合物。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体在治疗有需要的哺乳动物中的癌症的用途,所述用途包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物。在一个实施方案中,所述癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中,所述实体肿瘤是肉瘤、癌和淋巴瘤中的一种或多种。在一个实施方案中,所述癌症是B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和白血病中的一种或多种。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的自身免疫性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体在治疗自身免疫性疾病中的用途,所述用途包括提供包含有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物。在一些实施方案中,所述自身免疫性病状是以下中的一种或多种:多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病和1型糖尿病。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的炎性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供免疫球蛋白构建体在治疗个体中的炎性病状中的用途,所述用途包括向所述个体提供有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体。
本文提供一种包括如本文所定义的免疫球蛋白构建体及其使用说明书的试剂盒。
附图简述
图1A-1B提供规范IgG1抗体结构(图1A)和不对称双特异性抗体(图1B)的图形表示。在图1A中,两个片段抗原结合(Fab)臂中的一个在***框中突出显示。轻链由梯度表示并且重链由梯度表示。不同链之间的二硫键用虚线表示。重链的CH1结构域引导至接头中,之后是参与与第二重链配对、从而产生Fc的CH2和CH3结构域。在规则单克隆抗体像IgG1中,分子是沿两个重链之间的轴线向下对称的,而不对称双特异性抗体的目标是产生涉及两个不同重链和两个不同轻链的选择性配对的抗体样分子。不对称双特异性抗体由图1B中的不同链图案表示;第二重链由梯度表示,而第二轻链由梯度表示。
图2是连接至恒定结构域多肽的单链Fv多肽的设计的图形表示。所述图示出在VH的C末端与VL的N末端之间引入接头。另外,在CL的C末端与CH1结构域的N末端之间引入第二接头。选择所述接头以使得它们重构结构域间VL-VH几何形状,从而产生天然Fab样抗原结合。
图3提供包含两个单体多肽的双特异性免疫球蛋白构建体的图形表示,所述单体多肽各自包含连接至恒定结构域多肽的单链Fv多肽。
图4提供单链Fab的设计的图形表示,其中轻链与重链的N末端融合,从而将Fab表达为包含结构域VL-CL-VH-CH1的单链。所述专性VL和VH结构域配对,如CL和CH1结构域一样。
图5提供基于使用用所述单链Fab设计工程化的两个不同的单链Fab区段的不对称双特异性分子的图形表示,其中所述Fab是包含结构域VL-CL-VH-CH1的单链Fab。
图6A-6G描绘在以轻链***物(LCI)形式(6A-6C)和长接头(LL)形式(6D-6F)表达3种不同的scFab(4D5、TF和NM3E)之后的SDS-PAGE结果。图6G表示具有不同接头***物的scFab NM3E2的SDS-PAGE凝胶。
图7示出显示在还原和非还原条件下通过尺寸排阻色谱法从每种制剂分离的单体单链Fab种类的SDS-PAGE图谱。
图8A-8B示出抗原结合(ELISA)。scFab(D3H44的LL和LCI型式,v665和673)和对照Fab(v696)与TF结合。scFab(4D5的LL和LCI型式,v654和656)和对照Fab(v695)与HER2结合。
图9A-9E示出对不同变体进行的差示扫描量热法(DSC)实验。使用GE或MicroCal VP-Capillary仪器进行所有DSC实验。
图10示出单链Fab形式的台式(Benchtop)稳定性测定。左图:第1天;中心图:第3天;右图:第7天。结果指示在为期一周的研究过程中在所使用的相对稀释的浓度下所有单链Fab样品不会再多聚化。
图11示出单特异性二价scMab(异二聚体Fc)的表达。
图12A-12C示出变体的SDS-PAGE分析,从而说明scMab的台式稳定性测定。
图13示出CHO细胞系中二价双特异性scMab(异二聚体Fc)的表达和纯化。
图14A-14D示出双特异性scMab(LL/LL)的SEC图谱和SPR夹心测定。
图15A-15C示出双特异性scMab(LCI/LCI)的SEC图谱和SPR夹心测定。
图16A-16C示出双特异性scMab(LCI/LCI:1358;LCI/LL:1359)的SEC和靶结合图谱
图17示出在放大和纯化之后D3H44和4D5scFab的SDS-PAGE分析。
图18示出CD3/CD19二价双特异性scMab的SDS-PAGE表达分析。A、B以及C是指表达中所使用的链A与链B的比例:比例A=链A/链B=1∶1A/B=50%/50%;比例B=链A/链B=2∶1A/B=66%/34%;比例C=链A/链B=1∶2A/B=34%/66%。
图19:轻链***物形式的分子模型。可以引入连接VL和VL结构域和CL和CH1结构域的不同长度的接头。可以在重链(..VSSASTKG..)的原始肘序列中的肽键位置中的一个处引入切口以允许为实现所述轻链***物形式所需的序列拓扑结构。在一些实施方案中,可以从肘区中的切口部位去除少量的残基。
发明详述
产生双特异性抗体的之前尝试包括策略如融合表达具有相应特异性的单特异性二价抗体的两种杂交瘤细胞系(“四源杂交瘤(quadroma)技术”)(Milstein C,Cuello AC(1983)Hybrid hybridomasand their use in immunohistochemistry.Nature 305:537-540)。然而,显而易见的是根据由Milstein描述的策略同时表达两个不同重链和两个不同轻链导致仅含有微量所需双特异性抗体的10种几乎相同的化合物的几乎不可分离的混合物。(Suresh MR,Cuello AC,Milstein C(1986)Bispecific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas.MethodsEnzymol 121:210-228)。
设计选择性双特异性抗体的重要挑战包括两个重链的异二聚化的有效诱导;以及轻链和重链的选择性配对。用于诱导所述重链的选择性异二聚化的策略在例如WO/2012/058768中提供,其描述包含在不同结构域(例如CH2和CH3)中不对称的重链的抗体构建体,其中每个重链进行修饰以形成具有高选择性和纯度的所需异二聚体;并且其中所得重链异二聚体具有可比得上天然同二聚体的稳定性。
轻链和重链的选择性配一直是一个难以解决的问题,因为存在总计四种可能的重链和轻链配对,其中仅一种表示所需化合物。本文提供克服这一问题的方法,从而产生不对称多特异性IgG-样抗体的选择性组装。在某些实施方案中,本文提供不对称双特异性抗体构建体,所述抗体构建体包含连接至Fc区的N-末端的至少两个不同的抗原结合单链Fab区段,其中每个所述单链Fab区段包含轻链和重链的选择性配对,并且其中每个所述单链Fab区段识别不同的抗原。
提供一种工程化抗体的Fab部分中的特征的方法,以便有助于专性轻链和重链结构域的选择性配对。以连续方式连续表达专性结构域提供相邻结构域相互作用并且优先配对的动力学上有利的机会。VH与VL之间的环具有足以允许两个结构域之间的天然Fv样填充的长度。类似地,CL与CH1结构域之间的环具有适当的长度以便允许这两个结构域之间的天然相互作用。已经证实CH1是抗体结构中的最慢折叠结构域并且此结构域的折叠通过CL结构域的局部存在诱导。CH1结构域的折叠连接至其与CL结构域的配对。在此提出的轻链***物设计中的CL和CH1结构域序列的顺序表达有助于CH1结构域折叠和与其专性CL结构域的配对。
使用涉及共表达所述抗体的轻链和重链以便形成双特异性分子的常规方法,需要表达两个不同的重链和两个不同的轻链。这导致除目标双特异性产物之外形成不正确的重链和轻链对,并且需要复杂的纯化以便分离正确配对的目标双特异性种类。本文所描述的免疫球蛋白构建体包含单链Fab多肽和单链Fv,所述单链Fab多肽和单链Fv当与适当的恒定结构域多肽组合时允许正确配对的抗体结构的形成。
本文提供一种设计不对称的双特异性抗体分子的方法,所述双特异性抗体分子包含至少两个不同的单链Fab区段,其中每个所述单链Fab区段连接至重链多肽。
在某些实施方案中提供设计双特异性抗体的方法,所述双特异性抗体包含基于两个独立开发的单特异性抗体分子的单链Fab区段。本文提供一种设计抗体构建体的方法,其中所述方法包括配对两个不同的重链,每个重链选择性地与其专性轻链配对。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与所要求保护的主题所属领域中的技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的术语存在多个定义的情况下,以本章节中的那些为准。当提到一个URL或其它此类标识符或地址时,应了解此类标识符可改变,并且互联网上的特定信息可适当地发生变动,但是等效信息可通过搜索互联网来发现。对这些信息的援引显示了它们的可用性和公众传播。
应了解上文一般描述与下文详细描述仅是示例性和解释性的,并且不限制所要求保护的任何主题。在本申请中,除非另外明确陈述,否则使用单数包括复数。
用于产生修饰的CH3结构域的氨基酸修饰包括但不限于氨基酸***、缺失、取代和重排。CH3结构域的修饰和修饰的CH3结构域在本文被统称为“CH3修饰”、“修饰的CH3结构域”、“变体CH3结构域”或“CH3变体”。在某些实施方案中,这些修饰的CH3结构域被并入选择分子中。因此,在一个实施方案中提供包含并入修饰的CH3结构域的Fc区(如本文所用“Fc区”和类似的术语涵盖包含CH3结构域的至少一部分的任何重链恒定区结构域)的分子,例如多肽,如免疫球蛋白(例如抗体)和其它结合蛋白质。包含含有修饰的CH3结构域(例如,包含一个或多个氨基酸***、缺失、取代或重排的CH3结构域)的Fc区的分子在本文被称为“Fc变体”、“异二聚体”或“异多聚体”。本发明的Fc变体包含已进行不对称地修饰的CH3结构域以产生异二聚体Fc变体或区。所述Fc区由两个重链恒定结构域多肽-链A和链B组成,所述多肽可以可互换地使用,其条件是每个Fc区包含一个链A和一个链B多肽。将氨基酸修饰以不对称的方式引入至CH3中,从而在两个修饰的CH3结构域形成Fc变体时产生异二聚体(参见例如表1)。如本文所用,不对称氨基酸修饰是任何修饰,其中在一个多肽(例如“链A”)的特定位置处的氨基酸与所述异二聚体或Fc变体的同一位置处的第二多肽(例如“链B”)上的氨基酸不同。这可以是对来自Fc变体的链A和链B的两种不同氨基酸的两种氨基酸中的仅一种的修饰或两种氨基酸的修饰的结果。应了解变体CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰。
如本文所用,“分离的”构建体意指已经被鉴别并且从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的构建体。其天然环境的污染物组分是将干扰所述免疫球蛋白构建体的诊断或治疗用途的物质,并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
变体Fc异二聚体通常被纯化至基本同质。短语“基本上同质的”、“基本上同质形式”以及“基本同质”用于指示产物基本上没有源自不合需要的多肽组合(例如同二聚体)的副产物。以纯度表示,基本同质意指副产物的量不超过10%,并且优选低于5%,更优选低于1%,更优选低于0.5%,其中百分比是按重量计。
除非本文明确不同地定义,否则由抗体技术领域中的技术人员所理解的术语各自被给予本领域中所获得的含义。抗体已知具有可变区、铰链区和恒定结构域。免疫球蛋白结构和功能综述于例如,Harlow等人编辑,Antibodies:A Laboratory Manual,第14章(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1988)中。
在本说明书中,除非另外指明,否则任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应被理解为包括所列举范围内的任何整数值,并且在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)。如本文所用,除非另外指明,“约”意指所指示范围、值、序列或结构的±10%。应理解,除非另外说明或由其上下文指定,术语“一个(a/an)”如本文所用是指所列举组分中的“一个或多个”。替代(例如,“或”)的使用应被理解为意指所述替代中的任一者、两者或其任何组合。如本文所用,术语“包括(include)”和“包含(comprise)”同义地使用。另外,应理解源自本文所描述的结构和取代基的不同组合的单独单链多肽或免疫球蛋白构建体由本申请公开,其公开程度就如同每个单链多肽或异二聚体单独地进行阐述。因此,选择具体组分以形成单独单链多肽或异二聚体在本公开的范围内。
本文所用的章节标题仅出于组织性目的,并且不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分,包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍手册以及论文,皆据此出于任何目的以引用的方式明确地整体并入本文。
应了解本文所描述的方法和组合物不限于本文所描述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂,并且因此可变化。还应了解,本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而不意图限制本文所描述的方法和组合物的范围,所述范围将仅受所附权利要求书限制。
本文提及的所有公布和专利出于描述和公开例如在所述公布中描述的构建体和方法的目的以引用的方式整体并入本文,所述构建体和方法可结合本文所描述的方法、组合物和化合物使用。本文所论述的公布仅因其公开内容在本申请的提交日期之前而提供。本文的任何内容都不应解释为认可由于先前发明或出于任何其它原因而使本文所描述的发明者无权先于所述公开。
在本申请中,氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)如由蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)所定义来使用,所述蛋白质数据库是基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for AminoAcids and Peptides(残基名称、原子名称等),Eur.J.Biochem.,138,9-37(1984)连同Eur.J.Biochem.,152,1(1985)中的其修正。术语“氨基酸残基”主要意图指示包含于由20种天然存在的氨基酸组成的组中的氨基酸残基,即丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)以及酪氨酸(Tyr或Y)残基。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。也就是说,针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述,并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物,以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用,所述术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链,其中氨基酸残基通过共价肽键相连接。
术语“核苷酸序列”意图指示两个或更多个核苷酸分子的连续段。核苷酸序列可具有基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任何组合。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指用于在体外扩增所需核苷酸序列的方法,如描述于例如美国专利号4,683,195中。一般来说,PCR方法涉及引物延伸合成的反复循环,其使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用,并且所有这类术语应被理解为包括由细胞的生长或培养产生的子代。“转化”和“转染”可互换用于指将DNA引入细胞中的过程。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的a碳)的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经过修饰的R基(如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。提及氨基酸包括,例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸;D-氨基酸;化学修饰的氨基酸,如氨基酸变体和衍生物;天然存在的非蛋白质性氨基酸,如□-丙氨酸、鸟氨酸等;以及具有本领域已知的作为氨基酸的特征的特性的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于,α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如,2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)、以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如,半胱氨酸)。将非天然氨基酸,包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一个或多个D-氨基酸并入本发明的蛋白质中可以是以多种不同的方式有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比表现出增加的体外或体内稳定性。因此,当需要或要求较高的细胞内稳定性时,构建并入D-氨基酸的肽等可以是特别有用的。更具体地说,D-肽等是对内源性肽酶和蛋白酶抗性的,从而在需要改进的分子生物利用度以及延长的体内寿命时,提供这类特性。另外,不能有效加工D-肽等以用于对T辅助细胞的II类主要组织相容性复合体限制呈递,并且因此不太可能诱导完整生物体中的体液免疫应答。
在本文中,氨基酸可以其通常已知的三字母符号或以由国际纯化学与应用化学联合会生物化学命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样,核苷酸可以其通常公认的单字母代码来表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列,“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或当核酸并不编码氨基酸序列时,是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG以及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此,在丙氨酸由密码子指定的每一位置处,可以在不改变所编码多肽的情况下将密码子更改为所描述的相应密码子中的任一个。所述核酸变异是“沉默变异”,其是保守修饰的变异中的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列还描述核酸的每一种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的各密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)均可被修饰以产生功能上相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每个所描述的序列中。
关于氨基酸序列,本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”,其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域中的普通技术人员已知的。所述保守性修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域中的普通技术人员已知的。以下八组各自包含为彼此的保守性取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见,例如Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.;第2版(1993年12月)。
在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下的术语“相同”或“同一性”百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时,或如使用以下序列比较算法(或对于本领域中的普通技术人员来说可供使用的其它算法)中的一种或通过手动比对和目视检查来测量指定区时,如果序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在指定区上约50%同一性、约55%同一性、60%同一性、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%同一性),那么所述序列是“大致上相同的”。此定义还指测试序列的互补序列。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区上,或长度为75至100个氨基酸或核苷酸的区上,或者在未指定的情况下可存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。编码本发明的多肽的多核苷酸(包括来自除人以外的物种的同系物)可通过包括以下步骤的方法来获得:在严格杂交条件下使用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记的探针来筛选文库,以及分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。这类杂交技术是熟练的技术人员众所周知的。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的一个100个氨基酸的序列具有至少50%同一性,则所述衍生物或变体被称为与所述肽共有“同源性”或“同源”的。在某些实施方案中,所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少75%相同。在某些实施方案中,所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少85%相同。在某些实施方案中,所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段至少90%相同。在一些实施方案中,所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段至少95%相同。在某些实施方案中,所述衍生物或变体与所述肽或所述肽的具有相同数目的氨基酸残基作为衍生物的片段的衍生物或变体至少99%相同。
如本文所用,“分离的”多肽或免疫球蛋白构建体意指已经被鉴别并且从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的构建体或多肽。其天然环境的污染物组分是将干扰所述免疫球蛋白构建体的诊断或治疗用途的物质,并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
短语“与......选择性地(或特异性地)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复合混合物(包括但不限于,总细胞或文库DNA或RNA)中时,在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、形成双链体(duplexing)或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在如本领域中已知的低离子强度和高温条件下,DNA、RNA或其它核酸、或其组合的序列的杂交。通常,在严格条件下,探针将与其在核酸的复合混合物(包括但不限于,总细胞或文库DNA或RNA)中的靶标子序列杂交,但不与所述复合混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性地杂交。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)。
如本文所用,“抗体”是指基本上由特异性地结合和识别分析物(抗原)的一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε,其进而分别定义了所述免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成,每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每个链的N-末端定义具有约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链结构域和重链。在某些实施方案中,免疫球蛋白构建体包含来自连接至治疗性多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中,本文所提供的免疫球蛋白构建体中包含的免疫球蛋白结构域是来自基于免疫球蛋白的构建体,如双抗体或纳米抗体。在某些实施方案中,本文所描述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体如骆驼科动物抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中,本文所提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体如牛抗体、人抗体、骆驼科动物抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
“单链Fab区段”或(“单链Fab”)(参见例如图2、图4)是包含以下各项的多肽:抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)以及接头。在本文所描述的单链Fab区段的某些实施方案中,所述抗体结构域和所述接头具有自N末端至C末端包含VH-接头-VL-CL-接头-CH1的序列。在本文所描述的单链Fab区段的某些实施方案中,所述抗体结构域和所述接头具有自N末端至C末端包含VL-CL-接头-VH-CH1的序列。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,每个接头是多肽。在一些实施方案中,每个接头是包含约3至约100个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,每个接头是包含约5至约50个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的一些实施方案中,每个接头是包含至少10个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的一些实施方案中,每个接头是包含至少20个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,至少一个接头是至少30个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,至少一个接头是约30至约50个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,至少一个接头是约35至约50个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的一些实施方案中,每个接头是约30至约50个氨基酸的多肽。在某些实施方案中,每个接头是约35至约50个氨基酸的多肽。在所述单链Fab区段的某些实施方案中,每个接头是约30个氨基酸或更少的多肽。在某些实施方案中,所述单链Fab区段包含为约29个氨基酸或更少的多肽的至少一个接头。在某些实施方案中,所述单链Fab区段包含为约3个氨基酸至约29个氨基酸的多肽的至少一个接头。在某些实施方案中,所述单链Fab区段包含为约32个氨基酸或更少的多肽的至少一个接头。在某些实施方案中,所述单链Fab区段包含在轻链结构域与重链结构域之间的至少一个稳定二硫键。
如本文所用,如本文所描述的“轻链***物设计”或“轻链***物策略”或“轻链***物”(LCI)是指设计包含连接至重链多肽的单链Fv多肽的免疫球蛋白构建体,如图3中所示。在某些实施方案中,“轻链***物设计”或“轻链***物策略”或“轻链***物”是指通过将单链Fv多肽连接至恒定结构域多肽来设计单链Fab,如图2中所示。在一些实施方案中是包含以下各项的单链Fab区(scFab):来自免疫球蛋白重链的可变区多肽(VH)、来自免疫球蛋白轻链的可变区多肽(VL)、来自免疫球蛋白轻链的恒定区多肽(CL)以及来自免疫球蛋白重链的恒定区多肽(CH1);其中VH多肽和VL多肽通过第一接头连接以形成单链Fv构建体(scFv)。在一些实施方案中,所述CL和CH1通过第二接头连接。在某些实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VH-L1-VL-CL-L2-CH1的序列,其中L1和L2是第一接头和第二接头。在某些实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VH-L1-VL-L3-CL-L2-CH1的序列,其中L1、L2以及L3是接头。在一个实施方案中,所述免疫球蛋白构建体具有包含VL-L4-VH-CH1-L5-CL的序列,其中L4和L5是接头。
在某些实施方案中,每个接头是包含约1至约100个氨基酸的多肽。在特定实施方案中,每个接头是包含约1至约50个氨基酸的多肽。在特定实施方案中,每个接头是包含约10至约25个氨基酸的多肽。在一些实施方案中,所述接头包含含有选自Gly(G)、Ser(S)和Glu(E)的氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述接头由通式(Gly-Gly-Gly-Ser)n的多肽组成,其中n是4至10的整数。在某些实施方案中,至少一个接头是基于其增加纯化构建体的方便来进行选择。
如本文所用,如本文所描述的“长接头设计”或“长接头策略”或“长接头”(LL)是指设计包含连接至重链多肽的单链Fab多肽的多特异性或双特异性免疫球蛋白构建体,如图5中所示。在某些实施方案中,“长接头设计”或“长接头策略”或“长接头”是指如图4中所示设计单链Fab。在某些实施方案中,所述长接头包含具有形成螺旋的倾向的接头多肽。在一些实施方案中,所述接头的至少约25%以螺旋形式存在。在一些实施方案中,所述接头的至少约50%以螺旋形式存在。在某些其它实施方案中,所述接头的至少约60%以螺旋形式存在。在另一个实施方案中,所述接头的至少约75%以螺旋形式存在。在另一个实施方案中,所述接头的至少约80%以螺旋形式存在。在其它实施方案中,所述接头的至少约90%以螺旋形式存在。在其它实施方案中,所述接头的至少约95%以螺旋形式存在。在某些实施方案中,所述接头包含多个螺旋区段。在某些实施方案中,所述螺旋接头是基于其增加纯化构建体的方便来进行选择。
提供本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头多肽形成α螺旋、聚脯氨酸I型螺旋、聚脯氨酸II型螺旋以及310螺旋中的至少一个。在一些实施方案中,所述接头形成约1圈至约20圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约3圈至约5圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约2圈至约4圈之间的螺旋。在一个实施方案中,所述接头形成约2圈至约10圈之间的螺旋。在一些实施方案中,所述接头包含至少一对形成螺旋稳定相互作用的氨基酸。在一个实施方案中,所述螺旋稳定相互作用是电荷-电荷相互作用、阳离子-π相互作用、疏水相互作用以及大小互补相互作用中的至少一个。
提供本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体包含至少一个具有形成螺旋的倾向的接头多肽,并且其中所述接头多肽包含选自Gly(G)、Ser(S)、Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Val(V)以及Ile(I)的氨基酸。在某些实施方案中,所述接头多肽包含选自Met(M)、Ala(A)、Leu(L)、Glu(E)以及Lys(K)的氨基酸。在一个实施方案中,所述接头多肽包含至少一个Pro(P)残基。在某些实施方案中,所述接头具有包含至少一个(Asp-Asp-Ala-Lys-Lys)n基序的氨基酸序列,其中n是1至10的整数。
本文提供包含以下各项的免疫球蛋白构建体:第一多肽构建体,其包含本文所描述的第一scFab和含有第一CH3区的第一重链多肽;以及第二多肽构建体,其包含含有第二CH3区的第二重链多肽,其中所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个任选地包含变体CH3区,所述变体CH3区促进异二聚体的形成。在一些实施方案中,所述第一多肽构建体和第二多肽构建体还包含抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中,所述抗原结合多肽构建体是scFv或scFab中的至少一个。在一些实施方案中,所述scFab是本文所描述的scFab。
在某些实施方案中,取决于呈scFab或scMab形式的所要求的变体,其它免疫球蛋白恒定结构域包含于多肽序列和编码所述多肽的核酸序列中。在某些实施方案中,scMab构建体包含VH、VL、CL、CH1、CH2和CH3结构域与如本文所描述的接头以及存在的天然铰链区。在一些实施方案中,采用野生型CH3结构域序列来实现二价单特异性抗体分子。在一些实施方案中,采用CH2和CH3结构域的突变型式,所述突变型式改变FcRn结合或有利于CH3异二聚体形成。在一些实施方案中,CH2序列未包含于目标多肽序列中。在一些实施方案中,CH3结构域包含导致异二聚体Fc形成的突变。在一些实施方案中,采用形成异二聚体Fc的序列来实现二价双特异性抗体分子。
在一些实施方案中,所述第一重链多肽和第二重链多肽形成异二聚体Fc。在某些实施方案中,所述异二聚体Fc包含含有至少一个氨基酸突变的变体免疫球蛋白CH3结构域。在某些实施方案中,所述至少一个氨基酸突变促进具有可比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体Fc的形成。在一个实施方案中,所述变体CH3结构域具有约73℃或更大的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约90%的纯度。在一些实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约98%的纯度并且Tm是至少约73℃。在另一个实施方案中,所述异二聚体Fc被形成为具有至少约90%的纯度并且Tm是约75℃。
提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个还包含变体CH2结构域,所述变体CH2结构域包含氨基酸修饰以便促进与至少一种Fcγ受体的选择性结合。在一个实施方案中,所述第一重链多肽和第二重链多肽中的至少一个包含变体CH2结构域或铰链,所述变体CH2结构域或铰链包含阻止与至少一种Fcγ受体的功能有效结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中,所述Fc区是糖基化的。在一些实施方案中,所述Fc区是无糖基化的。在一个实施方案中,所述Fc区是岩藻糖化的。在另一个实施方案中,所述Fc区是无岩藻糖化的。
在一些实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述免疫球蛋白构建体是多特异性免疫球蛋白构建体。在一个实施方案中,其中所述免疫球蛋白构建体是双特异性的。
提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含通过接头连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含通过接头连接至第二恒定结构域多肽的与所述第一单链Fv多肽不同的第二单链Fv多肽,所述第二恒定结构域多肽与所述第一恒定结构域多肽不同;每个所述恒定结构域多肽包含CL区、CH1区以及CH3区或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述CL区和CH1区通过接头连接,并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。在一些实施方案中,所述构建体不包含任何CH2结构域。
在一个实施方案中提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含与第一恒定结构域多肽融合的第一scFab多肽;以及第二单体多肽,其包含与第二恒定结构域多肽融合的、与所述第一Fab多肽不同的第二scFab多肽;其中所述第一和第二scFab多肽中的至少一个包含具有形成螺旋结构的倾向的接头多肽;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异二聚体Fc区,所述变体免疫球蛋白CH3区包含至少一个氨基酸突变,所述至少一个氨基酸突变促进具有比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体的形成。
本文提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含连接至第二恒定结构域多肽的第二单链Fv多肽;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域、CH2结构域以及CH3结构域或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中至少一个单链Fv多肽通过接头连接至对应恒定结构域多肽的CL结构域。在某些实施方案中提供一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中至少一个单链Fv多肽通过接头连接至对应恒定结构域多肽的CH1结构域。在某些实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中至少一个单体多肽具有包含VH-L1-VL-CL-L2-CH1-CH2-CH3的序列,其中L1和L2是接头。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中至少一个单体多肽具有包含VH-L3-VL-L4-CH1-L5-CL-CH2-CH3的序列,其中L3、L4和L5是接头。在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中至少一个单体多肽具有包含VL-L6-VH-CH1-L7-CL-CH2-CH3的序列,其中L6和L7是接头。在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,所述恒定结构域多肽任选地包含连接所述CL结构域、CH1结构域、CH2结构域以及CH3结构域中的一个或多个的至少一个接头。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成异二聚体Fc区。在某些实施方案中,所述异二聚体Fc区包含含有至少一个氨基酸突变的变体免疫球蛋白CH3结构域。在一些实施方案中,所述至少一个氨基酸突变促进具有可比得上天然同二聚体Fc的稳定性所述异二聚体Fc区的形成。在一些实施方案中,所述变体CH3结构域具有约73℃或更大的熔解温度(Tm)。在某些实施方案中,所述异二聚体Fc区被形成为具有大于约90%的纯度。在某些实施方案中,所述异二聚体Fc区被形成为具有至少约98%或更大的纯度并且Tm是至少约73℃。在一些实施方案中,所述异二聚体Fc区被形成为具有约90%或更大的纯度并且Tm是约75℃。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其包含含有变体CH2结构域的至少一个恒定结构域多肽,所述变体CH2结构域包含氨基酸修饰以便促进与至少一种Fcγ受体的选择性结合。在一些实施方案中,至少一个恒定结构域多肽包含变体CH2结构域或铰链,所述变体CH2结构域或铰链包含阻止与至少一种Fcγ受体的功能有效结合的氨基酸修饰。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述Fc区是糖基化的。在一些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述Fc区是无糖基化的。
在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中每个接头是包含约1至约100个氨基酸的多肽。在一些实施方案中,接头多肽具有通式(Gly-Gly-Gly-Ser)n,其中n是1至20的整数。
提供一种本文所描述的分离的免疫球蛋白构建体,其中所述免疫球蛋白构建体是多特异性免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白构建体是双特异性的。
提供一种包含以下各项的分离的双特异性免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含通过接头连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含通过接头连接至第二恒定结构域多肽的与所述第一Fv多肽不同的第二单链Fv多肽,所述第二恒定结构域多肽与所述第一恒定结构域多肽不同;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域、CH2区以及CH3区或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。
本文提供一种包含以下各项的分离的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含连接至第二恒定结构域多肽的第二单链Fv多肽;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域、CH2结构域以及CH3结构域或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。
本文提供一种包含以下各项的分离的双特异性免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含通过接头连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含通过接头连接至第二恒定结构域多肽的与所述第一Fv多肽不同的第二单链Fv多肽,所述第二恒定结构域多肽与所述第一恒定结构域多肽不同;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域以及CH3区或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。本文提供一种包含以下各项的分离的双特异性免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及第二单体多肽,其包含连接至第二恒定结构域多肽的第二单链Fv多肽;每个所述恒定结构域多肽包含CL结构域、CH1结构域以及CH3结构域或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;并且其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成Fc区。在某些实施方案中,所述构建体不包含任何CH2结构域。
本文提供一种包含连接至恒定结构域多肽的单链Fv多肽的单链Fab多肽,所述恒定结构域多肽包含至少一个CL结构域和一个CH1结构域。
本文提供一种包含以下各项的免疫球蛋白构建体:第一单体多肽,其包含与第一恒定结构域多肽融合的第一单链Fab多肽;以及第二单体多肽,其包含与第二恒定结构域多肽融合的与所述第一Fab多肽不同的第二单链Fab多肽;其中所述第一和第二恒定结构域多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异二聚体Fc区,所述变体免疫球蛋白CH3区包含至少一个氨基酸突变,所述至少一个氨基酸突变促进具有比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体Fc的形成。在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的多特异性免疫球蛋白构建体,其中所述第一单链Fab多肽和所述第二单链Fab多肽中的至少一个具有包含VH-L8-VL-CL-L9-CH1的序列;其中L8和L9是接头。在某些实施方案中是一种本文所描述的分离的多特异性免疫球蛋白构建体,其中所述第一单链Fab多肽和所述第二单链Fab多肽中的至少一个具有包含VL-CL-L10-VH-CH1的序列;其中L10是接头。
本文提供一种包含如本文所定义的分离的免疫球蛋白构建体和适合的赋形剂的药物组合物。还提供一种用于产生这种药物组合物的方法,所述方法包括:在允许如本文所定义的免疫球蛋白构建体表达的条件下培养宿主细胞;从所述培养物回收所产生的免疫球蛋白构建体;以及产生所述药物组合物。
在某些实施方案中提供一种治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。在某些实施方案中,所述癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中,所述实体肿瘤是肉瘤、癌和淋巴瘤中的一种或多种。在一些实施方案中,所述癌症是B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和白血病中的一种或多种。
在某些实施方案中提供一种治疗有需要的哺乳动物中的自身免疫性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。在某些实施方案中,所述自身免疫性病状是以下中的一种或多种:多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病和1型糖尿病。
在某些实施方案中提供一种治疗有需要的哺乳动物中的炎性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。
本文提供包含编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的核酸的宿主细胞。在某些实施方案中,编码所述第一单体蛋白的核酸和编码所述第二单体蛋白的核酸存在于单个载体中。在某些实施方案中,编码所述第一单体蛋白的核酸和编码所述第二单体蛋白的核酸存在于单独的载体中。
还提供一种包括如本文所定义的免疫球蛋白构建体及其使用说明书的试剂盒。
功能活性:
“具有功能活性的多肽”是指能够展示与全长/天然蛋白质相关的一种或多种已知的功能活性的多肽。这类功能活性包括但不限于生物活性、抗原性[结合(或与多肽竞争结合)抗多肽抗体的能力]、免疫原性(产生结合本文所描述的特定多肽的抗体的能力)、与本文所描述的多肽形成多聚体的能力以及结合多肽的受体或配体的能力。在某些实施方案中,所述功能活性包括改进配偶体蛋白质的表达和稳定性的能力。
“具有生物活性的多肽”是指如在特定生物测定中测量的表现出与本文所描述的治疗性蛋白(包括成熟形式)的活性类似但不一定相同的活性的多肽,所述活性具有或不具有剂量依赖性。在剂量依赖性确实存在的情况下,与本文所描述的多肽相比,不必与所述多肽的剂量依赖性相同,而是基本上类似于给定活性的剂量依赖性(即,相对于本文所描述或表2中所呈现的多肽,候选多肽将表现出更大的活性或不超过约25倍更少或不超过约10倍更少的活性,或不超过约三倍更少的活性)。
使用或常规地改进本领域已知的测定、以及本文所描述的测定,可以测定本文所描述的免疫球蛋白构建体的功能活性(例如,生物活性)。
在某些实施方案中,当鉴别本文所描述的免疫球蛋白构建体的结合配偶体(例如受体或配体)时,测定本文所描述的免疫球蛋白构建体与所述结合配偶体的结合,例如通过本领域中熟知的方式例如像还原和非还原凝胶色谱法、蛋白质亲和色谱法以及亲和印迹。通常参见Phizicky等,Microbiol.Rev.59:94-123(1995)。在另一个实施方案中,可以使用本领域中已知的技术常规地测定免疫球蛋白构建体的生理学相关物与所述免疫球蛋白构建体的多肽的一种或多种底物结合的能力。
提供本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体结合选自CD3、CD19、HER2、组织因子和CD16a的至少一种靶抗原。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由细胞毒性细胞表达的抗原。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由T细胞表达的抗原。在一些实施方案中,所述T细胞是T辅助细胞、细胞毒性T细胞和自然杀伤T细胞中的至少一种。在某些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中是本文所描述的免疫球蛋白构建体,所述免疫球蛋白构建体结合由免疫细胞表达的抗原。
在一个实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种T细胞或自然杀伤细胞以及表达抗原的至少一种其它细胞。在一个实施方案中提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种T细胞和至少一种B细胞。在一些实施方案中,所述T细胞是人细胞。在一个实施方案中,所述T细胞是非人哺乳动物细胞。在一些实施方案中,本文所描述的免疫球蛋白构建体结合细胞上表达的与疾病相关的抗原。在一些实施方案中,所述疾病是癌症。在一个实施方案中,所述癌症选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和神经胶质瘤。在一个实施方案中,所述癌症是肉瘤、胚细胞瘤、***状瘤以及腺瘤中的至少一种。在一些实施方案中,所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌、骨肉瘤和软组织肉瘤中的至少一种。
在一些实施方案中,本文所描述的免疫球蛋白构建体结合为自身免疫反应性细胞的至少一种细胞上的抗原。在一些实施方案中,所述自身免疫反应性细胞是淋巴或骨髓细胞。
如本文所用的术语“有效量”是指所施用的免疫球蛋白构建体的量,所述量将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状。含有本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物可以被施用以用于预防性、增强和/或治疗性治疗。
治疗用途:
一方面,本文所描述的免疫球蛋白构建体涉及基于抗体的疗法,所述疗法涉及向患者施用所述构建体、其片段或变体以用于治疗一种或多种所公开的疾病、病症或病状。本文所描述的治疗性化合物包括但不限于本文所描述的免疫球蛋白构建体、编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的核酸。
在一个具体实施方案中是基于抗体的疗法,所述疗法涉及向患者施用包含抗体至少一个片段或变体的本文所描述的的免疫球蛋白构建体以用于治疗一种或多种疾病、病症或病状,所述疾病、病症或病状包括但不限于:神经病症、免疫***病症、肌肉病症、生殖病症、胃肠病症、肺病症、心血管病症、肾病症、增生性病症和/或癌性疾病和病状和/或如本文其它地方所描述的疾病、病症或病状。
在治疗上使用所述免疫球蛋白构建体的方式的总结包括在身体中局部地或全身性地结合,或通过抗体的直接细胞毒性结合,例如如通过补体(CDC)或通过效应细胞(ADCC)来介导。这些途径中的一些在以下更详细地描述。根据本文所提供的教义,本领域的普通技术人员将知道如何出于诊断、监测或治疗目的来使用本文所描述的免疫球蛋白构建体而无需过多实验。
本文所描述的包含抗体的至少一个片段或变体的免疫球蛋白构建体可单独或与其它类型的治疗(例如,放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法以及抗肿瘤剂)组合施用。一般来说,优选的是施用具有与所述患者相同的物种的物种起源或物种反应性(在抗体的情况下)的产物。因此,在一个实施方案中,为了治疗或预防将人抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用至人患者。
基因疗法:
在一个具体实施方案中,通过基因疗法,施用包含编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的序列的核酸以治疗、抑制或预防与蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因疗法是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸所进行的疗法。在这个实施方案中,所述核酸产生其编码的介导治疗作用的蛋白质。可使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
治疗或预防活性的证明:
在用于人中之前,在体外测试本文所描述的免疫球蛋白构建体或药物组合物,并且之后在体内测试所需的治疗或预防活性。例如,用于证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。所述化合物或组合物对所述细胞系和/或组织样品的作用可使用本领域技术人员已知的技术进行测定,所述技术包括但不限于玫瑰花结(rosette)形成测定和细胞溶解测定。根据本发明,可用于确定是否指示施用特定化合物的体外测定包括体外细胞培养测定,其中将患者组织样品生长在培养物中并且暴露于免疫球蛋白构建体或以另外的方式施用免疫球蛋白构建体,并且观察所述免疫球蛋白构建体对所述组织样品的作用。
治疗性/预防性施用和组合物
提供通过向受试者施用有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体或药物组合物来治疗、抑制和预防的方法。在一个实施方案中,所述免疫球蛋白构建体是大体上纯化的(即,大体上不含限制其作用或产生所不希望的副作用的物质)。在某些实施方案中,所述受试者是动物,包括但不限于动物如牛、猪、马、鸡、猫、狗等,并且在某些实施方案中是哺乳动物,并且最优选人。
在一个实施方案中是一种用于产生本文所描述的药物组合物的方法,所述方法包括:在允许如本文所描述的免疫球蛋白构建体表达的条件下培养宿主细胞;从所述培养物回收所产生的免疫球蛋白构建体;以及产生所述药物组合物。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体在治疗有需要的哺乳动物中的癌症的用途,所述用途包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物。在一个实施方案中,所述癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中,所述实体肿瘤是肉瘤、癌和淋巴瘤中的一种或多种。在一个实施方案中,所述癌症是B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和白血病中的一种或多种。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的自身免疫性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供一种本文所描述的免疫球蛋白构建体在治疗自身免疫性疾病中的用途,所述用途包括提供包含有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物。在一些实施方案中,所述自身免疫性病状是以下中的一种或多种:多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病和1型糖尿病。
提供一种治疗有需要的哺乳动物中的炎性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的本文所描述的药物组合物的组合物。还提供免疫球蛋白构建体在治疗个体中的炎性病状中的用途,所述用途包括向所述个体提供有效量的本文所描述的免疫球蛋白构建体。
不同递送***是已知的并且可用于施用本文所描述的免疫球蛋白构建体制剂,例如封装在脂质体、微颗粒、微胶囊中,能够表达所述化合物的重组细胞,受体介导的内吞作用(参见,例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可通过任何适宜途径施用,例如通过输注或弹丸注射,通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收,并且可与其它生物活性剂一起施用。施用可为全身性的或局部的。此外,在某些实施方案中,希望通过任何适合的途径(包括心室内和鞘内注射)将本文所描述的免疫球蛋白构建体组合物引入中枢神经***中;心室内注射可通过例如附接至储库(如Ommaya储库)的心室内导管来促进。还可以采用肺部施用,例如通过使用吸入器或喷雾器,并与雾化剂一起配制。
在一个具体实施方案中,希望将本文所描述的免疫球蛋白构建体或组合物局部施用至需要治疗的区域;这可通过例如但不限于以下的方式来实现:在外科手术过程中局部输注、局部应用例如在外科手术之后结合伤口敷料、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物,所述植入物是多孔或无孔或凝胶状材料,包括膜如硅橡胶膜(sialastic membrane)或纤维。优选地,当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时,必须注意使用所述蛋白质不会吸收的材料。
在另一个实施方案中,所述免疫球蛋白构建体或组合物可以囊泡、具体地说脂质体的形式递送(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990);Treat等,于Liposomes in the Therapy of Infectious Disease andCancer,Lopez-Berestein和Fidler(编著),Liss,New York,第353-365页(1989);Lopez-Berestein,同上,第317-327页;通常参见同上)。
在另一实施方案中,可以控制释放***来递送免疫球蛋白或组合物。在一个实施方案中,可使用泵(参见Langer,同上;Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald等,Surgery 88:507(1980);Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中,可以使用聚合材料(参见Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编著),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编著),Wiley,New York(1984);Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);还参见Levy等,Science 228:190(1985);During等,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等,J.Neurosurg.71:105(1989))。在另一实施方案中,控制释放***可邻近治疗性靶标(例如脑)置放,由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release,同上,第2卷,第115-138页(1984))。
其它控制释放***在Langer(Science 249:1527-1533(1990))的综述中论述。
在包含编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的核酸的一个具体实施方案中,所述核酸可通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并且施用它以使得它变成细胞内核酸来体内施用以促进它所编码的蛋白质的表达,此举的实现是例如通过使用反转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286),或通过直接注射,或通过使用微粒轰击(例如基因枪;Biolistic,Dupont),或用脂质或细胞表面受体或转染剂包覆,或通过将它与已知会进入核的同源盒样肽(homeobox-like peptide)连接来施用(参见例如Joliot等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868(1991))。或者,可细胞内引入核酸并且通过同源重组并入宿主细胞DNA内以进行表达。
本文还提供药物组合物。所述组合物包含治疗有效量的免疫球蛋白构建体和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中,术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准、或在美国药典中列出,或在用于动物并且更具体地说人的其它一般公知的药典中列出。术语“载体”是指使用其来施用治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌液体,如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时,水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体,尤其用于可注射溶液。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时,组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等的形式。所述组合物可用传统粘合剂和载体(如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体,如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′sPharmaceutical Sciences”中。所述组合物将包含治疗有效量的所述化合物(优选呈纯化形式)连同适合量的载体,以便提供适于施用至患者的形式。所述制剂应该符合施用方式的要求。
在某些实施方案中,将包含本文所描述的免疫球蛋白构建体的组合物根据常规工序配制为适用于静脉内施用至人类的药物组合物。通常,用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时,组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。一般来说,所述成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。在组合物有待通过输注施用的情况下,所述组合物可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在组合物通过注射施用的情况下,可提供含注射用无菌水或盐水的安瓿以便可在施用前混合各成分。
在某些实施方案中,本文所描述的组合物被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐,如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐;和与阳离子形成的那些盐,如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
可通过标准临床技术来确定本文所描述的组合物的将有效于治疗、抑制和预防与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的量。另外,可任选地采用体外测定以帮助鉴别最佳剂量范围。待用于所述制剂中的精确剂量还将取决于给药途径,和疾病或病症的严重程度,并且应该根据从业者的判断和每位患者的状况决定。由来源于体外或动物模型测试***的剂量-反应曲线外推有效剂量。
免疫球蛋白构建体的重组和合成产生方法:
提供一种包含至少一种用于表达本文所描述的免疫球蛋白构建体的表达载体的组合物,所述表达载体包含编码所述免疫球蛋白构建体的至少一个核酸序列。
在某些实施方案中是一种在稳定哺乳动物细胞中产生含有本文所描述的免疫球蛋白构建体的表达产物的方法,所述方法包括用编码所述免疫球蛋白构建体的至少一个DNA序列转染至少一种哺乳动物细胞,以产生稳定哺乳动物细胞;培养所述稳定哺乳动物细胞以产生包含所述免疫球蛋白构建体的所述表达产物。在某些实施方案中,所述哺乳动物细胞选自由VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞以及其亚类和变体组成的组。
在某些实施方案中是通过从酵母、微生物如细菌、或人或动物细胞系分泌而作为重组分子产生的免疫球蛋白构建体。在实施方案中,所述多肽是从宿主细胞分泌的。
实施方案包括细胞,如被转化以表达本文所描述的免疫球蛋白构建体的酵母细胞。除了转化的宿主细胞自身以外,提供那些细胞在营养培养基中的培养物,优选地单克隆(同源克隆地)培养物,或源自单克隆培养物的培养物。如果分泌多肽,则所述培养基将包含所述多肽与所述细胞,或无所述细胞(如果它们已经被过滤或离心掉)。许多表达***是已知的并且可以使用,包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母以及巴斯德毕赤酵母)、丝状真菌(例如曲霉)、植物细胞、动物细胞以及昆虫细胞。
本文所描述的免疫球蛋白构建体以常规方式产生,例如从***宿主染色体中或游离质粒上的编码序列产生。所述酵母以任何通常方式例如电穿孔用所需蛋白质的编码序列进行转化。用于通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker&Guarente(1990)Methods Enzymol.194,182中。
成功转化的细胞,即包含本发明的DNA构建体的细胞可通过熟知技术来鉴别。例如,可生长由引入表达构建体产生的细胞以产生所需多肽。可收获并溶解细胞并且使用方法如由Southern(1975)J.Mol.Biol.98,503或Berent等.(1985)Biotech.3,208所描述的方法将其DNA内容物针对所述DNA的存在进行检查。或者,可使用抗体来检测上清液中蛋白质的存在。
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416并且通常可从Stratagene Cloning Systems,La Jolla,Calif.92037,USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405以及pRS406是酵母整合质粒(YIp)并且并入酵母选择性标记物HIS3、7RP1、LEU2以及URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
已发展多种方法用于通过互补粘性末端将DNA可操作地连接至载体。例如,互补同聚物序列(tracts)可以被添加至有待***至载体DNA的DNA区段。所述载体和DNA区段然后通过所述互补同聚尾部之间的氢键合连接以形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供将DNA区段连接至载体的替代方法。将通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶1进行处理,所述酶用其3′5′外切核酸酶活性去除突出的-单链末端,并且用其聚合活性填充3′-凹端。
这些活性的组合因此产生平末端DNA区段。平末端区段然后在能够催化平末端DNA分子的连接的酶(如噬菌体T4DNA连接酶)存在下与大量摩尔过量的接头分子一起孵育。因此,反应产物是在其端处携带聚合物接头序列的DNA区段。这些DNA区段然后用适当的限制性酶裂解并且连接至表达载体,所述表达载体已用产生与所述DNA区段的末端相容的末端的酶裂解。
含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可自多个来源商购,包括International Biotechnologies Inc,New Haven,Conn.,USA。
预期作为用于表达白蛋白融合蛋白的宿主适用于实施本发明的示例性酵母属是毕赤酵母属(Pichua)(以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula))、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、木霉属(Trichoderma)、头孢酶属(Cephalosporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、亚罗酵母属(Yarrowia)、梅奇酵母属(Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等。优选的属是选自由酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属以及有孢圆酵母属组成的组的那些。酵母属菌种的实例是酿酒酵母、意大利糖酵母(S.italicus)以及鲁氏糖酵母(S.rouxii)。
克鲁维酵母属菌种的实例是胞壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。适合的有孢圆酵母属菌种是德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母属(汉逊酵母属)菌种的实例是安格斯毕赤酵母(P.angusta)(之前多形汉逊酵母(H.polymorpha))、异常毕赤酵母(P.anomala)(之前异常汉逊酵母(H.anomala))以及巴斯德毕赤酵母。用于转化酿酒酵母的方法是EP 251744、EP 258 067以及WO 90/01063中通常所教导的,所述专利以引用的方式并入本文。
优选的示例性酵母属菌种包括酿酒酵母、意大利糖酵母、糖化酵母(S.diastaticus)以及鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。优选的示例性克鲁维酵母属菌种包括胞壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母。优选的示例性汉逊酵母属菌种包括多形汉逊酵母(现在安格斯毕赤酵母)、异常汉逊酵母(现在异常毕赤酵母)以及荚膜毕赤氏酵母(Pichiacapsulata)。另外优选的示例性毕赤酵母菌种包括巴斯德毕赤酵母。优选的示例性曲霉属菌种包括黑曲霉和构巢曲霉。优选的示例性亚罗酵母属菌种包括解脂亚罗酵母(Y lipolytica)。许多优选的酵母菌种可从ATCC获得。例如,以下优选的酵母菌种可从ATCC获得并且适用于表达白蛋白融合蛋白:酿酒酵母Hansen、有性型菌株(teleomorph strain)BY4743yap3突变体(ATCC登录号4022731);酿酒酵母Hansen,有性型菌株BY4743hsp150突变体(ATCC登录号4021266);酿酒酵母Hansen,有性型菌株BY4743pmt1突变体(ATCC登录号4023792);酿酒酵母Hansen,有性型(ATCC登录号20626;44773;44774;以及62995);糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)Andrews和Gilliland不包括van der Walt,有性型(ATCC登录号62987);乳酸克鲁维酵母(Dombrowski)van der Walt,有性型(ATCC登录号76492);安格斯毕赤酵母(Teunisson等)Kurtzman,保藏为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)de Morais和Maia的有性型,有性型(ATCC登录号26012);黑曲霉van Tieghem,无性型(ATCC登录号9029);黑曲霉van Tieghem,无性型(ATCC登录号16404);构巢曲霉(Eidam)Winter,无性型(ATCC登录号48756);以及解脂耶氏酵母(Wickerham等)vander Walt和vonArx,有性型(ATCC登录号201847)。
酿酒酵母的适合启动子包括与以下相关的那些:PGKI基因、GAL1或GAL10基因,CYCI、PH05、TRP1、ADH1、ADH2,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡萄糖激酶、α-交配因子信息素[一种交配因子信息素]的基因,PRBI启动子、GUT2启动子、GPDI启动子、以及涉及5′调控区的部分与其它启动子的5′调控区的部分或与上游活化位点的杂合体的杂合启动子(例如EP-A-258 067的启动子)。
用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方便可调控启动子是如由Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265,10857-10864所描述的来自nmt基因的硫胺素可抑制启动子和如由Hoffman&Winston(1990)Genetics 124,807-816所描述的葡萄糖可抑制jbp1基因启动子。
转化用于表达外源基因的毕赤酵母的方法在例如Cregg等(1993)和不同Phillips专利(例如美国专利号4,857,467,以引用的方式并入本文)中教导,并且毕赤酵母表达试剂盒可从Invitrogen BV,Leek,Netherlands和Invitrogen Corp.,San Diego,Calif商购。适合的启动子包括AOX1和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132,3459-3465包括关于汉逊酵母载体和转化的信息,适合的启动子是MOX1和FMD1;而EP 361 991,Fleer等(1991)和来自Rhone-PoulencRorer的其它公布教导如何在克鲁维酵母属菌种中表达外源蛋白质,适合的启动子是PGKI。
转录终止信号优选地是真核基因的3′侧翼序列,所述序列包含转录终止和多腺苷酸化的正确信号。适合的3′侧翼序列可以是例如与所使用的表达控制序列天然地连接的基因的那些,即可与启动子相对应。或者,它们可以是不同的,在这种情况下优选酿酒酵母ADHI基因的终止信号。
在某些实施方案中,所需免疫球蛋白构建体蛋白最初使用分泌性前导序列表达,所述前导序列可以是在所选择的酵母中有效的任何前导序列。适用于酿酒酵母中的前导序列包括来自交配因子α多肽(MFα-1)的前导序列和EP-A-387 319的杂合前导序列。所述前导序列(或信号)在成熟白蛋白释放到周围培养基中之前被酵母裂解。此外,所述前导序列包括JP 62-096086(授权号为911036516)中所公开的酿酒酵母转化酶(SUC2)、酸性磷酸酶(PH05)、MF□-1的前序列、0葡聚糖酶(BGL2)和杀伤毒素;糖化酵母葡糖淀粉酶Il;卡尔酵母□-半乳糖苷酶(MEL1);乳酸克鲁维酵母杀伤毒素;以及假丝酵母属葡萄糖淀粉酶的前导序列。
提供含有编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的多核苷酸的载体、宿主细胞、以及通过合成和重组技术产生免疫球蛋白构建体。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制感受态型或复制缺陷型的。在后者情况下,病毒繁殖通常将仅发生于互补宿主细胞中。
在某些实施方案中,编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的多核苷酸连接至含有用于在宿主中繁殖的选择性标记物的载体。一般来说,将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀物中,或引入具有带电荷脂质的复合物中。如果载体是病毒,可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装并且然后转导至宿主细胞中。
在某些实施方案中,多核苷酸***片段(insert)可操作地连接至适当的启动子,如噬菌体λPL启动子,大肠杆菌lac、trp、phoA和rac启动子,SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等。其它适合的启动子对于本领域的技术人员将是已知的。所述表达构建体将还包含转录起始、终止位点,以及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分将优选包括在待翻译的多肽的起始处的翻译起始密码子和适当地位于待翻译多肽的末端处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所指示,所述表达载体将优选包括至少一种选择性标记物。所述标记物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性,和用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞;真菌细胞,如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(ATCC登录号201178));昆虫细胞如果蝇属S2和夜蛾属Sf9细胞;动物细胞如CHO、COS、NSO、293以及人黑色素瘤细胞;以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域中已知的。
优选用于细菌的载体包括可从QIAGEN,Inc.获得的pQE70、pQE60和pQE-9;可从Stratagene Cloning Systems,Inc.获得的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A;以及可从Pharmacia Biotech,Inc.获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG;以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。用于酵母***的优选表达载体包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K以及PAO815(全部可从Invitrogen,Carlbad,CA获得)。其它适合的载体对于本领域的技术人员将是显而易见的。
在一个实施方案中,编码本文所描述的免疫球蛋白构建体的多核苷酸与信号序列融合,所述信号序列将指导本发明的蛋白质定位至原核或真核细胞的特定隔室和/或指导本发明的蛋白质自原核或真核细胞的分泌。举例来说,在大肠杆菌中,可能希望指导所述蛋白质表达至周质间隙。所述免疫球蛋白构建体与其融合以便指导所述多肽表达至细菌的周质间隙的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定肠毒素B-亚基的信号序列、以及碱性磷酸酶的信号序列。几种载体可商购用于构建将指导蛋白质的定位的融合蛋白,如可从New England Biolabs获得的pMAL系列载体(具体地是pMAL-.rho.系列)。在一个具体实施方案中,本发明的多核苷酸白蛋白融合蛋白可与pelB果胶酸裂解酶信号序列融合以增加所述多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。参见美国专利号5,576,195和5,846,818,所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
与免疫球蛋白构建体融合以便指导其在哺乳动物细胞中的分泌的信号肽的实例包括但不限于MPIF-1信号序列(例如GenBank登录号AAB51134的氨基酸1-21)、司腺钙蛋白(stanniocalcin)信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA)以及共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG)。可与杆状病毒表达***结合使用的适合信号序列是gp67信号序列(例如,GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择性标记物的载体可分别在药物甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)或甲氨蝶呤存在下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是可利用为谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如,鼠类骨髓瘤细胞系,NSO)。谷氨酰胺合酶表达***还可通过提供另外抑制剂来防止内源性基因的作用而在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达***及其组分在以下PCT公布中详述:WO87/04462;WO86/05807;WO89/10036;WO89/10404;以及WO91/06657,所述公布特此以引用的方式整体并入本文。另外,谷氨酰胺合酶表达载体可从Lonza Biologics,Inc.(Portsmouth,N.H.)获得。使用GS表达***在鼠类骨髓瘤细胞中表达和产生单克隆抗体描述于Bebbington等,Bio/technology 10:169(1992)和Biblia和Robinson Biotechnol.Prog.11:1(1995)中,所述文献以引用的方式并入本文。
还提供含有本文所描述的载体构建体的宿主细胞,并且另外提供含有核苷酸序列的宿主细胞,所述核苷酸序列使用本领域中已知的技术与一个或多个异源调控区(例如,启动子和/或增强子)可操作地缔合。所述宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞(例如,源于人的细胞)或低等真核细胞如酵母细胞,或所述宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可选择调节***基因序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物存在下可提高从某些启动子的表达,从而可控制遗传工程化的多肽的表达。此外,不同宿主细胞具有翻译和翻译后加工和修饰(例如,磷酸化、裂解)蛋白质的特征和特定机制。可选择适当细胞系以确保对所表达的外来蛋白质的所需修饰和加工。
将本发明的核酸和核酸构建体引入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现。所述方法描述于许多标准实验室手册中,如Davis等Basic Methods In Molecular Biology(1986)。具体考虑本发明的多肽可事实上由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
除涵盖含有本文讨论的载体构建体的宿主细胞外,本发明还涵盖已被工程化为缺失或取代内源性遗传物质和/或包括遗传物质的脊椎动物来源、特别是哺乳动物来源的原代、传代和无限增殖化宿主细胞。与内源多核苷酸可操作缔合的遗传物质可活化、改变和/或扩增内源多核苷酸。
此外,本领域中已知的技术可用于通过同源重组将异源多核苷酸和/或异源调控区(例如启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白的内源多核苷酸可操作地缔合(参见例如1997年6月24日发布的美国专利号5,641,670;国际公布号WO 96/29411;国际公布号WO 94/12650;Koller等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989);以及Zijlstra等,Nature 342:435-438(1989),所述文献各自的公开内容以引用的方式整体并入)。
本文所描述的免疫球蛋白构建体可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化,所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、疏水电荷相互作用色谱法以及凝集素色谱法。最优选地,高效液相色谱法(“HPLC”)用于纯化。
在某些实施方案中,本发明的免疫球蛋白构建体使用阴离子交换色谱法进行纯化,所述阴离子交换色谱法包括但不限于Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q以及DEAE柱色谱法。
在具体实施方案中,本文所描述的蛋白质使用阳离子交换色谱法进行纯化,所述阳离子色谱法包括但不限于SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/SourceS和CM、Fractogel S和CM柱以及其等效物和可比物。
此外,本文所描述的免疫球蛋白构建体可使用本领域中已知的技术化学地合成(例如,参见Creighton,1983,Proteins:Structures andMolecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y和Hunkapiller等,Nature,310:105-111(1984))。例如,对应于多肽的片段的多肽可通过使用肽合成仪来合成。此外,如果需要,非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代或添加引入多肽序列中。一般来说,非经典氨基酸包括但不限于,常见氨基酸的D型异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、□-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生氨基酸(designer amino acid),如□-甲基氨基酸、C□-甲基氨基酸、N□-甲基氨基酸,以及氨基酸类似物。此外,氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
提供在翻译过程中或之后不同地修饰的免疫球蛋白构建体,例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化,蛋白水解裂解以及与抗体分子或其它细胞配体的键联等。多种化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行,所述技术包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解;乙酰化、甲酰化、氧化、还原;以及在衣霉素存在下代谢合成等。
本文所涵盖的另外翻译后修饰包括例如,N-连接或O-连接的碳水化合物链、N-末端或C-末端的加工)、化学部分附接至氨基酸主链、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰、以及由于原核宿主细胞表达而产生的N-末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。所述免疫球蛋白构建体用可检测的标记进行修饰,所述标记如酶、荧光、同位素或亲和标记以允许检测和分离蛋白质。
适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素生物素和抗生物素蛋白/生物素;适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素;发光物质的实例包括鲁米诺(luminol);生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白;并且适合放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体实施方案中,免疫球蛋白构建体或其片段或变体被附接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
如所提及,本文所描述的免疫球蛋白构建体通过自然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。应理解相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的若干位点处。本发明的多肽可以是支链的,例如由于泛素化;并且它们可以是环状的,有或无分支。环状、支链和支链环状多肽可来源于翻译后自然过程或可通过合成方法制备。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素(flavin)的共价附接、原血红素(heme)部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)以及泛素化。(参见,例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,NewYork(1993);POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIONOF PROTEINS,B.C.Johnson,编辑,Academic Press,New York,第1-12页(1983);Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990);Rattan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
在某些实施方案中,免疫球蛋白构建体还可附接至固相支持体,所述固相支持体特别适用于通过本文所描述的免疫球蛋白构建体结合、与本文所描述的免疫球蛋白构建体结合或缔合的多肽的免疫测定或纯化。所述固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
实施例
以下特定和非限制性实施例应仅被解释为说明性的,并且不以任何方式限定本公开。无需进一步详述,据信本领域的技术人员可基于本文描述而在最大程度上利用本公开。本文所引用的所有公布均特此以引用的方式整体并入。当提到一个URL或其它此类标识符或地址时,应了解此类标识符可改变,并且互联网上的特定信息可适当地发生变动,但是等效信息可通过搜索互联网来发现。对这些信息的援引显示了它们的可用性和公众传播。
实施例1:接头组成。
连接呈单链形式的结构域的接头肽可以影响所设计的蛋白质的特性,如蛋白水解稳定性、构象稳定性、重折叠动力学、多聚化的程度以及抗原亲和力。通过在连接至重链结构域的scFab和scFv的背景下测试几种接头长度和组成来鉴别在此所描述的长接头设计,如表1中所呈现。虽然通常使用GGGS序列,但电荷可以被引入所述接头中以提供改变的流体动力学特性,并且这些接头中的一些包含具有形成螺旋二级结构的倾向的序列。优先形成螺旋结构的多肽序列是本领域中已知的[Marqusee,S.和Baldwin,R.L.(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA,84,8898-8902]。这些多肽通常具有在多肽序列中的i和第(i+4)位置处有利地彼此相互作用的残基。本文所描述的构建体呈现以下独特和出人意料的优点:使用这种形成螺旋的多肽提供以单链形式设计和产生Fab分子。对于呈长接头形式的scFab,所述长接头连接CL结构域和VH结构域。表1示出所使用的接头。
表1:所使用的接头
接头组成 |
(GlSm)n;I=0,1,2,3,4,5;m=0,1;n=5,6,7,.. |
(SpGq)l(SEGq)m(SpGq)r;I,m=2,3,4,..;p,q,r=0,1,2,3,... |
GSTSGSGGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTSGSG |
GGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSG |
如本文所描述的轻链***物设计是指设计包含单链Fv多肽的免疫球蛋白构建体,所述单链Fv多肽连接至所述免疫球蛋白链的恒定结构域多肽。轻链***物设计包括在两个不同位置处的较短接头,一个接头连接VH结构域和VL结构域(VHVL接头)并且另一个接头连接CH结构域和CL结构域(CHCL接头)。采用分子建模来提出接头长度。图19示出轻链***物形式的典型模型。
表2示出在轻链***物设计中使用的接头。
表2:用于轻链***物设计的接头。在一些实施方案中,可以在N末端和/或C末端处引入其它残基以加帽这些接头残基。
如所预期,由于高接头灵活性,在可获得的scFv结构中不存在对应于VHVL接头的电子密度。VH的C末端和VL的N末端的相对位置表明接头路径将类似于在MOE中建模的那个,靠近VH:VL界面。
实施例2:使用长接头(LL)策略制备scFab构建体或通过使用轻链***物(LCI)策略制备scFv构建体:
从PDB中的1JPS结构提取抗体D3H44的序列(具有人源化D3H44Fab的复合物中的组织因子)。类似的,从1N8Z结构获得抗体4D5的序列(HER2的细胞外区与赫赛汀Fab的复合物)。从文献[Isolation and characterization of an anti-CD16single-chain Fv fragmentand construction of an anti-HER2/neu/anti-CD16bispecific scFv thattriggers CD16-dependent tumor cytolysis.McCall等1999,Mol Immunol,36(7):433-445]获得NM3E2(抗-CD16)scFv的序列。通过将所述结构域与以上表1和2中列出的接头连接来设计单链Fab和轻链***物结构。使用标准重组DNA技术来制备这些构建体。例如,对于具有长接头的scFab来说,长接头构建体的特异性设计在以下表3中示出并且LCI构建体的特异性设计在以下表4中示出。
在DNA空间中,所有序列具有对应于MAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG的前导信号序列和在5′EcoRI和3′BamHI处的限制性位点。所有Fab包含CL与CH1之间的二硫键形成所必需的半胱氨酸残基。在LCI***物的情况下,接头以以下这种方式连接至VH结构域和CH1结构域中的新形成的端:在一端上模拟scFv并且在另一端处避免接头之间的冲突,这通过去除CH1的新形成的N-末端处的一个必需氨基酸残基来辅助。所述scFab形式构建体包含具有所指示的适当接头的VH、VL、CL、CH1结构域。
表3.scFab的接头序列和图例
Fab类型 | GS-30 | GS-35 | GSE-30 | GSE-34 | GST-32 | 螺旋-41 |
4DS | v638 | v639 | v641 | v640 | v655 | v654 |
D3H44 | v657 | v658 | v660 | v659 | v674 | v673 |
接头图例:
GS-30:(GGGGS)6
GS-35:(GGGGS)7
GSE-30:(SGGG)2(SEGGG)4SG
GSE-34:(SGGG)2(SEGGG)4SGGGSG
GST-32:GSTSGSGGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTSGSG
螺旋-41:GGSGGGSGSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGGSGGGSG
表4:另外scFab的接头序列和图例
scFab | VHVL_接头 | CLCH_接头 |
v642-4DS | GS-15 | GS-20 |
v643-4DS,v662-D3H44 | GS-15 | GS-24 |
v644-4DS | GS-15 | GS-28 |
v664-D3H44 | GS-20 | GS-20 |
v646-4DS,v665-D3H44 | GS-20 | GS-24 |
v666-D3H44,v647-4DS | GS-20 | GS-28 |
v648-4DS | GST-18 | GS-20 |
v649-4DS | GST-18 | GS-24 |
v669-D3H44 | GST-18 | GS-28 |
v651-4DS | GST-2O | GS-20 |
v671-D3H44 | GST-2O | GS-24 |
v672-D3H44 | GST-20 | GS-28 |
v656-4DS,v675-D3H44 | GST-18 | GST-26 |
接头图例:
GS-15:(GGGGS)3
GS-20:(GGGGS)4
GS-24:(GGGGS)4GGGG
GS-28:(GGGGS)5GGG
GS-30:(GGGGS)6
GST-18:GSTSGSGKPGSGEGSTKG
GST-20:GSTSGSGKPGSGEGSTKGSG
GST-26:GSTSGSTSGSGKPGSGEGSTKGGSTS
GSE-30:(SGGG)2(SEGGG)4SG
GSE-34:(SGGG)2(SEGGG)4SGGGSG
实施例3:scFab的表达、纯化和分析
在2mL HEK293中进行表达(一式三份)。将细胞在指数生长期(1.5至2百万个细胞/m1)用PEI(聚乙烯亚胺线性25kDa溶解于水中至1mg/ml,Polysciences,目录号23966)和1ug DNA/ml的细胞以2.5∶1的PEI/DNA比例进行转染。将鲑鱼***DNA(70%)添加至完整100ugDNA。将PEI混合至总转染的1/20体积的转染培养基。将PEI/DNA混合物涡旋并且在室温下孵育3分钟。转染培养基(在室温下预先加热或37℃)与用于维持细胞的培养基(补充有4mM L-谷氨酰胺、0.1%普郎尼克F68和0.025mg/ml G418的F17培养基。)相同。使用MOPS缓冲液在还原或非还原条件、无煮沸下通过SDS-PAGE 4%-12%梯度凝胶评定表达。
表达结果在图6A至6F中示出。图6A示出无二硫键的Fab、具有轻链***物的scFab 4D5的表达;图6B示出scFab 4D5、具有接头***物的scFab D3H44的表达;图6C示出具有接头***物的scFabD3H44和scFab NM3E2的表达;图6D示出Fab对照、scFab 4D5、scFab D3H44、scFab NM3E2和在不存在DTT下TF的表达;图6E示出scFab 4D5、scFab D3H44的表达;图6F示出Fab对照、scFab NM3E2和TF的表达;并且图6G示出具有接头***物的scFab NM3E2的表达。图6A、6B以及6C中接近50kDa的条带指示呈轻链***物形式的scFab的形成。在图6D、6E、6F和6G中呈现了在不同类型的长接头的情况下scFab表达的比较。虽然在大多数情况下观察到预期单体种类的表达,但相对于所形成的二聚体种类,所观察到的表达水平和单体水平指示一些接头比其它接头表现更好。描绘结合不同抗原靶标的具有螺旋接头(H41)的scFab变体v654和v673倾向于始终更好地表达,其中在Fab中形成较低量的二聚体。
放大和纯化
将样品放大至500mL HEK 293细胞。将上清液中的表达的蛋白质浓缩至125mL并且以1ml/分钟的流速负载至KappaSelect亲和柱上。用10CV的PBS缓冲液进行平衡和洗涤,接着用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱所述蛋白质。汇集级分和并且在Econo-Pac柱上进行脱盐,并且将蛋白质储存在PBS中。
通过nanodrop评估蛋白质产率。在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE(图17)。非还原凝胶指示多聚化(如果存在)。无接头的对照分子v695(4D5Fab)以所预期的约50kDa的MW进行,从而示出从25kDa处的条带显而易见的弱二硫键还原。
放大和蛋白质纯化的结果的总结在以下表5中示出。
表5:亲和力纯化后变体产率的总结。
针对呈LCI和LL形式的两种不同的抗原结合Fab(4D5和D3H44)获得的产物单链Fab(scFab)与在无接头的情况下获得的单链Fab(scFab)是可比较的。
SEC(尺寸排阻色谱法)
采用Superdex S200(16/60),按照制造商的说明书,根据标准方案通过SEC对变体进行纯化。运行缓冲液是PBS。通过SDS-PAGE评定纯化的蛋白质。SDS-PAGE凝胶结果在图7中示出。所述结果的总结在以下表6中示出。
表6:SEC纯化的总结
结合
对SEC纯化的变体进行SPR和基于ELISA的抗原结合测定以确认所述变体能够结合靶抗原。对于SPR,将scFab捕获在用抗hIgG饱和的芯片上并且使配体(Her2或TF)在300nM下流过所述芯片。对于ELISA测定,将0.5ug/ml Her2或10ug/ml-0.156ug/ml TF放置在PBS中的测定板上。将单链Fab变体从400ng/ml连续稀释(以1∶2稀释步骤)至6.25ng/ml。使用在1∶5000、1∶10,000和1∶20,000稀释度下具有特异性的山羊(Fab’)2抗人(Fab’)2片段进行检测。图8A至8B示出变体654、658、695和705(图8A)以及变体685、673、696和707(图8B)的基于ELISA的抗原结合测定的结果。以下表7示出使用SPR获得的结合数据。
表7:通过SPR获得的scFab变体的结合数据
注意当以单链形式构建时Her2和组织因子结合Fab(4D5Fab和D3H44Fab)两者的结合亲和力均保留亲本Fab样抗原结合亲和力。
稳定性
对SEC纯化的变体进行差示扫描量热法(DSC)以便评价分子的热力学稳定性(图9A至9E)。使用GE或MicroCal VP-Capillary仪器进行DSC实验。将蛋白质缓冲液交换为PBS(pH 7.4)并且稀释至0.3至0.7mg/mL,其中0.137mL负载至样品细胞中,并且以1℃/分钟的扫描速率从20℃至100℃进行测量。使用Origin软件(GE Healthcare)分析数据,其中减去PBS缓冲液背景。
所述DSC结果的总结见于以下表8中。
表8:scFab变体的DSC结果
变体编号 | scFab形式 | *** | Tm(℃) |
695 | 天然Fab | HER2(4D5) | 81.2 |
696 | 天然Fab | TF(D3H44) | 79.1 |
654 | scFab LL | HER2(4D5) | 80.2 |
656 | scFab LCI | HER2(4D5) | 70.3 |
673 | scFab LL | TF(D3H44) | 78.9 |
665 | scFab LCI | TF(D3H44) | 67.4 |
705 | Fab,无S-S | HER2(4D5) | 78.3 |
707 | Fab,无S-S | TF(D3H44) | 77.7 |
具有长接头的呈单链形式的变体Fab保留亲本Fab样热稳定性。呈轻链***物形式的scFab具有相对于亲本Fab低约10℃的热稳定性。
实施例4:单链Fab形式的台式稳定性测定。(图10)
台式稳定性测试由以下组成:取得在分析下的每种蛋白质变体的样品并且在室温(20C)下为期一周储存的过程内监测分解和/或低聚。如下进行评定:使用还原和非还原SDS-PAGE,每孔负载2.5□g的蛋白质,接着尺寸排阻色谱法(SEC)和UPLC。通过A280nanodrop测定蛋白质浓度。每种蛋白质样品由对应于单体级分的尺寸排阻纯化的蛋白质组成。将蛋白质在室温下保持在小瓶中(台式),其中在实验开始时(时间0)取得初始样品。在24小时、3天以及7天之后取得后续样品。将每个样品在考马斯蓝SDS缓冲液中变性并储存在-80℃下直到最终SDS-PAGE评定。
所述样品的SDS-PAGE分析的结果在图10A(第1天)、图10B(第3天)以及图10C(第7天)中示出。所述结果的总结提供在以下表9和10中。
表9:台式稳定性结果的总结
表10.SPR结合数据。获得关于新鲜蛋白质和在室温下储存1周之后的数据。储存的样品保留与Her2和组织因子抗原的靶结合。
变体 | Fab类型 | 储存 | CH-VL接头 | KD | 标准偏差 |
V654 | 4D5 | -80 | a41 | 1.2E-09 | 2.E-10 |
V654 | 4D5 | 7天室温 | a41 | 5.E-10 | 2.E-10 |
V673 | D3H44 | -80 | a41 | 4.5E-11 | |
V673 | D3H44 | 7天室温 | a41 | 未检测到 | |
V695 | 4D5 | -80 | - | 6.E-10 | 1.E-10 |
V695 | 4D5 | 7天室温 | - | 8.E-10 | 1.E-10 |
V696 | D3H44 | -80 | - | 1.0E-10 | 6.E-11 |
V696 | D3H44 | 7天室温 | - | 8.E-11 | 2.E-11 |
V656 | 4D5 | -80 | GST18/GST26 | 2E-10 | 7.E-11 |
V656 | 4D5 | 7天室温 | GST18/GST26 | 4.E-10 | 1.E-10 |
V665 | D3H44 | -80 | GS20/GS24 | 6.2E-11 | 5.E-12 |
V665 | D3H44 | 7天室温 | GS20/GS24 | 9.E-11 | 2.E-11 |
V695 | 4D5 | -80 | - | 6.E-10 | 1.E-10 |
V695 | 4D5 | 7天室温 | - | 8.E-10 | 1.E-10 |
V696 | D3H44 | -80 | - | 1.0E-10 | 6.E-11 |
V696 | D3H44 | 7天室温 | - | 8.E-11 | 2.E-11 |
在表10中鉴别的a41接头对应于在表3的图例中提到的螺旋-41接头并且在本文其它地方还被称为H-41。结果指示在为期一周的研究过程中在所使用的相对稀释的浓度下所有单链Fab样品不会再多聚化。
实施例5:CHO细胞系中二价单特异性scMab(异二聚体Fc)的表达、纯化和分析。两个链的DNA比例是1∶1链A/链B。(图11)
构建表11中所描述的二价单特异性scMab。使用实施例2中所描述的scFab设计,使用标准重组DNA克隆方法来构建二价单特异性scMab。简言之,通过将编码相关scFab(长接头或LCI设计)的核酸经由野生型IgG1接头融合至编码抗体的Fc区的核酸来产生二价scMab的每个多肽。所使用的Fc区拥有CH3结构域上的允许异二聚体抗体分子的形成的突变(即链A具有L351Y_F405A_Y407V突变,并且链B具有T366L_K392M_T394W突变)。在2mL HEK293或CHO培养物中进行表达。将细胞在指数生长期(1.5至2百万个细胞/ml)用PEI(聚乙烯亚胺线性25kDa溶解于水中至1mg/ml,Polysciences,目录号23966)和1ug DNA/ml的细胞以2.5∶1的PEI/DNA比例进行转染。将鲑鱼***DNA(70%)添加至完整100ug DNA。将PEI混合至总转染的1/20体积的转染培养基。将PEI/DNA混合物涡旋并且在室温下孵育3分钟。转染培养基(在室温下预先加热或37℃)与用于维持细胞的培养基(补充有4mM L-谷氨酰胺、0.1%普郎尼克F68和0.025mg/ml G418的F17培养基。)相同。
对于纯化,使澄清的培养基升至室温并且脱气,之后使用0.45um的过滤器单元纯化。通过使用蛋白质A(Mabselect Sure)来纯化单链异二聚体和WT IgG1抗体。将柱用5CV的PBS平衡。将过滤的培养基负载到所述蛋白质A柱上,所述柱随后用10CV的PBS洗涤。将所述抗体用10CV柠檬酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱并且收集抗体级分。通过添加1/3级分体积的Tris缓冲液(pH-11)来中和pH。使用脱盐柱(来自Bio-Rad的Econo-Pac 10DG柱)使纯化的蛋白质脱盐。代表性SDS-PAGE凝胶在图11中示出。
表11:
实施例6:scMab的台式稳定性测定(图12A至12C)。
台式稳定性测试(一式三份地重复)由以下组成:取得在分析下的每种蛋白质变体的样品并且在不同温度下3天储存的过程内监测分解和/或低聚,并且与在-20C下储存的蛋白质相比较。如下进行评定:使用还原和非还原SDS-PAGE,每孔负载2.5□g的蛋白质。通过A280nanodrop测定蛋白质浓度。将蛋白质在目标温度下保持在小瓶中,其中在实验开始时(0时间)取得初始样品。在3天之后取得后续样品。将每个样品在考马斯蓝SDS缓冲液中变性并储存在-80C下直到最终SDS-PAGE评定。
结果指示在为期3天的研究过程中在所使用的相对稀释的浓度下所有单链Mab不会增加其多聚体状态。IgG1(赫赛汀)被包括作为对照。图12A至12C示出SDS-PAGE评定的结果。所述结果的总结在表12中示出。
表12:scMab的台式稳定性测试的总结
在台式稳定性分析的过程中无可见的显著产物降解或多聚化增加。
实施例7:如在图13中观察到的CHO细胞系中二价双特异性scMab(异二聚体Fc)的表达和纯化。两个链的DNA比例是1∶1链A/链B。
如以下构建如表13中描述的双特异性Her2(曲妥珠单抗)/TF(D3H44)scMab。用于产生双特异性scMab分子的方法用来组合如实施例5中所描述设计的重链(即拥有在其CH3结构域上的允许异二聚体Ab分子形成的突变(即,链A具有L351Y_F405A_Y407V突变,并且链B具有T366L_K392M_T394W突变)。这些二价scMab的重链上的CH3结构域中的所述突变允许双特异性scMab的多种组合,所述组合不仅保留与两种不同的抗原结合,而且具有拥有相同或不同的接头类型(在相同长的接头或LCI支架内的短接头或长接头)和相同或不同支架(即长接头对比LCI)的Fab区。构建以下组的双特异性scMab:具有相同接头和相同支架的双特异性分子(即v1353和1357);具有相同支架但不同接头的双特异性分子(v1352、1354、1355、1358);具有不同支架、不同接头的双特异性分子(v1359、1356)。如实施例3中所描述在50mL CHO培养物中进行表达。
对于纯化,使澄清的培养基升至室温并且脱气,之后使用0.45um的过滤器单元纯化。通过使用蛋白质A(Mabselect Sure)来纯化单链异二聚体和WT IgG1抗体。将柱用5CV的PBS平衡。将过滤的培养基负载到所述蛋白质A柱上,所述柱随后用10CV的PBS洗涤。将所述抗体用10CV柠檬酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱并且收集抗体级分。通过添加1/3级分体积的Tris缓冲液(pH-11)来中和pH。使用脱盐柱(来自Bio-Rad的Econo-Pac 10DG柱)使纯化的蛋白质脱盐。所述亲和纯化结果的总结在表14中示出。
表13:
表14:scMab的纯化的总结
实施例8:双特性scMab(LL/LL)的SEC图谱和SPR夹心测定。(图14、15、以及16)
将HER2固定在GLM传感芯片上并且初始捕获scMab。然后通过捕获固定的HER2-scMab上的TF来测定TF结合。所述二聚体双特异性scMab结合HER2和TF两者。
在25℃的温度下用HBST运行缓冲液(10mM HEPES、150mMNaCl、3.4mM EDTA以及0.05%Tween 20pH 7.4)使用BioRad ProteOnXPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga,ON))进行所有表面等离子体共振结合测定。使用由在分析物(水平)方向上以30μL/分钟注射300秒的标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶5稀释液激活的GLM传感芯片来产生Her-2捕获表面。在所述激活之后立即将Her-2在10mM NaOAc pH 4.5中的4.0μg/mL溶液在配体(垂直)方向上以25μL/分钟的流速注射直到约3000共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以30μL/分钟经300秒注射1M乙醇胺来淬灭剩余的活性基团,并且这还确保形成模拟-活化的点间(interspot)以用于空白参考。将一至五个单链Mab变体以25μL/分钟的流速同时注射在单独的配体通道中持续240秒。这产生饱和捕获到Her-2表面上。在抗体捕获后,使TF分析物流过芯片,被所述双特异性单链分子结合。将传感图进行比对并且使用缓冲液空白注射和点间进行双重参考,并且使用ProteOn Manager软件v3.0对所得传感图进行分析。
如图15A至15C中可以看出,进行双特异性scMab(LCI/LCI)的SEC图谱和SPR夹心测定。将HER2固定在芯片上并且初始捕获scMab。然后通过捕获固定的HER2-scMab上的TF来测定组织因子(TF)结合。所述二聚体双特异性scMab结合HER2和TF两者。单体种类的水平显著低于在长接头的情况下观察到的单体种类的水平。采用Superdex S200(16/60)并且按照制造商的说明书,使用尺寸排阻色谱法的标准方案。运行缓冲液是PBS。
如图16A-16C中所示,进行双特异性scMab(LCI/LCI:1358;LCI/LL:1359)的SEC和靶结合图谱。将HER2固定在芯片上并且初始捕获scMab。然后通过捕获固定的HER2-scMab上的TF来测定TF结合。所述二聚体双特异性scMab结合HER2和TF两者。采用Superdex S200(16/60)并且按照制造商的说明书,使用尺寸排阻色谱法的标准方案。运行缓冲液是PBS。表15提供所测试的变体的KD。
表15:变体对TF和HER2的亲和力。在此报道的值是在不同方向性情况下进行的SPR测量的平均值(即,对于TF结合,使TF抗原流经Her2捕获的scMab,使TF抗原流经IgG捕获的scMab并且使TF抗原流经固定的scMab;对于Her2结合,使Her2抗原流经IgG捕获的scMab并且使Her2抗原流经固定的scMab)。
变体 | TF的KD | HER2的KD |
1353 | 2.01E-11 | 3.22E-10 |
1355 | 2.3E-11 | 5.52E-10 |
1359 | 2.65E-11 | 2.01E-11 |
对照696 | 5.15E-11 | |
对照695 | 8.37E-10 | |
对照506 | 5.27E-10 |
对照变体的描述:变体506是结合基于HerceptinTM的序列的HER2的对照抗体。
表16提供指示不同双特异性scMab结合HER2或组织因子的能力的数据。使用这一实施例中描述的夹心SPR结合测定来测量结合。
表16:具有4D5和D3H44Mab(LL/LL、LCI/LCI和LL/LCI形式)的双特性scMab,观察到与靶抗原Her2和组织因子的双特异性结合。在两个臂上具有长接头的变体scMab 1352和1357不能结合TF。
实施例9:二价双特异性scMab(CD3/CD19)的表达、纯化和测试
二价双特异性scMab被设计成结合CD3和CD19,并且这些构建体的描述见于表17中。使用标准重组DNA方法来制备这些构建体。通过将抗-CD3替利珠单抗和抗-CD19MOR208的Fab的序列分散成其VH、VL、CH、和CL组分来制备所述构建体。对于LCI构建体,Fab的VH通过第一接头连接至轻链(由VL和CL组成)并且第二接头将所述轻链连接至Fab的CH。然后将Fab连接至IGG1铰链+Fc,所述IGG1铰链+Fc携带在链A上的突变T350V_L351Y_F405A_Y407V和在链B上的突变T350V_T366L_K392L_T394W。对于LL构建体,将完整轻链(由VL和CL组成)用接头连接至Fab的重链,然后将所述Fab连接至IGG1铰链+Fc,所述IGG1铰链+Fc携带在链A上的突变T350V_L351Y_F405A_Y407V和在链B上的突变T350V_T366L_K392L_T394W。从文献(Tabs数据库,由CraicComputing LLC提供的服务)获得用于变体1840至1847中的抗-CD3(替利珠单抗)和抗-CD19(MOR208)Fab的序列。用于1853中的CD19结合scFv源自兰妥莫单抗的序列。变体1861中的CD3结合scFv序列源自莫罗单抗(muronomab),而变体1862序列源自兰妥莫单抗。这些变体也如实施例3中所描述表达和纯化。在图18中示出显示这些变体的表达的示例性SDS-PAGE凝胶。
使用活细胞ELISA结合测定,使用滤板和使用真空歧管进行的洗涤步骤将这些变体针对其结合表达靶抗原的细胞的能力进行测试(由National Research Council,Montreal,Canada的Anne Marcil发展的方法)。如下进行所述方法。将细胞维持在指数生长期并且然后洗涤、计数并以10E5细胞每孔分配于50%培养基、50%封闭缓冲液中。将变体于封闭缓冲液中的稀释液添加至所述细胞并且在4℃下孵育1小时。在收集并在培养基中四次洗涤之后,将HPR-缀合的山羊抗人IgG添加至细胞,然后将所述细胞在4℃下孵育1小时。在收集并在培养基中四次洗涤和在PBS中3次洗涤之后,将TMB底物添加至细胞,然后将所述细胞在室温下孵育25分钟。通过添加H2SO4终止反应并且在450nm下读取OD。ELISA结果在表17和18中示出。A、B以及C是指变体的表达中所使用的链A与链B的比例:比例A=链A/链B=1∶1A/B=50%/50%;比例B=链A/链B=2∶1A/B=66%/34%;比例C=链A/链B=1∶2A/B=34%/66%。
表17:结合数据的总结
*变体名称是如针对以下所描述来产生:a)scMAB_LCI_CD3xCD19_GS20-GS24_GS20-GS24-单链scMab,LCI设计,具有在VH-VL之间的GS20接头和在链A上的CL-CH之间的GS24接头的CD3Fab。具有在VH-VL之间的GS20接头和在链B上的CL-CH之间的GS24接头的CD19Fab;以及b)scMAB_LL_CD3xCD19_HH41_HH41-单链Mab,长接头设计,具有在链A的轻链与重链之间的HH41接头的CD3Fab;和具有在链B的轻链与重链之间的HH41接头的CD19Fab。
表18:对照的结合数据
表16和17中的ELISA结果的图例
+++:在1/60稀释下OD450>2.0
++:在1/60稀释下OD450在1.0与2.0之间
+:在1/60稀释下OD450<1.0
+/-:在1/60稀释下OD450低于0.100,但在更高稀释下阳性(高于阴性对照)
-:OD450=或<阴性对照1041
所有变体包含来自替利珠单抗的抗-CD3弹头,其显示与含有RajiCD19的细胞很少至无结合(表16)。所有变体具有来自MOR208的抗-CD19弹头,其显示与含有HBP-All CD3的细胞无结合(表16)。阴性对照包含与所述变体相同的Fc并且显示与任一抗原无结合(表17)。因此,显示出与两种抗原的结合的变体是双特异性的,这是由于其弹头中的每个的独立结合。表16显示所有变体是双特异性的,具有两个起作用的弹头。
实施例10:所提供的序列的总结
以下表提供组成其中列出的变体的氨基酸序列的SEQ ID NO:。所有氨基酸序列包含EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG(其包含信号肽序列和在用于克隆的限制性位点中产生的残基)并且终止密码子用星号标记。
应了解,本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其产生的各种修改或变化可为本领域技术人员所想到且欲包括于本申请的精神和权限以及随附权利要求的范围内。
Claims (57)
1.一种免疫球蛋白构建体,其包含:
单链Fab区(scFab),其包含:
来自免疫球蛋白重链的可变区多肽(VH),
来自免疫球蛋白轻链的可变区多肽(VL),
来自免疫球蛋白轻链的恒定区多肽(CL),以及
来自免疫球蛋白重链的恒定区多肽(CH1);
其中所述VH和所述VL通过第一接头连接以形成单链Fv构建体(scFv)。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白构建体,其中所述CL和所述CH1通过第二接头连接。
3.如权利要求1至2中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述单链Fab区具有包含VH-L1-VL-CL-L2-CH1的序列,其中L1和L2是第一接头和第二接头。
4.如权利要求1至2中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述单链Fab区具有包含VH-L1-VL-L3-CL-L2-CH1的序列,其中L1、L2以及L3是接头。
5.如权利要求1至2中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述单链Fab区具有包含VL-L4-VH-CH1-L5-CL的序列,其中L4和L5是接头。
6.如权利要求1至5中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中每个接头是包含约1至约100个氨基酸的多肽。
7.如权利要求6所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头包含含有选自Gly(G)、Ser(S)和Glu(E)的氨基酸的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头由通式(Gly-Gly-Gly-Ser)n的多肽组成,其中n是4至10的整数。
9.一种免疫球蛋白构建体,其包含:
单链Fab区(scFab),其包含:
来自免疫球蛋白重链的可变区多肽(VH),
来自免疫球蛋白轻链的可变区多肽(VL),
来自免疫球蛋白轻链的恒定区多肽(CL),以及
来自免疫球蛋白重链的恒定区多肽(CH1);
其中所述VH和所述CL通过接头多肽连接,其中所述接头多肽表现出形成螺旋结构的倾向。
10.如权利要求9所述的免疫球蛋白构建体,其中所述单链Fab多肽具有包含VL-CL-L8-VH-CH1的序列;其中L8是所述具有形成螺旋结构的倾向的接头多肽。
11.如权利要求9或10所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头多肽形成α螺旋、聚脯氨酸I型螺旋、聚脯氨酸II型螺旋以及310螺旋中的至少一个。
12.如权利要求11所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头形成约1圈至约20圈之间的螺旋。
13.如权利要求9至12中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头包含至少一对形成螺旋稳定相互作用的氨基酸。
14.如权利要求13所述的免疫球蛋白构建体,其中所述螺旋稳定相互作用是电荷-电荷相互作用、阳离子-π相互作用、疏水相互作用以及大小互补相互作用中的至少一种。
15.如权利要求9至14中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头多肽包含选自Gly(G)、Ser(S)、Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Asn(N)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Val(V)以及Ile(I)的氨基酸。
16.如权利要求15所述的免疫球蛋白构建体,其中所述接头具有包含至少一个(Asp-Asp-Ala-Lys-Lys)n基序的氨基酸序列,其中n是1至10的整数。
17.一种免疫球蛋白构建体,其包含:
第一多肽构建体,其包含如权利要求1至16中任一项所述的第一scFab和含有第一CH3区的第一重链多肽;以及
第二多肽构建体,其包含含有第二CH3区的第二重链多肽,
其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽中的至少一个任选地包含变体CH3区,所述变体CH3区促进异二聚体的形成。
18.如权利要求17所述的免疫球蛋白构建体,所述第一多肽构建体和所述第二多肽构建体还包含抗原结合多肽构建体。
19.如权利要求18所述的免疫球蛋白构建体,其中所述抗原结合多肽构建体是scFv或scFab中的至少一个。
20.如权利要求19所述的免疫球蛋白构建体,其中所述scFab是如权利要求1至16中任一项所述的scFab。
21.如权利要求16至20中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽形成异二聚体Fc。
22.如权利要求21所述的免疫球蛋白构建体,所述异二聚体Fc包含含有至少一个氨基酸突变的变体免疫球蛋白CH3结构域。
23.如权利要求22所述的免疫球蛋白构建体,其中所述至少一个氨基酸突变促进具有可比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体Fc的形成。
24.如权利要求22或23所述的免疫球蛋白构建体,其中所述变体CH3结构域具有约73℃或更大的熔解温度(Tm)。
25.如权利要求22或23所述的免疫球蛋白构建体,其中所述异二聚体Fc被形成为具有至少约70%的纯度。
26.如权利要求22至25中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述异二聚体Fc被形成为具有至少约70%的纯度并且所述Tm是约73℃。
27.如权利要求22至25中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述异二聚体Fc被形成为具有至少约75%的纯度并且所述Tm是约75℃。
28.如权利要求17至27中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽中的至少一个还包含变体CH2结构域,所述变体CH2结构域包含氨基酸修饰以便促进与至少一种Fcγ受体的选择性结合。
29.如权利要求17至28中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽中的至少一个包含变体CH2结构域或铰链,所述变体CH2结构域或铰链包含阻止与至少一种Fcγ受体的功能有效结合的氨基酸修饰。
30.如权利要求17至29中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述Fc区是糖基化的。
31.如权利要求17至30中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述Fc区是无糖基化的。
32.如权利要求17至31中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述免疫球蛋白构建体是多特异性免疫球蛋白构建体。
33.如权利要求32所述的免疫球蛋白构建体,其中所述免疫球蛋白构建体是双特异性的。
34.一种免疫球蛋白构建体,其包含:
第一单体多肽,其包含通过接头连接至第一恒定结构域多肽的第一单链Fv多肽;以及
第二单体多肽,其包含通过接头连接至第二恒定结构域多肽的与所述第一Fv多肽不同的第二单链Fv多肽,所述第二恒定结构域多肽与所述第一恒定结构域多肽不同;
每个所述恒定结构域多肽包含CL区、CH1区以及CH3区或其片段、变体或衍生物中的每个中的至少一个;以及
其中所述CL区和所述CH1区通过接头连接,并且其中所述第一恒定结构域多肽和所述第二恒定结构域多肽形成Fc区。
35.如任一权利要求34所述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体不包含任何CH2结构域。
36.一种免疫球蛋白构建体,其包含:
第一单体多肽,其包含与第一恒定结构域多肽融合的第一scFab多肽;以及
第二单体多肽,其包含与第二恒定结构域多肽融合的与所述第一Fab多肽不同的第二scFab多肽;
其中所述第一scFab多肽和所述第二scFab多肽中的至少一个包含具有形成螺旋结构的倾向的接头多肽;以及
其中所述第一恒定结构域多肽和所述第二恒定结构域多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异二聚体Fc区,所述变体免疫球蛋白CH3区包含至少一个氨基酸突变,所述至少一个氨基酸突变促进具有比得上天然同二聚体Fc的稳定性的所述异二聚体的形成。
37.如权利要求17至36中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种表达抗原的细胞,其中所述细胞选自包含免疫细胞如白细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞内皮下细胞、乳腺细胞、胃细胞、子宫细胞、神经细胞、肌肉细胞、分泌细胞以及生殖细胞的列表。
38.如权利要求17至36中任一项所述的免疫球蛋白构建体,其中所述构建体可结合至少一种表达抗原的细胞,其中所述细胞选自包含T细胞、B细胞、自然杀伤细胞的列表。
39.如权利要求38所述的免疫球蛋白构建体,其中所述T细胞是人细胞。
40.如权利要求38所述的免疫球蛋白构建体,其中所述T细胞是非人哺乳动物细胞。
41.如权利要求38所述的分离的免疫球蛋白,其中所述至少一种细胞与疾病相关联。
42.如权利要求41所述的免疫球蛋白构建体,其中所述疾病是选自骨髓瘤、胚细胞瘤、***状瘤、腺瘤、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤以及神经胶质瘤的癌症。
43.如权利要求42所述的免疫球蛋白构建体,其中所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌、骨肉瘤和软组织肉瘤中的至少一种。
44.如权利要求38所述的免疫球蛋白构建体,其中所述至少一种细胞是自身免疫反应性细胞。
45.一种包含至少一种用于表达如权利要求1至44中任一项所述的免疫球蛋白构建体的表达载体的组合物,所述表达载体包含编码所述免疫球蛋白构建体的至少一个核酸序列。
46.一种在稳定哺乳动物细胞中产生含有如权利要求1至44中任一项所述的免疫球蛋白构建体的表达产物的方法,所述方法包括:用以下转染至少一种哺乳动物细胞:
编码所述免疫球蛋白构建体的至少一个DNA序列以产生稳定哺乳动物细胞;
培养所述稳定哺乳动物细胞以产生包含所述免疫球蛋白构建体的所述表达产物。
47.如任一权利要求46所述的方法,其中所述哺乳动物细胞选自由以下各项组成的组:VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞、以及其亚类和变体。
48.一种药物组合物,其包含如权利要求1至44中任一项所定义的分离的免疫球蛋白构建体和适合的赋形剂。
49.一种用于产生如权利要求48所述的药物组合物的方法,所述方法包括:
在允许如权利要求1至44中的一项所定义的免疫球蛋白构建体表达的条件下培养宿主细胞;
从所述培养物回收所产生的免疫球蛋白构建体;以及
产生所述药物组合物。
50.一种治疗有需要的哺乳动物中的癌症的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的如权利要求48所述的药物组合物的组合物。
51.如权利要求48所述的方法,其中所述癌症是实体肿瘤。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述实体肿瘤是肉瘤、癌和淋巴瘤中的一种或多种。
53.如权利要求50所述的方法,其中所述癌症是B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和白血病中的一种或多种。
54.一种治疗有需要的哺乳动物中的自身免疫性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的如权利要求48中所提供的药物组合物的组合物。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述自身免疫性病状是以下中的一种或多种:多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病以及1型糖尿病。
56.一种治疗有需要的哺乳动物中的炎性病状的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用包含有效量的如权利要求48中所提供的药物组合物的组合物。
57.一种试剂盒,其包括如权利要求1至44中任一项所定义的免疫球蛋白构建体及其使用说明书。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107949570A (zh) * | 2015-06-30 | 2018-04-20 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 多特异性结合蛋白 |
CN108283001A (zh) * | 2015-10-08 | 2018-07-13 | 酵活有限公司 | 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途 |
CN111902426A (zh) * | 2018-03-05 | 2020-11-06 | 法国血液机构 | 重组单链免疫球蛋白 |
CN112390882A (zh) * | 2019-08-19 | 2021-02-23 | 杨洋 | 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用 |
Families Citing this family (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
CA2806252C (en) | 2010-07-29 | 2019-05-14 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
JP6167040B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
EP2681245B1 (en) | 2011-03-03 | 2018-05-09 | Zymeworks Inc. | Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
PL2773671T3 (pl) | 2011-11-04 | 2022-01-24 | Zymeworks Inc. | Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc |
US9499634B2 (en) | 2012-06-25 | 2016-11-22 | Zymeworks Inc. | Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells |
CN104768571B (zh) | 2012-07-13 | 2018-11-09 | 酵活有限公司 | 多价异多聚体支架设计和构建体 |
EP2914634B1 (en) * | 2012-11-02 | 2017-12-06 | Zymeworks Inc. | Crystal structures of heterodimeric fc domains |
US9914785B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-03-13 | Zymeworks Inc. | Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
CN110981964B (zh) | 2013-01-14 | 2023-09-15 | Xencor股份有限公司 | 新型异二聚体蛋白 |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
AU2014207549B2 (en) | 2013-01-15 | 2018-12-06 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
AU2014232416B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-09-28 | Xencor, Inc. | Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions |
JP6618892B2 (ja) | 2013-04-23 | 2019-12-11 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 細菌バイオフィルムの遺伝的リプログラミング |
WO2014182970A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-11-13 | Zymeworks Inc. | Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs |
KR102497443B1 (ko) | 2014-03-28 | 2023-02-08 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 |
AU2015265457B2 (en) | 2014-05-28 | 2021-02-18 | Zymeworks Bc Inc. | Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof |
CA2967426A1 (en) | 2014-11-26 | 2016-06-02 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens |
PE20171103A1 (es) | 2014-11-26 | 2017-08-07 | Xencor Inc | Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
WO2016094602A1 (en) * | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Tufts University | Vhh based binding antibodies for anthrax and botulinum toxins and methods of making and using therefor |
WO2016100788A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Alkermes, Inc. | Single chain fc fusion proteins |
US10428155B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-10-01 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
TWI726870B (zh) | 2015-03-04 | 2021-05-11 | 美商健臻公司 | 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β1的scFv-Fc二聚體 |
TWI733661B (zh) | 2015-03-04 | 2021-07-21 | 美商健臻公司 | 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子-β1的經修飾IgG抗體 |
US10227411B2 (en) | 2015-03-05 | 2019-03-12 | Xencor, Inc. | Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions |
EP3280397A4 (en) * | 2015-04-06 | 2018-08-22 | President and Fellows of Harvard College | Biosynthetic amyloid-based materials displaying functional protein sequences |
CN106661121A (zh) * | 2015-04-28 | 2017-05-10 | 酵活有限公司 | 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途 |
EP3322735A4 (en) | 2015-07-15 | 2019-03-13 | Zymeworks Inc. | BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT |
JP6925278B2 (ja) | 2015-11-18 | 2021-08-25 | 中外製薬株式会社 | 液性免疫応答の増強方法 |
JP6931329B2 (ja) | 2015-11-18 | 2021-09-01 | 中外製薬株式会社 | 免疫抑制機能を有する細胞に対するt細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法 |
CN108699136B (zh) | 2015-12-07 | 2022-03-18 | Xencor股份有限公司 | 结合cd3和psma的异二聚抗体 |
AU2017233658B2 (en) | 2016-03-14 | 2023-09-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy |
JP7082604B2 (ja) | 2016-03-21 | 2022-06-08 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用 |
RU2022104399A (ru) | 2016-06-14 | 2022-05-05 | Ксенкор, Инк. | Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек |
JP7084881B2 (ja) | 2016-06-22 | 2022-06-15 | アルカームス インコーポレーテッド | Il-10の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法 |
AU2017290086A1 (en) | 2016-06-28 | 2019-01-24 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2 |
CN106318971B (zh) * | 2016-08-22 | 2019-12-20 | 南昌大学 | 一种人抗体基因重组质粒的转染方法 |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
EP3519436A4 (en) * | 2016-09-30 | 2020-09-09 | Baylor College of Medicine | TISSUE-ORIENTED ANTIBODY-BASED GENE THERAPY |
CN110214148A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | Xencor股份有限公司 | 含有IL-15/IL-15Rα Fc融合蛋白和PD-1抗体片段的双特异性异源二聚体融合蛋白 |
CN110944651A (zh) | 2017-02-08 | 2020-03-31 | 蜻蜓疗法股份有限公司 | 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途 |
US20200291089A1 (en) | 2017-02-16 | 2020-09-17 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof |
CA3054079A1 (en) | 2017-02-20 | 2018-08-23 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding her2, nkg2d and cd16 |
JOP20190222A1 (ar) | 2017-04-11 | 2019-09-24 | Zymeworks Inc | الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3 |
EP3619235A1 (en) * | 2017-04-11 | 2020-03-11 | Inhibrx, Inc. | Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same |
EP3630836A1 (en) | 2017-05-31 | 2020-04-08 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof |
MA49517A (fr) | 2017-06-30 | 2020-05-06 | Xencor Inc | Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène |
JP7245793B2 (ja) | 2017-06-30 | 2023-03-24 | ザイムワークス ビーシー インコーポレイテッド | 安定化したキメラFab |
AR112603A1 (es) | 2017-07-10 | 2019-11-20 | Lilly Co Eli | Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control |
WO2019035938A1 (en) | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Elstar Therapeutics, Inc. | MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF |
US20190092818A1 (en) * | 2017-09-22 | 2019-03-28 | Kite Pharma, Inc. | Chimeric polypeptides and uses thereof |
JP2021502100A (ja) | 2017-11-08 | 2021-01-28 | ゼンコア インコーポレイテッド | 新規抗pd−1配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
JP2021506291A (ja) | 2017-12-19 | 2021-02-22 | ゼンコア インコーポレイテッド | 改変されたil−2 fc融合タンパク質 |
US11667713B2 (en) | 2017-12-28 | 2023-06-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cytotoxicity-inducing therapeutic agent |
PE20220278A1 (es) | 2018-02-08 | 2022-02-25 | Dragonfly Therapeutics Inc | Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d |
WO2019178364A2 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules and uses thereof |
WO2019178362A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
CN112469477A (zh) | 2018-04-04 | 2021-03-09 | Xencor股份有限公司 | 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体 |
EP3781599A1 (en) | 2018-04-18 | 2021-02-24 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof |
CN112437777A (zh) | 2018-04-18 | 2021-03-02 | Xencor股份有限公司 | 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白 |
TW202016151A (zh) | 2018-06-09 | 2020-05-01 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 針對癌症治療之多特異性結合蛋白 |
EP3818083A2 (en) | 2018-07-03 | 2021-05-12 | Elstar Therapeutics, Inc. | Anti-tcr antibody molecules and uses thereof |
US11358999B2 (en) | 2018-10-03 | 2022-06-14 | Xencor, Inc. | IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins |
GB2597851A (en) | 2019-02-21 | 2022-02-09 | Marengo Therapeutics Inc | Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof |
WO2020172596A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Elstar Therapeutics, Inc. | Anti-tcr antibody molecules and thereof |
GB2599227B (en) | 2019-02-21 | 2024-05-01 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders |
GB2599229B (en) | 2019-02-21 | 2024-04-24 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
WO2020172571A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
CA3132185A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3 |
KR20210121274A (ko) * | 2019-03-29 | 2021-10-07 | 주식회사 녹십자 | 항-메소텔린 항체, 항-cd3 항체 또는 항-egfr 항체를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체 및 이의 용도 |
KR20220017430A (ko) | 2019-06-05 | 2022-02-11 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항체 절단 부위 결합 분자 |
BR112021023173A2 (pt) | 2019-07-10 | 2022-01-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moléculas de ligação à claudin-6 e usos das mesmas |
EP4010376A2 (en) * | 2019-08-06 | 2022-06-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric igg-like bispecific antibodies |
KR20220087441A (ko) * | 2019-09-16 | 2022-06-24 | 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 | 면역요법 화합물 및 방법 |
TW202128756A (zh) * | 2019-10-02 | 2021-08-01 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白 |
WO2021138407A2 (en) | 2020-01-03 | 2021-07-08 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof |
BR112022017526A2 (pt) | 2020-03-31 | 2022-10-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Método para produzir moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas |
EP4139363A1 (en) | 2020-04-24 | 2023-03-01 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
US11919956B2 (en) | 2020-05-14 | 2024-03-05 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3 |
CN116194124A (zh) | 2020-07-31 | 2023-05-30 | 中外制药株式会社 | 包含表达嵌合受体的细胞的药物组合物 |
KR102607909B1 (ko) | 2020-08-19 | 2023-12-01 | 젠코어 인코포레이티드 | 항-cd28 조성물 |
GB2616128A (en) | 2020-08-26 | 2023-08-30 | Marengo Therapeutics Inc | Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof |
WO2022046920A2 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
CN116761818A (zh) | 2020-08-26 | 2023-09-15 | 马伦戈治疗公司 | 检测trbc1或trbc2的方法 |
CA3212665A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
KR20230154311A (ko) | 2021-03-10 | 2023-11-07 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체 |
AU2022255506A1 (en) | 2021-04-08 | 2023-11-09 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999037791A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Multipurpose antibody derivatives |
US20070274985A1 (en) * | 2006-05-26 | 2007-11-29 | Stefan Dubel | Antibody |
WO2011034605A2 (en) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2117477C (en) * | 1992-12-11 | 2001-06-12 | Peter S. Mezes | Multivalent single chain antibodies |
EP1639009B1 (en) * | 2003-05-30 | 2013-02-27 | Merus B.V. | Fab library for the preparation of a mixture of antibodies |
RU2570633C2 (ru) * | 2009-05-27 | 2015-12-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Три- или тетраспецифические антитела |
TW201138821A (en) * | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
JP6167040B2 (ja) * | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
-
2013
- 2013-07-23 US US13/949,166 patent/US20140072581A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-23 AU AU2013293092A patent/AU2013293092A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-23 IN IN1299DEN2015 patent/IN2015DN01299A/en unknown
- 2013-07-23 CN CN201380036538.1A patent/CN104640561A/zh active Pending
- 2013-07-23 CA CA2878587A patent/CA2878587A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-23 JP JP2015524403A patent/JP2015531751A/ja active Pending
- 2013-07-23 WO PCT/US2013/051747 patent/WO2014018572A2/en active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999037791A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Multipurpose antibody derivatives |
US20070274985A1 (en) * | 2006-05-26 | 2007-11-29 | Stefan Dubel | Antibody |
WO2011034605A2 (en) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
WO2011034605A3 (en) * | 2009-09-16 | 2011-08-04 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107949570A (zh) * | 2015-06-30 | 2018-04-20 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 多特异性结合蛋白 |
CN108283001A (zh) * | 2015-10-08 | 2018-07-13 | 酵活有限公司 | 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途 |
CN111902426A (zh) * | 2018-03-05 | 2020-11-06 | 法国血液机构 | 重组单链免疫球蛋白 |
CN112390882A (zh) * | 2019-08-19 | 2021-02-23 | 杨洋 | 靶向cd3和cd20的双特异性抗体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2013293092A1 (en) | 2015-02-26 |
US20140072581A1 (en) | 2014-03-13 |
WO2014018572A2 (en) | 2014-01-30 |
CA2878587A1 (en) | 2014-01-30 |
IN2015DN01299A (zh) | 2015-07-03 |
WO2014018572A3 (en) | 2014-03-27 |
JP2015531751A (ja) | 2015-11-05 |
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