CN104630233A - OsChls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及OsChls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用。通过水稻核心种质重测序，对其叶绿素含量进行了***考察，通过全基因组关联分析检测到具极显著效应的位点。得到控制叶绿素含量自然变异的主效基因OsChls2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其蛋白质的序列如SEQ ID NO:6所示；它的等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：4所示。测序发现其中的hap2的CDS存在3个氨基酸的非同义突变，且有26个碱基的缺失，导致移码突变及翻译提前终止。转化试验表明超量表达的家系叶绿素含量出现了下降。该基因在水稻高光效育种中具有重要价值。

Description

OsChls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及到一个位于水稻第2染色体上控制叶绿素含量的基因OsChls2的克隆与应用。 

背景技术

绿色组织是植物进行光合作用的主要场所，其光合效率的提高对作物产量意义重大。理论上作物产量潜力可根据公式Y=0.487*St*εi*εc*εp计算(Monteith,1977)。研究发现，现代水稻品种合理密植后对光合有效辐射的拦截效率εi高达80-90%，收获指数εp也已达到50-60%，两者进一步提升的空间均十分有限。因总太阳辐射能St在一定地理位置和生长季节是固定的，上式中唯一可用来大幅提高产量的是光能利用效率εc(Horton,2000;Zhu et al2008;2010)。C3植物最大光能利用效率理论上可达4.6%，但田间观测的水稻等作物最大光能利用率往往仅为理论值的1/3，平均光能利用率仅为0.5%。叶绿素具有收集和传递光能的作用，反应中心的特殊叶绿素a分子还可以将光能转化为化学能。研究表明，在作物育种实践中可通过天线叶绿素含量的优化来提高光合效率。 

叶绿素含量的遗传基础比较复杂，受多个基因调控，是典型的数量性状。利用分子标记遗传连锁图谱及分离群体可以定位到控制该性状的QTLs，与此同时，还可通过关联分析对控制该性状的基因进行定位。关联分析是一种以连锁不平衡为基础和前提，通过鉴定自然群体内各性状与分子标记或候选基因相关性的分析方法，可鉴定控制生物特定性状的基因区段（QTL）（Gupta et al2005；Rafalski2010）。与传统QTL定位方法相比，关联分析的优点主要体现在：（1）关联分析在精细定位方面更加直接和方便，其作图精度更高（Buckler et al 2002）；（2）关联分析能同时检测到多个等位基因，并有可能鉴定出最优等位基因；（3）由于关联分析使用的是自然存在的种质资源群体，因此不需要利用多年时间来构建作图群体（Meuwissen et al2000；Flint-Garcia et al2003；Whitt et al2003；Flint-Garcia et al2005）。 

通常关联分析有两种策略，包括全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）和候选基因关联分析（Candidate Gene Association Study）（Aranzana et al2005；Cockram et al2010；Huang et al2010）。但是无论是何种策略，基本包括以下4个步骤：（1）选择具有高度遗传多样性的种质材料；（2）群体结构分析来避免假阳性关联；（3）对无 数特定的目标性状进行多点、多年、多重复的准确考察（Flint-Garcia et al2003；Wilson et al2004）；（4）在分析了种质材料的群体结构、标记间LD水平和目标性状的表型数据后，即可运用关联分析软件（如TASSEL或ANOVA）进行关联分析（Wu et al2001）。 

本发明采用新一代测序技术对533份水稻核心种质完成了重测序，建立了全基因组关联分析平台，并对种质叶绿素含量进行了***考察，进一步通过全基因组关联分析(GWAS)检测到具极显著效应的位点。本发明采用关联分析的策略发掘控制叶绿素含量自然变异主效基因OsChls2，然后在自然群体中挑选部分材料进行了重测序验证，发现在自然群体中存在5种单倍型，选择其中一个单倍型的等位基因作为转化片段，对其进行超量表达，发现该等位基因能显著降低水稻叶绿素含量。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从水稻中分离克隆一个控制叶绿素含量基因的完整编码区段DNA片段，并对该基因进行了超量表达研究，发现该基因能极显著降低水稻叶绿素含量，显然该基因在调控水稻叶绿素含量中具有重要育种价值。申请人将该基因命名为OsChls2。 

本发明的目的还包括OsChls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用。 

未达到上述目的，在本发明中，申请人通过高通量测序技术对533份核心种质进行了测序，根据测序结果将材料分为不同的亚群。然后通过对ind及aus亚群进行OsChls2全基因组的深度测序，并对叶绿素含量性状进行了分析，转化试验表明超量表达的家系叶绿素含量出现了下降。 

本发明分离克隆的OsChls2（在本说明书中有时候表述为hap2）主效基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，其等位基因hap1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

根据测序结果将该基因分为5个单倍型，hap1的翻译蛋白与“日本晴”的蛋白序列一致，而其中hap2在编码区存在3个氨基酸的非同义突变，且有26个碱基的缺失，hap3存在由移码突变导致一个氨基酸的缺失，导致其翻译蛋白出现了一个氨基酸的缺失，其中编号为hap1和hap2单倍型的的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示。 

对该基因不同单倍型在部分种质中做了表达量分析，发现hap2和hap1在表达量上存在极显著差异（见图3）。 

对所获基因进行了超量表达，发现hap2基因的片段转入水稻中花11（hap1）后转基因阳性株出现叶绿素含量下降（见图7A-图7D）。 

本发明的优点在于：本发明首次在水稻中应用全基因组关联分析的方法找到了一个控制叶绿素含量的主效基因及它的等位基因，这些基因在水稻高光效育种中具有重要育种价值。同时本发明也为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。 

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。 

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是分离克隆的OsChls2主效基因的等位基因（编号hap1）的核苷酸序列，序列全长为1455bp；其中：1-64位和1112-1455位是外显子区域，内含子区域为65-1111位，其编码135个氨基酸。其中CDS区为1-64位和1112-1455位，TGA为终止子。 

序列表SEQ ID NO:2是分离克隆的OsChls2主效基因（编号hap2）的核苷酸序列，序列全长为1378bp；编码109个氨基酸。其中：CDS区为1-64位和1113-1378位，TAA为终止子。在该主效基因中，1-64位和1113-1378位为外显子区域；内含子区域为65-1112位区域。 

序列表SEQ ID NO:3是拼接的OsChls2主效基因的等位基因（hap1）的CDS区，序列全长为408bp，编码135个氨基酸序列。 

序列表SEQ ID NO:4是OsChls2主效基因的等位基因（hap1）的蛋白质的序列。 

序列表SEQ ID NO:5是拼接的OsChls2主效基因（编号hap2）的CDS区，序列全长为330bp，编码109个氨基酸序列。 

序列表SEQ ID NO:6是OsChls2主效基因的蛋白质的序列。 

图1.用于深度测序的材料在aus中的表型分析。发现两年的重复试验结果表明：aus中的两种单倍形材料在SPAD、chlb、chla/chlb表型中存在显著差异，而chla及total chl也在一年中检测到了显著差异（分别见图1A-1D）。 

图2.用于深度测序的材料在ind中的表型分析。发现两年的重复试验结果表明，ind中hap2及hap5与hap1单倍型材料在SPAD、chla、chlb、chla/chlb及total chl表型中存在显著差异（分别见图2A-2E）。 

图3.OsChls2基因在水稻hap2和hap1中表达水平示意图。取ind的四种单倍型材料，做表达量检测，发现hap2及hap5的表达量极显著低于hap1。 

图4.原始质粒pCAMBIA1301。 

图5.本发明构建的超量表达质粒pCAMBIA1301s，与原始质粒pCAMBIA1301相比，在多克隆位点旁加上了35S强启动子。 

图6.转基因家系阳性检测图,其中共16个转基因植株，检测得到13株阳性单株（见泳道1-8,10-12,14-15），3株阴性单株（见泳道9,13,16）。 

图7.转基因家系表型统计分析图。其中转基因阳性植株和阴性植株相比出现了叶绿素含量的下降（见图7A-7D）。 

图8.两种蛋白质类型的比对图。H1是hap1的核酸序列的外显子翻译成氨基酸的序列，H2是hap2的核酸序列的外显子翻译成氨基酸的序列，H1与H2在氨基酸数量及排列顺序上存在极大的差异，黑色表示通过比对相同的氨基酸序列，灰色表示通过比对不同的氨基酸序列。 

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明本质和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。 

首先，对核心种质进行收集，提取其大样DNA（提取水稻组织中DNA的方法为常用方法），采用新一代测序技术对其进行测序。结合田间材料对其进行叶绿素含量的***考查，将测序数据及表型数据通过全基因组关联分析的方法找到位于2号染色体上一个控制叶绿素含量的基因OsChls2。然后结合该基因在不同材料中存在自然变异，对部分材料进行了深度测序，根据测序结果对该基因进行了单倍型分型，发现hap2存在氨基酸序列的缺失，且翻译提前终止。Real-Time PCR表达分析发现，该基因在核心种质中的hap2中存在较低的表达，hap2与hap1的表达量存在显著差异，同时结合***考察的叶绿素的数据发现两个单倍型间的表型也存在极显著差异。超量表达该基因发现含有hap2基因的片段转入中花11（hap1）后，转基因阳性株出现叶绿素含量下降。 

实验材料来自于全世界各地的核心种质，其田间叶色存在丰富的表型变异。提取其DNA，采用新一代测序技术对其进行测序，形成低覆盖度的测序数据. 

实施例1：OsChls2基因的克隆 

（1）核心种质叶绿素含量的***考察 

待水稻核心种质抽穗后3天左右，取健康的叶片立即放入装冰的泡沫盒中，用黑布裹好，然后立即带回实验室中。用分析天平精确称重，剪碎，加入混合抽提液，4℃避光抽提，期间每隔一段时间摇匀样品，待样品完全脱色后于分光光度计上测量其吸光度值，其后按照Arnon法修正公式计算叶绿素含量（方法参考Jiang G,He Y,Xu C,Li X,Zhang Q.The genetic basis of stay-green in rice analyzed in a population of doubled haploid lines derived from an indica by japonica cross.Theor Appl Genet,2004,108:688-698）。 

（2）控制叶绿素含量候选基因的关联分析 

取样533份核心种质的叶片，抽取其DNA，采用第二代测序技术将其测序后得到SNP标记（方法参考Huang X,Zhao Y,Wei X,Li J,Wang A,Zhao Q,Li W,Guo Y,Deng L,Zhu C,Fan D,Lu Y,Weng Q,Liu K,Zhou T,Jing Y,Si L,Dong G,Huang T,Lu T,Feng Q,Qian Q,Li J,Han B.Genome-wide association study of flowering time and grain yield traits in a worldwide collection of rice germplasm.Nat Genet,2012,44:32-39），同时考察核心种质叶绿素含量，全基因组关联分析检测P值显著的位点。通过LMM模型在2号染色体的物理位置10831243处，找到P值为3.7e-06的显著位点，在该显著位点上游58kb处，发现有一个注释基因是和叶绿素代谢途径相关的，确定该基因为目标候选基因OsChls2。 

（3）OsChls2主效基因的功能预测 

根据InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)对蛋白质结构进行预测，OsChls2基因（Hap1）编码的蛋白质由135个氨基酸组成（见序列表SEQ ID NO：4），它包含一个保守的PF12740结构域。利用BLASTp对OsChls2基因编码氨基酸组成的蛋白质结构进行搜索，发现该基因编码一丝氨酸脱氢酶。以前的研究表明该叶绿素酶是叶绿素降解过程中的关键酶，茉莉酮酸甲酯可以诱导脂酶模体，该酶作为丝氨酸脱氢酶能够催化甘油三酯脂肪酶。 

实施例2：比较测序确定OsChls2等位基因间的自然变异 

（1）序列测定 

对部分核心种质扩增该基因，采用高保真度的LA-Taq和rTag(购自日本TakaRa公司)从这些材料的基因组中进行PCR扩增,按照普通PCR反应程序，设置30个循环，退火温度58℃，延伸时间1min30s按照普通PCR反应程序，设置30个循环，退火温度58℃，延伸时间1min30s，然后进行PCR测序（PCR测序由武汉华大基因公司进行），用于测序引物见表1。使用Sequencher4.5软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。该基因（hap2）的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码区序列见SEQ ID NO：5，其蛋白质的序列见SEQ ID NO：6。 

（2）该基因在自然群体中的测序分析 

目标区段间的序列比较分析在核心种质两个亚群(aus和ind)中发现存在40个SNP和InDel差异，其中29个突变位于内含子区，11个突变位于编码区的外显子。编码区有7个同义突变，1个非同义突变以及3个indel的变化引起的氨基酸序列的改变，因此可以将测序得到的群体分为5个单倍型，其中hap1和日本晴的蛋白类型一致。 

表1用于本发明比较测序的引物 

实施例3：OsChls2基因在不同单倍型间的表型及表达量分析 

对aus及ind亚群的SPAD、叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)、总叶绿素含量（total chl）、叶绿素a/b等表型进行了分析，发现aus亚群中的两个单倍型在2012年检测的五种表型均存在显著差异，2013年在SPAD、chlb、叶绿素a/b等表型间存在显著差异（见图1）。在ind亚群中，上述五个性状中均有不同单倍型材料存在显著差异，尤其是hap1与hap2在各表型 中均存在极显著差异（见图2），同时提取各单倍型材料RNA做表达量检测（RNA的提取参见Trans Zol试剂盒），分析表明hap1与hap2之间存在极显著差异（见图3）。 

两年的重复结果显示，该基因对控制叶绿素含量具有极显著效应。 

实施例4：OsChls2基因在遗传转化中的应用（转基因） 

1、OsChls2转基因技术路线： 

挑选一个hap2材料台山糯（中国农业大学李自超教授馈赠），设计一对带有限制性核酸内切酶BamHI和SalI接头的PCR特异引物扩增基因组DNA，按照常规PCR反应程序，设置30个循环，退火温度58℃，延伸时间1min30s,连接到TA克隆T载体（购自Promega公司）上，挑选出含有候选基因的无突变的正确克隆，利用限制性核酸内切酶BamHI和SalI酶切阳性克隆，进行亚克隆，再连接到双元超表达载体pCAMBIA1301S上，多克隆位点旁加一35S强启动子（见图4，图5），采用通用的转基因的方法，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种“中花11”中，经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因的水稻植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法（参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal6:271-282）基础上进行优化。 

本发明共获得独立转基因（Over-expression）T₀代水稻植株16株，包括13株阳性单株和3株阴性单株。经测试表明，转基因水稻阳性和阴性植株的叶绿素含量（见图6）差异显著。转基因T₀代阳性超表达单株均表现出叶绿素含量下降的表型，证明了该候选基因OsChls2就是控制叶绿素含量的一个基因。 

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述： 

（1）试剂和溶液缩写 

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；HN（Hygromycin B，潮霉素）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量元素成分溶液）；N6mix（N6微量元素成分溶液）；MSmax（MS大量元素成分溶液）；MSmix（MS微量元素成分溶液） 

（2）主要溶液配方 

1）N_6max培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液（10X）配制）： 

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。 

2）N_6min培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液（100X）配制）： 

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。 

3）铁盐（Fe²⁺EDTA）贮存液（按照100X浓缩液配制）： 

将3.73克乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O）和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。 

4）维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）： 

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。 

5）MS培养基大量元素母液（MS_max母液）(按照10X浓缩液配制)： 

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。 

6）MS培养基微量元素母液（MS_min母液）(按照100X浓缩液配制)： 

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。 

7）2,4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制： 

秤取2,4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。 

8）6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制： 

秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。 

9）萘乙酸（NAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制： 

秤取NAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。 

10）吲哚乙酸（IAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制： 

秤取IAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。 

11）葡萄糖贮存液（0.5克/毫升）的配制： 

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。 

12）AS贮存液的配制： 

秤取AS0.392克，加入DMSO10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，-20℃保存备用。 

13）1N氢氧化钾贮存液配制： 

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。 

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方： 

1）诱导培养基 

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（30毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（例如121℃下灭菌15分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。 

2）继代培养基： 

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（30毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。 

3）预培养基（粳稻可以不做这一步）： 

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。 

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。 

4）悬浮培养基： 

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。 

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。 

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。 

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/每皿）。 

6）筛选培养基： 

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。 

使用前溶解培养基，加入250微升HN（50毫克/毫升）和400微升CN（10克CN/36毫升水）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升）。 

7）预分化培养基（粳稻可以不做这一步）： 

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。 

使用前溶解培养基，250微升HN（50毫克/毫升）250微升CN（250毫克/毫升），分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。 

8）分化培养基： 

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。 

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到100毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。 

9）生根培养基 

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。 

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述方法灭菌。 

（4）农杆菌介导的遗传转化步骤： 

3.1愈伤诱导 

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl₂）种子表面消毒15分钟； 

2)用灭菌水洗种子4-5次； 

3)将8-10粒种子放在诱导培养基上； 

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-5周，温度26±1℃。 

3.2愈伤继代： 

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。 

3.3预培养： 

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。 

3.4农杆菌培养： 

1)在带有对应抗性选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京）上划线预培养农杆菌EHA105（该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株）两天，培养温度28℃； 

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。 

3.5农杆菌侵染： 

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内； 

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀=0.8-1.0； 

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟； 

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。 

3.6愈伤洗涤和选择培养： 

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌； 

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素（CN）的灭菌水中摇30分钟； 

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干； 

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周至长出好的抗性愈伤。 

3.7分化： 

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天； 

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照下培养5周-6周至长出大的苗子，培养温度26℃。 

3.8生根与炼苗： 

1)剪掉分化时产生的老根； 

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26℃。 

3.9移栽 

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，等长势健壮后再移栽至大田。 

Claims (4)

1.OsChls2主效基因在调控水稻叶绿素含量中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.OsChls2主效基因在调控水稻叶绿素含量中的应用，其特征在于该基因的蛋白质的序列如SEQ ID NO：6所示。

3.OsChls2主效基因的等位基因hap1在调控水稻叶绿素含量中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.OsChls2主效基因的等位基因hap1在调控水稻叶绿素含量中的应用，其特征在于该基因的蛋白质的序列如SEQ ID NO：4所示。