CN103421804B - Ghd7-1基因调控水稻产量、开花期及株高中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及一个能增加水稻产量、延迟抽穗期和增加株高的多效基因的主效基因Ghd7-1及其两个等位基因的克隆及应用。其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1，3和5所述。遗传转化表明，本发明建立的近等基因系单株产量从14.8g提高到25.6g，同时延迟抽穗19天，增加植株高度28cm，每穗颖花数增加45个，对水稻的遗传改良有着巨大的应用价值。

Description

Ghd7-1基因调控水稻产量、开花期及株高中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个对水稻谷物产量，开花期及植株高度同时具有巨大效益的数量性状位点基因的精细定位并借用农杆菌介导的遗传转化方法进行了功能验证。

背景技术

水稻是全球将近一半人口的主要食物，但是随着人口的日益增长和耕地的不断紧缩，如何提高水稻单位面积的产量来满足不断增加的粮食需求，是一个迫切需要解决的问题。水稻产量的直接组成因子包括每穗实粒数，千粒重和单株分蘖数，同时又受到了倒伏，病虫害和水源等多方面的影响。其中，每穗实粒数由每穗颖花数和结实率共同决定；千粒重由粒长、粒宽、粒厚和充实度共同决定。水稻作为一个感光性很强的短日照植物，开花期的早晚决定了水稻的种植地域性限制。植株高度则对植株生物量和倒伏性都有影响进而影响了水稻的产量，第二次绿色革命就是通过降低水稻高度，提高抗倒伏性而达到了高产的目的。

目前已经克隆了众多影响产量的基因，其中Ghd7和Ghd8都是同时影响了水稻产量，开花期和植株高度的多效基因。Ghd7位于水稻第7染色体近着丝粒区，编码一个包含CCT domain的蛋白，在长日照条件下它能增加株高30cm，延迟抽穗30天，同时增产50%（Weiya Xue等，Natural variation in Ghd7 isan important regulator of heading date and yield potential in rice,Nature genetics,2008,40:761-767）。Ghd8位于第8染色体上端，编码了一个CBF类基因，在长日照下它能增加株高20cm，延迟抽穗9天，同时将单株产量由15.1克增加至23.8克（Wenhao Yan等，A major QTL,Ghd8，playspleiotropic roles in regulating grain productivity,plant height,and heading date in rice,Molecular plant,2011,4:319-330）。

本发明利用图位克隆的方法克隆了一个位于第7染色体长臂末端，能同时影响了水稻单产，开花期和植株高度的多效基因Ghd7-1。在长日照下Ghd7-1能够增加每穗颖花数50%，单株产量由14.8g提高到25.6g，同时延迟抽穗19天，增加植株高度28cm，因而对水稻育种有着巨大的应用价值。

发明内容

本发明克隆了一个控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7-1。这个基因在一定程度增加株高和延长生育期，同时大幅度提高水稻产量，具有较好的生产应用前景。申请人将克隆的这个基因命名为Ghd7-1。

本发明是这样实现的：

1、QTL扫描及近等基因系的构建：利用一个由水稻品种珍汕97（ZS97）和特青(TQ)衍生出的共190个家系的重组自交系（分别命名RIL-1,RIL-2……RIL-190），种植了F7和F8代进行QTL扫描的时候发现在第7染色体末端RM248附近有一个同时控制产量，株高和开花期的QTL，而此处为杂合型的第189家系（简称RIL189）同时存在株高，抽穗期和每穗颖花数的分离，其中特青基因型为高株，晚抽穗，每穗颖花数增加(Touming Liu等，2011),且表现成3:1分离，与珍汕97等位基因型相比，特青等位基因型能增加产量50%，延迟抽穗期19天，增加株高28cm，即该位点的近等基因系构建完成（见附图1,2）。

2、Ghd7-1的精细定位与候选基因的确定：2011年在湖北武汉种植了2200株的近等基因系背景F2大群体进行基因的精细定位，将基因定位在公共标记RM22181到染色体末端约104kb的区间。通过对该区段基因进行功能预测，对在标记RM22181之后20kb的OsPRR37进行比较测序，与特青相比，珍汕97存在一个8bp的缺失，该8bp的缺失设计为标记鉴定所有重组单株，发现它与表型共分离。因此，将它确定为候选基因。OsPRR37编码产物为拟响应调控因子，该8bp的缺失导致了该基因编码产物的提前终止，造成了CCT domain的缺失。OsPRR37在拟南芥，大麦和高粱里面的同源基因都已经证明与植物开花有关系，因此我们将它作为候选基因。

3、Ghd7-1的功能验证：利用SamI和SalI切点，将OsPRR37的CDS连接到pCAMBIA1301S载体上，利用农杆菌介导的遗传转化将候选基因转入珍汕97中。并在T1代进行表型考察，发现超表达OsPRR37可以增加株高16cm，延迟抽穗期30天，同时增加每穗颖花数40个，确认OsPRR37具有延迟抽穗，增加株高和每穗颖花数的功能。

3、Ghd7-1的基因结构分析：Ghd7-1编码一个拟响应调控因子，整个基因包含REC domain和CCT domain共2个domain。而珍汕97基因型在距离起始密码子（ATG）1515 bp处缺失8bp，导致了基因移码，编码提前终止，最终CCT domain缺失。

本发明克隆了水稻Ghd7-1基因，它能同时增加株高，延迟抽穗期天和增加每穗颖花数，增加产量，为水稻育种提供了很好的材料。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的Ghd7-1主效基因的核苷酸序列。序列长度为2229bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的Ghd7-1主效基因的氨基酸序列。编码742个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的Ghd7-1主效基因其中一个等位基因的核苷酸序列。序列长度为1527bp。

序列表SEQ ID NO：4是本发明克隆的Ghd7-1主效基因其中一个等位基因的氨基酸序列。编码508个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：5是本发明克隆的Ghd7-1主效基因另一个等位基因的核苷酸序列。序列长度为2229bp。

序列表SEQ ID NO：6是本发明克隆的Ghd7-1主效基因另一个等位基因的氨基酸序列。编码742个氨基酸。

图1.是本发明的总体技术路线图。珍汕97、特青为亲本杂交产生F1后，进行自交得选取190粒自交种种植下一代F2，190个F2每一单株自交产生190个F3，利用这种单粒传方法到第8代。其中利用F7代和F8代基因型和表型构建遗传连锁图谱并扫描QTL，结果在第7染色体长臂扫描到Ghd7-1（同时控制株高、抽穗期和产量）。其中RIL189在目标区段是杂合型其它区段都是纯和型，因此挑取此家系自交得到Ghd7-1的近等基因系NIL（Ghd7-1）。利用自交产生的F2群体进行精细等位找到候选基因，并通过转基因进行功能验证。

图2.是本发明构建的近等基因系中不同等位基因型单株的抽穗期、株高和每穗颖花数表型。图中：图2A是在近等基因系背景下NIL(ZS)、NIL(TQ)分别表示珍汕97、特青等位基因型的单株，特青等位基因型单株延迟19天抽穗；图2B是在近等基因系背景下与NIL(ZS)单株相比，NIL(TQ)单株能增加株高28cm；图2C是在近等基因系背景下与NIL(ZS)单株相比，NIL(TQ)单株能增加每穗颖花数45个。

图3.利用2200株F2群体精细定位的结果。图中：黑线上面表示的是标记名称，下面对应的数字表示在相应标记处重组单株数目。利用自己设计的indel标记PN19结合表型共筛选到110个重组单株，利用公共标记RM248筛选得到75个重组单株，利用公共标记RM22181筛选到1个重组单株，最后重组单株在8bpdeletion处基因型与表型完全共分离。

图4.珍汕97和特青Ghd7-1编码蛋白的氨基酸序列比对，Ghd7-1珍汕97和特青两种基因型的氨基酸序列，转化用的日本晴核酸序列。

图5.本发明中所用到的超表达载体构建示意图。

图6.转基因抽穗期和株高表型：图6A是转基因阳性单株（OE(+)）与转基因阴性单株（OE(-)）相比抽穗期延迟；图6A是转基因阳性单株（OE(+)）与转基因阴性单株（OE(-)）相比株高增高。

具体实施方式

从水稻品种珍汕97和特青的重组自交系里面在第7染色体末端同时扫描到控制株高、抽穗期和每穗颖花数的QTL，挑取其中的RIL189家系构建近等基因系NIL(Ghd7-1)，并进行遗传分析以考察QTL的效应。利用2200株的NIL-F2群体进行精细定位，最后将基因定位于从公共标记RM22181至染色体结束的约104kb的区段。在此区间共有7个基因，其中包含OsPRR37，对其进行测序结果发现在珍汕97里面基因内有8bp的缺失并造成提前终止，而对重组单组进行基因型鉴定发现这8bp的缺失与表型完全共分离，将此基因定为候选基因。将此基因的日本晴等位基因型接到pCABIA1301s超表达载体上转化珍汕97，在T1代也出现了转基因阳性单株延迟抽穗期，增加株高和每穗颖花数的表型，确认了OsPRR37就是Ghd7-1。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了Ghd7-1基因的分离克隆及功能验证。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：Ghd7-1的定位和效应分析

（1）Ghd7-1的发现：利用珍汕97（江西省农业科学院颜龙安院士选育和惠赠）与特青自交系（广东省农科院黄耀祥院士选育和惠赠）在F7代和F8代收集抽穗期和每穗颖花数的表型，同时对每个家系利用公共的SSR标记（www.gramene.org）鉴定基因型构建遗传连锁图谱（Touming Liu等,2011,Comparisonof quantitative trait loci for rice yield,panicle length and spikelet density across threeconnected populations,Journal of Genetics,90:377-382），然后利用用WinQTLcartographer 2.0软件选择复合区间作图法（Zeng ZB.Precision mapping of quantitative trait loci.Genetics，1994,136:1457-1468）扫描QTL，F7和F8在第7染色体末端公共标记RM248（www.gramene.org）处都扫描到抽穗期和每穗颖花数的QTL。在RIL189家系里面，在此区间是杂合基因型其它地方都是纯和基因型，而在后代中出现表型分离分离，所有珍汕97基因型的都是早花、矮株、小穗，特青基因型都是晚花、高株、大穗（RIL189家系即Ghd7-1的近等基因系NIL(Ghd7-1)的选育参见：Touming Liu等，2011，Quantitativetrait loci for the number of grains per panicle dependent on or independent of heading date inrice(Oryza sativa L.),Breeding Science 61:142–150，下同）。

（2）Ghd7-1的近等基因系的构建及效应评价：在重组自交系的190个家系里面，RIL189家系是一个只在RM248处为杂合基因型，其它位置基因型为纯和基因型的单株。RIL189自交产生F2群里中存在株高，抽穗期和每穗颖花数及产量的分离，且分离比为3:1，因此由RIL189家系（该家系即Ghd7-1的近等基因系NIL，文献同上Touming Liu等的文献）分离得到了Ghd7-1的近等基因系NIL(Ghd7-1)。分别挑取30株珍汕97纯和等位基因型NIL(ZS97)与30株特青纯和等位基因型NIL(TQ)的单株，考察抽穗期、株高，每穗颖花数和单株产量（见图2），具体结果如表1：

表1  Ghd7-1近等基因系表型比较

从上表可以看到，在近等基因系背景下，与珍汕97等位基因型NIL(ZS)相比，特青等位基因型NIL(TQ)能延迟抽穗期19天，增加株高28cm，增加每穗颖花数50%，单株产量由14.8g提高到25.6g。

（3）Ghd7-1的精细定位：在2200株的NIL-F2群体里面，利用自己设计的indel标记PN19和RM248鉴定单株基因型，结合抽穗期表型筛选重组单株，发现PN19与Ghd7-1之间共有110个重组单株，而公共标记RM248与Ghd7-1之间共有75个重组单株，这75个重组单组为PN19与RM248共有，即在这75个单株里面，RM248与PN19基因型相同，说明Ghd7-1位于RM248至第7染色体末端结束的位置（图3所示）。PN19引物序列如下：

PN19F:TTCGTTTCGCAATTTACACG

PN19R:CCAGCCCAAGGCTTTTTAC

利用公共标记RM22181筛选这75个重组单株发现还有1个重组单株，这个重组单株在PN19，RM248和RM22181处都是杂合基因型但是早抽穗，后代测验也验证了这一重组单株的真实性，说明Ghd7-1位于RM22181至第7染色体长末端结束。RM22181据第7染色体长臂最末端有104kb，其中包含OsPRR37(Os07g0695100)（http://rapdblegacy.dna.affrc.go.jp/）等7个基因。OsPRR37在拟南芥（Norihito Nakamichi等Arabidopsis Clock-Associated Pseudo-Response Regulators PRR9,PRR7 andPRR5 Coordinately and Positively Regulate Flowering Time Through the CanonicalCONSTANS-Dependent Photoperiodic Pathway,2007,Plant Cell Physiol.48:822-832）、大麦(AdrianTurner等,The Pseudo-Response Regulator Ppd-H1 Provides Adaptation to Photoperiod in Barley，Science,2005,310:1031-1034）和高粱（Rebecca L.Murphy等,Coincident light and clock regulationof pseudoresponse regulator protein 37(PRR37)controls photoperiodic flowering in sorghum,PNAS，2011,108:16469-16474）中的同源基因都对抽穗期有影响。而对OsPRR37的全长cDNA进行比较测序后我们发现在距离翻译起始位点1515bp处珍汕等位基因型缺失了GAACGTTG共8bp（珍汕97cDNA序列见SEQ IDNO：3，特青cDNA序列见SEQ ID NO：1），进而导致了氨基酸翻译时移码，翻译提前终止（OsPRR37珍汕97与特青氨基酸比对结果见图4）。OsPRR37编码蛋白包括了一个信号接收区域REC domain和一个DNA结合区域CCT domain（http://www.uniprot.org/uniprot/Q0D3B6），而在珍汕97里面8bp缺失导致移码、氨基酸翻译提前终止，蛋白质的CCT domain缺失，可能会无法行使功能。利用这8bp的缺失设计一对SSR引物，其DNA序列如下所示：

8bp deletion F:GTGTCCATTAGCCTTAACAGC

8bp deletion R:CAAGGTTCTAATGGTAGTAGC

利用这对SSR引物8bp deletion对2240个单株进行基因型鉴定，发现这8bp的缺失与表型完全共分离：所有珍汕97纯合等位基因型均是早花，所有晚花都是纯合特青基因型或者杂合基因型，因此将OsPRR37定位候选基因。在PN19、RM248,RM22181与8bp deletion之间的重组单株分别是110个，75个和1个，如图3所示。

实施例2：Ghd7-1的转基因功能验证

（1）转化片段的获得：利用Trizol试剂抽提日本晴品种的叶片RNA（货号15596-026），取4ug总RNA进行反转录（方法见invitrogen SSⅢ说明书,货号18080-093），取0.5ul做模板用PCR扩增的方法（方法见宝生物工程大连有限公司，LA Taq酶说明书，货号DRR002A）得到该基因的编码区全长（SEQ ID NO：5），所用引物为：CDSF:AcccgggAAACCCCTGCCACCACTCAACCC

CDSR:TGTCGACTTGTTGATCGATCGGCCAAGG

所用程序为PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃1分钟30秒，⑤从②－④循环35次，⑥72℃15分钟，⑦4℃保存。将PCR产物利用Fermentas的回收试剂盒回收（方法见该试剂盒说明书，货号#K0513），连接promega公司的T-easy试剂盒（方法见该试剂盒说明书，货号A1380），测序得到无突变的TA克隆用于构建超表达载体。

（2）转化载体的构建：利用常规的酶切连接的方法将序列从TA克隆上切下并连入pCAMBIA 1301S载体（由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室练兴明老师提供），操作过程见图5。利用引物上的SmaI和SalI酶切位点将CDS片段酶切（限制性外切酶购自宝生物工程（大连）有限公司，货号为D1085A和D1080A，操作方法参见该生物材料的说明书），载体也用相同的方法进行酶切，利用Fermentas的回收试剂盒回收（操作方法见该试剂盒的说明书，货号#K0513），利用NEB的T4 ligase（B0202S,方法见说明书），连接产物电转化DH10B（所用电转仪为eppendorf electroporator 2510,电压参数为1800v，使用方法见电转仪说明书，大肠杆菌DH10B菌株购自promega公司），连接产物涂于含30mg/L的卡那霉素的LA平皿上，16h后挑取单菌落于1mL含30mg/L的卡那霉素的LB培养基中，培养12h后抽取质粒，利用SmaI和SalI酶切检测阳性克隆（操作方法见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）。对阳性克隆进行测序，确认外源片段无突变。（3）转化珍汕97：将上述（2）中构建好的载体电转化到农杆菌（A.tumefaciens）EHA105（购自澳大利亚CAMBIA实验室），方法参见上述（2）中连接产物的电转化。转化珍汕97的方法参考Hiei等人报道的方法（Hiei等,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282）进行。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

（1）试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；HN（Hygromycin B，潮霉素）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量元素成分溶液）；N6mix（N6微量元素成分溶液）；MSmax（MS大量元素成分溶液）；MSmix（MS微量元素成分溶液）

（2）主要溶液配方

1）N6培养基大量元素母液（按照10倍浓缩液（10X）配制）：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2）N6培养基微量元素母液（按照100倍浓缩液（100X）配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3）铁盐（Fe2EDTA）贮存液（按照100X浓缩液配制）

将3.73克乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）和2.78克FeSO4·7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（按照100X浓缩液配制）

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5）MS培养基大量元素母液（MSmax母液）(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6）MS培养基微量元素母液（MSmin母液）(按照100X浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7）2,4-D贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9）萘乙酸（NAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10）吲哚乙酸（IAA）贮存液（1毫克/毫升）的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11）葡萄糖贮存液（0.5克/毫升）的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12）AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13）1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方

1）诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口后按常规方法灭菌（例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同）。

2）继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（25毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

3）预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

4）共培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中（25毫升/每皿）。

5）悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6）选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN（50毫克/毫升）和400微升CN（250毫克/毫升）分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。（注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升）。

7）预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN（50毫克/毫升）250微升CN（250毫克/毫升），分装倒入培养皿中（25毫升/皿）。

8）分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶（50毫升/瓶），封口，按上述方法灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中（25毫升/管），封口，按上述方法灭菌。

（4）农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

将成熟的珍汕97水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl2）种子表面消毒15分钟；

用灭菌水洗种子4-5次；

将种子放在诱导培养基上；

将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基（LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京）上预培养农杆菌EHA105（该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株）两天，温度28℃；

将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；

将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素（CN）的灭菌水中30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同普通大田。

得到的植株为转基因T0代，利用T0代自交得到T1代家系用于考察表型。转基因阳性单株的鉴定利用8bp deletion设计的indel引物扩增，在8%PAGE胶上面完成（方法参考Zietkiewicz等Genomefingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification，genomecs,1994）。杂合带型为转基因阳性单株，珍汕97纯和带型全为阴性。

（4）转基因T1代植株表型考察：武汉正季种植T1代植株，对T1代各家系考察株高，抽穗期和每穗颖花数,具体结果见附图6和表2。结果显示所有的转基因阳性单株跟阴性单株相比都具有延迟抽穗期，增加每穗颖花数和株高变高的表型，确认了此段序列具有控制抽穗期，每穗颖花数和株高的功能。

表2转基因T1代各家系表型考察

Claims (2)

1.一种多效性基因的主效基因Ghd7-1在调控水稻产量和株高中的应用，其特征在于该主效基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的主效基因的等位基因调控水稻产量和株高中的应用，其特征在于该等位基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。