CN103374578A

CN103374578A - 一种调控水稻谷粒粒长和粒重的基因Gl3及应用

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Publication number: CN103374578A
Application number: CN201210110092XA
Authority: CN
Inventors: 邢永忠; 鲁丽; 邵迪
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-04-16
Also published as: CN103374578B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。通过基因定位，分离克隆得到一个调控水稻谷粒粒长和粒重的主效基因Gl3及等位基因Gl3-NYZ。它们的核苷酸序列分别与序列表SEQ ID NO：1和3所示。通过QTL定位与发表的全基因组的关联分析结果，将这个调控粒形性状的基因定位在第三染色体RM6881与RM6283标记之间，其含有一个影响种子发育的基因OsMYB3，定为候选基因。利用水稻自然群体，进行比较测序和关联分析发现，含有主效基因Gl3及其等位基因Gl3-NYZ的籼稻品种之间粒长有显著差异。利用RNAi干扰载体转化水稻品种，结果表明，转化植株的粒长从7.85mm增长到9.60mm；千粒重从28.33g增加到34.11g，达到极显著水平。本发明克隆的基因为水稻的产量和品质育种提供了新的基因资源。

Description

一种调控水稻谷粒粒长和粒重的基因Gl3及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及到一个位于水稻第三染色体着丝粒附近控制谷粒粒长和粒重的主效基因Gl3的基因克隆。利用已发表的QTL定位结果和全基因组关联分析结果相结合，将基因初步定位到第三染色体RM6881与RM6283之间。通过对定位区间中基因功能进行预测，确定一个与植物发育相关的MYB家族基因OsMYB3为候选基因。再利用一个自然群体对该基因进行比较测序和关联分析，确定了该基因在自然群体中的功能。最后，利用RNAi干扰技术，通过农杆菌介导的遗传转化对该基因的功能进行了验证。

背景技术

水稻谷粒的大小是粒重的主要决定因素，而粒重又是水稻产量的三个构成因子之一，因此，谷粒大小是影响产量的重要因素(Xing and Zhang 2010)。另外，与小麦，大麦，玉米等其它粮食作物不同是，水稻的谷粒大小直接展现在消费者面前，是一个重要的稻米外观品质性状，并且不同文化背景的消费者对不同大小的谷粒有偏爱(Fitzgerald et al.2009)。因此，阐明谷粒大小的遗传基础和分子机理有利于同时改良水稻的产量和品质。

水稻谷粒的大小是典型的数量性状，遗传基础比较复杂。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL(Quantitative Trait Loci)进行分解和定位。利用这种方法，近年来很多研究小组定位并克隆了多个控制谷粒大小的QTLs。例如影响粒宽的基因GW2，qSW5/GW5，GS5(Li et al.2011；Shomura et al.2008；Songet al.2007；Weng et al.2008)，以及一个位于第三染色体着丝粒附近的影响粒长的基因GS3(Fan et al.2006)。除此之外，仍然有许多影响粒形的位于第三染色体的QTL通过近等基因系被定位到(Xing et al.2002；Thomson et al.2003；Li et al.2004)。近年来，随着全基因组测序技术的进步，水稻全基因组关联分析取得了重大突破，定位到了许多与粒形性状相关联的位点(Huang et al.2010；Huang et al.2012；Zhao et al.2011)。这些结果表明，除了已克隆的粒形基因以外，仍然有很多控制粒形的主效基因存在。本发明所涉及的Gl3基因，是位于第三染色体的第二个粒形基因，编码一个与植物种子发育相关的MYB转录因子，发明人利用图位克隆基因定位、关联分析以及遗传转化相结合的方法分离克隆了该基因。Gl3遗传效应显著，对于水稻产量和品种性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，为水稻的产量和品质育种提供新的基因资源。

发明内容

本发明从水稻中分离克隆一个第三染色体上控制谷粒粒长、粒重的主效基因，利用这个基因能改良水稻产量和品质，申请人将该基因命名为Gl3(Grain length3)基因。

本发明利用三个研究小组已发表的第三染色体上粒形基因QTL的定位结果，并与已发表的全基因组关联分析结果中第三染色体上与粒形相关联的位点结合，将Gl3初步定位在GS3基因的下游，标记RM6881和RM6283之间，通过对这个区间17.7kb范围内2个基因的功能预测，确定了其中一个含有完整的R2R3型的MYB结构域的基因(LOC_Os03g29614即OsMYB3)为候选基因。该候选基因共编码342个氨基酸，相对于“川7”基因型，“南洋占”基因型在终止密码处发生了一个12bp的***，导致其终止密码处7个氨基酸的改变和20个氨基酸的缺失。通过对一个含有118份常规品种的自然群体进行比较测序发现该基因在籼稻品种含有两种基因型，关联分析发现含有这两种基因型的品种间其粒长有极显著差异。并且，利用RNAi干扰技术，通过农杆菌介导的遗传转化，发现该基因表达量的降低能够使转化受体水稻“中花11”的粒长从7.85mm增长到9.60mm；千粒重从28.33g增加到34.11g。达到极显著的差异。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明在水稻中克隆了调控水稻谷粒长和粒重性状的主效基因Gl3及其等位基因Gl3-NYZ，为水稻的高产优质育种提供了新的基因资源；

(2)本发明结合基因定位，关联分析和遗传转化的方法，快速高效克隆基因，为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。

附图说明

SEQ ID NO：1是Gl3基因的核苷酸序列，序列全长为5097bp。

SEQ ID NO：2是Gl3基因的蛋白质的氨基酸序列，编码342个氨基酸。

SEQ ID NO：3是Gl3基因的等位基因Gl3-NYZ的核苷酸序列，序列全长为5130bp

SEQ ID NO：4是Gl3基因的等位基因Gl3-NYZ的蛋白质的氨基酸序列，编码321个氨基酸

SEQ ID NO：5是Gl3基因的双链抑制片段，全长411bp。

图1：为水稻第三染色体着丝粒附近的分子标记示意图。

SSR标记序列参见http://www.gramene.org/；GS09标记序列参见Fan et al.，2006；分子标记的物理位置参见数据库Rice Genome Annotation Project Rice Genome Browser - Release 7http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/。

图2：为主效基因Gl3和等位基因Gl3-NYZ的氨基酸序列比对，*号代表相同的氨基酸序列。

图3：为一种抑制表达载体pds1301图谱。

制备方法：将pMCG161(GenBank ID：AY572837.1)用EcoRI和HindIII(均购自宝生物工程大连有限公司)酶切后回收外源片段，再连入到pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)中得到表达载体pds1301。

图4：为一种抑制表达T0代转基因植株中Gl3基因的表达量检测示意图。

图中：dsGl3-2；dsGl3-3分别代表两个T0代转基因家系，CK为阴性对照株。

图5：为抑制转化T1代植株的粒长和粒重与阴性对照植株的表现型差异比较图。

左右两个比较图中：T1代表转化阳性植株的平均粒长/千粒重。CK代表转基因阴性植株的平均粒长/千粒重。所检测植株各50株。

图6：为一种抑制表达Gl3基因后T1代水稻植株的表型。

图中：Gl3被抑制后，谷粒粒长变大(图中：上排谷粒为转基因阳性株，下排谷粒为阴性株对照)，转基因植株穗粒数减少，着粒密度变小(左为阴性株对照，右为转基因阳性株)。转基因植株株高变矮(左为阴性对照，右为转基因阳性株)。

具体实施方式

实施例1：Gl3基因的定位与候选基因确定

以Bai等以大粒品种“南洋占”，小粒品种“川7”为亲本的重组自交系，在2006年和2007年两年重复实验中，在第三染色体着丝粒附近的两个SSR标记RM6080和RM156之间，定位得到一个同时影响谷粒粒长，粒宽，粒重的主效QTL(见Bai et al.2010)。标记位置如图1所示。除此之外，有很多研究小组在这一区间附近也定位得到了与粒形以及粒重相关的基因。Li等由一个野生稻和栽培稻的杂交后代群体，在RZ452(即RM632，见http://www.gramene.org/)和RM156之间定位到一个影响种子大小和千粒重的主效QTL(gw3.1)(见Li et al.2004)。Liu等利用一个蜀恢881和Y34的F2群体，将一个粒形和粒重的主效基因Mit(3)定位在RM282和RM6283之间(见Liu et al.2005)。在这3个研究小组共同定位到的影响种子粒形及粒重的QTL区间RM632与RM6283之中，Fan等由一个9311和川7的杂交群体，定位并克隆了一个主效基因GS3(见Fan et al.2006)，它位于GS09和RM6881标记之间。但这些影响种子粒形及粒重的QTL效应可能并非由GS3基因单独控制。2010年Huang等通过517个自然群体进行全基因组关联分析发现，在GS3基因下游0.3MB的范围内，还存在着第二个与粒形和粒重有关的基因(见Huang et al.2010)。结合3个研究小组的QTL定位结果，申请人认为GS3基因下游的RM6881和RM6283之间17.7kb的范围内，存在第二个与粒形和粒重相关的基因，申请人将其命名为Gl3(Grain length 3)基因。

该区段中含有两个预测基因，其中有一个MYB转录因子基因OsMYB3(LOC_Os03g29614)。MYB基因家族是植物中最大的家族，主要与植物发育以及次生代谢有关。拟南芥中OsMYB3的同源基因TT2，参与调节种子成熟早期花青素的积累，并且严格在种子胚胎发育的早期表达(Nesi et al.2001)。在玉米中，OsMYB3的同源基因C1，参与玉米中花青素的生物合成(Cone et al.1986)。大麦中的同源基因GAMYB，能够特异性的结合到GARE motif，调节种子萌发过程中α-淀粉酶基因的表达，矮牵牛的同源基因PHMYB3，作为一个花瓣表皮特异表达的转录因子，能结合到类似AACA motif上。这种AACA motif和GARE motif相似，特异性的存在于谷蛋白(一种种子储存蛋白)基因的启动子中。由于OsMYB3与这些参与水稻种子蛋白的合成，调节种子发育的基因有很高的同源性，因此申请人认为OsMYB3基因为Gl3基因。

对大粒品种“南洋占”(粒长12.2mm；千粒重43.3g)，小粒品种“川7”(粒长5.8mm；千粒重11.4g)(以上所述品种由上海市农业生物基因中心罗利军惠赠)的Gl3基因全基因组包含启动子共5.2kb的范围进行测序，以确认两个品种中Gl3基因是否含有等位基因型之间的差异。

测序方法具体为：首先，抽提上述两个水稻品种植株叶片总DNA，DNA抽提方法参考CTAB法(见Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，TheorAppl Genet，83，495-499)。利用7对PCR产物相互部分重叠的引物(见下所述)，采用高保真度的LA-Taq从这两个品种的基因组中进行PCR扩增(PCR反应总体系为20μl，具体配法为：DNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加双蒸水至20μl。所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司产品。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃50秒，第⑤步是从②步-④步循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存)。然后，取5μl的PCR产物做测序前的消化反应。利用5U的EXOI(Biolabs公司产品)，0.13U的SAP(大连宝生物公司)以及l×PCR buffer(大连宝生物公司)在37℃C反应，使PCR产物消化1小时。最后，利用美国PE公司的测序试剂盒BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0和ABI 3730测序仪(美国ABI公司产品，按照说明书操作)分别从每个PCR产物两端测序。为了保证测序的准确性，每个扩增片段测3-4个重复。得到的测序片段再使用Sequencher 3.1.2软件(Gene Codes Corporation，美国)分别进行序列拼接。

测序引物的DNA序列由上海生工生物公司合成，所述的引物组合如下所示：

MICF 1CACGCTTCCCAAGCTATGAT

M1CR1 CCGTGCTTGGCGATGTAG

M1CF2 CGCCATTGGCATTGTTTGTA

M1CR2 CTCCCAATGCTGCCTGTCC

M1CF3 CCAAACTCCGATGCTAAACTC

M1CR3 CTCATCTCATGGAGCAGACAGA

M1CF4 TCTGAGAATATCACCGAGAA

M1CR4 AGTTCCCTCGCTTCGTAC

M1CF5 TCTAATGTGATGCCTATCAT

M1CR5 GCTTGCTGAGGGTGCT

M1CF6 CCGTCTGTATCGACCTTGACTT

LR4 GATCGGATGGGACTAATCCTAAT

LF7 CGGGTCATGCCATGTTTG

LR4 GATCGGATGGGACTAATCCTAAT

结果表明：得到的“川7”和“南洋占”序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1(序列长度为5097bp)和SEQ IDNO：3(序列长度为5130bp)所示，发现Gl3基因的等位基因“南洋占”基因型分别在基因的内含子和编码区有一个38bp和一个12bp的***。结合上述多个小组的QTL定位结果，关联分析结果，以及OsMYB3基因的在种子发育上的功能，这种Gl3基因型及其等位基因型之间的差异，与“川7”“南洋占”在粒长和粒重性状上的差异有显著的相关性。

实施例2：Gl3基因的蛋白质多态性以及它与谷粒粒长的关联分析

1.Gl3基因cDNA的分离

本发明所对应的Gl3基因(LOC_Os03g29614)，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布了该基因的转录本D88619(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/D88619)。通过常规的RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)从水稻品种“川7”和“南洋占”散粉后三天的穗部组织中扩增得到cDNA序列。cDNA的具体扩增方法如下：

1)先抽提来自水稻散粉后三天穗部的RNA，RNA抽提使用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；

2)RT-PCR中反转录合成cDNA第一链：配混合液1：总RNA 2μg，DNaseI 2U，10x DNAseI buffer1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAseI活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligdT，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；

3)然后根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的该基因全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。引物的DNA序列如下所述：

M1LF6 CGCCATTGGCATTGTTTGTA

M1RR1 CGTGCCGATGATCCGACT

PCR反应总体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl LATaq酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃50秒，⑤从②-④循环35次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。

4)PCR扩增得到D88619的cDNA产物，将其连接到T/A克隆载体pGEMT-vector(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上并用T7和SP6引物(载体pGEMT-vector自带的引物)测序验证。

2.Gl3基因及其等位基因Gl3-NYZ的氨基酸序列比对

通过对“川7”以及“南洋占”两个亲本cDNA的比较测序发现，其氨基酸序列在双亲本中存在很大差异，并且“南洋占”基因型在其终止密码处有12bp的***，导致了7个氨基酸的改变和20个氨基酸的缺失(“川7”，“南洋占”Gl3基因的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：2和SEQ IDNO：4所示)。氨基酸比较如图2所示。结合实施例1结果，所述Gl3基因的蛋白质以及其等位基因Gl3-NYZ的蛋白质之间的差别，也与“川7”“南洋占”两个水稻品种的粒长和粒重性状之间的差异相关。

3、Gl3基因与谷粒粒长的关联分析

1)通过对一个含有118个品种(上述118个参考品种为公开报道的常规品种，上述参考品种部分来源于上海农业生物基因中心罗利军教授赠送的材料，部分参考品种为华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室保藏的材料，不是克隆本发明基因及等位基因的材料)的自然群体比较测序发现(测序方法见实施例1)，自然群体中含有两种类型的Gl3等位基因型，对应于主效基因Gl3及其等位基因Gl3-NYZ。其核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

2)经过序列比对发现，在75个籼稻品种中，37个品种含有Gl3基因型，38个品种含有Gl3-NYZ基因型。然而，在43个粳稻品种中，只含有Gl3-NYZ一种基因型。

3)考虑到群体结构效应，申请人只比较75个籼稻品种中的Gl3和Gl3-NYZ的基因型之间的粒长，发现差异达到极显著(p＝7.50E-12)，如表1。因此，申请人认为，籼稻自然群体的粒长差异，与Gl3基因型差异显著相关。

表1：自然群体中含有两种基因型的品种之间的粒长差异

基因	粳稻品种	粳稻品种	粳稻品种	粳稻品种
						平均粒长	品种数	平均粒长	品种数
Gl3	8.04	37	-	0
					Gl3-NYZ	9.05	38	8.48	43

实施例3：Gl3基因的功能验证

1、RNAi双链抑制载体的构建

1)利用如下所述的引物组合对SEQIDNO：1中的目标序列进行扩增。所述的引物的DNA序列如下所示：

M1RF3 ACTAGTGGTACCGGTCGCCATGCAACGGAC

M1RR3 GAGCTCGGATCCAGCTCGATGTCGTCCAAGTCAA

得到的双链抑制片段，其序列如SEQ ID NO：5所示。

2)将得到的双链抑制片段用BamHI和KpnI先将其进行双酶切(购自宝生物工程大连有限公司，具体参见内切酶说明书)，回收目标片段后连到双链抑制载体上(图3所示)。连接酶购自NEB公司，反应体系参见说明书。

3)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

4)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述的方法抽提质粒，用KpnI和BamHI(购自宝生物工程大连有限公司)酶切检测，得到的阳性质粒用pMCG-1F和pMCG-1R测序验证，得到抑制表达第一链载体；所用引物的DNA序列如下：

pMCG-1F：CTGCTCCACACATGTCCATT

pMCG-1R：CCCACCATCTTGTGGAGCTA

5)用步骤2)中的方法，将方法1)中得到的序列用SacI和SpeI(购自宝生物工程大连有限公司)双酶切后连接到抑制表达第一链载体上，用pMCG-2F和pMCG-2R测序验证，得到完成的双链抑制表达载体；所用引物的DNA序列如下所示：

pMCG-2F：GGCTCACCAAACCTTAAACAA

pMCG-2R：CTGAGCTACACATGCTCAGGTT

6)将步骤5)的抑制表达载体通过电转化的方法(参考文献、使用电压的参数参照实施例3的步骤3)的方法进行)导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。

7)将步骤6)的抑制表达农杆菌向水稻受体品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所公开报道且公开发放的水稻品种)转化，遗传转化方法如下

2、RNAi双链抑制载体的转化

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

2)溶液配方

a)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。b)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

将上述试剂在20-25摄氏度下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

c)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄口7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

d)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

e)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

f)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

g)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于20-25℃温度下保存。

h)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，20-25℃温度保存。

i)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

j)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

k)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

1)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

m)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20-25℃温度保存备用。

3)用于水稻遗传转化的培养基配方

a)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

b)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

c)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

d)共培养基

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

e)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

f)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

g)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

h)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

i)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

4)农杆菌介导的遗传转化步骤

a)愈伤诱导

将成熟的水稻品种“中花11”水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟，用灭菌水清洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上。将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

b)愈伤组织继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

c)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

d)农杆菌培养

在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，1998)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

e)农杆菌侵染

将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

f)愈伤洗涤和选择培养

灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

g)分化

将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

h)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

i)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

所获得的T0代转基因植株命名为dsGl3-n(n为转基因植株2或转基因植株3，它们分别代表转基因的不同家系)。

3、转基因性状调查和表达分析

1)取T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity anddifferentiation ofindica anjaponica rice detected by RFLP analysis，1992，TheorAppl Genet，83，495-499)。然后用PCR方法对T0代转化植株用引物pMCG-2F和pMCG-2R进行阳性检测。

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物各0.3μl，Taq酶0.2μl加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③56℃30秒，④72℃1分钟，第⑤步从②步一④步循环32次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备。

2)为了检测抑制表达植株中的目标基因表达量，抽提了T0代转基因植株散粉后三天穗部组织的总RNA，按照实施例2的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测Gl3的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95℃预变性10秒，进入循环后95℃变性5秒，60℃退火延伸40秒，40个循环。结果见图4，与阴性对照相比，两个家系的Gl3基因的表达量发生了显著性降低。用到的Gl3基因定量的引物DNA序列如下所示：

M1RTF1 GTGGAATCGAATCAGTCGAGC

M1RTR1 TACGCCTTCTGCGCCTACTTA

3)将T1代植株种植大田后进行表型观察，通过对50株转基因T1代阳性植株和阴性对照比较，发现转基因阳性植株平均粒长为9.60mm，相对于转化阴性对照粒长7.85mm，达到极显著差异。转基因阳性植株的千粒重从28.33g增加到34.11g，达到极显著的差异，比较图见图5。同时，还伴随着穗粒数减少，穗长变长，着粒密度减小等特征，见图6。图6显示：第一行谷粒为转基因表型，第二行为阴性对照。植株和穗：右边为转基因表型，左边为阴性对照。

参考文献

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Claims

1.Gl3基因在控制水稻谷粒粒长和粒重中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的Gl3基因在控制水稻谷粒粒长粒重中的应用，该基因的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的Gl3基因的等位基因Gl3-NYZ，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

4.如权利要求3所述的Gl3基因的等位基因Gl3-NYZ，其特征在于，该基因的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。