CN112322649B - OsFGH5基因hap2型启动子在调控水稻叶片光化学效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsFGH5基因hap2型启动子在调控水稻光化学效率中的应用。包括在调控水稻光化学效率自然变异中的应用。通过对OsFGH5基因进行单倍型分析，显示该基因在启动子区域存在多态性，启动子区域的多态性会造成启动子活性差异，进而造成表达量差异。通过测定近等基因系的叶绿素荧光参数来研判该基因hap2型启动子的功能及在调控水稻光化学效率中的应用。OsFGH5基因所表达的蛋白定位于水稻叶绿体中,与叶绿体ATP合酶CF₁β亚基的II‑2区域相互作用，帮助β亚基与α亚基组装成α/β异源二聚体，参与CF₁亚复合体组装过程。该基因在调控水稻光化学效率中具有的重要育种价值。

Description

OsFGH5基因hap2型启动子在调控水稻叶片光化学效率中的 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsFGH5基因hap2型启动子在调控水稻光化学效率自然变异中的应用。本发明包括OsFGH5基因启动子多态性分析，近等基因系验证该基因hap2型启动子在调控水稻叶片高效的光化学效率的应用，以及OsFGH5作用机理的探究和突变体植株的构建，为水稻的遗传改良提供新的遗传资源的应用途径。

背景技术

植物的生长离不开能量的积累和消耗，在形成作物产量的干物质中，90％以上的有机物质都是通过光合作用同化合成的。由此可见，光合作用是植物一切生理活动的基础，植物的形态结构和生长发育都与光合作用紧密相关。同时，作为将光能转化为稳定化学能的最有效手段，光合作用也是维持生态平衡中最重要的环节。在自然条件下，大部分的农作物常处于光能过剩的情况，植物在强光下出现光抑制，会降低作物的光合能力，使光合机构失活的同时产生活性氧物质，阻碍植物生长。光能被植物吸收后一般有三个主要去向，即推动光合作用，转变为热能耗散，以荧光的形式释放。光合机构捕获光能并参与这三种能量释放途径是相互竞争相互调节的，其中一种途径的改变都会导致其它二者发生变化。因此，可以通过对叶绿素荧光的探测来探究植物的光化学效率和热耗散情况。

在前期结合高通量高光谱成像技术和全基因组关联分析中申请人发现了一个可能调控水稻叶绿素含量的基因OsFGH5(参见：An integrated hyperspectral imaging andgenome-wide association analysis platform provides spectral and geneticinsights into the natural variation in rice，2017，Scientific reports 7(1):4401)。分离克隆OsFGH5，分子和遗传实验表明该基因参与叶绿体ATP合酶的组装过程，近等基因系材料证实该基因启动子调控水稻叶片光化学效率。本发明进一步阐明了该基因作用本质，探究其在光保护和光合电子传递过程中的作用，将为优化光能分配、减轻植物光抑制程度，改善水稻的光合效率提供新的思路，也为水稻高光效育种提供重要育种价值。

发明内容

本发明的目的在于从水稻中分离克隆到OsFGH5基因，该基因定位于叶绿体内，参与叶绿体ATP合酶的组装调控。通过测定近等基因系材料的叶绿素荧光表型来探究该基因在自然群体中的变异程度以及hap2型启动子对水稻光化学效率产生的高效影响。通过分子生物学实验探究该基因作用的本质。同时在转基因试验中敲除该基因从而抑制了该基因的表达，进一步研判该基因在水稻植株内的功能表达。显示该基因hap2型启动子在调控水稻光化学效率中具有的重要育种价值。

本发明的具体方案如下所示

申请人分离克隆了一个控制水稻叶片光化学效率基因的完整编码区段DNA片段，将该基因命名为OsFGH5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其在NCBI数据库中的登录号为NC_029264.1。

申请人在水稻种质资源中，根据该基因启动子区域、5’UTR和3’UTR的SNPs和InDels进行分析，在籼稻、粳稻和Aus稻中将OsFGH5共分为3种主要的单倍型，显示该基因在启动子区域存在多态性。启动子酶活试验和表达谱数据库表明OsFGH5基因启动子区域的多态性造成启动子活性差异及表达量差异。(见实施例1)。

根据该基因分型信息构建近等基因系材料，在叶绿素荧光参数上具有表型差异，证实OsFGH5参与了水稻分蘖期叶片光化学效率的自然变异，OsFGH5基因hap2型启动子能导致更高的电子传递活性和电子传输速率，调控更高效的光化学效率(见实施例2)。

分子和遗传分析显示，OsFGH5作为核编码的蛋白质，定位于水稻叶绿体中(见实施例3)。它能与叶绿体ATP合酶CF₁β亚基的II-2区域相互作用，推测其帮助β亚基与α亚基组装成α/β异源二聚体，参与CF₁亚复合体组装过程从而直接影响水稻叶片光化学效率。(见实施例4)。

本发明进一步利用CRISPR技术构建得到转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH–FGH5，通过农杆菌介导的遗传转化将所述的OsFGH5基因导入水稻宿主中。在该基因所示的3183bp的序列的第1599-1619；2004-2024是该基因特异性靶标位，其中在该基因序列的1610-1907碱基位缺失了298个碱基。对CRISPR材料T₀代家系分蘖期叶绿素荧光参数进行了***考察，清楚地证实了OsFGH5突变会导致光化学效率降低，并通过对叶绿素含量的考察，表明OsFGH5突变会间接影响叶绿素含量。(见实施例5)。

附图说明

图1：OsFGH5的单倍型分析。附图标记说明：最上方为基因结构，从左往右依次为启动子(promoter)，5’UTR，CDS和3’UTR。下方图表的第一行表示每个SNP在基因中的具***置，右边三列表示各单倍型对应不同亚型的数目。每个位点不同的碱基用有无颜色背景来区别。(数据来源：http://ricevarmap.ncpgr.cn/)。

图2：OsFGH5基因启动子活性比较。附图标记说明：图2中的A图：水稻原生质体转化中所用的载体信息。A图中的a和b、c和d分别共转化水稻原生质体(Reporter和internalcontrol体积比为10:1)，测得的fLUC与rLUC的比值即为对应的OsFGH5单倍型启动子活性。图2中的B图：双分子荧光素酶活试验。图2中的C图：珍汕97和明恢63在三叶期和分蘖期的OsFGH5基因表达谱数据(数据来源：http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl/)。图中：“**”表示t测验中p值<0.01，表示差异极显著。

图3：近等基因系亲本日本晴(hap2)和L122(hap1)的OsFGH5启动子的序列特征。

图4：近等基因系表型比较。附图标记说明：图4中的A图：NIL(NIP)和NIL(L122)的SPAD值比较。图4中的B图：NIL(NIP)和NIL(L122)的光诱导曲线。图4中的C图：NIL(NIP)和NIL(L122)在P515信号下测得pmf及其两个组分Δψ和ΔpH。图4中的D图：NIL(NIP)和NIL(L122)的光强与NPQ的关系。图4中的E图：NIL(NIP)和NIL(L122)的光强与相对ETR的关系。图4中的F图：NIL(NIP)和NIL(L122)的光强与1-qL的关系。图中：“*”表示t测验中p值<0.05，显著差异。

图5：本发明的瞬时表达(载体)质粒pM999-FGH5-GFP的结构图。

图6：OsFGH5蛋白亚细胞定位分析。附图标记说明：图6中的A图：白光通道下的水稻原生质体。图6中的B图：红光通道下的叶绿体自发荧光。图6中的C图：绿光通道下的OsFGH5-GFP融合蛋白发出的荧光。图6中的D图：绿光与红光的叠加通道。标尺为10μm。

图7：本发明的(载体)质粒pGBKT₇和pGADT₇的结构图。

图8：酵母双杂交分析OsFGH5与CF₁β互作。附图标记说明：OsFGH5与GAL4-BD融合，CF₁β与GAL4-AD融合。pGBKT₇-53与pGADT₇-T的共转化用作阳性对照，而pGBK₇-Lam与pGADT₇-T的共转化用作阴性对照。与空载体pGADT₇或pGBKT₇共转化则作为排除诱饵蛋白与猎物蛋白自我激活的阴性对照。AD，GAL4激活域；BD，GAL4 DNA结合结构域。

图9：CF₁β亚基蛋白截短示意图。附图标记说明：上方数字显示为氨基酸个数。

图10：酵母双杂交分析OsFGH5与CF₁βII-2的互作。附图标记说明：OsFGH5与GAL4-BD融合，CF₁βII-2与GAL4-AD融合。pGBKT₇-53与pGADT₇-T的共转化用作阳性对照，而pGBK₇-Lam与pGADT₇-T的共转化用作阴性对照。与空载体pGADT₇或pGBKT₇共转化则作为排除诱饵蛋白与猎物蛋白自我激活的阴性对照。AD，GAL4激活域；BD，GAL4 DNA结合结构域。

图11：BiFC载体的多克隆位点示意图。

图12：本发明的(载体)质粒pGEX-6P-1和pMal-C2x的结构图。

图13：BiFC验证OsFGH5与CF₁βII-2的互作。附图标记说明：黄色荧光表明OsFGH5与CF₁βII-2的相互作用。pVYNE和pVYCE-CF₁βII-2、pVYNE-OsFGH5和pVYCE分别用于阴性对照。标尺为5μm。图14：Pull-down验证OsFGH5与CF₁βII-2的互作。附图标记说明：图14中的A图：原核表达及纯化后的蛋白，MBP大小约为44KD，MBP-OsFGH5大小约为80KD，GST大小约为26KD，GST-CF₁βII-2大小约为38KD。图14中的B图：anti-MBP和anti-GST抗体免疫杂交后的结果。GST-CF₁βII-2和MBP蛋白用于阴性对照。

图15：本发明的(载体)质粒CRISPR/gRNA vectors的构建路线和图谱。

图16：本发明的(载体)质粒pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的构建路线和图谱。

图17：本发明的(载体)质粒pYLCRISPR/Cas9-MH–FGH5构建路线和图谱。附图标记说明：在图17中：T1为第一个靶点ATTAGTCCTGTGATGCACGA；T2为第二个靶点AATGTTCTGGCGTTCGATGA。

图18：野生型(阴性植株)与突变体(阳性植株)敲除靶点序列比对。附图标记说明：WT：“日本晴”阴性植株；Cas9-1和Cas9-2：纯合***一个碱基“A”的阳性单株；Cas9-3、Cas9-4和Cas9-5：纯合缺失294碱基的阳性单株。图中：下划线处为起始密码子ATG；灰色为敲除靶点序列；“-”代表碱基缺失；“//”代表省略的碱基。

图19：突变体(阳性植株)与野生型(阴性植株)的叶绿素荧光特性的比较。附图标记说明：图19中的A图为NPQ诱导的时间过程。图19中的B图为NPQ的光强依赖性曲线。图19中的C图为光强梯度下的相对ETR水平。图19中的D图为光强梯度下的1-qL水平。图中：“*”表示t测验中p值<0.05，表示显著差异。

图20：突变体(阳性植株)与野生型(阴性植株)材料的叶绿素含量的表型性状比较。附图标记说明：图20中的A图：分蘖期SPAD值比较。图20中的B图：分光光度法测定分蘖期叶片总叶绿素含量。图20中的C图：分蘖期叶绿素a含量的比较。图20中的D图：分蘖期叶绿素b含量的比较。图中：“**”表示t测验中p值<0.01，表示极显著差异。

具体实施方式

对序列表的说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的OsFGH5基因的核苷酸序列。序列长度为3183bp。

序列表SEQ ID NO:2是本发明涉及的OsFGH5基因hap1型启动子核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:3是本发明涉及的OsFGH5基因hap2型启动子核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:4是本发明涉及的叶绿体ATP合酶CF₁β亚基的蛋白质序列。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明中验证OsFGH5基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：OsFGH5基因启动子活性及基因表达量差异

1.OsFGH5单倍型分析

申请人对OsFGH5基因在水稻种质资源中的单倍型进行分析，根据该基因启动子区域、5’UTR和3’UTR的SNPs和InDels进行分析，最后在籼稻、粳稻和Aus稻中将其分为3种主要的单倍型(见图1)。分析显示大多数SNP集中于启动子区域。在转录起始位点前1K的启动子范围内，共有14个SNP突变位点。表明该基因在启动子区域存在多态性。

2.OsFGH5启动子活性分析及表达量分析

为了验证OsFGH5在核心种质中启动子的多态性是否会造成该基因启动子活性的差异，申请人选取明恢63(来自福建省农业科学院)和珍汕97(来自江西省农业科学院)两个水稻品种，其分别属于SNP突变位点差异最多的两个单倍型(明恢63为hap1，珍汕97为hap2)。再将两个材料的基因组DNA作为模板，扩增出不同单倍型的OsFGH5启动子序列，所用引物信息为：190-MH(ZS)-pro-F(ACGGCCAGTGCCAAGCTTCGTACAAGGCATGTGCAT)/190-MH(ZS)-pro-R(GAAGGGTCTTGCAGATCTGCGCGTGAAATGTCCACAG)。将扩增好的序列连接到经HindⅢ/BglⅡ双酶切后的190-fLUC载体上，内参载体为拟南芥泛素基因驱动的海肾荧光素酶基因(rLUC)(见图2中的A图)。最后通过双分子荧光素酶活实验(Dual Luciferase Assay)在水稻原生质体中比较OsFGH5启动子活性。测得的fLUC与rLUC的比值即为对应单倍型的OsFGH5启动子活性。结果表明在珍汕97中OsFGH5启动子活性显著高于明恢63，即hap2的启动子活性要高于hap1(见图2中的B图)。通过查找本室水稻表达谱数据库，比较了珍汕97和明恢63两份材料的三叶期和分蘖期的OsFGH5表达量(见图2中的C图)，发现珍汕97的OsFGH5表达量高于明恢63，这与启动子活性实验的结果相吻合，即hap2的OsFGH5启动子活性高于hap1，基因表达量也高于hap1。

实施例2：利用近等基因系材料证实OsFGH5基因hap2型启动子对水稻分蘖期光化学效率的调控效应

申请人对OsFGH5近等基因系NIL(NIP)和NIL(L122)的表型性状进行了考察。构建水稻近等基因系的方法是本领域的常规方法，可参考申请日前相关的报道的方法。本发明近等基因系的构建步骤大体上以粳稻品种“日本晴”为受体亲本，以籼稻“L122”(即广恢122系列，为报道品种)为供体亲本，经过杂交后得到F1代植株，再与轮回亲本“日本晴”进行多次回交后自交。其中“日本晴”(NIP)材料为hap2，L122材料为hap1。对比两亲本的OsFGH5基因序列，发现L122材料在启动子-811处存在367bp的片段***(图3)，该片段可作为筛选近等基因系中导入株系的依据。在该片段前后位置设计引物FGH5-NIL-F(GGTTTAGAAGGATACATC)/FGH5-NIL-R(GTTCAAACTACTCCCTCC)，用1.0％琼脂糖凝胶检测PCR产物，共鉴定出18株NIL(L122)，14株NIL(NIP)，其余为杂合植株。

分别取10株NIL(NIP)和NIL(L122)在分蘖期进行叶绿素荧光参数和SPAD值的考察。叶绿素荧光参数测定的具体过程为：在实验室配制0.01％的琼脂糖作为叶片存放缓冲液；田间取水稻的分蘖期叶片样品组织置于缓冲液中，将样品暗处理2h以上。使用Dual-PAM-100双通道调制叶绿素荧光仪测量分蘖期各叶绿素荧光参数。(1)在测量光(650nm，0.1μmol photons m^-2s^-1)下测量暗适应叶的最小荧光产率(F_o)。施加饱和脉冲的白光(3000μmol photons m^-2s^-1，持续0.8秒)以确定在黑暗中的最大荧光产率(F_m)。然后用光化光(919μmol photons m^-2s^-1)照射叶片4min。在照射期间，通过每20s施加一次饱和脉冲测量最大叶绿素荧光(F_m')及NPQ随时间的变化趋势。(2)按不同光化光的光强梯度分别照射叶片30s后，记录光强度依赖性光合参数NPQ，ETR和1-qL并绘制曲线。(3)使用配备有P515/535发射器-检测器模块(Walz)的Dual-PAM-100测量pmf。pmf可以分为两个部分，即pH和ΔΨ，当驱动ATP合酶时，两者在热力学上是等效的。将植物暗适应过夜后，用690μmol photons m^-2s^-1红光照射叶片10min。记录可逆电致变色位移动力学2min。并计算pmf，ΔΨ和ΔpH的值。所得结果如下所述。

NIL(NIP)的SPAD值为43.86±1.50，NIL(L122)的SPAD值为42.56±1.64，可知NIL(NIP)的SPAD值大于NIL(L122)，且两者之间存在显著性差异(见图4中的A图)。将叶片暗处理后用光化光(919μmol photons m^-2s^-1)照射4min，期间每20s施加一次短暂的饱和脉冲，NIL(NIP)在4min后NPQ平均被诱导至2.73，而NIL(L122)上升至2.87，两者存在显著性差异，表明NIL(L122)的热耗散高于NIL(NIP)(见图4中的B图)。NPQ的主要成分qE由类囊体腔H⁺浓度严格触发和控制，若光反应过程中ATP合酶的质子流出不足，导致类囊体腔中高水平质子的积累，发生在反应中心和捕光复合体上的NPQ便起到了防止光抑制过程中危险自由基上升的作用。因此，NPQ水平也可用作评估类囊体腔内质子累积程度。DUAL-PAM-100的P515/535模块检测pmf及其两个组分Δψ、ΔpH，可发现NIL(L122)中的总pmf及其两种成分均高于NIL(NIP)，表明NIL(L122)的类囊体腔中较高的质子积累水平(见图4中的C图)。另外用不同光化光(15,33,91,169,327,498,756和1175μmol photons m^-2s^-1)分别照射叶片30s后，得到了光强度依赖性光合参数NPQ、相对ETR和1-qL。在高于327μmol photons m^-2s^-1的光强下，NIL(L122)的稳态NPQ大于NIL(NIP)，这与P515/535模块观察到高水平质子在NIL(L122)类囊体腔中积累一致(见图4中的D图)。与NIL(NIP)相比，在光强度高于327μmol photonsm^-2s^-1的NIL(L122)中观察到较低的ETR水平(见图4中的E图)，表明NIL(L122)有较低的线性电子传递速率。而在高于756μmol photons m^-2s^-1的光强度下在NIL(L122)中观察到更高的1-qL水平(见图4中的F图)，表明NIL(L122)中PSII受体侧的还原程度高于NIL(NIP)，其电子传递活性较低。以上近等基因系材料的表型结果表明，OsFGH5基因hap2型启动子相比hap1型启动子能调控更高效的光化学效率。

实施例3：OsFGH5定位于叶绿体

本实施例中，申请人构建了亚细胞定位载体，具体过程为设计一对引物pM999-F(ATAAGCTTGATATCACTAGTCCTCCAGCCACCGCCCAC)/pM999-R(CCCCCGGGCTGCAGTCTAGATATGGTTGGTCCTTGAAG),通过PCR技术，扩增去除了终止密码子的OsFGH5的cDNA序列，30μl的PCR反应体系，包含DNA模板2μl，KOD buffer 15μl，2mM dNTP 6μl，10uM引物(F/R)各0.9μl，KOD酶0.6μl，加ddH₂O至30μl。PCR扩增反应程序：98℃,5min；98℃,30s；60℃,30s；68℃,1min；32cycles；68℃,7min,25℃保存。同时利用限制性内切酶SpeI/XbaI对亚细胞定位表达载体pM999-GFP(见图5)进行酶切。酶切体系：PCR产物5μg，10×QuickCut buffer 5μl，SpeI 5μl，XbaI 5μl，加ddH₂O至50μl。37℃酶切30min。PCR扩增产物及酶切产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。分别将目的片段和酶切载体纯化回收，通过HIFI Taq DNA连接酶将OsFGH5的CDS序列克隆到载体pM999-GFP的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和GFP基因之间。之后转化大肠杆菌Trans1-T1(购自TransGen公司)，通过测序获得阳性单克隆。抽提高质量质粒后转化水稻原生质体进行瞬时表达。在荧光显微镜下观察，结果显示在绿光与红光的叠加通道叶绿体自发荧光部位与OsFGH5-GFP融合蛋白发出的荧光部位重合，表明OsFGH5所表达的蛋白定位于叶绿体中(见图6)。

实施例4：OsFGH5参与叶绿体ATP合酶CF₁亚复合体的组装

申请人利用ProQuest^TM Two-Hybrid System(Invitrogen)在酵母体内验证OsFGH5与CF₁β相互作用。具体过程为设计引物pGBKT7-FGH5-F/R和pGADT7-CF₁β-F/R将蛋白OsFGH5和CF₁β的cDNA序列分别构建到pGBKT₇和pGADT₇载体上，使其分别与GAL4-BD和GAL4-AD融合，经测序验证正确后，抽提重组质粒。具体载体信息见图7。将构建好的质粒共转化到AH109酵母菌株(来自本实验室)中，使用空的pGADT₇和pGBKT₇载体作为对照。在SD/-Leu-Trp培养基筛选出阳性单菌落后，转接于SD/-Ade-His-Leu-Trp培养基上，28℃下生长3天。具体操作步骤见Invitrogen手册。结果显示OsFGH5和CF₁β的重组质粒共转化的酵母菌株在SD/-Ade-His-Leu-Trp培养基上正常生长，与阳性对照长势一致，而转入了空载体的酵母菌株无法生长，表明OsFGH5蛋白能与CF₁β亚基发生相互作用(见图8)。

叶绿体ATP合酶CF₁β亚基的基因组序列共有1497个核苷酸，蛋白大小为498个氨基酸，具体序列见序列表SEQ ID NO:4。基于菠菜(Spinacia oleracea)叶绿体ATP合酶的晶体结构(参见：The structure of the chloroplast F₁-ATPase at 3.2A resolution，2001，J Biol Chem 276:1345–1352)，CF₁β亚基可分为三个结构域(见图9)：含有六链β-桶(CF₁βI)的N-末端结构域，含有核苷酸结合位点的中心结构域(CF₁βII)和C-末端的α-螺旋束(CF₁βIII)，其中CF₁β中心结构域(CF₁βII)进一步又可分为三个区域：CF₁βII-1(Pro-97-Gly-165)，是位于α₃β₃六聚体外表面的长环；CF₁βII-2(Gly-166-Ile-275)，含有3个α-螺旋和4个β-链，形成具有相邻CF₁α亚基的CS位点；CF₁βII-3(Phe-276-Pro-377)，主要位于α₃β₃六聚体内部并且与另一个相邻的CF₁α靠近NCS位点。根据以上划分，对CF₁β亚基cDNA序列截短后构建到pGADT₇载体上，与OsFGH5进行酵母双杂交实验，显示与OsFGH5相互作用的区域为CF₁βII-2(见图10)。以上酵母双杂交实验涉及的引物的编号及序列如下所述：

pGBKT7-FGH5-F:ATGGAGGCCGAATTCCCTCCAGCCACCGCCCAC；

pGBKT7-FGH5-R:GGCCGCTGCAGGTCGACAGCAAAATCGGCCATTCGA；

pGADT7-CF₁β-F:ATGGAGGCCAGTGAATTCATGAGAACCAATCCTACTAC；

pGADT7-CF₁β-R:TCGAGCTCGATGGATCCTCATTTCTTCAATTTGTTCT；

pGADT7-CF₁βI-R:TCGAGCTCGATGGATCCTCCCGTGTCAATCACTTCCA；

pGADT7-CF₁βII-1-F:ATGGAGGCCAGTGAATTCGCTCCTCTCAGTGTTCCT；

pGADT7-CF₁βII-1-R:TCGAGCTCGATGGATCCTCCACGCCGATAAGGAGC；

pGADT7-CF₁βII-2-F:ATGGAGGCCAGTGAATTCGGAAAAATCGGACTATTTGG；

pGADT7-CF₁βII-2-R:TCGAGCTCGATGGATCCGATATTATCGATGAATAG；

pGADT7-CF₁βII-3-F:ATGGAGGCCAGTGAATTCTTTCGTTTTGTTCAAGCAGG；

pGADT7-CF₁βII-3-R:TCGAGCTCGATGGATCCAGGTTGTAACATAGTTGAGG；

pGADT7-CF₁βIII-F:ATGGAGGCCAGTGAATTCCGGATCGTTGGCAACGAA；

申请人利用BiFC、Pull-down实验进一步验证OsFGH5与CF₁βII-2的相互作用。

BiFC实验的具体步骤为：将OsFGH5和CF₁βII-2的全长cDNA分别通过BamHI/XhoI双酶切克隆至pUC-VYNE和pUC-PVYCE载体上(见图11)。OsFGH5的cDNA与YFP的N端1-155位氨基酸融合组成重组质粒pVYNE-OsFGH5，CF₁βII-2的cDNA与YFP的C端156-239位氨基酸融合组成重组质粒pVYCE-CF₁βII-2。构好的重组质粒(包括空载体)用高质量质粒抽提试剂盒Qiagen Plasmid Midi Kit(购自Qiagen公司)抽提，然后用100μL ddH₂O溶解质粒(浓度1μg/μL左右)。将两个重组质粒(分别取5μg)共转化至水稻原生质体。pVYNE和pVYCE-CF₁βII-2、pVYNE-OsFGH5和pVYCE作为对照组也分别共转化至水稻原生质体。最后使用激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP2,Germany)观察结果。该实验涉及的引物的编号及序列如下所述：

pVYNE-FGH5-F:GCCCAGGCCTACTAGTGGATCCCCTCCAGCCACCGCCCAC；

pVYNE-FGH5-R:CCCGGGAGCGGTACCCTCGAGAGCAAAATCGGCCATTCGA；

pVYCE-CF₁βII-2-F:CAGGCCTACTAGTGGATCCGGAAAAATCGGACTATTTGG；

pVYCE-CF₁βII-2-R:GGGAGCGGTACCCTCGAGGATATTATCGATGAATAG；

Pull-down实验的具体步骤为：MBP标签融合的OsFGH5序列通过EcoRI/SalI酶切位点连接到原核表达载体pMal-C2x(图12)上，测序验证正确后将构建好的载体(包括空载体)转化入原核表达菌株BL21(DE3)(购自Transgen公司)。类似地，GST标签融合的CF₁βII-2序列通过EcoRI/SalI酶切连接到原核表达载体pGEX-6P-1(见图12)上，经测序验证正确后将构建好的重组质粒(包括空载体)转化入原核表达菌株BL21(购自Transgen公司)。涂布于相应抗生素的LA培养基上生长12h。挑取单克隆菌株于含有相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，然后按1:100的比例稀释扩大培养。待大肠杆菌在37℃生长至对数中期(OD₆₀₀＝0.4～0.6)加入0.1mM IPTG，置于16℃摇床中继续诱导过夜(原核表达菌株BL21在28℃下培养8小时)，离心收集菌体。MBP标签的菌体用Column Buffer重悬，GST标签的菌体用1×PBS重悬，超声波裂解菌体，离心收集上清液。用Amylose resin(NEB)分离纯化MBP融合的蛋白，Glutathione Sepharose(Glutathione Sepharose^TM 4Fast Flow,GE Healthcare)分离纯化GST融合的蛋白。纯化后的MBP-FGH5融合蛋白及MBP标签空蛋白作为诱饵蛋白，GST标记的CF₁βII-2融合蛋白作为猎物。在2mL离心管中将纯化过的诱饵蛋白分别与等量的猎物蛋白混合，加入1mL Column Buffer(含有蛋白酶抑制剂)，置于静音混合器上，4℃混匀6小时，取1％总体积的样品记作Input于-20℃保存。剩余的样品与Amylose resin(NEB)混合，在静音混合器上4℃过夜。4℃500×g离心5min后弃上清，用Column Buffer洗涤5次，每次5min,洗涤过程在静音混合器上进行。最后用50μL 2×laemmli buffer(购自Sigma公司)重悬，98℃变性10min，至冰上冷却后4℃500×g离心10min，取上清记作IP。将Input和IP进行SDS-PAGE分离后，凝胶中的蛋白经装膜仪(350mA恒流，1.5h)转移至PVDF膜上。用含有5％none-fatty milk的1×TBST室温预杂交2h以封闭背景，分别用anti-MBP和anti-GST抗体进行免疫杂交。最后进行化学发光，显影。该实验涉及的引物的编号及序列如下所述：

pMal-C2x-FGH5-F:GGAAGGATTTCAGAATTCCCTCCAGCCACCGCCCAC；

pMal-C2x-FGH5-R:GCTTGCCTGCAGGTCGACAGCAAAATCGGCCATTCGA；

6p1-CF₁βII-2-F:CGTGGATCCCCGGAATTCGGAAAAATCGGACTATTTGG；

6p1-CF₁βII-2-R:GCGGCCGCTCGAGTCGACGATATTATCGATGAATAG；

该实验涉及的主要溶液配方：

1)Column Buffer：

2)10X TBS缓冲液

Tris(WM 121.14) 24.2g

NaCl 80.0g

ddH₂0 至1L

3)10X TBST缓冲液

10X TBS缓冲液 100mL

ddH₂0 900mL

Tween-20 1mL

BiFC实验结果中，共表达pVYNE-OsFGH5/pVYCE-CF₁βII-2的原生质体在共聚焦显微镜下有明显的黄色荧光而对照组无荧光，表明在细胞内OsFGH5与CF₁βII-2互作(见图13)。Pull-down实验结果中，anti-MBP抗体免疫杂交后，四个泳道都有条带，而anti-GST抗体免疫杂交后，Input中MBP和MBP-OsFGH5有条带，IP中MBP为空白而MBP-OsFGH5有条带，证实MBP-OsFGH5与GST-CF₁βII-2相互作用(见图14)。因此在叶绿体中，OsFGH5与CF₁β亚基中能和相邻α亚基形成CS位点的表面区域相结合，帮助CF₁β亚基与CF₁α亚基组装成α/β异源二聚体，参与叶绿体ATP合酶复合物的生物发生，从而影响水稻叶片的光化学效率。

实施例5：OsFGH5突变导致分蘖期水稻光化学效率降低

1.CRISPR突变体材料载体构建及遗传转化

以水稻品种“日本晴”测序序列设计靶定于目标基因的特异性引物，构建得到CRISPR载体，具体步骤为，申请人首先利用OsFGH5序列设计两个CRISPR靶标位点，并控制其靶标位点落在OsFGH5基因外显子区域。将两个靶标接头分别与CRISPR/gRNA-U3(见图15)和CRISPR/gRNA-U6a(见图15)载体连接，利用Bsa I限制性内切酶完整地将gRNA-U3和gRNA-U6a切下并共同连接到pYLCRISPR/Cas9-MH载体(见图16)上，得最终的pYLCRISPR/Cas9-MH–FGH5终质粒(见图17)，并将终质粒转入“日本晴”愈伤组织中。以上过程所用的载体均来自刘耀光实验室。最终获得OsFGH5转基因苗，测定其分蘖期叶绿素荧光参数，验证该基因在调控水稻光化学效率中的重要功能。试验中所用的遗传转化受体水稻材料是粳稻品种“日本晴”(Oryza.Sativa L.spp.japonica)，为常用品种。

将菌株pYLCRISPR/Cas9-MH–FGH5导入水稻“日本晴”的愈伤组织采用是农杆菌介导的遗传转化方法，经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因的水稻植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6:271-282)基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基氨基嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N_6max培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

2)N_6min培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制)：

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

3)铁盐(Fe²⁺EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MS_max母液)(按照10X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

6)MS培养基微量元素母液(MS_min母液)(按照100X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升，室温储存。

7)2,4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2,4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃避光保存。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，-20℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方：

1)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌15分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基(粳稻可以不做这一步)：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)悬浮培养基：

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

5)共培养基：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

6)筛选培养基：

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(10克CN/36毫升水)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基(粳稻可以不做这一步)：

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基：

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到100毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：

3.1愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将8-10粒种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-5周，温度26±1℃。

3.2愈伤继代：

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养：

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

3.4农杆菌培养：

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上划线预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，培养温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染：

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀＝0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养：

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中摇30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周至长出好的抗性愈伤。

3.7分化：

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照下培养5周-6周至长出大的苗子，培养温度26℃。

3.8生根与炼苗：

1)剪掉分化时产生的老根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，等长势健壮后再移栽至大田。

2.T₀代CRISPR材料的阳性检测

利用常规的CTAB法抽提CRISPR植株基因组DNA，作为PCR模板。通过扩增筛选标记引物cas9-F/R来检测无cas9存在的植株。20μl的PCR反应体系，包含：20-50ng DNA模板,10mM Tris-HCl,50mM KCl,0.1％Triton X-100,1.8mM MgCl₂,0.1mM dNTP,0.2μM引物和1UrTaq DNA polymerase。PCR扩增的条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，34个循环；72℃延伸至7min。用1.0％琼脂糖凝胶检测PCR产物，无cas9存在的植株用BFACRI-JC-F/R引物测序检验，筛选出纯合突变的阳性单株。部分测序结果见图18，Cas9-1和Cas9-2阳性单株均发生了碱基***突变，在U6a靶位点上***了一个碱基“A”。Cas9-3、Cas9-4和Cas9-5阳性单株发生了碱基缺失突变，在U6a靶位点附近缺失了294个碱基。T₀代共检测出8株阳性单株(突变类型均为以上所示的两种类型之一)和4株阴性单株。本实施例涉及的引物的编号及序列如下所述：

cas9-F:GGTCGCCTACCACGAGAAGTACC；

cas9-R:GTGAGGTCCTGGTGGTGCTCGTC；

BFACRI-JC-F:CTCCATCCCATAATATAGCAACG；

BFACRI-JC-R:CAAATTCATAGGAAGGCACCGAT；

3.CRISPR材料影响光化学效率相关表型的测定

对T₀代检测出的8株阳性植株和4株阴性植株的分蘖期叶绿素荧光参数进行检测。暗适应后，在40s时施加一个光化光，监测叶片在919μmol photons m^-2s^-1光强度下4min内的NPQ变化(见图19中的A图)。1min后两者的NPQ值开始出现显著差异，在4min内NPQ逐渐达到稳态，此时阴性植株NPQ值为3.17±0.13，阳性植株NPQ值升至3.44±0.04，表现出较高的热耗散水平。而后通过设置光化光强度梯度(21，155，490，979，1360，2426μmol photons m^{- 2}s^-1)来进行快速光曲线的测量。分析发现在光强高于979μmol photons m^-2s^-1(见图19中的B图)时，阳性植株相较于阴性植株观察到更高的稳态NPQ水平，表明类囊体腔中的质子积累水平较高。在光强高于490μmol photons m^-2s^-1(见图19中的C图)时，阳性植株有较低的ETR水平，表明其线性电子传输速率降低。而在高于979μmol photons m^-2s^-1的光强(见图19中的D图)下，阳性植株观察到更高的1-qL水平，表明阳性植株中质体醌在光***II受体侧的还原程度高于野生型。以上结果证明OsFGH5突变会降低叶片光化学效率，造成类囊体腔内质子水平累积。

另外，对其分蘖期叶绿素含量也进行了检测。叶绿素含量测定过程为：(1)采用SPAD仪(SPAD-502,Konica-Minolta,Japan)活体测定水稻叶片叶绿素相对含量。选取分蘖期倒二叶，测量叶片上中下三处SPAD值(应避开主叶脉)，取平均数，每个材料进行3次生物学重复。(2)采用分光光度法离体测定水稻叶片叶绿素绝对含量，即称取分蘖期倒二叶中间部位叶片0.04g(去除主叶脉)，剪碎放入离心管，加入2mL抽提液(丙酮：乙醇：水体积比＝4.5:4.5:1)，4℃遮光抽提12h，期间上下颠倒，待样品完全变白后进行吸光光度分析，测量A₆₆₃和A₆₄₅的吸光值便可计算出水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量。每个材料进行3次生物学重复。具体计算公式如下：

Chl a＝(12.71A663-2.59A645)×V/1000W

Chl b＝(22.88A663-4.67A645)×V/1000W

Total chl＝(8.04A663-20.29A645)×V/1000W

其中A₆₆₃和A₆₄₅分别为相应波长下的吸光值，其中:V代表抽提液体积(mL)，W代表叶片重量(g)。

分蘖期SPAD值检测的结果显示阴性植株的SPAD值为46.54±2.04，阳性植株的SPAD值降低为43.38±1.87，两者存在极显著差异(见图20中的A图)。利用分光光度法离体检测了分蘖期叶片的绝对叶绿素含量(见图20中的B图)，显示阴性植株的叶绿素含量为1.9±0.13mg/g，阳性植株的叶绿素含量极显著低于野生型，为1.7±0.12mg/g，该结果呈现的趋势与SPAD值测量结果相一致。且阳性植株中叶绿素a和叶绿素b含量相对于阴性植株都表现出显著下降的趋势(见图20中的C图,D图)。证明OsFGH5突变也会导致分蘖期水稻叶绿素含量降低。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsFGH5基因hap2型启动子在调控水稻叶片光化学效率中的应用

<141> 2019-12-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3183

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3183)

<400> 1

atgtcgacgg cggcggcggc cgcggcgtcc acctcgctcc ggccggcctc ccagtccgcg 60

ctccgtctcg cggtttcgct ccctcaccac cttcgtcgtc tctgattctg tgtaatttat 120

catgcgcctt cgtctaaccg agtagtcttc cccggttaaa tcgcgcaggg ttcgccgcgg 180

cggtggtgct ggggagcccc ggcgctctcc cctgcgagga gagcattcca cgcggacacg 240

cggaggcggt tcgtgttctc tccttgggcg tttgcttcta gtatggaatg gagttgatgg 300

ccttttgtcc gaattagttt tgcttcctgt ggtgtatttg ggggaagtca tcgcagacct 360

gtggattacc cttcatgttg cattgttgtc tcctgtggga ttaagtgttt catgagattg 420

gggtatttcg ttgtagatta ctgttctatg cttttaaatt gcaatgccgg taattttgtt 480

gctacgagtt attgttcaga gtagattact tctataactc tcgctgttcc attggagttg 540

cttatacagt gcgctctcta actgccacca gcacagttca gatgttcttc agggtgtttt 600

agtaacatga gtttctacgg tcctgatgca catttctgat tcatgtgcaa atctacatct 660

accattcatt cctaggattt catactattt ggtagctgca atgcggcagg atctgtgatt 720

tgcctttccg aattcattgt gatggtgcaa atagacagat gaacagtcta ttattattct 780

taatttaaga acctatgttt gtattaaaca ggaagacttt gttatatgca actgataaag 840

gcccagaaga atccttgaag aagacaattg aagttgacag gttgatcgag atgctgaggg 900

atgcaaatcc tagagaggta actcttcata tcttcaatct gactgtttat tctactactc 960

tccatcccat aatatagcaa cgtagtgctg gatgcccgta tccagatcca tagtactagg 1020

gtacgtccca tccggtccta ggttgctata ttatgggaca gaggaagtat tagataaggt 1080

tacagtctca ggttttacac cacactaaaa gatctctcca ttcaattgta ccaatttaaa 1140

tctgttacca aacctctata gtatataatt ctccttgctt tgagcatgct tccattagtt 1200

cttggttcaa aatctgtaga accaatctaa gcagtacttg atgacttggt cgtgggagca 1260

ttaagcctca agttctgtga acaacatgaa ctgttcaatt ttatttactt cggagttttc 1320

atatttacct ttagtttctt atcaggttta ttttacgcat ttagaaatat ttgaagtatg 1380

cttatccttg tcagtttatc actagatttt attattatgt ctatggtaat tctaaatact 1440

ggagcattgc tgaacagaat atatgcagtt tgttttattt tcatttaatt gaattaagcc 1500

ttgctttgtt ttgaaattac ttttgacatg aaaattactt gatcaactta ctaatttacc 1560

cttccttgca tgtgacagct tgatcaaata gtggttgaaa atgttctggc gttcgatgag 1620

ggtttctggg ttcggctggc agcaagaatt gatctatgca aatcggatga tgataaagca 1680

tggttttcac aattggattt cttttttgtt actatggaat gtcgatcccg ttctcttagc 1740

tcgattaatc taactttgtg aatggtgtct ctcttctgcc ttttcagaaa gactatgaag 1800

aattggctga aaatgtcatg aacatagttg accgtcttgt ccataagact gatgtaagaa 1860

caatattggg tcacattatt tgtattaatg gcaacacttt tggcattttt atcgtgatca 1920

gaaaagttcc ttgaatgctg ctaatattta cccttatcta ttcaggaaaa gattgaacag 1980

tcaactgatg tgctgaaggc aattattagt cctgtgatgc acgaaggtga aaacgccacg 2040

tggccaccga gagatccgga ggctctcaaa ttgatggaga aagtaagaac gaacatagct 2100

attttttcac tgttattctt tactgggata tttcatcggt gccttcctat gaatttggtt 2160

tatttcacat tacctcacac atagcattta gtcgctttag gcaagttact gttttggttg 2220

gctctacttc acatgaaaca gatttatatt ccaatctgta gtgtaactag aaagtgccag 2280

ttttatactc caatcttgta tttgtttttt atggtgtcct ggtatcgcca ggaaatttca 2340

aatagagaaa aagaaggaca gctagacgaa ggatttctgt cagaggttaa tgctcagttg 2400

aggcaggtat gtgtcatttt ctacattgtg gattaacttt gttgatatat tactcagcat 2460

agagtagttt tgctactcat tttactatta cacccttaca tgtgtttagg ctaaacaaga 2520

tggagataaa ccaggacttc aagctatgct gcagaaggtg ttgcagctgt atgcgtccaa 2580

ttttctccaa aagcgtagtt acgcttacaa aggtaaatcc tgttcattcg ttttggactg 2640

ttgaaccaca accactgaga atgattaccc tttaaattga tttgtctatc tttcattttc 2700

agggggagaa gtaatagtgc ctgaaagttt tcttgaatct gtaataaagg gtatgtatca 2760

ttgtgcggag agattgtttg tcttcaatca actgatctca acctttaata tatccagatt 2820

gtgccttgca gctccggaaa acgagtggaa caagctgttg cttgatgggt taacagtggg 2880

gaaaggaaat gtttcaccag aagaatttta tgctgttata aagaagagaa ttgagagagt 2940

cttaattcgc acagtaatat cccaaccttt ggagttatac agagaacgca atctctttta 3000

gtttgtcagg accttgtctt tagtttagca tcccctcagc acatttttca tttttcctct 3060

tgttatcttt ttgtttgaca ggaaggaggt tcttatcagc agcgcatact cgttgaatat 3120

ctaaaagaga tacaggctag agcggaggaa gttgtgaagg tgcttcaagg accaaccata 3180

tga 3183

<210> 2

<211> 1619

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1619)

<400> 2

cgtacaaggc atgtgcatac tactccctcc gtcccaaaat aagtgcagtt ttgcactatt 60

tatgttcaac gtttgaccgt ccgtcttatt tgaaaaaatt ttatgattag tatttttatt 120

gctattagat gataaaacat gaataatact ttatgtgtga ctaaatgttt ttaatttttt 180

tacaaaattt tcaaataaga cggacggtca aacgttgaac gtgaatagtg taaaactgca 240

cttattttgg gacggaggta gtagtatata caccgtactc ttccgtatgt actgtacgtc 300

ttgtacacca taaattaaat tgaaaaaaaa aggtttagaa ggatacatcg aaatgaaaac 360

tttagaaagt cagtccaacg ggagaagtca ttaataggag gatccggatc tcagctacag 420

tcacaatagt aactgcaacc taagggcccc tttgaatcgc agggtagaaa aaacggagga 480

ataggaaaaa cacaggattc tgacaggaat tgaagtgtaa aacagaggat tacaaaacac 540

aggaaaaaca caggaatggt cgtttgatta gagcgcagga aaaacgcagg aatcggatga 600

gagagataga ctcagaggaa atgttccaag aggttagacc tcttgctaac tttcctccaa 660

aatatgtata ggactaccca ttcaatagga attttaaagg attggatatg attcaatcct 720

ttgtttcaaa ggccttcata ggattttttt ccataggatt gaaatcctcc aaaattccta 780

tattttccct ataaatcaaa gggaccctaa gcaagatcag tgcgcaccat tggatacaaa 840

taagacagtc tagatcatac tccctctatc cttaaatata agggatttta gttggatgta 900

atatgtctgg acaggcttcg tatccaaatt cattgtacta taataaatca catacaacca 960

aaatccctta tatttagaga tagagggagt acatcgtact attgatagca ttgtaccaaa 1020

aaactgtagc acggagtact atgcacaatt ttacattagc gtatactttc tccgtaaaaa 1080

aacgtatata gaactagatg tgacacattt taatataacg aatctgcaga gagatagttt 1140

gaatgggacg gagggagtag tttgaaccat tcatcataaa aattaacaat caaaattata 1200

cgcagtcgtt taacttaacg ttacaagtat aactgaactt gatctgaatc cttaatcgta 1260

gtgttgcgaa cgctgtgcaa tttttgtgat tacgtgtgct ctccagttca tccaagtaaa 1320

ctgccaagcc agcccatgtc cccaacgcca caatcttaca gggccggccc cactggtgct 1380

tcgtttcgca tgggccaaat gcagcaccgc ttgccagctc gtaattgcgg cccattaacc 1440

taaatgggcc gatcgagtgg tggtgcagcc caaccacaag gccacgacaa aaaaaacgtc 1500

ctcctcttcg agtcgtccgc ttccactcac gccggctcat cctctctctc tctccaaatc 1560

tgtggacatt tcacgcgcgc tctccgctcc agcctccggc caccgcccac cggccggcg 1619

<210> 3

<211> 1009

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1009)

<400> 3

cgtacaaggc atgtgcatac tagtatatac accgtactcc tccgtatgta ctgtacgtct 60

tgcacaccat aaattaaatt ggaaaaaaaa ggtttagaag gatacatcga aatgaaaact 120

ttagaaagtc agtccaacgg gagaagtcat taataggagg atccggatct cagctacagt 180

cacaatagta actgcaacct aagcaagatc agtgcgcacc attggataca aatcagacag 240

tctagatcat actccctcta tacttaaata taagggattt taattggatg cgatacgtct 300

ggacaggctt catatccaaa ttcattgtac tagaataaat cacatacaac caaaatccct 360

tatatttagg gatagaggga gtacatcgta ctattgatag cattgtacga aaaaactgta 420

gcacggagta ctatgcacaa ttttacatta gcgtatactt tctccgtaaa aaaacgtata 480

tagaactgga tgtgacacat tttaatataa cgaatctgca gagagatagt ttgaatggga 540

cggagggagt agtttgaacc attcatcgta aaaatgaaca atcaaaatta tacgcagtcg 600

tttaacttaa cgttacaagt ataactgaac ttgatctgaa tccttaatcg tagtgttgcg 660

aacgctgtgc aatttttgtg attacgtgtg ctctccagtt catccaagta aactgccaag 720

ccagcccatg tccccaacgc cacaatctta cagggccggc cccactggtg cttcgtttcg 780

catgggccaa atgcagcacc gcttgccagc tcgtaattgc ggcccattaa cctaaatggg 840

ccgatcgagt ggtggtgcag cccaaccaca aggccacgac aaaaaaaacg tcctcctctt 900

cgagtcgtcc gcttccactc acgccggctc atcctctctc tctccaaatc tgtggacatt 960

tcacgcgcgc tctccgctcc agcctccagc caccgcccac cggccggcg 1009

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(498)

<400> 4

Met Arg Thr Asn Pro Thr Thr Ser Arg Pro Gly Val Ser Thr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Lys Ser Thr Gly Arg Ile Asp Gln Ile Ile Gly Pro Val Leu Asp

20 25 30

Val Thr Phe Pro Pro Gly Lys Leu Pro Tyr Ile Tyr Asn Ala Leu Val

35 40 45

Val Lys Ser Arg Asp Thr Asp Gly Lys Gln Ile Asn Val Thr Cys Glu

50 55 60

Val Gln Gln Leu Leu Gly Asn Asn Arg Val Arg Ala Val Ala Met Ser

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Leu Met Arg Gly Met Glu Val Ile Asp Thr Gly Ala

85 90 95

Pro Leu Ser Val Pro Val Gly Gly Ala Thr Leu Gly Arg Ile Phe Asn

100 105 110

Val Leu Gly Glu Pro Val Asp Asn Leu Gly Pro Val Asp Thr Ser Ala

115 120 125

Thr Phe Pro Ile His Arg Ser Ala Pro Ala Phe Ile Glu Leu Asp Thr

130 135 140

Lys Leu Ser Ile Phe Glu Thr Gly Ile Lys Val Val Asp Leu Leu Ala

145 150 155 160

Pro Tyr Arg Arg Gly Gly Lys Ile Gly Leu Phe Gly Gly Ala Gly Val

165 170 175

Gly Lys Thr Val Leu Ile Met Glu Leu Ile Asn Asn Ile Ala Lys Ala

180 185 190

His Gly Gly Val Ser Val Phe Gly Gly Val Gly Glu Arg Thr Arg Glu

195 200 205

Gly Asn Asp Leu Tyr Met Glu Met Lys Glu Ser Gly Val Ile Asn Glu

210 215 220

Lys Asn Leu Glu Glu Ser Lys Val Ala Leu Val Tyr Gly Gln Met Asn

225 230 235 240

Glu Pro Pro Gly Ala Arg Met Arg Val Gly Leu Thr Ala Leu Thr Met

245 250 255

Ala Glu Tyr Phe Arg Asp Val Asn Lys Gln Asp Val Leu Leu Phe Ile

260 265 270

Asp Asn Ile Phe Arg Phe Val Gln Ala Gly Ser Glu Val Ser Ala Leu

275 280 285

Leu Gly Arg Met Pro Ser Ala Val Gly Tyr Gln Pro Thr Leu Ser Thr

290 295 300

Glu Met Gly Ser Leu Gln Glu Arg Ile Thr Ser Thr Lys Lys Gly Ser

305 310 315 320

Ile Thr Ser Ile Gln Ala Val Tyr Val Pro Ala Asp Asp Leu Thr Asp

325 330 335

Pro Ala Pro Ala Thr Thr Phe Ala His Leu Asp Ala Thr Thr Val Leu

340 345 350

Ser Arg Gly Leu Ala Ser Lys Gly Ile Tyr Pro Thr Val Asp Pro Leu

355 360 365

Asp Ser Thr Ser Thr Met Leu Gln Pro Arg Ile Val Gly Asn Glu His

370 375 380

Tyr Glu Thr Ala Gln Arg Val Lys Gln Thr Leu Gln Arg Tyr Lys Glu

385 390 395 400

Leu Gln Asp Ile Ile Ala Ile Leu Gly Leu Asp Glu Leu Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Arg Leu Thr Val Ala Arg Ala Arg Lys Ile Glu Arg Phe Leu Ser

420 425 430

Gln Pro Phe Phe Val Ala Glu Val Phe Thr Gly Ser Pro Gly Lys Tyr

435 440 445

Val Gly Leu Ala Glu Thr Ile Arg Gly Phe Gln Leu Ile Leu Ser Gly

450 455 460

Glu Leu Asp Gly Leu Pro Glu Gln Ala Phe Tyr Leu Val Gly Asn Ile

465 470 475 480

Asp Glu Ala Ser Thr Lys Ala Ile Asn Leu Glu Glu Glu Asn Lys Leu

485 490 495

Lys Lys

Claims (1)

1.一种单倍型为hap2的启动子通过启动OsFGH5基因表达在调控水稻叶片光化学效率中的应用，其特征在于所述，所述OsFGH5基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述单倍型为hap2的启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

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