CN105505843B

CN105505843B - 一株光合细菌菌株、含该菌株的液体肥及制备方法、应用

Info

Publication number: CN105505843B
Application number: CN201610105754.2A
Authority: CN
Inventors: 闫志英; 袁月祥; 许力山; 廖银章; 李志东; 李东; 刘晓风
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: CN105505843A

Abstract

本发明涉及一株光合细菌菌株及富含该菌株的液体肥，属于微生物发酵及农业种植等技术领域。该菌株经鉴定为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)HL CGMCC No.11874，能够在光照或黑暗条件下利用沼液基质快速繁殖生长。本发明还提供了该菌株作为微生物液体肥的应用：以新鲜沼液为原料，对红假单胞菌HL进行培养而得，菌液中红假单胞菌HL浓度≥10⁸CFU/mL。本发明将沼液基质利用与光合细菌培养进行耦合，生产出具备多重特殊性能的微生物液体肥料，提供了一种廉价绿色的沼液高附加值开发技术与产品。

Description

一株光合细菌菌株、含该菌株的液体肥及制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及富含该菌株的液体肥，具体涉及一种基于沼液原料的微生物液体肥、其制备方法及其应用，属于微生物发酵及农业种植等技术领域。

背景技术

随着我国畜禽养殖业的发展，每年畜禽养殖粪便的产生量已达25亿吨，同时，我国是农业大国，每年农业生产产生7亿多吨农作物秸秆。以沼气工程为代表的厌氧发酵技术是一种能消纳畜禽粪便、农作物秸秆、生活垃圾等有机废弃物、缓解能源短缺的环境友好型技术，得到日益广泛的应用。据统计，截至2013年，我国各类沼气工程已超过10万处，农村沼气用户沼气池4300万户，并且根据《可再生能源中长期发展规划》，到2020年，建成大型畜禽养殖场沼气工程10000座。伴随沼气工程的大规模发展，其产生的沼液沼渣等发酵残留物的大幅增多，全国每年沼液排放量已超过1.3亿吨，沼液中含有高浓度的有机物以及氮、磷、钾等营养物质，直接排放对环境造成极大污染。因此，沼液如何消纳已成为限制沼气工程发展的瓶颈性问题。目前对沼液处理的方法可概括为资源化利用和达标排放处理两方面，沼液资源化利用包括沼液肥料化还田、沼液浸种、沼液生物农药、沼液作为培养基等；沼液达标处理有高成本工业化处理和人工湿地或氧化塘自然生态处理。达标排放处理将沼液视为高有机物、高氮磷的污水，采用生物、化学等方法进行处理，不利用或少利用其中的营养物质，是一种单纯的污染治理技术，处理成本非常高昂，在大多数中小沼气工程中很难采用；资源化利用强调对沼液中营养物质的利用，将沼液作为资源进行开发，是处置沼液的优选方式。目前，沼液的资源化利用多在农业种植领域的低端利用为主，但随着我国农药减量控害、化肥减量增效行动的深入推进，有机肥料及生物农药的市场需求潜力巨大，沼液中含有各类氨基酸、赤霉素、生长素、糖类、核酸以及抗生素等，是一种天然的有机肥和生物农药。因此，对沼液进行高附加值开发，将对破解沼液消纳困难制约我国沼气工程可持续发展的瓶颈问题具有重要意义。目前，沼液高附加开发利用也有陆续报道，如CN 105254367A公开了一种“一种用沼液制取滴灌专用肥的方法”，该方法是利用澄清的沼液为基料，添加营养元素和微生物菌剂混合制备得到滴灌专用肥，但该方法设备投资大，处理运行成本高。CN 102503660A公开了一种“一利用沼液制成的高效微生物液体菌肥及应用”，该菌肥是以澄清的沼液和微生物功能菌、植物生长调节剂、扩散剂为母料，按一定比例混合制备得到微生物液体菌肥，但该菌肥中添加了大量无机化学成分，对沼液天然成份产生了破坏。

综上所述，对沼液高附加值开发大都停留沼液浓缩、沼液混配等技术层面，这些技术要么存在设备投资巨大，运行成本高昂；要么存在破坏沼液天然成份等问题。因此亟需开发一种廉价绿色的沼液高附加值开发技术与产品。

发明内容

本发明针对现有微生物液体肥存在的问题，提供了一株高效光合细菌菌株以及基于沼液原料的富含该光合细菌菌株的微生物液体肥，本发明还提供一种该微生物液体肥的制备方法。此外，本发明还提供了该微生物液体肥的应用。

本发明的技术方案是，一株光合细菌菌株，经鉴定为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)HL CGMCC No.11874，该菌株能够在光照或黑暗条件下利用沼液基质快速繁殖生长。

该菌株从池塘底泥样品中筛选得到，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏编号为：CGMCC No.11874，保藏日期为：2015年12月14日。该菌性状特征如下：

(1)形态特征

菌体呈杆状，略弯，菌体大小0.7～0.9×1.2～2.3μm，在固体平板上菌落圆而小，呈鲜红至暗红。

(2)培养性质

在液体培养基中厌氧光照或微好氧光照下，30～40℃培养3天后，菌液均呈红色至鲜红色，后期转为红褐色，老培养物形成均质易扩散的沉淀；在固体培养基平板培养：30～40℃培养5天可大量生长，菌落表面凸起，边缘规则，小而圆，光滑无褶皱，菌落鲜红。

本发明还提供了一种微生物液体肥，所述液体肥包括上述红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)HL CGMCC No.11874的菌液，菌液中红假单胞菌HL浓度≥10⁸CFU/mL，所述菌液以新鲜沼液为原料，对红假单胞菌HL进行培养而得。

所述微生物液体肥中还可以包括保护剂，所述保护剂占液体肥总质量的1％～5％。所述红假单胞菌HL的菌液以沼液为原料，对红假单胞菌HL进行培养而得。优选的是，所述保护剂为甘油或液体石蜡的一种或两种。

沼液是沼气工程厌氧发酵后的液相残留物，但光合细菌很难在沼液中培养，而本发明筛选出的红假单胞菌HL可以很好地利用沼液快速培养，所以本发明提供了一种微生物液体肥的制备方法，将沼液基质利用与光合细菌培养进行耦合，生产出具备多重特殊性能的微生物液体肥料。该方法包括以下步骤：

(1)沼液装料：把新鲜沼液装入红假单胞菌HL培养装置中；

(2)接种红假单胞菌HL：将红假单胞菌HL按10⁴～10⁶CFU/mL的接种密度接种到有新鲜沼液的培养装置中；

(3)搅拌兼氧培养：发酵时控制发酵温度、光照强度和发酵时间；其搅拌选择低速桨式搅拌器，转速30r/min～100r/min，发酵温度为25℃～37℃，发酵时间为3天～6天，光照下培养，光照强度为2000Lx～5000Lx；

(4)培养结束后储藏：将培养后得到的富含红假单胞菌HL微生物液体肥在常温或冷藏温度下保藏。

优选地，所述新鲜沼液取自于稳定产气8个月以上沼气工程发酵罐排放的沼液。

发酵后得到的富含红假单胞菌HL微生物液体肥在常温下保藏，其有效期为5～8个月；或者在4℃～8℃冷藏温度下保藏，其有效期为12～14个月。

为了延长微生物液体肥料的贮存时间，可以向其中加入1％～5％质量比的保护剂。优选的是，保护剂可以甘油、液体石蜡等中的一种。加入保护剂时，先将保护剂加入少量微生物液体肥中，搅拌均匀后，加入余下的微生物液体肥，并充分混合，制成添加了保护剂的微生物液体肥。

本发明还提供了上述微生物液体肥在植物根施和叶面喷施上的应用。

根据中华人民共和国《复合微生物肥料》农业行业标准(NY/T789-2004)的要求和检测方法对制备的微生物液体肥产品进行检验，标准要求合格产品的技术指标为：有效活菌数≥0.5×10⁸CFU/mL，总养分(N+P₂O₅+K₂O)≥4％，杂菌率≤15％，pH值为3-8，有效期≥3个月；标准要求合格产品的无害化指标为：粪大肠菌群数≤100个/mL，蛔虫卵死亡率≥95％，As≤75mg/L，Cd≤10mg/L，Pb≤100mg/L，Cr≤150mg/L，Hg≤10mg/L。经过大量的试验证明，上述微生物液体肥可以达到下表技术指标和无害化指标。

微生物液体肥的技术指标

微生物液体肥的无害化指标

本发明的优越之处在于：

(1)本发明提供的一种基于沼液原料的微生物液体肥，结合了沼液和光合细菌(红假单胞菌)二者优势，不仅可为作物提供营养元素，还可补充多种作物有益物质，如小分子氨基酸、维生素、腐植酸和各种微量元素等活性物质，还可提高土壤有机质。同时富含的光合细菌能够固氮、固碳及氧化分解硫化物和胺类物质等多种有毒物质，促进蔬菜、水稻、玉米等作物幼苗的发育，提高蔬菜、水稻和玉米等作物的产量和抗病能力。同时，富含的光合细菌还可以改善土壤微生物区系，提升土壤肥力。

(2)本发明采用沼气工程的沼液为培养基原料制备富含光合细菌的微生物液体肥，能够将大型沼气工程中的沼液全部资源化利用，提高沼液的商品性和附加值，解决了沼液消纳难的问题，另一方面为本发明一种基于沼液原料的微生物液体肥提供了非常低廉和充足的原料，具有明显的生产成本优势。

(3)本发明的微生物液体肥制备方法的实施方式简单，可大规模生产，也易于辐射推广。

(4)本发明不仅解决了传统沼液用于农业生产中肥效低的弊端，同时通过光合细菌的固氮和固硫作用，去除了沼液中的硫化氢、氨等刺激性恶臭，实现了沼液的资源化安全处理与利用。

(5)本发明为根部灌施和叶面喷施两用微生物液体肥料，既能叶面喷施，又能随水滴灌，具有施肥简便、供肥及时、作物易于吸收、肥料利用率高等优点。

具体实施方式

实施例1

(1)红假单胞菌菌株HL的选育方法，步骤如下：

1)将10g取自四川双流区永安镇新街村鱼塘的底泥研碎悬于90mL无菌蒸馏水中震荡均匀，煮沸15min，冷却后梯度稀释，并涂布于筛选培养基中，30℃下培养72h，得到菌落，筛选培养基为光合细菌固体培养基(g/L)的组成为：酵母膏1g、MgCl₂ 0.2g、NH₄Cl 1g、K₂HPO₄ 0.5g、NaCl 1g、NaHCO₃ 1g、补水至1000mL，调节pH至6.8。

2)挑选菌落鲜红、生长旺盛、表面光滑的菌落6株，相同的培养条件下，将这6株菌进行反复划线培养三次以上，以获得纯菌株，接种于光合细菌液体培养基中，于30℃下培养72h，得到纯菌株种子液。

3)将纯菌株种子液按照1～5％的接种量接种到含100ml液体发酵培养基的500ml血清瓶中，于30℃，100r/min发酵培养72h。选择发酵液鲜红、菌体浓度较高的第2号菌，命名为HL。

(2)红假单胞菌菌株HL的生理生化特征见下表1。

表1菌株HL的生理生化特征

实施例2

一种基于沼液原料的微生物液体肥的各组分的重量百分比为：以沼液为原料培养的富含红假单胞菌HL的菌液95％、甘油保护剂5％。成品肥料各项技术指标和无害化指标如下表2和表3。

表2微生物液体肥的技术指标

表3微生物液体肥的无害化指标

实施例3

一种基于沼液原料的微生物液体肥的各组分的重量百分比为：以沼液为原料培养的富含红假单胞菌HL的菌液97％、液体石蜡保护剂3％。成品肥料各项技术指标和无害化指标如下表4和表5。

表4微生物液体肥的技术指标

表5微生物液体肥的无害化指标

实施例4

一种基于沼液原料的微生物液体肥的各组分的重量百分比为：以沼液为原料培养的富含红假单胞菌HL的菌液99％、甘油保护剂1％。成品肥料各项技术指标和无害化指标如下表6和表7。

表6微生物液体肥的技术指标

表7微生物液体肥的无害化指标

实施例5

一种基于沼液原料的微生物液体肥的组分的重量百分比为：以沼液为原料培养的富含红假单胞菌HL的菌液100％。成品肥料各项技术指标和无害化指标如下表8和表9。

表8微生物液体肥的技术指标

表9微生物液体肥的无害化指标

实施例6

一种基于沼液原料的微生物液体肥的制备方法，步骤为：

(1)新鲜沼液装料：把新鲜沼液装入红假单胞菌HL培养装置中,新鲜沼液取自于双流县永安镇新街村沼气站的沼气工程发酵罐排放的沼液，稳定产气8个月以上。主要成分如下表：

(2)接种红假单胞菌HL：将红假单胞菌HL按10⁵CFU/mL的接种密度接种到新鲜沼液中。

(3)搅拌兼氧培养:搅拌选择低速桨式搅拌器，转速30r/min，发酵温度为30℃，发酵4天，光照下培养，光照强度为3000Lx。

(4)培养结束后储藏：培养后得到富含红假单胞菌HL微生物液体肥在常温下保藏，有效期为6个月。

实施例7

与实施例6不同的是：接种密度10⁴CFU/mL；转速100r/min，培养温度为25℃，发酵时间为6天，光照强度4000Lx；培养得到富含红假单胞菌HL微生物液体肥在4℃冷藏温度下保藏，其有效期为13个月。

实施例8

与实施例6不同的是：接种密度10⁶CFU/mL；转速70r/min，培养温度为35℃，发酵时间为2天，光照强度5000Lx；培养得到富含红假单胞菌HL微生物液体肥常温下保藏，其有效期为8个月。

实施例9

与实施例6不同的是：转速50r/min，培养温度为37℃，发酵时间为1天，在常温下保藏，其有效期为5个月。

实施例10

为了延长微生物液体肥料的贮存时间，在实施例6制备得到的微生物液体肥料中，先向少量液体肥料加入2％质量比的甘油作为保护剂，在常温下保藏，其有效期为10个月。

实施例11

为了延长微生物液体肥料的贮存时间，在实施例7制备得到的微生物液体肥料中，先向少量液体肥料加入5％质量比的液体石蜡保护剂，在常温下保藏，其有效期为11个月。

实施例12

为了延长微生物液体肥料的贮存时间，在实施例8制备得到的微生物液体肥料中，先向少量液体肥料加入3％质量比的液体石蜡保护剂，在4℃下冷藏温度下保藏，其有效期为16个月。

实施例13

为了延长微生物液体肥料的贮存时间，在实施例9制备得到的微生物液体肥料中，先向少量液体肥料加入2％质量比的甘油保护剂，在4℃下冷藏温度下保藏，其有效期为15个月。

实施例14

一种基于沼液原料的微生物液体肥盆栽根施效果实验：实验所用盆栽植株为玉米，首先穿过地膜打孔，将玉米苗放入孔洞中，然后通过膜上的孔洞，向每株玉米苗根际周围灌施50mL实施例2中的微生物液体肥或者普通沼液，然后浇灌250ml定根水。

实验设置三个处理组，分别为：

(1)对照组，不施用任何肥料；

(2)普通沼液组，施用普通沼液；

(3)微生物液体肥组，施用实施例2的微生物液体肥。

玉米苗移栽30天后，测定玉米株正下方0～10cm根际土壤固氮活力并和玉米株的鲜重。测定结果如下表10所示，施用沼液和微生物液体肥都能够显著的增加根际固氮活力和玉米植株的鲜重。相对于对照处理组，普通沼液处理组根际固氮活力和植株鲜重分别增加了9.5％和27％，微生物液体肥处理组根际固氮活力和植株鲜重分别增加了23.3％和55.8％。因此，微生物液体肥能够显著地增加玉米苗株根际土壤固氮活力和苗期植株的鲜重。

表10微生物液体肥盆栽实验结果

测定指标	对照组	普通沼液组	微生物液体肥组
				根际固氮活力(μm.C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>/g.土.天)	2.32	2.54	2.86
玉米植株鲜重(g/盆)	81.2	103.1	126.5

实施例15

一种基于沼液原料的微生物液体肥盆栽叶面喷施效果实验：实验所用盆栽植株为黄瓜，待黄瓜幼苗长出后，每天向幼苗喷施经稀释20倍的实施例3中的微生物液体肥或者普通沼液。

实验设置三个处理组，分别为：

(1)对照组，喷施清水；

(2)普通沼液组，喷施普通沼液；

(3)微生物液体肥组，喷施实施例3的微生物液体肥。

根据黄瓜的生长周期，分别测定黄瓜株高和每株黄瓜总产量。测定结果如下表11所示，施用沼液和微生物液体肥都能够显著的黄瓜株高和每株黄瓜总产量。相对于对照处理组，普通沼液处理组黄瓜株高和每株黄瓜总产量分别增加了8.6％和34.4％，微生物液体肥处理组黄瓜株高和每株黄瓜总产量分别增加了17.9％和75％。因此，微生物液体肥能够显著地增加黄瓜株高和黄瓜总产量。

表11微生物液体肥盆栽实验结果

Claims

1.一株光合细菌菌株，其特征在于：代号为HL，经鉴定为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)，于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11874；菌落鲜红，菌体呈杆状，略弯，菌体大小0.7～0.9μm×1.2～2.3μm，在固体平板上菌落圆而小，呈鲜红至暗红。

2.一种红假单胞菌HL微生物液体肥，其特征在于：该微生物液体肥包括保藏号为CGMCCNo.11874的红假单胞菌HL的菌液，菌液中红假单胞菌HL浓度≥10⁸CFU/mL，所述菌液以新鲜沼液为原料，对红假单胞菌HL进行培养而得。

3.如权利要求2所述的一种红假单胞菌HL微生物液体肥，其特征在于：该微生物液体肥还包括保护剂，所述保护剂占微生物液体肥总质量的1％～5％。

4.如权利要求2所述的一种红假单胞菌HL微生物液体肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)沼液装料：把新鲜沼液装入红假单胞菌HL的培养装置中；

(3)搅拌兼氧培养：低速桨式搅拌器转速30r/min～100r/min进行搅拌，发酵温度为25℃～37℃，发酵时间为3天～6天，光照下培养，光照强度为2000Lx～5000Lx；

(4)培养结束后储藏：将培养后得到的富含红假单胞菌HL的微生物液体肥在常温或冷藏温度下保藏。

5.如权利要求4所述的一种红假单胞菌HL微生物液体肥的制备方法，其特征在于，在步骤(3)之后还包括加保护剂步骤：将保护剂加入到少量步骤(3)得到的微生物液体肥中，搅拌均匀后，加入余下的微生物液体肥，并充分混合；保护剂的加入量为添加保护剂后的微生物液体肥质量的1％～5％。

6.如权利要求2所述的一种红假单胞菌HL微生物液体肥在植物根施和叶面喷施上的应用。